Method Article

Dwa różne paradygmaty preferencji miejsca w czasie rzeczywistym wykorzystujące optogenetykę w brzusznym obszarze nakrywki myszy

DOI:

10.3791/60867

⸱

February 12th, 2020

 ,  , 
1Department of Organismal Biology, Unit of Comparative Physiology, Uppsala University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy dwa łatwe do naśladowania protokoły krok po kroku dla paradygmatów preferencji miejsca z wykorzystaniem optogenetyki u myszy. Korzystając z tych dwóch różnych konfiguracji, zachowania związane z preferencjami i unikaniem mogą być solidnie oceniane w ramach tego samego aparatu z wysoką selektywnością przestrzenną i czasową oraz w prosty sposób.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie, w jaki sposób aktywacja neuronów prowadzi do określonego wyniku behawioralnego, jest fundamentalne dla nowoczesnej neuronauki. Połączenie optogenetyki u gryzoni z testami behawioralnymi w zwalidowanych paradygmatach pozwala na pomiar konsekwencji behawioralnych po stymulacji odrębnych neuronów w czasie rzeczywistym z wysoką selektywnością przestrzenną i czasową, a tym samym ustalenie związków przyczynowych między aktywacją neuronów a zachowaniem. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół dla paradygmatu preferencji miejsca w czasie rzeczywistym (RT-PP), zmodyfikowanej wersji klasycznego testu preferencji miejsca warunkowego (CPP). RT-PP jest wykonywany w aparacie trójkomorowym i może być wykorzystany do odpowiedzi, czy stymulacja optogenetyczna określonej populacji neuronów jest satysfakcjonująca czy awersyjna. Opisujemy również alternatywną wersję protokołu RT-PP, tzw. protokół preferencji neutralnego przedziału (NCP), który może być wykorzystany do potwierdzenia awersji. Oba podejścia opierają się na rozszerzeniach klasycznej metodologii wywodzącej się z farmakologii behawioralnej i niedawnym zastosowaniu optogenetyki w dziedzinie neuronauki. Oprócz pomiaru preferencji miejsca w czasie rzeczywistym, konfiguracje te mogą również dostarczać informacji dotyczących uwarunkowanego zachowania. Udostępniamy łatwe do naśladowania protokoły krok po kroku wraz z przykładami naszych własnych danych i omawiamy ważne aspekty, które należy wziąć pod uwagę podczas stosowania tego typu eksperymentów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Implementacja optogenetyki, nowoczesnego narzędzia eksperymentalnego neurobiologii, w którym światło jest używane do kontrolowania aktywności neuronalnej, doprowadziła w ostatnich latach do znacznego postępu w zrozumieniu, jak określone populacje neuronów wpływają na zachowanie1,2,3. Wyjątkowa selektywność przestrzenna i czasowa optogenetyki pozwala na ustalenie związków przyczynowo-skutkowych między wzbudzeniem lub hamowaniem grup komórek będących przedmiotem zainteresowania a wyjściem behawioralnym2,3. Selektywność przestrzenna w optogenetyce jest powszechnie zapewniona przez system Cre-Lox, w którym aktywność rekombinazy Cre prowadzi do rekombinacji dowolnych sekwencji DNA obecnych między miejscami Lox, tzw. alleli floxed (flankowanych przez miejsca Lox)4. Celem zastosowania systemu Cre-Lox w optogenetyce jest osiągnięcie ekspresji alleli kodujących opsyny optogenetyczne w określonych neuronach będących przedmiotem zainteresowania, przy jednoczesnym pozostawieniu otaczających neuronów pozbawionych ekspresji. Opsyny to białka wrażliwe na światło, które po stymulacji światłem o określonej długości fali umożliwiają przepływ jonów, który wpływa na pobudliwość neuronalną lub wpływa na funkcje komórkowe poprzez modulację dalszych szlaków efektorowych. Nowatorskie warianty opsyn, które różnią się działaniem (pobudzające, hamujące, modulujące), mechanizmem, aktywacją przez długość fali świetlnej i właściwościami kinetycznymi5 są stale rozwijane, aby sprostać potrzebom konkretnych podejść eksperymentalnych. Jeśli chodzi o pobudliwość, użycie depolaryzującej lub hiperpolaryzującej opsyny dyktuje aktywność neuronów (odpowiednio pobudzenie lub hamowanie) po stymulacji światłem o określonej długości fali dostarczanej do mózgu3.

Selektywna aktywność promotora kieruje ekspresję rekombinazy Cre do interesujących neuronów. Implementując floksowany allel interesującej nas opsyny, rekombinacja za pośrednictwem Cre zapewni, że opsyna jest selektywnie wyrażana w neuronach, które współwyrażają rekombin3,6. To zastosowanie podwójnej transgeniki do bezpośredniej selektywności przestrzennej okazało się bardzo skuteczne w optogenetyce. Tak więc, podczas gdy stymulacja światłem w celu aktywacji opsyn jest szeroko dostarczana przez wszczepione domózgowo światłowód podłączony do źródła światła (LED lub lasera) 3, tylko neurony wyrażające zarówno rekombinazę Cre, jak i floksowany allel opsyny zareagują na tę stymulację. System Cre-Lox u gryzoni można osiągnąć na różne sposoby, używając tylko transgeników (zarówno rekombinaza Cre, jak i konstrukt opsyny floxed są kodowane u zwierząt transgenicznych), tylko zastrzyków wirusowych (konstrukty DNA dla rekombinazy Cre i floksowanej opsyny są dostarczane przez nośnik wirusa) lub kombinacji tych dwóch (na przykład rekombinaza Cre jest kodowana przez transgeniczne zwierzę, któremu wstrzykuje się wirusa przenoszącego konstrukt opsyny floxed)5. Konstrukt DNA opsyny floksowanej jest zwykle klonowany w ramce z genem reporterowym, aby umożliwić wizualizację rekombinacji za pośrednictwem Cre w skrawkach tkanki. Podczas gdy optogenetyka może być również wykonywana u szczurów, przedstawione protokoły zostały opracowane dla myszy. Dla uproszczenia myszy przenoszące zarówno rekombinazę Cre, jak i floksowaną opsynę będą określane jako "myszy optogenetyczne". W opisanych poniżej protokołach myszy optogenetyczne zostały wygenerowane przez mieszane podejście transgeniczne (rekombinaza Cre pod kontrolą dwóch różnych promotorów) i wirusowe (przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem, AAV, do dostarczenia floksowanego konstruktu DNA opsyny - w naszym przypadku ChR2 / H134R). Pozyskiwanie i utrzymywanie transgenicznych linii myszy jest istotną częścią metodologii. Myszy transgeniczne z napędem Cre i floksowaną opsyną mogą być produkowane do każdego celu lub kupowane, jeśli są dostępne na rynku, podobnie jak szereg wirusów przenoszących sekwencje DNA kodujące rekombinazę Cre i floksowane opsyny w różnych formach.

Optogenetyka w połączeniu z testami behawioralnymi okazała się cennym narzędziem do badania roli odrębnych regionów mózgu lub odrębnych populacji neuronów w poszczególnych typach zachowań. W kontekście zachowań związanych z nagrodą, optogenetyka umożliwiła weryfikację wcześniejszych odkryć w dziedzinie farmakologii behawioralnej i psychologii eksperymentalnej, a także umożliwiła nowy poziom czasowo istotnej analizy tego, jak niektóre neurony wpływają na zachowanie. Jedną z metod, która została wykorzystana w kilku badaniach do oceny zachowań związanych z nagrodą, jest zmodyfikowana wersja klasycznej metody znanej jako Warunkowa Preferencja Miejsca (CPP). Klasyczny CPP został wykorzystany do oceny nagradzających lub awersyjnych właściwości nadużywanych narkotyków poprzez ich zdolność do wywoływania skojarzeń Pawłowa ze wskazówkami otoczenia7,8. W terminologii Pawłowa, lek jest bodźcem bezwarunkowym, ponieważ może wywołać zbliżenie lub wycofanie, jeśli jest odpowiednio nagradzający lub awersyjny. Ciągłe parowanie leku z różnymi neutralnymi bodźcami, które same w sobie nie wywołują żadnej reakcji, może prowadzić do zbliżenia się lub odstawienia tylko po prezentacji wcześniej neutralnych, ale po sparowaniu, tzw. bodźców warunkowych9. Analiza CPP jest zwykle wykonywana w aparacie zawierającym dwie komory tej samej wielkości, ale gdzie każda komora jest zdefiniowana przez odrębne cechy, takie jak tekstura podłogi, wzory ścian i oświetlenie (neutralne bodźce). Oba przedziały są połączone korytarzem lub otworem między przedziałami. Podczas kondycjonowania badany, zwykle mały gryzoń, otrzymuje pasywne zastrzyki z narkotyku, gdy jest ograniczony do jednego z dwóch głównych przedziałów i soli fizjologicznej, gdy jest ograniczony do drugiego przedziału. Satysfakcjonujące efekty leku są następnie oceniane podczas sesji bez leków, kiedy badany może swobodnie eksplorować całą aparaturę. Uważa się, że ilość czasu spędzonego w wcześniej sparowanym kompartmencie (reakcja warunkowa) odzwierciedla mechanizmy uczenia się Pawłowa, w których pośredniczą między nagradzającymi efektami leku a sygnałami przedziału związanymi z jego podawaniem (bodźce warunkowe). Jeśli zwierzę spędza więcej czasu w przedziale sparowanym z lekiem, lek wywołał uwarunkowaną preferencję miejsca, co oznacza, że ma nagradzający wpływ na zachowanie. Z drugiej strony, jeśli lek jest postrzegany jako awersyjny, zwierzę będzie unikać komory sparowanej z lekiem i spędzać więcej czasu w komorze sparowanej solą fizjologiczną, co wskazuje na uwarunkowaną awersję do miejsca (CPA)8,9,10,11.

