Method Article

Ocena morfologiczna i funkcjonalna aksonów i ich synaps podczas śmierci aksonów u Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/60865

⸱

March 16th, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Fundamental Neurosciences, University of Lausanne

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj udostępniamy protokoły do przeprowadzenia trzech prostych testów degeneracji aksonów (śmierci aksonów) wywołanych urazem u Drosophila melanogaster, aby ocenić morfologiczne i funkcjonalne zachowanie odciętych aksonów i ich synaps.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwyrodnienie aksonów jest wspólną cechą chorób neurodegeneracyjnych oraz gdy układy nerwowe są poddawane próbie przez siły mechaniczne lub chemiczne. Jednak nasza wiedza na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zwyrodnienia aksonów pozostaje ograniczona. Zwyrodnienie aksonów wywołane urazem służy jako prosty model do badania, w jaki sposób odcięte aksony dokonują własnego demontażu (śmierć aksonu). W ostatnich latach zidentyfikowano ewolucyjnie zachowaną kaskadę sygnalizującą śmierć aksonów od much do ssaków, która jest wymagana, aby oddzielony akson uległ degeneracji po urazie. I odwrotnie, osłabiona sygnalizacja śmierci aksonów powoduje morfologiczne i funkcjonalne zachowanie odciętych aksonów i ich synaps. W tym miejscu przedstawiamy trzy proste i niedawno opracowane protokoły, które pozwalają na obserwację morfologii aksonów, czyli funkcji aksonalnej i synaptycznej odciętych aksonów, które zostały odcięte od ciała komórki neuronalnej, u muszki owocowej Drosophila. Morfologię można zaobserwować w skrzydle, gdzie częściowe uszkodzenie powoduje śmierć aksonów obok nieuszkodzonych aksonów kontrolnych w tym samym pęczku nerwowym. Alternatywnie, morfologię aksonów można również zaobserwować w mózgu, gdzie cały pęczek nerwowy ulega śmierci aksonu wywołanej ablacją czułków. Funkcjonalne zachowanie odciętych aksonów i ich synaps można ocenić za pomocą prostego podejścia optogenetycznego w połączeniu z postsynaptycznym zachowaniem pielęgnacyjnym. Przedstawiamy przykłady wykorzystujące mutację powodującą utratę funkcji wysokiego drutu i nadmierną ekspresję dnmnat, które mogą opóźnić śmierć aksonów o tygodnie lub miesiące. Co ważne, protokoły te mogą być stosowane poza obrażeniami; Ułatwiają one charakterystykę neuronalnych czynników utrzymania, transportu aksonalnego i mitochondriów aksonalnych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Integralność morfologiczna neuronów jest niezbędna do utrzymania funkcji układu nerwowego przez całe życie. Zdecydowana większość objętości neuronalnej jest zajmowana przez aksony1,2; W związku z tym utrzymanie przez całe życie szczególnie długich aksonów jest poważnym wyzwaniem biologicznym i bioenergetycznym dla układu nerwowego. Zidentyfikowano wiele mechanizmów wsparcia aksonalno-wewnętrznego i glejowo-zewnętrznego, zapewniających przeżycie aksonów przez całe życie. Ich upośledzenie powoduje zwyrodnienie aksonów3, co jest powszechną cechą układów nerwowych zagrożonych przez chorobę oraz przez siły mechaniczne lub chemiczne4,5. Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw zwyrodnienia aksonów pozostają słabo poznane w jakimkolwiek kontekście, co sprawia, że opracowanie skutecznych metod leczenia w celu zablokowania utraty aksonów jest wyzwaniem. Opracowanie skutecznych terapii przeciwko tym schorzeniom neurologicznym jest ważne, ponieważ stanowią one ogromne obciążenie dla naszego społeczeństwa6.

Zwyrodnienie aksonów wywołane urazem służy jako prosty model do badania, w jaki sposób odcięte aksony dokonują własnego rozkładu. Odkryta i nazwana na cześć Augustusa Wallera w 1850 roku, degeneracja Wallera (WD) jest terminem zbiorczym, który obejmuje dwa odrębne, molekularnie rozłączne procesy7. Po pierwsze, po uszkodzeniu aksonów, aksony oddzielone od swoich ciał komórkowych aktywnie dokonują własnej autodestrukcji (śmierci aksonu) poprzez ewolucyjnie zachowaną kaskadę sygnalizującą śmierć aksonu w ciągu jednego dnia po urazie8. Po drugie, otaczający glej i wyspecjalizowane fagocyty angażują się i usuwają powstałe resztki aksonów w ciągu trzech do pięciu dni. Tłumienie sygnalizacji śmierci aksonu skutkuje odciętymi aksonami, które pozostają zachowane przez tygodnie9,10,11,12, podczas gdy tłumienie pochłaniania glejowego kończy się szczątkami aksonów, które utrzymują się tygodniami in vivo13,14,15.

Badania na muchach, myszach, szczurach i danio pręgowanych ujawniły kilka ewolucyjnie zachowanych i niezbędnych mediatorów sygnalizacji śmierci aksonów8. Mutanty śmierci aksonów zawierają odcięte aksony i synapsy, które nie przechodzą śmierci aksonów; Pozostają morfologicznie i funkcjonalnie zachowane przez tygodnie, przy braku wsparcia dla ciała komórkowego9,10,12,13,16,17,18,19,20,21,22,23. Odkrycie i scharakteryzowanie tych mediatorów doprowadziło do zdefiniowania szlaku molekularnego powodującego śmierć aksonów. Co ważne, sygnalizacja śmierci aksonu jest aktywowana nie tylko wtedy, gdy akson jest przecięty, zgnieciony lub rozciągnięty24,25; Wydaje się również, że przyczynia się do różnych zwierzęcych modeli schorzeń neurologicznych (np. gdzie aksony degenerują się w sposób niezależny od urazu4, ale z szeregiem korzystnych skutków4,8). Dlatego zrozumienie, w jaki sposób śmierć aksonu powoduje zwyrodnienie aksonów po urazie, może dostarczyć wglądu wykraczającego poza prosty model urazu; Może również zapewnić cele dla interwencji terapeutycznej.

Muszka owocowa Drosophila melanogaster (Drosophila) okazała się nieocenionym systemem sygnalizacji śmierci aksonów. Badania na muchach ujawniły cztery istotne, ewolucyjnie zachowane geny śmierci aksonów: highwire (hiw)11,14, dnmnat12,26, dsarm10 i axundead (axed)12. Modyfikacja tych mediatorów – mutacje powodujące utratę funkcji hiw, dsarm i axed oraz nadekspresja dnmnat – silnie blokuje śmierć aksonów na całe życie muchy. Podczas gdy odcięte aksony typu dzikiego ulegają śmierci aksonów w ciągu 1 dnia, odcięte aksony i ich synapsy pozbawione hiw, dsarm lub axed pozostają nie tylko morfologicznie, ale także funkcjonalnie zachowane przez tygodnie. Nie wiadomo jeszcze, czy możliwe jest również zachowanie funkcjonalności poprzez wysoki poziom dmnnat.

