Ustalono kilka różnych metod barwienia immunologicznego przy użyciu pierwotnych przeciwciał od tego samego gatunku gospodarza. W tym miejscu opisujemy zastosowanie usuwania przeciwciał za pośrednictwem mikrofal i tyramidu fluoroforowego do blokowania reaktywności krzyżowej przeciwciał podczas multipleksowego barwienia immunologicznego na utrwalonych w formalinie odcinkach nadnerczy myszy zatopionych w parafinie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Podgrzewanie w kuchence mikrofalowej i fluorofor-tyramamid do multipleksowego barwienia immunologicznego nadnerczy myszy − przy użyciu niesprzężonych przeciwciał pierwszorzędowych od tego samego gatunku gospodarza
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Barwienie immunologiczne jest szeroko stosowane w badaniach biomedycznych, aby pokazać wzór ekspresji komórkowej danego białka. Multipleksowe barwienie immunologiczne umożliwia znakowanie przy użyciu wielu przeciwciał pierwszorzędowych. Aby zminimalizować reaktywność krzyżową przeciwciał, barwienie immunologiczne multipleksowe przy użyciu barwienia pośredniego wymaga nieznakowanych przeciwciał pierwszorzędowych od różnych gatunków gospodarzy. Jednak odpowiednia kombinacja przeciwciał różnych gatunków nie zawsze jest dostępna. W tym miejscu opisujemy metodę stosowania nieznakowanych przeciwciał pierwszorzędowych od tego samego gatunku gospodarza (np. W tym przypadku oba przeciwciała pochodzą od królika) do immunofluorescencji multipleksowej na mysich odcinkach nadnerczy zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie. Metoda ta wykorzystuje tę samą procedurę i odczynniki, które są używane na etapie pobierania antygenu, aby usunąć aktywność wcześniej wybarwionego pierwszorzędowego kompleksu przeciwciał. Preparaty barwiono pierwszym przeciwciałem pierwszorzędowym przy użyciu ogólnego protokołu barwienia immunologicznego, po którym nastąpił etap wiązania z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym. Następnie zastosowano metodę wytwarzania sygnału peroksydazy awidyny-biotyny z fluoroforem-tyramidem jako substratem. Immunoaktywność pierwszego pierwszorzędowego kompleksu przeciwciał została usunięta przez zanurzenie w mikrofalowym wrzącym roztworze cytrynianu sodu na 8 minut. Nierozpuszczalne osadzanie się fluoroforu i tyramidu pozostało na próbce, co pozwoliło na zabarwienie szkiełka innymi przeciwciałami pierwszorzędowymi. Chociaż ta metoda eliminuje większość sygnałów fałszywie dodatnich, może pozostać pewne tło z reaktywności krzyżowej przeciwciał. Jeżeli próbki są wzbogacone endogenną biotyną, można zastosować przeciwciało drugorzędowe sprzężone z peroksydazą w celu zastąpienia biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego, aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich z odzyskanej endogennej biotyny.
Wprowadzenie
W barwieniu immunologicznym multipleksowym, bezpośrednie barwienie za pomocą sprzężonych przeciwciał pierwszorzędowych może dostarczyć pouczających wyników. Bez użycia przeciwciał drugorzędowych, metoda bezpośredniego barwienia wiąże się z niskim ryzykiem fałszywych sygnałów kolokalizacji z reaktywności krzyżowej przeciwciał. Jednak sprzężone reportery (fluorofor, enzymy) lub biotyna na pierwszorzędowym przeciwciałie ograniczają jego przyszłe zastosowanie. Alternatywnie, pośrednie barwienie immunologiczne zwykle zapewnia silniejsze sygnały przy użyciu niesprzężonego przeciwciała pierwszorzędowego z znakowanym przeciwciałem drugorzędowym. Idealnie byłoby, gdyby niesprz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Barwienie pierwszym przeciwciałem
- Odwoskuj i ponownie uwodnij szkiełka FFPE w ciągu 5 minut przeznaczonych na każdy z następujących etapów: ksylen lub równoważne odczynniki 3x, 100% etanol 2x, 95% etanol 1x, 70% etanol 1x, 50% etanol 1x i woda destylowana 2x,
UWAGA: Szkiełka powinny pozostać wilgotne, począwszy od tego etapu ponownego nawodnienia, aż do montażu w ostatnim kroku. - W celu opcjonalnego pobrania antygenu umieścić szkiełka w 275 ml wrzącego roztworu cytrynianu sodu (10 mM, pH = 6,0) na 8 minut. Aby roztwór pozostał w stanie wrzenia, umieść szkiełka płasko na dnie pudełka z końcówkami do pipet o wymiarach 14 x 9,5 x 9 cm3....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wyniki uzyskano z próbek poddanych wszystkim opisanym etapom, w tym etapowi 1.2 dotyczącemu odsłaniania antygenów. Wszystkie użyte tutaj przeciwciała wtórne były biotynilowane. W celu opracowania sygnałów z pierwszego i drugiego przeciwciała pierwszorzędowego zastosowano fluorofor-tyramidę. Obrazy zarejestrowano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kostkę FITC (dla fluorescencji zielonej), kostkę TxRED (dla Cy3) oraz kostkę DAPI (dla DAPI).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Multipleksowe barwienie immunologiczne jest przydatne do badania kolokalizacji komórkowej dwóch lub więcej antygenów. Ta szeroko stosowana technika daje przekonujące wyniki kolokalizacji, gdy pierwszorzędowe przeciwciała są sprzężone z różnymi reporterami (barwienie bezpośrednie). Jednak barwienie bezpośrednie zwykle zapewnia słabsze sygnały w porównaniu z barwieniem pośrednim, które obejmuje sprzężone przeciwciała drugorzędowe w celu wykrycia przeciwciał pierwszorzędowych. W barwieniu pośrednim wysokiej jakości wynik ba.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca jest wspierana przez NIH R00 HD032636.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotynylowany osioł anty-mysz | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 rozcieńczenie |
| Biotynylowany osioł anty-królik | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 rozcieńczenie |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μ g / ml w wodzie destylowanej |
| Mikroskop fluorescencyjny | ECHO | Revolve 4 | |
| Streptawidyna sprzężona z peroksydazą chrzanową | JacksonImmuno | 016-030-084 | Rozcieńczenie 1:1,000 |
| Kuchenka mikrofalowa, 700 W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anty-CYP2F2 | Santa Cruz | SC-374540 | 1:250 rozcieńczenie |
| Mysz anty-TH | Santa Cruz | SC-25269 | Rozcieńczenie 1:1,000 |
| Normalna surowica osła | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% surowica w PBST |
| Królik anty-20&alfa; HSD | Kerafast | EB4002 | rozcieńczenie 1:500 |
| Królik anty-3β HSD | TransGenic | KO607 | 1:250 rozcieńczenie |
| Królik anty-TH | NOVUS | NB300-109 | 1:1,000 rozcieńczenie |
| Królik anty-β-katenina | Abcam | ab32572 | 1:500 rozcieńczenie |
| Streptawidyna Peroksydaza chrzanowa (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1,000 rozcieńczenie |
| TSA Cy3 Tyramid | PerkinElmer | SAT704B001EA | Rozcieńczenie 1:100 |
| TSA Fluoresceina Tyramid | PerkinElmer | SAT701001EA | rozcieńczenie 1:100 |
Bibliografia
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