Ponieważ optogenetyka może być zaimplementowana do kontrolowania aktywności neuronalnej w "czasie rzeczywistym", użycie paradygmatu behawioralnego podobnego, ale odmiennego od konfiguracji CPP, pozwala na pomiar preferencji miejsca przy bezpośredniej aktywacji neuronów. Oparta na optogenetyce analiza preferencji miejsca jest zatem często określana jako paradygmat analizy preferencji miejsca w czasie rzeczywistym (RT-PP). W paradygmacie RT-PP optogenetyczna stymulacja odrębnych neuronów za pomocą systemu Cre-Lox zastępuje ogólnoustrojowe dostarczanie leku wykonywane w klasycznym CPP, tak że paradygmat RT-PP mierzy, czy optogenetycznie indukowana stymulacja neuronów jest postrzegana jako nagradzająca czy awersyjna. Obecny opis skupi się na myszach optogenetycznych, ale również szczury optogenetyczne mogą być testowane przy użyciu podobnych protokołów.

Zamiast warunkować do jednego przedziału na raz, jak w klasycznym paradygmacie CPP, mysz optogenetyka w paradygmacie RT-PP może swobodnie poruszać się w całym aparacie, a zachowanie jest rejestrowane przez całą sesję. Wejście do jednego z przedziałów jest połączone z wewnątrzczaszkową stymulacją światłem. Przy odpowiednich parametrach stymulacji świetlnej neurony, które wyrażają pobudzającą opsynę, zostaną w ten sposób aktywowane. Jeśli stymulacja światłem jest postrzegana jako satysfakcjonująca, mysz optogenetyczna pozostanie w przedziale sparowanym światłem, podczas gdy jeśli stymulacja światłem jest postrzegana jako awersyjna, mysz opuści przedział, aby uciec przed stymulacją. Ten rodzaj analizy pozwala na ocenę uczenia się warunkowego: badany może wywołać stymulację światłem, a tym samym aktywację neuronów, wchodząc do przedziału, i zatrzymać stymulację, wychodząc z przedziału, podobnie jak w przypadku naciskania dźwigni podczas zadania instrumentalnego. Co więcej, mechanizmy uczenia się asocjacyjnego mogą być oceniane podczas kolejnych sesji, w których czas spędzony w każdym przedziale jest mierzony przy braku stymulacji. W ten sposób badacz może oddzielić natychmiastowe efekty nagradzania po stymulacji interesujących neuronów a związanym z tym tworzeniem pamięci asocjacyjnej12.

W obecnym badaniu opisujemy krok po kroku dwa protokoły konfiguracji dla opartego na optogenetyce zachowania preferencji miejsca u swobodnie poruszających się myszy. Pierwszy protokół opisuje RT-PP w aparacie trzykomorowym i został nakreślony w oparciu o protokoły ostatnio przedstawione przez Root i współpracowników13 i innych autorów12,14,15,16,17,18. Eksperyment składa się z dwóch faz składających się z kilku codziennych sesji (pokazanych na rysunku 1A). Każda sesja jest przeznaczona do innych celów, a parametry sprzężenia stymulacji z komorą są odpowiednio zmieniane. Pierwsza sesja, "Test wstępny", służy do oceny początkowych preferencji badanego do jednego z przedziałów. Po podłączeniu do krosowego, badany może swobodnie eksplorować aparaturę przy braku stymulacji przez 15 minut. Jeśli początkowa preferencja dla któregokolwiek z przedziałów jest większa niż 80%, mysz jest wykluczona z analizy, ponieważ początkowe odchylenie boczne może zniekształcić analizę. Po "Preteście" rozpoczyna się "Faza 1". Pierwsza część składa się z dwóch następujących po sobie, codziennych, 30-minutowych sesji "RT-PP". Podczas "Fazy 1" mysz optogenetyczna jest podłączona do źródła lasera za pomocą krosowego i umieszczana na arenie, aby swobodnie je eksplorować. Mysz otrzymuje wewnątrzczaszkową stymulację laserową po wejściu do jednego z głównych przedziałów. Można przeprowadzić eksperymenty pilotażowe w celu określenia, która komora zostanie przypisana jako sparowana laserowo, a która jako niesparowana. Jeśli okaże się, że stymulacja jest satysfakcjonująca, laser zostanie sprzężony z najmniej preferowanym przedziałem podczas "testu wstępnego" i z najbardziej preferowanym, jeśli stymulacja jest awersyjna. W związku z tym prezentowany protokół RT-PP jest zgodny z tendencyjnym projektem w tym sensie, że stymulacja laserowa nie jest losowo przypisana do żadnego z dwóch głównych przedziałów (projekt bezstronny), ale jest wybierana tak, aby uniknąć początkowych preferencji myszy. Wejście do drugiej komory głównej lub przegrody neutralnej łączącej dwie komory główne nie powoduje stymulacji światłem wewnątrzczaszkowym, a zatem nie jest parowane światłem. Sesje te pozwalają na ocenę w czasie rzeczywistym satysfakcjonujących lub awersyjnych właściwości stymulacji określonych populacji neuronów. Ostatniego dnia "Fazy 1" odbywa się 15 minutowa sesja bez żadnej stymulacji. Sesja ta służy omówieniu reakcji warunkowych ("CR"), które wynikają z asocjacyjnego uczenia się między stymulacją a środowiskiem, w którym została odebrana. Co najmniej trzy dni po "Fazie 1" ma miejsce "Faza Odwrócenia", która ma taką samą strukturę jak "Faza 1", ale wcześniej niesparowana komora główna jest teraz sparowana ze stymulacją świetlną. Podobnie jak w przypadku "Fazy 1", po dwóch sesjach stymulacji następuje sesja "CR". "Faza odwrócenia" służy do potwierdzenia, że zachowanie myszy jest zależne od stymulacji optogenetycznej i nie jest związane z losowymi parametrami. Każda sesja eksperymentu RT-PP musi być oddzielnie zaprogramowana w oprogramowaniu śledzącym. Obecny protokół opisuje takie ustawienia w określonym oprogramowaniu, ale można użyć dowolnego innego oprogramowania śledzącego, które jest w stanie wysyłać sygnały modulacji tranzystor-tranzystor-logika (TTL) do źródła światła.

Drugi protokół opisuje nowatorski układ określany jako paradygmat Neutralnej Preferencji Przedziału (NCP). Ten zmodyfikowany protokół RT-PP wykorzystuje niewielki rozmiar i przezroczystość korytarza łączącego, który jest naturalnie omijany przez mysz ze względu na jego wąską i przezroczystą kompozycję. Łącząc oba główne przedziały ze stymulacją świetlną i pozostawiając korytarz wolny od stymulacji światłem, konfiguracja NCP może być wykorzystana do przetestowania, czy stymulacja optogenetyczna zmusi mysz do spędzania większej ilości czasu w korytarzu, aby uniknąć stymulacji optogenetycznej. Porównując czas spędzony w dwóch sparowanych światłach przedziałach z czasem spędzonym na korytarzu, można dokonać weryfikacji awersji wywołanej optogenetycznie . Eksperyment NCP składa się z dwóch następujących po sobie codziennych sesji, w których myszy optogenetyczne otrzymują stymulację (30 minut każda) w celu zmierzenia preferencji w czasie rzeczywistym oraz jednej sesji bezlaserowej (15 minut) w celu oceny uwarunkowanych odpowiedzi podobnych do tych w protokole RT-PP.