Tutaj przedstawimy trzy proste i niedawno opracowane protokoły do badania śmierci aksonów (np. morfologii i funkcji odciętych aksonów i ich synaps w czasie) w przypadku braku wsparcia dla ciała komórki. Pokazujemy, w jaki sposób osłabiona śmierć aksonów powoduje odcięte aksony, które są morfologicznie zachowane z mutacją utraty funkcji hiw (hiw∆N) i jak osłabiona śmierć aksonu powoduje odcięcie aksonów i synaps, które pozostają funkcjonalnie zachowane przez co najmniej 7 dni z nadmierną ekspresją dnmnat (dnmnatOE). Protokoły te pozwalają na obserwację morfologii poszczególnych aksonów i synaps w ośrodkowym lub obwodowym układzie nerwowym (odpowiednio OUN i PNS)13,14, podczas gdy funkcjonalne zachowanie odciętych aksonów i ich synaps w OUN można zobrazować za pomocą prostej konfiguracji optogenetycznej połączonej z pielęgnacją jako odczytem behawioralnym12.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Obserwacja morfologii aksonów podczas śmierci aksonu w PNS

  1. Uraz skrzydła: częściowe uszkodzenie wiązek aksonów
    1. Użyj 5 dziewiczych samic i 5 samców z odpowiedniego genotypu (Rysunek 4A, pokolenie P0) do wykonania krzyżówek w temperaturze pokojowej (RT). Przepuszczać P0 do nowych fiolek co 3-4 dni. Codziennie zbieraj świeżo zamknięte dorosłe potomstwo (pokolenie F1) i leżakuj je przez 7–14 dni.
    2. Znieczulić muchy na elektrodach CO2. Użyj mikronożyczek, aby przeciąć żyłę przedniego skrzydła mniej więcej w środku skrzydła (Rysunek 1A). Użyj jednego skrzydła do leczenia kontuzji, a drugiego skrzydła jako nieuszkodzonej kontroli dopasowanej do wieku. Zastosuj jeden uraz na skrzydło i upewnij się, że masz wystarczająco dużo uszkodzonych skrzydeł (około 15 skrzydeł).
      UWAGA: Można przeciąć całe skrzydło, ale wystarczy przeciąć tylko przednią żyłę skrzydła. Jest to najmocniejsza część skrzydła.
    3. Odzyskaj muchy w fiolkach zawierających żywność.
  2. Sekcja skrzydeł i wizualizacja aksonów
    1. Rozprowadź 10 μl oleju halowęglowego 27 za pomocą pipety wzdłuż całego szkiełka (Rysunek 1B).
    2. Odetnij rannego, a także nieuszkodzone skrzydło sterowe w pożądanych punktach czasowych (np. 1 lub 7 dni po urazie). Użyj mikronożyczek do cięcia i pęsety, aby chwycić skrzydło. Zamontuj maksymalnie 4 skrzydła w oleju halocarbon 27 (Rysunek 1B) i przykryj je szkiełkiem pokrywującym.
    3. Natychmiast zobrazuj skrzydło za pomocą mikroskopu z obracającym się dyskiem. Zdobądź serię przekrojów optycznych wzdłuż osi z krokiem 0,33 μm i skompresuj stosy z w jeden plik do późniejszych analiz.
      UWAGA: Nie chwytaj za przednią żyłę skrzydłową, w której znajdują się ciała komórkowe i aksony. Chwyć skrzydło pośrodku. Tkanka w skrzydłach nie jest utrwalona; Utrzymuj czas od zamontowania skrzydeł do ich obrazowania poniżej 8 minut.

figure-protocol-1
Ryc. 1: Obserwacja morfologii aksonów podczas obumierania aksonów w skrzydle. (A) Schematyczne skrzydło muchowe z dwoma słabo znakowanymi GFP neuronami czuciowymi, które są również oddzielnie wskazane poniżej. Wskazane jest miejsce urazu i pole obserwacji. (B) Schemat obrazowania skrzydeł. Uszkodzone i nieuszkodzone skrzydła sterowe (szare) są zamontowane w oleju halocarbon oil 27 (czerwony) na szklanym suwaku (jasnoniebieskim) i przykryte zamkiem maskującym (czarnym). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Obserwacja morfologii aksonów i synaps podczas śmierci aksonu w OUN