Poniższe protokoły RT-PP i NCP zostały niedawno zweryfikowane w naszym laboratorium w badaniu nad tym, jak różne typy neuronów zlokalizowanych w brzusznej części nakrywki (VTA) są zaangażowane w różne aspekty zachowania związanego z nagrodą12. Tutaj, aby zilustrować implementację protokołów RT-PP i NCP, transgenicznym myszom stereotaktycznie wstrzyknięto transporter dopaminy (DAT)-Cre19 i pęcherzykowy transporter glutaminianu 2 (VGLUT2)-Cre20 transgenicznym myszom stereotaktycznie wstrzyknięto AAV przenoszący konstrukt DNA z floksowanym rodopsyną2 (ChR2) do VTA, po czym wszczepiono światłowód powyżej VTA. Reakcje behawioralne uzyskane po analizie tych myszy przy użyciu dostarczonych protokołów RT-PP i NCP pokazują, w jaki sposób aktywacja neuronów dopaminergicznych i glutaminergicznych w VTA prowadzi do różnych reakcji behawioralnych (ryc. 1).

Protokoły krok po kroku dla paradygmatów RT-PP i NCP są dostarczane z informacjami od genotypowania transgenicznych myszy, stereotaktycznych iniekcji wirusowych i umieszczania światłowodów, aż po programowanie oprogramowania śledzącego do kontroli laserowej i oceny behawioralnej. Ponadto omówiono propozycje modyfikacji protokołu w zakresie parametrów stymulacji oraz aspektów eksperymentalnych, które mogą mieć wpływ na wynik naukowy. Chociaż protokoły są opisane w kontekście VTA, można je zastosować do dowolnego obszaru mózgu lub populacji neuronów, pod warunkiem, że dostępne są odpowiednie narzędzia optogenetyczne, takie jak odpowiedni sterownik Cre i floksowane opsyny.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało przeprowadzone przy użyciu heterozygotycznych DAT-Cre19 i VGLUT2-Cre20 myszy obojga płci w wieku >8 tygodni i wadze >20 g. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie ze szwedzką (Ustawa o dobrostanie zwierząt SFS 1998:56) i prawodawstwem Unii Europejskiej (Konwencja ETS 123 i dyrektywa 2010/63/UE) za zgodą lokalnych Komisji Etyki Zwierząt.

1. Genotypowanie myszy

  1. Wykonaj biopsję ucha za pomocą dziurkacza do uszu, aby użyć go do genotypowania myszy transgenicznych.
  2. Przygotuj nakłuwacze w uszach, aby przeprowadzić reakcję łańcuchowej polimerazy (PCR) przy użyciu specjalnie przygotowanych starterów.
    UWAGA: W tym protokole zastosowano startery skierowane na Cre.
    1. Dodać 75 μl buforu do lizy (bufor 1: 250 mM NaOH, 2 mM EDTA) do każdej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej stempel do uszu.
    2. Inkubować w bloku grzewczym w temperaturze 96 °C przez 30 minut.
    3. Pozostawić próbki do ostygnięcia przez 5 minut, a następnie dodać 75 μl buforu neutralizacyjnego (bufor 2: 400 mM Tris-HCl pH 8,0).
  3. Wykonaj PCR zgodnie ze standardowymi procedurami12,21 przy użyciu odpowiednich starterów (tutaj: Cre FW 5'-ACGAGTGATGAGGTTCGCAAGA-3', Cre REV 5'-ACCGACGATGAAGCATGTTTAG-3').
    UWAGA: Pracuj na lodzie pod kapturem PCR i zwracaj uwagę, aby nie zanieczyścić odczynników i próbek.
    1. Przygotuj główną mieszankę PCR. Pomnóż następujące objętości w zależności od liczby próbek, które mają być analizowane, w tym odpowiednich próbek kontrolnych. Wymieszać odczynniki do pojedynczej reakcji objętościowej końcowej o objętości 25 μl w następującej kolejności: woda destylowana (18,9 μL), 10x bufor z MgCl2 (2,5 μL), 10 mM mieszanina dNTP (0,5 μL), 10 μM starter do przodu (1 μL), 10 μM starter odwrotny (1 μL), 5 U/μL polimerazy DNA (0,1 μL), i matrycowy DNA (1 μl; zostanie dodany w następnych krokach).
      UWAGA: Zawsze dodawaj ujemną, dodatnią i pustą (bez matrycy DNA) kontrolę, aby zapewnić prawidłowe wyniki.
    2. Dodać 24 μl mieszanki wzorcowej do probówek PCR.
    3. Dodać 1 μl matrycy DNA (pochodzącej z dziurkacza w ucho każdej myszy) do każdej probówki PCR.
    4. Odwirować krótko probówki do PCR, aby upewnić się, że DNA matrycy znajduje się w mieszance wzorcowej.
    5. Przeprowadzić PCR za pomocą termocyklera, korzystając z programu cyklicznego w Tabeli 1.
  4. Przygotować żel agarozowy do przeprowadzenia próbek za pomocą elektroforezy.
    UWAGA: Rozmiar będzie zależał od liczby próbek, które należy przeanalizować.
    1. Dodaj 1% w/v proszku agarozy w 1x bufor Tris-acetate-EDTA (TAE) w szklanej butelce. Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści, regularnie sprawdzając, czy nie wykipia.
      UWAGA: Podejmij środki ostrożności, aby uniknąć oparzeń.
    2. Pozostawić żel do ostygnięcia do temperatury około 50 °C i dodać barwnik z żelu z kwasem nukleinowym (0,5 μl/50 ml żelu).
    3. Wlej żel do tacki odlewniczej zawierającej dobrze nagrzebienie i pozostaw w temperaturze pokojowej, aż całkowicie zestali. Delikatnie zdejmij grzebienie.
    4. Napełnij zbiornik do elektroforezy 1x buforem TAE i umieść żel w zbiorniku.
    5. Dodaj 2 μl 1x barwnika ładującego DNA do każdej z próbek DNA.
    6. Załadować 4 μl drabinki DNA do pierwszego dołka żelu, a następnie przystąpić do ładowania całej objętości próbek do pozostałych studzienek.
    7. Ustaw źródło zasilania elektroforezy na 140 V i pracuj przez 25−30 min.
    8. Umieść żel pod źródłem promieniowania UV i zrób zdjęcie wyników.

2. Chirurgia stereotaktyczna

  1. Po genotypowaniu oddziel myszy, zachowując te, które są dodatnie dla Cre. Poczekaj, aż osiągną wiek co najmniej 8 tygodni i ważą >20 g, aby wykonać operację.
    1. Zdezynfekuj środowisko i wysterylizuj narzędzia chirurgiczne, aby przeprowadzić operację w warunkach aseptycznych.
    2. Wstrzyknąć myszom podskórnie środek przeciwbólowy na 30 minut przed zabiegiem.
    3. Znieczulić myszy izofluranem (2-3% w normalnym powietrzu w celu indukcji i 1,5-2,0% w celu utrzymania znieczulenia). Upewnij się, że osiągnięto odpowiedni poziom znieczulenia, testując brak odruchów bólowych, delikatnie szczypiąc palec u nogi myszy. Należy odpowiednio dostosować dawkę izofluranu.
    4. Umieść mysz na aparacie stereotaktycznym. Dodaj lubrykant do oczu, aby zapobiec zmianom w oku z powodu suchości i zgolić włosy na czubku czaszki. Użyj poduszki grzewczej, aby utrzymać stabilną temperaturę myszy.
    5. Wstrzyknąć 100 μl środka znieczulającego miejscowo pod skórę czaszki i odczekać, aż zacznie działać przez 5 minut.
    6. Przygotuj miejsce nacięcia, stosując trzy okrężne aplikacje alkoholu lub sterylnego roztworu soli fizjologicznej na przemian z jodem. Użyj sterylnej bawełnianej końcówki i rozpocznij aplikację od linii nacięcia, na zewnątrz.
    7. Delikatnie unieś skórę kleszczami i wykonaj nacięcie ~1,5 cm wzdłuż osi ostrocaudalnej nożyczkami chirurgicznymi, aby odsłonić powierzchnię czaszki.
    8. Za pomocą bawełnianego patyczka nałóż roztwór H2O2 w celu usunięcia okostnej.
    9. Opłucz czaszkę sterylną solą fizjologiczną i osusz ją za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką.
    10. Zlokalizuj bregmę i lambdę.
    11. Upewnij się, że czaszka jest płaska, umieszczając końcówkę igły iniekcyjnej, wyregulowaną na ramie stereotaktycznej, na bregmie i lambdzie. Zmierz współrzędne brzuszne dla każdej pozycji i porównaj. Gdy czaszka jest płaska, współrzędne brzuszne zarówno dla bregmy, jak i lambdy są identyczne. Jeśli nie, dostosuj pozycję głowicy i ponownie wykonaj pomiary.
    12. Znajdź i zaznacz miejsce (AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm od bregmy według Franklin i Paxinos22), w którym nastąpi wstrzyknięcie wirusa zależnego od Cre i implantacja światłowodu i wykonaj mały otwór za pomocą mikrowiertła.
    13. Załadować 400 nL wirusa do strzykawki o pojemności 10 μl zamontowanej na aparacie stereotaktycznym za pomocą precyzyjnej pompy.
    14. Ostrożnie opuść igłę (34 G, skośna) i wstrzyknij 300 nL wirusa optogenetycznego zależnego od Cre (AAV5-EF1a-DIO-ChR2(H134)-eYFP [5,6 x 1012 vg/mL]) do VTA (AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm od bregmy i -4,4 mm od powierzchni czaszki, zgodnie z Franklin i Paxinos22) z szybkością wstrzykiwania 100 nL/min przy użyciu pompy precyzyjnej.
    15. Po wstrzyknięciu należy pozostawić igłę na miejscu przez dodatkowe 10 minut, aby umożliwić dyfuzję wirusa (Rysunek 2A).
    16. Powoli wycofać igłę z miejsca wstrzyknięcia.
    17. Wykonaj małe otwory za pomocą mikrowiertła, aby dopasować kotwiące, które ustabilizują włókno światłowodowe i kompleks cementu dentystycznego.
    18. Ponownie weź współrzędne bregmy i wszczep światłowód (średnica 200 μm, 0,37 NA) na: AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm od bregmy i -4,0 mm od powierzchni czaszki (Rysunek 2B) według Franklina i Paxinos22.
    19. Zabezpiecz włókno na czaszce za pomocą cementu dentystycznego. Nałóż wystarczającą ilość cementu wokół kości światłowodowej, aby przymocować ją do czaszki, ale zwróć uwagę, aby pozostawić 3−4 mm górnej części kości udowej wolnej od cementu, aby umożliwić połączenie krosowego (Rysunek 2C).
      UWAGA: Zwróć uwagę, aby nie wypełniać otworu cementem, ponieważ może to spowodować uszkodzenie tkanki mózgowej. W otworze można dodać materiały hemostatyczne, aby temu zapobiec.
    20. Użyj kleju tkankowego lub wchłanialnych szwów, aby zamknąć otwartą ranę i pozostawić zwierzę do rekonwalescencji na co najmniej dwa tygodnie. Dodatkową dawkę leku przeciwbólowego należy podać 12−24 h po zabiegu.

3. Ustawianie sterowania źródłem lasera

  1. Użyj mikrokontrolerów jednopłytkowych do sterowania źródłem lasera. Napisz skrypt za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Załaduj skrypt na płytkę mikrokontrolera za pomocą odpowiedniego połączeniowego do komputera.
    UWAGA: Skrypt powinien zawierać zewnętrzną modulację (wejście) pochodzącą z oprogramowania śledzącego przez skrzynkę TTL oraz wyjście do lasera w celu kontrolowania parametrów stymulacji. W przypadku impulsu o szerokości 10 ms przy częstotliwości 20 Hz należy użyć skryptu znajdującego się w dodatkowym pliku kodowania.
  2. Podłącz płytkę do lasera i skrzynki TTL sprzętu śledzącego.
    1. Użyj sieciowego, aby podłączyć skrzynkę TTL do płytki (pin 5 dla dostarczonego skryptu) (Rysunek 3A,C).
    2. Upewnij się, że laser jest ustawiony na sterowanie za pomocą modulacji zewnętrznej i podłącz laser do płytki za pomocą FC/PC (pin 13 dla danego skryptu) ( Rysunek 3B,C).
    3. Podłącz odpowiednie piny do uziemionych części płytki.
  3. Podłącz źródło lasera do światłowodu.
    1. Podłącz źródło lasera do złącza obrotowego ( Rysunek 3D).
    2. Podłącz krosowy (Rysunek 3E) do złącza obrotowego.
    3. Ustabilizować złącze obrotowe nad aparatem, ale poza obszarem nagrywania. Upewnij się, że długość światłowodowego jest odpowiednia, aby mysz mogła bez przeszkód poruszać się po arenie (Rysunek 3F).

4. Konfiguracja eksperymentu dla podejścia RT-PP w oprogramowaniu śledzącym

  1. Skalibruj ustawienia areny. Za pomocą linijki zmierz określoną część aparatu fizycznego, narysuj linię odpowiadającą części zmierzonej na obrazie w oprogramowaniu w zakładce Draw Scale to Calibrate i wprowadź znaną już wartość (krok 1 w Rysunek 4).
  2. Zaprojektuj arenę. Narysuj obszar, w którym będzie rejestrowany ruch myszy (krok 2 w Rysunek 4).
  3. Utwórz strefy. Narysuj strefy, które ostatecznie zostaną przypisane jako sparowane laserowo, niesparowane laserowo i "neutralne" (krok 3 w Rysunek 4).
  4. Sprawdź poprawność konfiguracji, aby upewnić się, że nie ma sprzecznych parametrów, na przykład stref poza areną (krok 4 w Rysunek 4)
  5. Ustaw parametry eksperymentalne w zakładce ustawienia kontroli próbnej (krok 5 w Rysunek 4).
    1. Ustaw czas próbny, jak pokazano w kroku 1 w Rysunek 5 dla 30-minutowej sesji RT-PP.
    2. Upewniając się, że "kontrola sprzętowa" jest włączona, przypisz komorę jako sparowaną laserowo, w której wejście myszy wyzwoli sygnał TTL przez oprogramowanie śledzące do płytki mikrokontrolera. W Rysunek 5 (krok 2) komora sparowana laserowo to komora A. W przypadku fazy odwrócenia zamień komory tak, aby komora B została sparowana laserowo, a komora A została rozparowana. W tym celu należy zamienić literę A na B i literę B na literę A w oprogramowaniu.

5. Modyfikacja konfiguracji w celu przetestowania właściwości awersyjnych stymulacji przy użyciu podejścia NCP

  1. Wykonaj kroki 4.1−4.4 zgodnie z wcześniejszym opisem.
  2. Ustaw czas eksperymentu na 30 minut za pomocą opcji "Powtórz do" w ustawieniach pola "Odniesienie" (krok 1 w Rysunek 6).
  3. Przypisz zarówno strefy A, jak i B jako sparowane laserowo (krok 2 w Rysunek 6), dodając "gdy punkt środkowy znajduje się w dowolnej ze stref A i B" dla pola warunku związanego z ustawieniami dla przedziałów A i B. Zwróć uwagę, że laser wyłączy się, gdy zwierzę znajdzie się w neutralnej komorze.