  1. Ablacja czułków: uszkodzenie całych wiązek aksonów
    1. Użyj 5 dziewiczych samic i 5 samców z odpowiedniego genotypu (Ryc. 5A, pokolenie P0) do wykonania krzyżówek w RT. Przepuszczaj P0 do nowych fiolek co 3-4 dni. Codziennie zbieraj świeżo zamknięte dorosłe potomstwo (pokolenie F1) i pozwól mu dojrzewać przez 7 do 14 dni.
    2. Znieczulić muchy na elektrodach CO2. Użyj pęsety, aby dokonać ablacji prawego 3. segmentuczułka w celu jednostronnej ablacji; lub zarówno lewy, jak i prawy3-ciowy segment czułka do obustronnej ablacji (Rysunek 2A-C). Spowoduje to usunięcie ciał komórek neuronalnych znakowanych GFP, podczas gdy ich wypustki aksonalne pozostaną w OUN.
      UWAGA: Ablacja czułkowa powoduje zerwanie całego pakietu aksonów. Jeśli wykonywana jest ablacja jednostronna, wiązka aksonów po stronie przeciwnej (antena bez ablacji) służy jako kontrola wewnętrzna. Upewnij się, że wykonałeś wystarczającą ilość ablacji czułków (około 15 zwierząt).
    3. Odzyskaj muchy w fiolkach zawierających żywność.
  2. Sekcja mózgu i wizualizacja aksonów
    1. Wymieszaj bazę z elastomeru silikonowego (9 ml) i utwardzacz (1 ml) w stosunku objętościowym 10:1. Przenieść każdą mieszaninę o objętości 5 ml na płytkę do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm i zredukować wprowadzane powietrze przez mieszanie z delikatnym mieszaniem w dygestorii przez noc. Mieszanina krzepnie w ciągu 24 h.
      UWAGA: Płytki sekcyjne należy przygotować tylko raz i można ich używać wielokrotnie.
    2. Znieczulenie much na elektrodach CO2 i odcięcie głów dorosłym za pomocą dwóch pęset w żądanych punktach czasowych (np. 1 lub 7 dni po ablacji czułków). Użyj jednej pęsety, aby chwycić za szyję, a drugiej pęsety, aby przymocować klatkę piersiową. Delikatnie ściągnij szyję i głowę z klatki piersiowej.
      UWAGA: Pozostaw odcięte głowy na podkładce CO2 do momentu osiągnięcia żądanej liczby, ale pamiętaj, aby przejść do następnego kroku w ciągu 30 minut.
    3. Przenieś wszystkie głowice do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml roztworu utrwalającego zawierającego 4% paraformaldehydu (PFA) i 0,1% Triton X-100 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą pęsety zanurzonej w roztworze utrwalającym.
      UWAGA: Główki muchy dobrze przylegają do mokrej pęsety. Umożliwia to łatwe przeniesienie wszystkich głowic do probówki mikrowirówkowej.
    4. Zamocuj głowice na 20 minut, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej. Umieść probówkę mikrowirówki na lodzie, głowice będą grawitować do dna probówki mikrowirówki. Usunąć supernatant za pomocą pipety i powtórzyć tę procedurę z pięcioma 2-minutowymi płukaniami 1 ml buforu płuczącego zawierającego 0,1% Triton X-100 w PBS z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej, w celu usunięcia pozostałości roztworu utrwalającego.
      UWAGA: Filmy o tym, jak przeprowadzić sekcję mózgów dorosłych Drosophila, są łatwo dostępne27.
    5. Przenieść głowice ze szklaną pipetą do płytki rozwarstwiającej wypełnionej buforem do mycia. Użyj jednej pęsety, aby chwycić i ściągnąć trąbkę z głowy, jednocześnie trzymając głowę drugą pęsetą. Pozostawi to dziurę, w której trąbka została przymocowana do egzoszkieletu.
    6. Użyj dwóch pęset, aby usunąć egzoszkielet między otworem a każdym okiem złożonym. Umożliwi to otwarcie struktury głowy za pomocą obu pęsety i delikatne wydrapanie mózgu w środku.
    7. Oczyść każdy mózg, usuwając przyklejoną do niego tchawicę lub tłuszcz (Rysunek 2D, góra). Po oczyszczeniu mózgu umieść go w nowej probówce do mikrowirówki zawierającej 1 ml buforu do przemywania na lodzie.
      UWAGA: Uszkodzone lub utracone płaty wzrokowe nie wpłyną na płat węchowy w centrum mózgu (Rysunek 2D, góra).
    8. Zastąp bufor płuczący 1 ml roztworu utrwalającego, gdy wszystkie mózgi zostaną zebrane i zgromadzone na dnie probówki do mikrowirówki. Napraw mózgi przez 10 minut z kołysaniem w RT, a następnie pięć 2-minutowych myć w 1 ml buforu do mycia z kołysaniem w RT.
    9. Zastosować przeciwciała pierwszorzędowe (1:500) w buforze do przemywania przez noc z kołysaniem w temperaturze 4 °C, a następnie 10 płukań przez 2 godziny przy użyciu 1 ml buforu do przemywania z kołysaniem w temperaturze pokojowej.
    10. Zastosować przeciwciała drugorzędowe (1:500) w buforze płuczącym 2 godziny z kołysaniem w temperaturze pokojowej i owinąć probówkę mikrowirówki folią aluminiową, aby zablokować światło. Probówkę do mikrowirówki należy przykryć folią aluminiową do końca zabiegu. Stosować dziesięć płukań z 1 ml buforu do przemywania przez 2 godziny z kołysaniem w temperaturze pokojowej.
    11. Usunąć supernatant i użyć pojedynczej kropli odczynnika zapobiegającego blaknięciu, aby pokryć mózgi w probówce do mikrowirówki. Inkubować mózgi przez co najmniej 30 minut w temperaturze 4 °C przed przygotowaniem ich do montażu i obrazowania.
    12. Przygotuj szkiełko z okładką, przyklej do niego taśmę laboratoryjną i wytnij z taśmy kształt przypominający literę "T" (Rysunek 2D, na dole). Powstała w ten sposób przestrzeń służy jako obszar, do którego zostanie wciśnięty odczynnik zapobiegający blaknięciu zawierający mózg 28, najlepiej do obu komór.
      UWAGA: Użyj końcówki do pipety o pojemności 20-200 μl w miejscu, w którym odcięto 3 mm końcówki, aby poszerzyć otwór pipety. Umożliwi to pipetowanie odczynnika zapobiegającego blaknięciu zawierającego mózg. Ostrożnie przykryj mózgi szkiełkiem nakrywkowym.
    13. Użyj gliny, aby przygotować dwie małe równe bułki. Upewnij się, że gliniane rolki nie są wyższe niż wysokość szklanego zjeżdżalni. Przyklej gliniane bułki do szkiełka (Rysunek 2D, na dole). Umieść kanapkę ze szkiełkiem podstawowym zawierającą mózg na glinianych bułkach.
      UWAGA: Aksony znakowane GFP i ich synapsy znajdują się z przodu mózgu. Łatwiej jest więc wyobrazić sobie je od frontu. Jednak mózgi będą albo skierowane do góry, albo twarzą w dół na kanapce ze slajdem na okładce. Gliniane bułki służą jako uchwyty na kanapki, a podczas obrazowania kanapkę można odwrócić do góry nogami. Umożliwi to pozyskiwanie obrazów z przodu z każdego mózgu.
    14. Za pomocą mikroskopu konfokalnego należy uzyskać serię przekrojów optycznych wzdłuż osi Z z krokiem co 1,0 μm i skompresować stosy z w jeden plik do kolejnych analiz, aby ocenić liczbę nienaruszonych projekcji aksonalnych.

figure-protocol-2
Rycina 2: Obserwacja morfologii aksonów i synaps podczas śmierci aksonu w mózgu. (A) Widok z boku schematycznej głowicy muchy z ciałami komórek, aksonami i synapsami oznaczonymi GFP. (B) Widok z przodu w dużym powiększeniu neuronów receptorów węchowych znakowanych GPF oraz ich aksonów i synaps. Ciała komórkowe znajdują się w 3.segmencie anteny, a ich aksony wystają do OUN. Aksony tworzą synapsy w kłębuszku nerkowym w lewym płacie węchowym, przekraczają linię środkową i tworzą synapsy w kłębuszkach nerkowych na przeciwległym płacie węchowym. (C) Przykłady głowic muchowych z jednostronną ablacją czułkową. Góra: Nieuszkodzona kontrola. Środek: Ablacja 3. segmentuanteny. Dół: Ablacja2 (a więc i 3 odcinka anteny). (D) Przygotowanie mózgu. U góry: Schematycznie wypreparowany mózg muchy ze zaznaczonymi płatami węchowymi i projekcjami aksonalnymi w polu widzenia. U dołu: Schemat do obrazowania mózgu. Dwie gliniane bułki (zielone) są zamontowane na szklanym szkiełku (jasnoniebieskim), trzymają kanapkę ze szkiełkiem nakrywkowym, która zawiera mózgi much (szare). Mózgi są zamontowane w odczynniku zapobiegającym blaknięciu (fioletowy), otoczone taśmą laboratoryjną (pomarańczowa) i przykryte dwoma slajdami okładkowymi (czarnymi). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Pielęgnacja wywołana przez optogenetykę jako odczyt funkcji aksonów i synaps