6. Przeprowadzanie eksperymentu z użyciem stymulacji laserowej

  1. Skonfiguruj ustawienia wykrywania.
    1. Użyj manekina przypominającego mysz, aby zapewnić odpowiednie ustawienia wykrywania.
    2. Umieścić manekina w jednej komorze aparatu i użyć automatycznego zestawu z dynamicznym odejmowaniem.
    3. Wyjmij manekina i umieść go w przeciwległej komorze. Upewnij się, że manekin jest w pełni wykryty, a jeśli nie, dostosuj ustawienia za pomocą oprogramowania, aby uzyskać prawidłowe wykrywanie.
      1. Na tym etapie sprawdź również, czy stymulacja działa tak, jak powinna. Rozpocznij akwizycję, korzystając z wcześniej skonfigurowanych ustawień kontroli próbnej i umieść manekina w komorze sparowanej laserowo i sprawdź, czy stymulacja została uruchomiona tak, jak powinna. Następnie umieść smoczek w niesparowanej i/lub neutralnej komorze i sprawdź, czy stymulacja została zatrzymana.
  2. Użyj miernika mocy z czujnikiem, aby ustawić moc lasera na 10 mW za pomocą pokrętła na laserze ( Rysunek 3B). Wykonuj ten krok za każdym razem, gdy używana jest stymulacja laserowa.
    UWAGA: Używaj sprzętu ochronnego do oczu, ponieważ bezpośrednia ekspozycja na światło lasera może spowodować trwałe uszkodzenie oczu.
  3. Umieść mysz w urządzeniu.
    1. Delikatnie wyjmij mysz z klatki i podłącz implant światłowodowy do patchcordu światłowodowego za pomocą ceramicznej tulei.
    2. Delikatnie umieść mysz w neutralnej komorze aparatu trzykomorowego.
    3. Poczekaj, aż mysz zostanie wykryta przez oprogramowanie.
    4. Usuń pionowe drzwi przesuwne uniemożliwiające zwierzęciu wejście do głównych komór.
    5. Pozwól zwierzęciu na swobodną eksplorację bez żadnych przeszkód.
      UWAGA: Ta sama procedura jest wykonywana, gdy zwierzę nie otrzymuje stymulacji, z wyjątkiem tego, że krok 6.2 nie jest potrzebny i laser jest cały czas wyłączony.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trzykomorowy aparat (Rysunek 3F) jest odpowiedni do zajmowania się nagradzanymi efektami leków i oceny w czasie rzeczywistym nagradzających lub awersyjnych właściwości bezpośredniej stymulacji neuronów za pomocą optogenetyki. Składa się z dwóch komór głównych (20 cm [szer.] x 18 cm [dł.] x 25 cm [wys.]) oraz jednej mniejszej komory łączącej (20 cm [szer.] x 7 cm [dł.] x 25 cm [wys.]). Główne komory mają wyraźną fakturę i wzory ścian i podłogi, aby ułatwić naukę asocjacyjną, podczas gdy komora łącząca/neutralna jest wąska i przezroczysta, dzięki czemu myszy spędzają w niej naturalnie mniej czasu. Jak opisano powyżej, oprogramowanie śledzące może być używane do rejestrowania kilku parametrów behawioralnych myszy, w tym ruchu i czasu spędzonego w każdym przedziale, oraz do kontrolowania stymulacji laserowej. Cały eksperyment RT-PP odbywa się w ciągu 8 sesji (Rysunek 1A) i pozwala zarówno ocenić nagradzające lub awersyjne właściwości bezpośredniej stymulacji (dni 3, 4, 6 i 7), jak i tworzyć skojarzenia, pozytywne lub negatywne, w odpowiedzi na wcześniejsze doświadczenia (dni 5 i 8, "CR").

Po pierwsze, przetestowaliśmy myszy DAT-Cre, którym wstrzyknięto wirusa AAV-ChR2-eYFP w VTA, aby celować w neurony dopaminergiczne. Zgodnie z literaturą zaobserwowaliśmy, że myszy wolały spędzać czas w komplemencie w połączeniu ze stymulacją (Rysunek 1B, faza 1, dni 3 i 4, niebieskie kółka, dwukierunkowe powtarzane pomiary [RM] analiza wariancji [ANOVA], efekt przedziału F(2,18) = 141, p < 0,001; efekt sesji x przedział F(12,108) = 42,1, p < 0,001; Test post hoc Tukeya sparowany vs niesparowany p < 0,001). Faza odwrócenia, w której zamieniono parowanie przedziałów na stymulację laserową, potwierdziła te obserwacje (Rysunek 1B, dni 6 i 7, niebieskie kółka, test post hoc Tukeya sparowany vs niesparowany przedział p < 0,001), wykluczając w ten sposób możliwość, że wyniki uzyskane z fazy 1 były związane z odchyleniami bocznymi lub parametrami losowymi. Uśrednienie czasu spędzonego w każdej komplemencie w ciągu czterech dni RT-PP potwierdziło, że myszy spędzały średnio około 70% czasu w przedziale sparowanym laserowo, w przeciwieństwie do przedziałów niesparowanych (~20%) i neutralnych (~10%) (Rysunek 1B wykres słupkowy, jednokierunkowy RM ANOVA, efekt stymulacji F(2,6) = 139, p < 0,001, Post Tukeya, jak sparowane i niesparowane i neutralne przedziały p < 0,001). Ponadto, przy braku stymulacji, w dniach 5 i 8 myszy spędzały znacznie więcej czasu w pomieszczeniu wcześniej sparowanym ze stymulacją laserową (post hoc p Tukeya < 0,001), co wskazuje, że poprzednie doświadczenie było wystarczające do wywołania asocjacyjnych zachowań związanych z uczeniem się odzwierciedlonych jako "poszukiwanie" stymulacji. Dane te są zgodne z literaturą i pokazują, że obecna metoda może być niezawodnie wykorzystana do badania nagradzających efektów stymulacji optogenetycznej określonych populacji neuronów w VTA.

Następnie przetestowaliśmy myszy VGLUT2-Cre, którym wstrzyknięto AAV-ChR2-eYFP w VTA, jak wyżej, aby celować w neurony glutaminergiczne VTA. W tym eksperymencie zaobserwowaliśmy fenotyp behawioralny odwrotny do tego, który wykazywały myszy DAT-Cre. W ten sposób myszy unikały przedziału sparowanego ze stymulacją i spędzały więcej czasu w niesparowanym przez wszystkie dni RT-PP (Rysunek 1C po lewej, dwukierunkowy RM ANOVA, efekt przedziału F(2,12) = 40,9, p < 0,001; efekt sesji x przedział F(12,72) = 16,1, p < 0,001; Test post hoc Tukeya sparowany vs niesparowany p < 0,001; Rysunek 1C po prawej, jednokierunkowy efekt RM ANOVA stymulacji F(2,6) = 162, p < 0,001, parowane i niesparowane i neutralne przedziały Tukeya p < 0,001). Co ciekawe, w dniach 5 i 8 "CR" myszy nie wykazywały wyraźnego unikania wcześniej sparowanego przedziału (brak różnic między sparowanymi i niesparowanymi przedziałami). Możliwe, że brak warunkowej odpowiedzi jest spowodowany nieodpowiednim czasem spędzonym w sparowanym komorze lasera, co uniemożliwiło powstanie skojarzeń między aktywacją lasera a konkretnym środowiskiem, w którym to miało miejsce. Aby dokładniej zbadać ten fenotyp unikania, użyliśmy zmodyfikowanego protokołu, który nazwaliśmy "neutralną preferencją przedziału", w skrócie NCP. W tym eksperymencie oba główne przedziały zostały sparowane ze stymulacją, a neutralny przedział pozostał wolny od stymulacji (Rysunek 7A). Postawiliśmy hipotezę, że jeśli stymulacja ma właściwości awersyjne, to mysz będzie zmuszona spędzać czas w mniejszym, neutralnym pomieszczeniu, aby tego uniknąć. Rzeczywiście, w obu dniach stymulacji (Stim1 i Stim2) myszy spędzały większość czasu w neutralnym przedziale (około 80%) w porównaniu z parami (Rysunek 7B, C; po lewej: dwukierunkowy efekt ANOVA RM przedziału F(2,8) = 70,9, p < 0,001; efekt sesji x przedział F(4,16) = 6,9, p = 0,002, post hoc Tukeya "Stymulacja 1" neutralny przedział vs przedział 1 i 2 p < 0,01, przedział neutralny "Stymulacja 2" vs przedział 1 i 2 p < 0,001; po prawej: jednokierunkowy RM ANOVA, efekt stymulacji F(2,2) = 54,2, p = 0,018, test post hoc Tukeya sparowany 1 i 2 vs neutralny p < 0,05). Podobnie jak w przypadku dni "CR" podczas testu RT-PP, myszy nie wydawały się tworzyć negatywnych skojarzeń między przedziałami a stymulacją; oznacza to, że przy braku stymulacji (CR) badali wszystkie przedziały w tym samym stopniu (Rysunek 7B, brak różnic między czasem spędzonym w sparowanych przedziałach a neutralnym przedziale). Wyniki tych eksperymentów potwierdziły fenotyp behawioralny zaobserwowany podczas konfiguracji RT-PP, a tym samym wspierają kombinatoryczną implementację zarówno paradygmatów RT-PP, jak i NCP.

figure-results-1
Rysunek 1: Testy behawioralne z wykorzystaniem optogenetyki w paradygmacie RT-PP. (A) Schematyczne przedstawienie osi czasu eksperymentów. (B,C) U góry po lewej: wykres przedstawiający procent czasu spędzonego w każdym przedziale podczas eksperymentu RT-PP dla myszy DAT-Cre (N = 10) i VGLUT2-Cre (N = 7), którym wstrzyknięto AAV-ChR2-eYFP. Niebieskie kółka: komora sparowana laserowo; białe, czarne kółka: komory główne; Szare kółka: neutralna komora. U góry po prawej: średni procent czasu spędzonego w każdym przedziale w dniach 3, 4, 6 i 7 (RT-PP). U dołu: reprezentatywne mapy cieplne czasu spędzonego w każdej komorze dla myszy DAT-Cre i VGLUT2-Cre. Wszystkie dane miały rozkład normalny (test Shapiro-Wilka). Wyniki przedstawiono jako średnią ± SEM. ***p < 0,001 sparowane vs niesparowane; #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 przedział sparowany vs neutralny; §§p < 0,01, §§§p < 0,001 przedział niesparowany vs neutralny. Ten rysunek został zmodyfikowany z Bimpisidis et al.12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Procedura chirurgiczna w eksperymentach optogenetycznych. (A) Wstrzyknięcie wektora wirusowego zależnego od Cre do VTA. (B) Implantacja światłowodu powyżej miejsca wstrzyknięcia. Zwróć uwagę na kotwiące używane do stabilizacji. (C) Trwałe zakotwiczenie włókna na czaszce za pomocą cementu dentystycznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Ryc. 3: Aparatura używana w eksperymentach optogenetycznych. (A) pole TTL używane w badaniach. Odbiera dane wejściowe z oprogramowania śledzącego i wysyła sygnały TTL do płytki mikrokontrolera. (B) Widok z przodu (z góry) i z tyłu (z dołu) źródła laserowego użytego do eksperymentów. (C) Płytka mikrokontrolera służąca do sterowania stymulacją laserową. Zwróć uwagę na połączenia od skrzynki TTL do źródła lasera. (D) Przegub obrotowy. (E) Cięciwa światłowodowa używana w eksperymentach. (F) Aparatura trzykomorowa używana do eksperymentów RT-PP i NCP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Projektowanie aren i stref w oprogramowaniu śledzącym. Krok 1: Kalibracja konfiguracji. Krok 2: Rysunek całej areny. Krok 3: Rysowanie stref na arenie. Krok 4: Walidacja konfiguracji. Krok 5: Zakładka Ustawienia kontroli próbnej do ustawiania czasu i parametrów stymulacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Ustawianie parametrów czasu i stymulacji eksperymentu RT-PP w oprogramowaniu śledzącym. Dodanie szczegółowych zasad dotyczących czasu trwania (krok 1) i warunków stymulacji światłem (krok 2). Warunki można łatwo zmienić, aby dopasować je do wymagań fazy odwrócenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Ustawianie parametrów czasu i stymulacji eksperymentów NCP w oprogramowaniu śledzącym. Czas trwania sesji stymulacji (krok 1) jest podobny do tych dla RT-PP, ale warunki aktywacji stymulacji światłem (krok 2) są inne. Wejście do którejkolwiek z głównych komór (tutaj nazywanych strefą A i strefą B) powoduje stymulację optogenetyczną, która kończy się dopiero wtedy, gdy mysz wejdzie do neutralnej komory. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Testy behawioralne z wykorzystaniem optogenetyki w paradygmacie KPK. (A) Schematyczne przedstawienie układu doświadczalnego. (B) Po lewej: wykres przedstawiający procent czasu spędzonego w każdym przedziale podczas dwóch dni stymulacji (Stim1 i Stim 2) oraz podczas sesji odpowiedzi warunkowej (CR) dla myszy VGLUT2-Cre, którym wstrzyknięto AAV-ChR2 w VTA (N = 5). Po prawej: średni procent czasu spędzonego w każdym przedziale w ciągu dwóch dni stymulacji KPK. (C) Reprezentatywna mapa cieplna czasu spędzonego w każdej komorze dla myszy VGLUT2-Cre podczas jednego z dni stymulacji. Dane miały rozkład normalny (test Shapiro-Wilka). Wyniki przedstawiono jako średnią ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 niesparowane vs sparowane 1 i sparowane 2 przedziały. Ten rysunek został zmodyfikowany z Bimpisidis et al.12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

kroktemperaturaczas trwaniaCykli
1. Początkowa denaturacja95 °CCzas trwania: 4 min1
2. Denaturacja95 °C30 sekund30
3. Wyżarzanie55 °C30 sekund
4. Rozszerzenie72 °C40 sekund
5. Ostateczne przedłużenie72 °CCzas trwania: 6 min1
6. Trzymaj4 °CDopóki nie zostanie zatrzymany przez eksperymentatora1

Tabela 1: Program cykliczny PCR.

Dodatkowy plik kodowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym badaniu przedstawiamy dwa protokoły krok po kroku, jak przeprowadzać różne rodzaje analiz preferencji miejsca za pomocą optogenetyki u myszy. Przedstawione protokoły zostały wykorzystane do oceny nagradzających lub awersyjnych fenotypów behawioralnych neuronów VTA (ryc. 1 i ryc. 6)12, ale można je również wykorzystać do zbadania behawioralnej roli neuronów w innych regionach mózgu.

W kilku ostatnich badaniach opisano paradygmaty RT-PP w aparatach dwukomorowych23,24 i trzykomorowych 13,14,15,16,17,18. Obecne protokoły opisują szczegółowe konfiguracje dla protokołów RT-PP i NCP w trzykomorowym aparacie przypominającym te tradycyjnie używane w eksperymentach CPP do oceny skutków behawioralnych po podaniu narkotyków nadużywających. Chociaż wyniki są tutaj prezentowane tylko jako procent czasu, jaki mysz spędziła w każdym przedziale, oprogramowanie śledzące pozwala na analizę kilku innych parametrów behawioralnych, takich jak przejścia do stref, prędkość, czas spędzony w bezruchu i inne. Analiza różnych parametrów może mieć znaczenie dla interpretacji danych.

Obecne protokoły RT-PP są elastyczne i mogą być modyfikowane w celu sprawdzenia, czy różne rodzaje wzorców stymulacji mają satysfakcjonujące efekty. Parametry sterowania laserem można łatwo zmienić za pomocą skryptu na płytce mikrokontrolera lub w oprogramowaniu śledzącym, co pokazuje wszechstronność konfiguracji. Sugerujemy częstotliwość stymulacji 20 Hz, która mieści się w zakresie, a czasem niższym, częstotliwości stosowanych w poprzednich badaniach z użyciem tego samego wariantu opsyny (ChR2 / H134R) w celu zbadania neuronów dopaminergicznych i glutaminergicznych oraz ich zakończeń 13,14,16,17,18,23,24,25,26,27. Ostatnie badania wykazały, że wyższe częstotliwości stymulacji mogą mieć odwrotny wpływ na zachowanie niż niższe, i że efekty te są pośredniczone przez blok depolaryzacyjny spowodowany wyższymi częstotliwościami28. Podobnie, różnice w wynikach behawioralnych wykazano podczas stymulacji neuronów glutaminergicznego i GABA-ergicznego w bocznym obszarze przedwzrokowym15. W badaniach tych badano neurony o innych obszarach niż VTA, a największy wpływ zaobserwowano na wysokie częstotliwości neuronów nieglutaminergicznego 15,28. Nasz wybór częstotliwości 20 Hz opiera się na wcześniejszych badaniach glutaminergicznych i dopaminergicznych neuronów VTA, które wykazały, że przy różnych częstotliwościach stymulacji, wyjście behawioralne związane z nagrodą nie ulega znaczącymzmianom.

Dodatkowym parametrem, który można regulować i który może mieć wpływ na wynik eksperymentu, jest moc źródła światła. Wyższa moc lasera może zwiększyć rozmiar obszaru stymulowanego światłem, co może być korzystne w niektórych typach eksperymentów, ale z wadą wzrostu temperatury5. Rzeczywiście, niedawne badania wykazały, że wzrost temperatury wywołany laserem może zmieniać fizjologię mózgu i wpływaćna pomiary behawioralne. Obserwacje te podkreślają znaczenie włączenia kontroli opsynowo-ujemnych do projektu eksperymentalnego. W obecnym protokole użyliśmy lasera o mocy 10 mW, który jest podobny i wcześniej wykazano, że jest skuteczny w stymulowaniu neuronów dopaminergicznych i glutaminergicznych w VTA 16,24,26. Podczas ustawiania eksperymentów należy zwrócić uwagę na wielkość obszaru, w którym znajdują się interesujące nas ogniwa oraz właściwości światłowodów i patchcordów (apertura numeryczna, średnica rdzenia). Parametry te należy wziąć pod uwagę podczas wykonywania obliczeń związanych z mocą lasera. Aby uzyskać szczegółowe informacje, można skorzystać z kalkulatora opracowanego przez laboratorium Karla Deisserotha (http://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php).