  1. Konfiguracja optogenetyczna
    1. Eksperyment optogenetyczny przeprowadź w ciemnym pomieszczeniu. Upewnij się, że konfiguracja składa się z reflektora LED na podczerwień (IR) o długości fali 850 nm do oświetlania much w ciemności (Rysunek 3A), czerwonego reflektora LED 660 nm do aktywacji neuronów wyrażających CsChrimson oraz monochromatycznej kamery z filtrem długoprzepustowym 700 nm, który zapobiega nagrywaniu błysków czerwonego światła.
    2. Użyj drukarki 3D, aby wygenerować malutką okrągłą komorę behawioralną o średnicy 1 cm, przykryj ją szkiełkiem pokrywy i umieść emiter 860 nm sprzężony z czerwonym reflektorem LED obok komory (Rysunek 3B).
      UWAGA: Emiter wskazuje, kiedy czerwony reflektor LED jest włączony, aktywując w ten sposób neurony.
    3. Zamontuj reflektory LED i kamerę na górze komory (Rysunek 3A, C).
    4. Aktywuj neurony za pomocą błysków 10 Hz w ciągu 10 s. Czas trwania aktywacji można dostosować zgodnie z projektem eksperymentalnym.
  2. Przygotowanie much do optogenetyki
    1. Rozpuść jedzenie na muchy w kuchence mikrofalowej. Po ostygnięciu żywności, przed zestaleniem, dodać 1:100 z 20 mM całego trans-retinalu w etanolu (EtOH) do końcowego stężenia 200 μM. Dobrze wymieszać i natychmiast wlać pokarm do pustych fiolek.
      UWAGA: Unikaj dodawania całego trans-retinalu do gorącego jedzenia, może to spowodować mniej wydajną optogenetykę.
    2. Przykryj fiolki zawierające zestaloną żywność zatyczkami lub wacikami. Owinąć fiolki folią aluminiową. Następnie należy przechowywać fiolki zawierające żywność w ciemnym, chłodnym pomieszczeniu.
    3. Użyj 5 dziewiczych samic i 5 samców (Ryc. 6A, pokolenie P0) z odpowiedniego genotypu do wykonywania krzyżówek w RT. Przepuszczaj P0 do nowych fiolek co 3-4 dni. Zbieraj codziennie świeżo zamknięte dorosłe potomstwo (pokolenie F1) i pozwól mu dojrzewać przez 7 do 14 dni w pokrytych aluminium fiolkach zawierających 200 μM wszystkich trans-retinalu w pokarmie dla much.
    4. Zbieraj muchy, stukając nimi z fiolek zawierających żywność do pustej fiolki bez jedzenia. Schłodzić fiolkę w wodzie zawierającej lód przez około 30 sekund. Muchy zasną. Umieść szybko pojedyncze muchy w małych komorach pokrytych szkiełkiem pokrywowym (Rysunek 3B).
      UWAGA: Gdy tylko muchy się rozgrzeją, budzą się. Kluczowe jest szybkie rozłożenie pojedynczych much w pojedynczych komorach każda. Unikaj elektrod CO2 do znieczulania much, wpłynie to na ich zachowanie.
    5. Wykonuj optogenetykę, aby wywołać pielęgnację czułków. W tym przypadku protokół składa się z następujących interwałów: 30 s, gdy czerwone światło jest nieobecne, a następnie 10 s ekspozycji na czerwone światło przy 10 Hz. Powtórz tę procedurę w sumie trzy razy, a następnie dodatkowe 30 sekund, w których czerwone światło jest nieobecne12,29,30.
      UWAGA: Ten protokół można dostosować zgodnie z preferencjami eksperymentalnymi.
    6. Zbieraj pojedyncze muchy z każdej komory na podkładkach CO2. Narazić je na uszkodzenie czułka. Przeprowadź ablację zarówno lewego, jak i prawego 2. segmentu anteny (Rysunek 2C). Spowoduje to usunięcie ciał komórkowych neuronów narządu Johnstona (JO), podczas gdy wypustki aksonalne pozostaną w OUN. Odzyskaj muchy w pokrytych aluminium fiolkach zawierających 200 μM, wszystkie trans-retinal.
      UWAGA: W przypadku pielęgnacji czułków indukowanej przez optogenetykę, ciała komórek neuronów czuciowych są umieszczone w drugim segmencie anteny (Rysunek 2C).
    7. W odpowiednich punktach czasowych (np. 7 dni po ablacji czułków) badany poddaje się kolejnemu testowi pielęgnacyjnemu (wróć do kroku 3.2.4).

figure-protocol-3
Rycina 3: Konfiguracja optogenetyczna do indukowania pielęgnacji jako odczyt funkcji aksonów i synaps. (A) Ilustracja zmontowanych komponentów wymaganych w optogenetyce. Reflektor LED na podczerwień (IR), kamera i czerwony reflektor LED (odpowiednio od lewej do prawej). Komponenty wraz ze szczegółowym opisem są wymienione w Tabeli materiałów. (B) Widok z góry ilustracja komory behawioralnej wraz z emiterem podczerwieni wskazującym aktywację czerwonego reflektora LED. (C) Ilustracja konfiguracji z pojedynczym mocowaniem. Dla dwóch reflektorów LED i kamery wymagane są w sumie trzy konfiguracje mocowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powyżej opisaliśmy trzy metody badania morfologii i funkcji odciętych aksonów i ich synaps. Pierwsza metoda pozwala na wysokorozdzielczą obserwację pojedynczych aksonów w PNS. Wymaga klonów wygenerowanych techniką MARCM14,31. W tym przypadku przeprowadziliśmy krzyżówki, aby wygenerować klony MARCM typu dzikiego i zmutowanego (Rysunek 4A). Proste przecięcie w środku skrzydła wywołuje uszkodzenie aksonów neuronów znajdujących się dystalnie (np. po zewnętrznej stronie skrzydła), podczas gdy neurony proksymalne (np. między miejscem cięcia a klatką piersiową) pozostają nieuszkodzone. Takie podejście umożliwia obserwację śmierci aksonów obok nieuszkodzonych aksonów kontrolnych w tym samym pęczku nerwowym (Rysunek 1A, Figura 4B). W tym przypadku użyliśmy tła genetycznego, co skutkowało małą liczbą klonów znakowanych GFP (np. po dwa w każdym eksperymencie14). Przedstawiamy przykłady 1 i 7 dni po uszkodzeniu aksonów typu dzikiego, aby podać przykłady aksonów kontrolnych, aksonów ulegających śmierci aksonów i fragmentów aksonów usuwanych odpowiednio przez otaczający glej. Ponadto powtórzyliśmy uszkodzenie aksonów u mutantów wysokodrutowych, gdzie przeanalizowaliśmy wynik 7 dni po urazie.

Nieuszkodzone skrzydła kontrolne skrywają dwa klony typu dzikiego, a więc dwa aksony typu dzikiego oznaczone symbolem GFP (Rysunek 4B, typ dziki, nieuszkodzona kontrola). Jeden dzień po przecięciu środka skrzydła za pomocą mikronożyczek, śmierć aksonów jest indukowana w aksonach znakowanych GFP, gdzie ciała komórkowe są dystalne do miejsca cięcia, podczas gdy aksony z proksymalnie umieszczonych ciał komórkowych służą jako wewnętrzna kontrola w tym samym pęczku nerwowym (Ryc. 4B, typ dziki, 1 dzień po urazie). Zwróć uwagę na ślad szczątków aksonalnych w górnej części wskazany strzałką. 7 dni po uszkodzeniu aksonalnym, szczątki aksonów znakowane GFP są usuwane przez otaczający glej, podczas gdy nieuszkodzone aksony kontrolne oznaczone GFP pozostają w wiązce nerwowej (Rysunek 4B, typ dziki, 7 dni po urazie, strzałka). W przeciwieństwie do tego, zmutowane aksony wysokodrutowe, które zostały odcięte przez 7 dni, pozostają morfologicznie zachowane, zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami11,14 (Rysunek 4B, highwire, 7 dni po urazie, strzałka). Wyniki te pokazują potężną rozdzielczość wizualną skrzydła Drosophila. Śmierć aksonów można zaobserwować obok nieuszkodzonych osób kontrolnych w tym samym pęczku nerwowym. Podczas gdy aksony typu dzikiego ulegają śmierci aksonów w ciągu 1 dnia po urazie, a powstałe szczątki są usuwane w ciągu 7 dni, mutanty wysokodrutowe z niedoborem śmierci aksonów pozostają morfologicznie zachowane przez 7 dni.

figure-results-1
Ryc. 4: Podejście do badania śmierci aksonów neuronów czuciowych znakowanych GFP w skrzydle. (A) Schematyczne krzyżowanie się w celu wygenerowania klonów typu dzikiego i wysokiego drutu w skrzydle (odpowiednio generacja P0 i F1). Dziewicze samice są po lewej stronie, mężczyźni po prawej. Szczegółowe informacje na temat genotypu można znaleźć w Tabeli Materiałów. (B) Przykłady aksonów kontrolnych i uszkodzonych znakowanych GFP. Pole widzenia jest wskazane na (Rysunek 1A). Od lewej do prawej: odpowiednio nieuszkodzone aksony kontrolne typu dzikiego, aksony typu dzikiego 1 dzień po urazie, aksony typu dzikiego 7 dni po urazie, aksony zmutowane 7 dni po urazie. Strzałki wskazują odcięte aksony, Pasek skali = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Druga metoda opisuje, jak wizualizować całe wiązki aksonów wystające do OUN, gdzie tworzą synapsy, które należą do neuronów umieszczonych zarówno w lewej, jak i prawej czułce (Rysunek 2A-C). Tutaj przeprowadziliśmy krzyżówki w celu wygenerowania klonów MARCM typu dzikiego i zmutowanego (Rysunek 5A). Nieuszkodzone, znakowane GFP aksony i ich synapsy mogą być wizualizowane w ciągu kilku dni lub tygodni, przy braku urazu (Rysunek 5B, typ dziki, nieuszkodzona kontrola). Alternatywnie, zwierzęta można poddać ablacji 3. segmentuanteny, a odcięte aksony znakowane GFP i ich synapsy można obserwować w ciągu czasu przez godziny lub dni. Skupiliśmy się na 7 dniach po ablacji czułków, ponieważ w tym momencie aksony i ich synapsy uległy śmierci aksonów, a powstałe szczątki są usuwane przez otaczający glej. Jeśli zostanie wykonana jednostronna ablacja prawej anteny, to prawa wiązka aksonów zostanie odcięta i zostanie zdemontowana, a powstałe szczątki zostaną w pełni usunięte 7 dni po urazie (Rysunek 5B, typ dziki, jednostronna ablacja, 7 dni po urazie, strzałki), zgodnie z poprzednimi ustaleniami13. Alternatywnie, zarówno prawa, jak i lewa czułka mogą zostać poddane ablacji, co spowoduje przecięcie obu wiązek aksonów, a 7 dni po urazie aksony i ich synapsy zniknęły (Ryc. 5B, typ dziki, obustronna ablacja, 7 dni po urazie, strzałka). W przeciwieństwie do tego, jednostronna ablacja prawych czułków u mutantów wysokodrutowych powoduje odcięcie aksonów, które pozostają zachowane 7 dni po urazie, zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami11,14 (Rysunek 5B, wysoki drut, jednostronna ablacja, 7 dni po urazie, strzałka). Wyniki te pokazują, że odcięte aksony typu dzikiego ulegają śmierci aksonów, a powstałe szczątki są usuwane w ciągu 7 dni, podczas gdy mutanty z niedoborem śmierci aksonów nie przechodzą śmierci aksonów i pozostają morfologicznie zachowane przez 7 dni.

figure-results-2
Rycina 5: Podejście do badania śmierci aksonów neuronów czuciowych znakowanych GFP w mózgu. (A) Schematyczne krzyżowanie się w celu wygenerowania klonów typu dzikiego i wysokoprzewodowego w mózgu (odpowiednio generacja P0 i F1). Dziewicze samice są po lewej stronie, mężczyźni po prawej. Szczegółowe informacje na temat genotypu można znaleźć w Tabeli Materiałów. (B) Przykłady aksonów kontrolnych i uszkodzonych znakowanych GFP. Od lewej do prawej: odpowiednio nieuszkodzone grupy kontrolne typu dzikiego, typ dziki 7 dni po jednostronnej ablacji czułków, typ dziki 7 dni po obustronnej ablacji czułków i mutanty wysokodrutowe 7 dni po jednostronnej ablacji czułków. Strzałki wskazują odcięte wiązki aksonów, pasek skali = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Trzecia metoda pozwala na obserwację funkcjonalnego zachowania odciętych aksonów i ich synaps w OUN. Opiera się na manipulacji podzbiorem neuronów JO znajdujących się w 2.segmencie antenowym, które są wystarczające do wywołania pielęgnacji czułków. Ekspresja przesuniętej ku czerwieni rodopsyny kanałowej (CsChrimson) w neuronach JO, w połączeniu z suplementacją diety wszystkich trans-retinal, jest wystarczająca do wywołania prostego postsynaptycznego zachowania pielęgnacyjnego po ekspozycji na czerwone światło12,30. Tutaj przeprowadziliśmy krzyżówki, aby wygenerować neurony JO typu dzikiego i neurony JO z nadekspresją dnmnat (dnmnatOE) (Rysunek 6A). Muchy typu dzikiego lub muchy zawierające neurony JO z osłabioną śmiercią aksonów (dnmnatOE), obie mają silne zachowanie pielęgnacyjne przed urazem. Jednak 7 dni po urazie (np. obustronna ablacja 2. segmentu czułka), pielęgnacja nie jest wywoływana przez optogenetykę u much dzikich z powodu wywołanego urazem zwyrodnienia aksonów i synaps, podczas gdy zwierzęta z osłabioną śmiercią aksonu kontynuują pielęgnację (Ryc. 6 B, Film 1,2). Osłabiona śmierć aksonów jest zatem w stanie funkcjonalnie zachować odcięte aksony i ich synapsy przez 7 dni.