Weryfikacja histologiczna rekombinacji Cre-Lox jest kolejnym krytycznym aspektem przy stosowaniu eksperymentów optogenetycznych. Walidacja skuteczności rekombinacji powinna zawsze odbywać się w kohorcie pilotażowej przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów behawioralnych na dużej grupie zwierząt. Jest to ważne ze względów etycznych, ale także ze względu na zoptymalizowaną wydajność eksperymentalną. Każdy konstrukt wirusowy może wykazywać zmienną specyficzność dla różnych typów neuronów i w różnychregionach5, parametr, który może wpływać na eksperymenty w nieprzewidywalny, a nawet mylący sposób. Na przykład wcześniej zwalidowaliśmy wzorzec rekombinacji Cre-Lox wirusów AAV5 w VTA myszy DAT-Cre i stwierdziliśmy, że jednostronne wstrzyknięcia były wystarczające, aby celować w większość obszaru zainteresowania. Kiedy następnie badaliśmy ograniczone przestrzennie subpopulacje w obrębie VTA, takie jak jedna charakteryzująca się ekspresją NeuroD6, zaobserwowaliśmy, że dwustronne zastrzyki wirusowe były bardziej skuteczne w celowaniu w większą liczbę neuronów, dając wyraźniejsze efekty behawioralne po optogenetycznej stymulacji światłem12. Co więcej, czas od operacji do rozpoczęcia eksperymentów behawioralnych musi być dokładnie przemyślany. Dwa tygodnie to wystarczający czas, aby konstrukt DNA ChR2 uległ ekspresji w ciałach komórkowych, jak pokazujemy tutaj, ale dłuższy czas oczekiwania (~ 8 tygodni) może być potrzebny, jeśli badacz testuje efekt stymulacji w obszarach projekcyjnych 13,14,15,17.

Warto zauważyć, że objętość wstrzykniętego wirusa (w naszym przypadku 300 nL) może być odpowiednia podczas badania neuronów w VTA, ale objętość i miano muszą być dostosowane w zależności od wydajności transdukcji i wielkości badanej struktury. Dodatkowo, w przypadku struktur obustronnych znajdujących się w pewnej odległości od osi przyśrodkowej, może być konieczne wykonanie obustronnych iniekcji, a także obustronne wszczepienie światłowodów, aby zapewnić aktywację/zahamowanie w obu półkulach.

Na koniec zawsze konieczne jest wykonanie pośmiertnej analizy histologicznej w celu walidacji i potwierdzenia skuteczności rekombinacji Cre-Lox oraz zweryfikowania prawidłowego miejsca implantacji światłowodu w zamierzonym miejscu. Nieoczekiwana, nadmiernie ograniczona lub nadmierna rekombinacja Cre-Lox może wystąpić z powodu nieznanej dystrybucji neuronów wyrażających Cre poza granicami zamierzonego obszaru lub z powodu różnic w serotypie wirusa, złego obchodzenia się z wirusem, zatkania strzykawki w celu dostarczenia wirusa lub innych problemów związanych z operacją. Weryfikacja zadowalającej rekombinacji Cre-Lox i prawidłowej implantacji światłowodów musi być przeprowadzona w celu potwierdzenia wszelkich wyników statystycznych ocen behawioralnych w celu wyciągnięcia bezpiecznych wniosków.

Jeśli chodzi o dane przedstawione tutaj jako przykłady wykorzystania dwóch paradygmatów behawioralnych, na podstawie wcześniejszych ustaleń oczekiwano znaczącej preferencji dla strony sparowanej światłem uzyskanej przez optogenetyczną stymulację neuronów dopaminergicznych w VTA poprzez analizę myszy DAT-Cre w paradygmacie RT-PP 23,24,25,26,27 podczas gdy unikanie tej strony pokazane przez myszy VGLUT2-Cre nie było przewidziane. Wykazano, że neurony VGLUT2 VTA i ich projekcje są zaangażowane zarówno w nagrodę, jak i awersję 16,17,24,30,31, dlatego przeprowadziliśmy analizę NCP, aby bardziej szczegółowo ocenić pozorne zachowanie unikające obserwowane w obecnej konfiguracji RT-PP. Wykorzystując wąski, przezroczysty korytarz jako jedyny niesparowany przedział bez światła, aby potwierdzić awersyjne właściwości stymulacji neuronów glutaminergicznego VTA, oczywiste jest, że w tym konkretnym układzie trójkompartmentowym optogenetyczna aktywacja tych neuronów powoduje reakcję awersyjną. Eksperymenty te, które zostały pokazane tutaj jako przykład sytuacji, które mogą skorzystać na zastosowaniu zarówno protokołów RT-PP, jak i NCP, były częścią niedawno opublikowanego badania, a pełny zestaw danych, a także dyskusje dotyczące tych ustaleń można znaleźć w tej publikacji12.

Oprócz NCP, alternatywne sposoby potwierdzania awersji obejmują silne oświetlenie obszaru na otwartym polu podczas parowania reszty areny z aktywacją laserową lub wykonanie zadania aktywnego unikania, w którym mysz musi wykonać określony wzorzec zachowania, aby zakończyć stymulację laserową15.

Podsumowując, opisane protokoły dostarczają krytycznych informacji o tym, jak skutecznie przeprowadzić analizę RT-PP i NCP w najbardziej efektywny sposób, aby odkryć rolę aktywacji neuronalnej w nagrodzie i awersji. W zależności od hipotezy naukowej, przy użyciu tych protokołów można analizować szereg parametrów, a każdy protokół można również łączyć z innymi zwalidowanymi paradygmatami w celu zoptymalizowanych analiz behawioralnych wdrażających optogenetykę w celu zajęcia się określonymi obszarami mózgu i neuronami będącymi przedmiotem zainteresowania.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasze źródła finansowania są wdzięczne: Uniwersytet w Uppsali, Vetenskapsrådet (Szwedzka Rada ds. Badań Naukowych), Hjärnfonden, Parkinsonfonden, Fundacje Badawcze Bertila Hållstena, OE&Edla Johansson, Zoologisk Forskning i Åhlén. Zwierzęta były trzymane na Uniwersytecie w Uppsali, a eksperymenty były przeprowadzane w Ośrodku Behawioralnym Uniwersytetu w Uppsali.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Wirus zależny od AAV-CreUNC Vector Core-szeroka gama wirusów dostosowanych do potrzeb każdego projektu
AgarozaVWR Life Science443666A
Bufor do PCRKapa BiosystemsKB100310x, zawiera 1,5 mM MgCl2 w 1x
Bupiwakaina (Marcaina)AspenN01BB01znieczuleniu miejscowym, 5 mg / ml roztwor, wymaga recepty
Karprofen (Norocarp)N-Vet27636przeciwzapalnie, przeciwbólowo; 50 mg/ml roztwór, wymaga
zestawu dNTPThermo Fisher ScientificR0181100mM, należy rozcieńczyć do 10mM i
mieszanej drabinki DNAThermo Fisher ScientificSM0243100 pz, 50 μ g Gene Ruler
Barwnik ładujący DNAThermo Fisher ScientificR06116x, rozcieńczyć do 1x przed użyciem
Dziurkacz do uszuAgnThosAT7000dziurkacz do uszu do pobierania próbek tkanek do PCR lub do znakowania zwierząt
Patchcordy światłowodowe SoczewkidoryckieMFP_200/240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25
Wszczepialne soczewkiświatłowodowe Doric MFC_200/245-0.37_5mm_ZF1.25_FLTWłaściwości włókien mogą się zmieniać w zależności od eksperymentu
Pompa infuzyjna do wstrzykiwań z wirusemAgnThosLegato 130zawiera zdalną pompę do mocowania strzykawki bezpośrednio na ramie stereotexi
Izofluran (Forane)BaxterN01AB06Lotny środek znieczulający, wymaga recepty
jubilerskieAgnThosMCS1x2
ŹródłolaseraMarwell Laser SystemsCNI MBL-III-473-100mW
Płytka mikrokontroleraPłytkę Arduino"Uno"można zamówić w kilku firmach
MicrodrillAgnThos1474można zamówić z uchwytem stereotaktycznym lub bez
Igła (34G)World Precision InstrumentsNF36BV
Barwnik żelowy z kwasem nukleinowym - GelRedBiotiumProbówki 41003-T
do PCRAxygenPCR-0208-CP-C
Miernik mocyThorlabsPM100D
Aparat do preferencji miejscaPanlab76-0278
Obrotowe złączeDoric SoczewkiFRJ_1x1_FC-FC
RękawyDoricSLEEVE_ZR_1-25Tuleja pasująca do połączenia patchcordu z wszczepionym układem optycznym włókno
Cement stabilizującyIvoclar VivadentTetric EvoFlow
Strzykawka (10ul)World Precision InstrumentsNanoFil
Taq polimerazaKAPA BIOSYSTEMSKE1000500U
bufor TAEOmega BIO-TEKSKU:50x stężenie, przed użyciem należy rozcieńczyć
TermocyklerBIO-RAD S10001852148niezbędne do przeprowadzenia reakcji PCR
Klej tkankowyAgnThosVetbond
Oprogramowanie śledząceSkrzynka NoldusEthovision XT
TTL SkrzynkaNoldusNoldus USB-IO Nadajnik
UVAzure Biosystemsc200
działa na receptę AC10089 Model