figure-results-3
Rycina 6: Podejście do wizualizacji funkcji aksonalnej i synaptycznej po aksotomii. (A) Schematyczne krzyżówki w celu wygenerowania neuronów czuciowych JO z nadekspresją typu dzikiego i dnmnat (odpowiednio generacja P0 i F1). Dziewicze samice są po lewej stronie, mężczyźni po prawej. Szczegółowe informacje na temat genotypu można znaleźć w Tabeli Materiałów. (B) Indywidualne etogramy zachowań pielęgnacyjnych indukowanych przez optogenetykę. U góry: indywidualne etogramy much typu dzikiego przed i 7 dni po urazie (niebieskie). U dołu: indywidualne etogramy muszek z nadekspresją dnmnat (dnmnatOE) w neuronach JO przed i 7 dni po urazie (czerwony). Każdy pojemnik wskazuje na co najmniej 1 zachowanie pielęgnacyjne w ciągu 1 s. linia wskazuje sumę wszystkich pojemników. (C) Kwantyfikacja zachowań związanych z uwodzeniem. Dane są przedstawiane jako średnia ± odchyleniu standardowym, p > 0,001 (jednoczynnikowa ANOVA, wielokrotne porównanie z testem post hoc Tukeya). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Film 1: Reprezentatywne zachowanie pielęgnacyjne typu dzikiego wywołane przez optogenetykę przed i 7 dni po ablacji czułków. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 2: Reprezentatywne zachowanie pielęgnacyjne wywołane przez optogenetykę u muszek z nadekspresją dnmnat w neuronach JO przed i 7 dni po ablacji czułków. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj protokoły pozwalają na solidną i powtarzalną obserwację morfologii, a także funkcji aksonów i ich synaps oddzielonych od ich ciał komórkowych u Drosophila. Test skrzydeł ułatwia obserwację obumarcia aksonów obok nieuszkodzonych aksonów kontrolnych w PNS14, podczas gdy test antenowy ułatwia obserwację całych wiązek nerwowych aksonów znakowanych GFP i ich synaps, w celu oceny zarówno morfologii, jak i funkcji mózgu (OUN)12. Istnieją krytyczne kroki i pewne zalety dla każdego podejścia do badania morfologii, które należy wziąć pod uwagę podczas projektowania eksperymentów.

Aby zaobserwować morfologię aksonów w PNS w skrzydle, można łatwo przeprowadzić eksperymenty ze względu na przezroczystość skrzydła: pozwala to ominąć sekcję i immunohistochemię. Jednak ze względu na brak mocowania, skrzydła muszą być obrazowane natychmiast po zamontowaniu14. Obecnie często używane są dwa różne sterowniki Gal4, ok371Gal4 lub dpr1Gal4, a oba odniesienia oferują różne podejścia do ilościowego określania zwyrodnienia14,26. Zaleca się rzadkie znakowanie kilku neuronów za pomocą "Analizy mozaikowej z represyjnym markerem komórkowym (MARCM)"14,31, ponieważ rozdzielczość morfologii aksonów jest bezprecedensowa. Natomiast obserwacja synaps nie jest możliwa w skrzydłach, znajdują się one w brzusznym rdzeniu nerwowym wewnątrz klatki piersiowej much. Co więcej, dodatkowe markery aksonalne nie mogą być uwidocznione za pomocą immunohistochemii: woskowaty naskórek uniemożliwia dyfuzję utrwalaczy i przeciwciał do leżącej poniżej tkanki.

Aby zaobserwować morfologię aksonów i synaps w OUN, należy przeprowadzić sekcje mózgu. Mają one tę zaletę, że za pomocą immunohistochemii można zaobserwować dodatkowe markery aksonalne i synaptyczne, a synapsy można obserwować wraz z aksonami w tym samym polu widzenia10,13. Duży zbiór scharakteryzowanych sterowników receptora węchowego (ORN) Gal4 jest łatwo dostępny32, a często OR22aGal4 jest sterownikiem z wyboru. W przypadku ablacji czułków ciała komórkowe neuronów OR22a znajdują się w 3. segmencie (ryc. 2B). Kwantyfikacja oparta na intensywności fluorescencji służy do ilościowego określenia zwyrodnienia aksonów lub synaps13. I odwrotnie, eksperymenty są czasochłonne ze względu na sekcję mózgu i barwienie przeciwciał.

Aby uwidocznić funkcję aksonalną i synaptyczną po aksotomii, optogenetyka służy do wyzwalania pielęgnacji czułków: służy jako odczyt do funkcjonalnego zachowania odciętych aksonów i ich synaps12. Obwód pielęgnacyjny i odpowiadające mu sterowniki czuciowe, między- i ruchowe Gal4 zostały dokładnie opisane29,30. GMR60E02Gal4 znakuje podzbiór neuronów czuciowych narządu Johnstona (JO), które są wymagane i wystarczające do pielęgnacji29,30. W przypadku ablacji czułków ciała komórkowe neuronów JO znajdują się w drugimsegmencie anteny (ryc. 2B). Konfigurację optogenetyczną można łatwo zbudować od podstaw lub dostosować istniejącą konfigurację. Co ważne, eksperymenty muszą być przeprowadzane w ciemnym pomieszczeniu, a muchy są w ten sposób wizualizowane za pomocą reflektora LED w podczerwieni (IR). Podczas korzystania z CsChrimson jako kanału, ważne jest, aby dostarczyć pokarmowi wszystkie trans-retinale i czerwony reflektor LED, aby aktywować neurony JO29. Alternatywnie, do aktywacji neuronów można wykorzystać kanały wrażliwe na niebieskie światło i niebieski reflektor LED lub kanał TrpA1 i temperaturę29,33. Kwantyfikacja zachowań związanych z uwodzeniem została już opisana12,29.

Kiedy testy te są wykorzystywane do specyficznego badania śmierci aksonów, ważne jest, aby pamiętać, że fenotyp zachowania morfologicznego lub funkcjonalnego powinien być solidny w czasie. Istnieją przypadki, w których śmierć aksonów prowadzi do spójnego, ale mniej wyraźnego fenotypu w zachowaniu morfologicznym34,35, a to, czy taki fenotyp przekłada się na zachowanie funkcjonalne, pozostaje do ustalenia.

Fenotypy śmierci aksonów zaobserwowano również w neuronach podczas rozwoju larw Drosophila, gdzie nerwy były raczej zmiażdżone niż uszkodzone11,23. W tym przypadku skupiliśmy się na dorosłych neuronach Drosophila, które zakończyły rozwój. W tym kontekście można łatwo zastosować interferencję RNA36 lub specyficzny tkankowo CRISPR/Cas937. Co ważne, powyższe techniki mogą być stosowane w kontekście niezależnym od śmierci aksonów: ułatwiają charakterystykę czynników utrzymania neuronów38, transportu aksonalnego39, zależnych od wieku zmian mitochondriów aksonalnych40 oraz morfologii mitochondriów aksonalnych41.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować całemu laboratorium Neukomm za wkład. Prace te były wspierane przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (SNSF) Nagrodę Adiunkta (grant 176855), Międzynarodową Fundację Badań nad Paraplegią (IRP, grant P180), SNSF Spark (grant 190919) oraz przez wsparcie Uniwersytetu w Lozannie i Wydziału Neuronauk Podstawowych (État de Vaud) dla LJN.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Pęseta (wysoka precyzja, bardzo cienka)EMS78520-5do ablacji antenowej
(krawędź tnąca 5 mm)EMS72933-04Uraz skrzydła
Probówka mikrowirówkowa 1,5 mlEppendorf30120086.0000
Naczynie do hodowli tkankowych 35 mmSarstedt83.3900
Szkiełka nakrywkowe, grubość 1Thermo Scientific& handel;
Szkiełka mikroskopowe SuperfrostThermo Scientific™
Kamera CMOS USB 2.0 o wysokiej czułości, 1280 x 1024, globalna migawkaThorlabsDCC1240MKonfiguracja kamery
Pierścień ustalający SM1 dla Ø Tubusy i mocowania obiektywów 1"ThorlabsSM1RR
25mm 1/1.2" Obiektyw z mocowaniem CAdapter TamronM112FM25
z zewnętrznymi gwintami M27 x 0,5 i wewnętrznymi gwintami SM1ThorlabsSM1A36
Asferyczny obiektyw kondensacyjny i Oslash; 25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nmThorlabsACL2520U-B
Ø Filtr długoprzepustowy Premium 25,0 mm, długość fali odcięcia: 700 nmThorlabsFELH0700
SM1 (1.035"-40), gwint zewnętrzny, 0.5" długitubus obiektywu ThorlabsSM1T2
SM1 bez gwintów zewnętrznych, długość 1", dwa pierścienie ustalające w zestawieThorlabsSM1M10
850 nm, 900 mW (min) Zamontowana dioda LED, 1200 mAReflektor LEDThorlabsM850L3
Łącznik SM1 (1.035"-40), Gwint zewnętrzny, 0.5" Długość Tubusobiektywu ThorlabsSM1T2
SM1 bez gwintów zewnętrznych, 2" długości, dwa pierścienie ustalające w zestawie Soczewkaasferycznego ThorlabsSM1M20
Oslash; 25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nmThorlabsACL2520U-B
Ø Filtr długoprzepustowy Premium 25,0 mm, Cut-On Długość fali: 850 nmThorlabsFELH0850
Pierścień ustalający SM1 do Ø Tubusy i mocowania soczewek 1"ThorlabsSM1RR
660 nm, 940 mW (min) Zamontowana dioda LED, 1200 mAThorlabsM660L4Czerwony reflektor LED
Asferyczna soczewka kondensatora i Oslash; 25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nmThorlabsACL2520U-B
SM1 (1.035"-40) Łącznik, gwint zewnętrzny, 0.5" LongThorlabsSM1T2
SM1 Tubus obiektywu bez gwintu zewnętrznego, 2" długości, dwa pierścienie ustalające w zestawieThorlabsSM1M20
15 V, 2.4 A Zasilacz ze złączem Jack 3.5 mm do jednego K- lub T-CubeThorlabsKPS101LED sterownik
LED T-Cube, 1200 mA Max Drive PrądThorlabsLEDD1B
150 mm x 300 mm x 12,7 mm Aluminiowa płyta stykowa, Krany M6 o podwójnej gęstościThorlabsMB1530/MPodstawa montażowa
Ø 12,7 mm Uniwersalny uchwyt na słupek, sprężynowa śruba skrzydełkowa blokująca, L = 75 mmThorlabsUPH75/MMocowanie, 3x (IR LED, czerwona dioda LED, krzywka)
i Oslash; Pierścień ślizgowy 1,20" do tubusów obiektywów SM1 i tulei przedłużających C-Mount,ThorlabsSM1RC/M
Ø Słupek optyczny 12,7 mm, SS, śruba dociskowa M4, gwintownik M6, L = 150 mmThorlabsTR150/M
Ø Słupek optyczny 12,7 mm, SS, śruba dociskowa M4, gwintownik M6, L = 40 mmThorlabsTR40/M
do Ø Słupki 1/2", 5 mm sześciokątneśrubaRA90/M
M6 x 1,0 ze stali nierdzewnej, długość 16 mm, zestaw 25ThorlabsSH6MS16do montażu na podstawie
USB-6001 14-bitowy 20 kS/s Wielofunkcyjne I/O i NI-DAQmxNational Instruments782604-01Czerwony sterownik reflektora LED
20k Ohm 1 Gang Liniowy potencjometr do montażu na paneluTT Electronics/BIP230-2EC22BR20Kfintuner do wskaźnika
Emiter IR (860nm), 100 mA promieniowyOsram475-1365-NDwskaźnika czerwonego światła
-Misc
All-trans retinalSigmaR2625
Absolutny etanolVwr20821.296
Olej halowęglowy 27SigmaH8773
MowiolMerk81381
ParaformaldehydSigmaF8775
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)SigmaP5493
Sylgard 184 baza elastomeru silikonowegoDow Corning Corp4019862
Sylgard 184 utwardzacz z elastomeru silikonowegoDow Corning Corp4019862
Triton X-100SigmaT8787
Przeciwciała anty-GFP kurczakaRockland600-901-215Przeciwciała
Goat Dylight anty-ChickenAbcamab96947
FM7a, BBDSCRRID:chromosom X
FRT19A[hs-neo]BDSCRRID:BDSC_1709
hiw[Δ N]BDSCRRID:BDSC_51637
hs-FLP[12]BDSCRRID:BDSC_1929
tuba-Gal80[LL1]BDSCRRID:BDSC_5132
w[1118]BDSCRRID:BDSC_3605
20xUAS-IVS-CsChrimson::mVenusBDSCRRID:BDSC_551352. chromosom
5xUAS-Gal4[12B]KiotoRRID:Kyoto_108492
5xUAS-HA::d nmnatBDSCRRID:BDSC_39702
5xUAS-mCD8::GFP[LL5]BDSCRRID:BDSC_5134
ase-FLP[2d]Freeman laboratoryNeukomm et al., 2014 (PNAS)
CyOBDSCRRID:
dpr1-Gal4BDSCRRID:BDSC_25083
OR22a-Gal4BDSCRRID:BDSC_9952
ey-FLP[6]BDSCRRID:BDSC_55773. chromosom
GMR60E02-Gal4BDSCRRID:BDSC_39250
TM3,Sb,eBDSCRRID:BDSC_3644
Nożyczki MicroPoint BB02400600A113MNT0AA00008032E00MNT10 Łącznik IR kondensatora & M4 Tap Zacisk kątowy ze sześciokątnym BDSC_785BDSC_2555