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The Development and Application of Optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34 (1), 389-412 (2011).">Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The Development and Application of Optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34 (1), 389-412 (2011).
  2. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).">Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
  3. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).">Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  4. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).">Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
  5. Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).">Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  6. Cre-driven optogenetics in the heterogeneous genetic panorama of the VTA. Trends in Neurosciences. 38 (6), 375-386 (2015).">Pupe, S., Wallén-Mackenzie, Å Cre-driven optogenetics in the heterogeneous genetic panorama of the VTA. Trends in Neurosciences. 38 (6), 375-386 (2015).
  7. Animal models of addiction. Dialogues in Clinical Neuroscience. 19 (3), 247-258 (2017).">Spanagel, R. Animal models of addiction. Dialogues in Clinical Neuroscience. 19 (3), 247-258 (2017).
  8. Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: Update of the last decade. Addiction Biology. 12 (3-4), 227(2007).">Tzschentke, T. M. Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: Update of the last decade. Addiction Biology. 12 (3-4), 227(2007).
  9. The use of place conditioning in studying the neuropharmacology of drug reinforcement. Brain Research Bulletin. 23 (4-5), 373-387 (1989).">Hoffman, D. C. The use of place conditioning in studying the neuropharmacology of drug reinforcement. Brain Research Bulletin. 23 (4-5), 373-387 (1989).
  10. What's conditioned in conditioned place preference? Trends in Pharmacological Sciences. 34 (3), 162-166 (2013).">Huston, J. P., Silva, M. A. D. S., Topic, B., Müller, C. P. What's conditioned in conditioned place preference? Trends in Pharmacological Sciences. 34 (3), 162-166 (2013).
  11. Conditioned place preference: What does it add to our preclinical understanding of drug reward? Psychopharmacology. 153 (1), 31-43 (2000).">Bardo, M. T., Bevins, R. A. Conditioned place preference: What does it add to our preclinical understanding of drug reward? Psychopharmacology. 153 (1), 31-43 (2000).
  12. The NeuroD6 subtype of VTA neurons contributes to psychostimulant sensitization and behavioral reinforcement. eNeuro. 6 (3), e0066(2019).">Bimpisidis, Z., et al. The NeuroD6 subtype of VTA neurons contributes to psychostimulant sensitization and behavioral reinforcement. eNeuro. 6 (3), e0066(2019).
  13. Role of Glutamatergic Projections from Ventral Tegmental Area to Lateral Habenula in Aversive Conditioning. Journal of Neuroscience. 34 (42), 13906-13910 (2014).">Root, D. H., Mejias-Aponte, C. A., Qi, J., Morales, M. Role of Glutamatergic Projections from Ventral Tegmental Area to Lateral Habenula in Aversive Conditioning. Journal of Neuroscience. 34 (42), 13906-13910 (2014).
  14. Optogenetic excitation in the ventral tegmental area of glutamatergic or cholinergic inputs from the laterodorsal tegmental area drives reward. European Journal of Neuroscience. 45 (4), 559-571 (2017).">Steidl, S., Wang, H., Ordonez, M., Zhang, S., Morales, M. Optogenetic excitation in the ventral tegmental area of glutamatergic or cholinergic inputs from the laterodorsal tegmental area drives reward. European Journal of Neuroscience. 45 (4), 559-571 (2017).
  15. Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission. Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).">Barker, D. J., et al. Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission. Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).
  16. Rewarding Effects of Optical Stimulation of Ventral Tegmental Area Glutamatergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 35 (48), 15948-15954 (2015).">Wang, H. L., Qi, J., Zhang, S., Wang, H., Morales, M. Rewarding Effects of Optical Stimulation of Ventral Tegmental Area Glutamatergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 35 (48), 15948-15954 (2015).
  17. VTA glutamatergic inputs to nucleus accumbens drive aversion by acting on GABAergic interneurons. Nature Neuroscience. 19, 725-733 (2016).">Qi, J., et al. VTA glutamatergic inputs to nucleus accumbens drive aversion by acting on GABAergic interneurons. Nature Neuroscience. 19, 725-733 (2016).
  18. A glutamatergic reward input from the dorsal raphe to ventral tegmental area dopamine neurons. Nature Communications. 5, 5390(2014).">Qi, J., et al. A glutamatergic reward input from the dorsal raphe to ventral tegmental area dopamine neurons. Nature Communications. 5, 5390(2014).
  19. Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (4), 1325-1330 (2007).">Ekstrand, M. I., et al. Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (4), 1325-1330 (2007).
  20. A transgenic mouse line for molecular genetic analysis of excitatory glutamatergic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 45 (3), 245-257 (2010).">Borgius, L., Restrepo, C. E., Leao, R. N., Saleh, N., Kiehn, O. A transgenic mouse line for molecular genetic analysis of excitatory glutamatergic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 45 (3), 245-257 (2010).
  21. Targeting VGLUT2 in Mature Dopamine Neurons Decreases Mesoaccumbal Glutamatergic Transmission and Identifies a Role for Glutamate Co-release in Synaptic Plasticity by Increasing Baseline AMPA/NMDA Ratio. Frontiers in Neural Circuits. 12, 64(2018).">Papathanou, M., et al. Targeting VGLUT2 in Mature Dopamine Neurons Decreases Mesoaccumbal Glutamatergic Transmission and Identifies a Role for Glutamate Co-release in Synaptic Plasticity by Increasing Baseline AMPA/NMDA Ratio. Frontiers in Neural Circuits. 12, 64(2018).
  22. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. Boston, MA. (2008).">Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. Boston, MA. (2008).
  23. Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning. Science. 324 (5930), 1080-1084 (2009).">Tsai, H. C., et al. Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning. Science. 324 (5930), 1080-1084 (2009).
  24. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 1-13 (2016).">Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 1-13 (2016).
  25. Sufficiency of Mesolimbic Dopamine Neuron Stimulation for the Progression to Addiction. Neuron. 88 (5), 1054-1066 (2015).">Pascoli, V., Terrier, J., Hiver, A., Lüscher, C. Sufficiency of Mesolimbic Dopamine Neuron Stimulation for the Progression to Addiction. Neuron. 88 (5), 1054-1066 (2015).
  26. Phasic excitation of ventral tegmental dopamine neurons potentiates the initiation of conditioned approach behavior: parametric and reinforcement-schedule analyses. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 155(2014).">Ilango, A., Kesner, A. J., Broker, C. J., Wang, D. V., Ikemoto, S. Phasic excitation of ventral tegmental dopamine neurons potentiates the initiation of conditioned approach behavior: parametric and reinforcement-schedule analyses. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 155(2014).
  27. Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement. PLoS ONE. 7 (4), 1-8 (2012).">Kim, K. M., et al. Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement. PLoS ONE. 7 (4), 1-8 (2012).
  28. Galanin neurons in the ventrolateral preoptic area promote sleep and heat loss in mice. Nature Communications. 9, 4129(2018).">Kroeger, D., et al. Galanin neurons in the ventrolateral preoptic area promote sleep and heat loss in mice. Nature Communications. 9, 4129(2018).
  29. Thermal constraints on in vivo optogenetic manipulations. Nature Neuroscience. 22 (7), 1061-1065 (2019).">Owen, S. F., Liu, M. H., Kreitzer, A. C. Thermal constraints on in vivo optogenetic manipulations. Nature Neuroscience. 22 (7), 1061-1065 (2019).
  30. Aversion or Salience Signaling by Ventral Tegmental Area Glutamate Neurons. iScience. 2, 51-62 (2018).">Root, D. H., Estrin, D. J., Morales, M. Aversion or Salience Signaling by Ventral Tegmental Area Glutamate Neurons. iScience. 2, 51-62 (2018).
  31. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).">Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

OptogeneticsVentral Tegmental AreaReal Time Place PreferenceNeutral Compartment PreferenceConditioned Place PreferenceThree Compartment ApparatusDAT Cre MiceVglut2 Cre MiceAAV Channelrhodopsin EYFPLaser Stimulation

Related Articles