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Matsuda, W., et al. Single Nigrostriatal Dopaminergic Neurons Form Widely Spread and Highly Dense Axonal Arborizations in the Neostriatum. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).
  2. Wedel, M. J. A Monument of Inefficiency: The Presumed Course of the Recurrent Laryngeal Nerve in Sauropod Dinosaurs. Acta Palaeontologica Polonica. 57 (2), 251-256 (2012).
  3. Mariano, V., Domínguez-Iturza, N., Neukomm, L. J., Bagni, C. Maintenance mechanisms of circuit-integrated axons. Current Opinion in Neurobiology. 53, 162-173 (2018).
  4. Conforti, L., Gilley, J., Coleman, M. P. Wallerian degeneration: an emerging axon death pathway linking injury and disease. Nature reviews Neuroscience. 15 (6), 394-409 (2014).
  5. Neukomm, L. J., Freeman, M. R. Diverse cellular and molecular modes of axon degeneration. Trends in Cell Biology. 24 (9), 515-523 (2014).
  6. Gustavsson, A., et al. Cost of disorders of the brain in Europe 2010. European Neuropsychopharmacology: The Journal of the European College of Neuropsychopharmacology. 21 (10), 718-779 (2011).
  7. Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 (1850).
  8. Rosell, A. L., Neukomm, L. J. Axon death signalling in Wallerian degeneration among species and in disease. Open Biology. 9 (8), 190118(2019).
  9. Mack, T. G., et al. Wallerian degeneration of injured axons and synapses is delayed by a Ube4b/Nmnat chimeric gene. Nature Neuroscience. 4 (12), 1199-1206 (2001).
  10. Osterloh, J. M., et al. dSarm/Sarm1 is required for activation of an injury-induced axon death pathway. Science. 337 (6093), New York, NY. 481-484 (2012).
  11. Xiong, X., et al. The highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of nmnat protein. PLoS Biology. 10 (12), 1001440(2012).
  12. Neukomm, L. J., et al. Axon Death Pathways Converge on Axundead to Promote Functional and Structural Axon Disassembly. Neuron. 95 (1), 78-91 (2017).
  13. MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50 (6), 869-881 (2006).
  14. Neukomm, L. J., Burdett, T. C., Gonzalez, M. A., Zuchner, S., Freeman, M. R. Rapid in vivo forward genetic approach for identifying axon death genes in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (27), 9965-9970 (2014).
  15. Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nature Communications. 8, 14355(2017).
  16. Lunn, E. R., Perry, V. H., Brown, M. C., Rosen, H., Gordon, S. Absence of Wallerian Degeneration does not Hinder Regeneration in Peripheral Nerve. The European Journal of Neuroscience. 1 (1), 27-33 (1989).
  17. Adalbert, R., et al. A rat model of slow Wallerian degeneration (Wld(S)) with improved preservation of neuromuscular synapses. The European Journal of Neuroscience. 21 (1), 271-277 (2005).
  18. Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning. Development. 137 (23), Cambridge, England. 3985-3994 (2010).
  19. Feng, Y., et al. Overexpression of Wld(S) or Nmnat2 in Mauthner Cells by Single-Cell Electroporation Delays Axon Degeneration in Live Zebrafish. Journal of Neuroscience Research. 88 (15), 3319-3327 (2010).
  20. Gilley, J., Coleman, M. P. Endogenous Nmnat2 is an essential survival factor for maintenance of healthy axons. PLoS Biology. 8 (1), 1000300(2010).
  21. Babetto, E., Beirowski, B., Russler, E. V., Milbrandt, J., DiAntonio, A. The Phr1 ubiquitin ligase promotes injury-induced axon self-destruction. Cell Reports. 3 (5), 1422-1429 (2013).
  22. Gerdts, J., Summers, D. W., Sasaki, Y., DiAntonio, A., Milbrandt, J. Sarm1-mediated axon degeneration requires both SAM and TIR interactions. The Journal of Neuroscience. 33 (33), 13569-13580 (2013).
  23. Gerdts, J., Brace, E. J., Sasaki, Y., DiAntonio, A., Milbrandt, J. SARM1 activation triggers axon degeneration locally via NAD+ destruction. Science. 348 (6233), New York, NY. 453-457 (2015).
  24. Bridge, P. M., et al. Nerve crush injuries--a model for axonotmesis. Experimental Neurology. 127 (2), 284-290 (1994).
  25. Maxwell, W. L., Bartlett, E., Morgan, H. Wallerian Degeneration in the Optic Nerve Stretch-Injury Model of Traumatic Brain Injury: A Stereological Analysis. Journal of Neurotrauma. 32 (11), 780-790 (2015).
  26. Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Current Biology. 22 (7), 590-595 (2012).
  27. Janelia Farm Adult Drosophila Brain Dissection. , Available from: https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols (2015).
  28. Cold Spring Harbor. Mowiol mounting medium. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  29. Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. eLife. 3, 02951(2014).
  30. Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. A neural command circuit for grooming movement control. eLife. 4, 08758(2015).
  31. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  32. Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. An olfactory sensory map in the fly brain. Cell. 102 (2), 147-159 (2000).
  33. Hampel, S., McKellar, C. E., Simpson, J. H., Seeds, A. M. Simultaneous activation of parallel sensory pathways promotes a grooming sequence in Drosophila. eLife. 6, (2017).
  34. Farley, J. E., et al. Transcription factor Pebbled/RREB1 regulates injury-induced axon degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 23 (6), (2018).
  35. Wang, H., et al. Rapid depletion of ESCRT protein Vps4 underlies injury-induced autophagic impediment and Wallerian degeneration. Science Advances. 5 (2), 4971(2019).
  36. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  37. Port, F., et al. A large-scale resource for tissue-specific CRISPR mutagenesis in Drosophila. bioRxiv. 102, 636076(2019).
  38. Vagnoni, A., Hoffmann, P. C., Bullock, S. L. Reducing Lissencephaly-1 levels augments mitochondrial transport and has a protective effect in adult Drosophila neurons. Journal of Cell Science. 129 (1), 178-190 (2016).
  39. Vagnoni, A., Bullock, S. L. A cAMP/PKA/Kinesin-1 Axis Promotes the Axonal Transport of Mitochondria in Aging Drosophila Neurons. Current Biology. 28 (8), 1265-1272 (2018).
  40. Cao, X., et al. In vivo imaging reveals mitophagy independence in the maintenance of axonal mitochondria during normal aging. Aging Cell. 16 (5), 1180-1190 (2017).
  41. Smith, G. A., et al. Glutathione S-Transferase Regulates Mitochondrial Populations in Axons through Increased Glutathione Oxidation. Neuron. 103 (1), 52-65 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Axon DeathDrosophila MelanogasterAxonal MorphologySynaptic FunctionOptogeneticsWing Injury AssayAntennal AblationHighwire MutationDnmnat OverexpressionSpinning Disk Microscopy

Related Articles