Artykuł metodologiczny

Podgrzewanie w kuchence mikrofalowej i fluorofor-tyramamid do multipleksowego barwienia immunologicznego nadnerczy myszy − przy użyciu niesprzężonych przeciwciał pierwszorzędowych od tego samego gatunku gospodarza

DOI:

10.3791/60868

⸱

21 lutego 2020

 ,  ,  , 
1College of Animal Science & Technology, Henan University of Science and Technology, 2Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine, Auburn University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ustalono kilka różnych metod barwienia immunologicznego przy użyciu pierwotnych przeciwciał od tego samego gatunku gospodarza. W tym miejscu opisujemy zastosowanie usuwania przeciwciał za pośrednictwem mikrofal i tyramidu fluoroforowego do blokowania reaktywności krzyżowej przeciwciał podczas multipleksowego barwienia immunologicznego na utrwalonych w formalinie odcinkach nadnerczy myszy zatopionych w parafinie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Barwienie immunologiczne jest szeroko stosowane w badaniach biomedycznych, aby pokazać wzór ekspresji komórkowej danego białka. Multipleksowe barwienie immunologiczne umożliwia znakowanie przy użyciu wielu przeciwciał pierwszorzędowych. Aby zminimalizować reaktywność krzyżową przeciwciał, barwienie immunologiczne multipleksowe przy użyciu barwienia pośredniego wymaga nieznakowanych przeciwciał pierwszorzędowych od różnych gatunków gospodarzy. Jednak odpowiednia kombinacja przeciwciał różnych gatunków nie zawsze jest dostępna. W tym miejscu opisujemy metodę stosowania nieznakowanych przeciwciał pierwszorzędowych od tego samego gatunku gospodarza (np. W tym przypadku oba przeciwciała pochodzą od królika) do immunofluorescencji multipleksowej na mysich odcinkach nadnerczy zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie. Metoda ta wykorzystuje tę samą procedurę i odczynniki, które są używane na etapie pobierania antygenu, aby usunąć aktywność wcześniej wybarwionego pierwszorzędowego kompleksu przeciwciał. Preparaty barwiono pierwszym przeciwciałem pierwszorzędowym przy użyciu ogólnego protokołu barwienia immunologicznego, po którym nastąpił etap wiązania z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym. Następnie zastosowano metodę wytwarzania sygnału peroksydazy awidyny-biotyny z fluoroforem-tyramidem jako substratem. Immunoaktywność pierwszego pierwszorzędowego kompleksu przeciwciał została usunięta przez zanurzenie w mikrofalowym wrzącym roztworze cytrynianu sodu na 8 minut. Nierozpuszczalne osadzanie się fluoroforu i tyramidu pozostało na próbce, co pozwoliło na zabarwienie szkiełka innymi przeciwciałami pierwszorzędowymi. Chociaż ta metoda eliminuje większość sygnałów fałszywie dodatnich, może pozostać pewne tło z reaktywności krzyżowej przeciwciał. Jeżeli próbki są wzbogacone endogenną biotyną, można zastosować przeciwciało drugorzędowe sprzężone z peroksydazą w celu zastąpienia biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego, aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich z odzyskanej endogennej biotyny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W barwieniu immunologicznym multipleksowym, bezpośrednie barwienie za pomocą sprzężonych przeciwciał pierwszorzędowych może dostarczyć pouczających wyników. Bez użycia przeciwciał drugorzędowych, metoda bezpośredniego barwienia wiąże się z niskim ryzykiem fałszywych sygnałów kolokalizacji z reaktywności krzyżowej przeciwciał. Jednak sprzężone reportery (fluorofor, enzymy) lub biotyna na pierwszorzędowym przeciwciałie ograniczają jego przyszłe zastosowanie. Alternatywnie, pośrednie barwienie immunologiczne zwykle zapewnia silniejsze sygnały przy użyciu niesprzężonego przeciwciała pierwszorzędowego z znakowanym przeciwciałem drugorzędowym. Idealnie byłoby, gdyby niesprzężone przeciwciała pierwszorzędowe stosowane w barwieniu immunologicznym multipleksowym pochodziły od różnych gatunków gospodarzy, aby uniknąć reaktywności krzyżowej przeciwciał. Jednak odpowiednia kombinacja przeciwciał pierwszorzędowych pochodzących od różnych gatunków gospodarzy nie zawsze jest dostępna.

Ustanowiono kilka metod mających na celu wyeliminowanie ryzyka reakcji przeciwciała drugorzędowego z niepożądanym przeciwciałem pierwotnym. Jedną z powszechnych metod jest użycie przeciwciała monomerycznego F(ab) w celu zablokowania wszelkich pozostałych epitopów wiążących na pierwszym pierwszorzędowym kompleksie przeciwciał przed barwieniem drugim pierwotnym przeciwciałem1. Usuwanie przeciwciał, które jest podobne do paska i reprobacji arkusza Western blot, usuwa wcześniej wybarwiony kompleks przeciwciał bez usuwania osadzania się wykrywalnych cząsteczek reporterowych, takich jak tetrachlorowodorek 3,3'-diaminobenzydyny (DAB)2 i fluorescencyjne osadzanie tyramidu3. Dzięki tej metodzie cząsteczki reporterowe w różnych kolorach mogą pokazać wynik multipleksu na tym samym szkiełku. Barwienie multipleksowe jest również możliwe do osiągnięcia poprzez całkowite usunięcie wcześniej zdeponowanych warstw przeciwciał i wyrównanie następnie uzyskanych obrazów z innych przeciwciał4,5. Wszystkie te metody dają wiarygodne wyniki, chociaż każda z nich ma swoje ograniczenia i wymaga skomplikowanych procedur lub specjalnego systemu obrazowania.

Obecny protokół pokazuje zastosowanie metody usuwania przeciwciał z wykorzystaniem powszechnie dostępnych. Protokół ten może być stosowany do wykonywania multipleksowego barwienia immunofluorescencyjnego na utrwalonych w formalinie odcinkach nadnerczy myszy zatopionych w parafinie (FFPE) za pomocą dwóch nieznakowanych przeciwciał pierwszorzędowych od tego samego gatunku gospodarza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Barwienie pierwszym przeciwciałem

  1. Odwoskuj i ponownie uwodnij szkiełka FFPE w ciągu 5 minut przeznaczonych na każdy z następujących etapów: ksylen lub równoważne odczynniki 3x, 100% etanol 2x, 95% etanol 1x, 70% etanol 1x, 50% etanol 1x i woda destylowana 2x,
    UWAGA: Szkiełka powinny pozostać wilgotne, począwszy od tego etapu ponownego nawodnienia, aż do montażu w ostatnim kroku.
  2. W celu opcjonalnego pobrania antygenu umieścić szkiełka w 275 ml wrzącego roztworu cytrynianu sodu (10 mM, pH = 6,0) na 8 minut. Aby roztwór pozostał w stanie wrzenia, umieść szkiełka płasko na dnie pudełka z końcówkami do pipet o wymiarach 14 x 9,5 x 9 cm3 (szer. x dł. x wys.) z pokrywką i podgrzewaj roztwór w kuchence mikrofalowej o mocy 700 W w kuchence mikrofalowej o mocy 700 W przez 8 minut. Następnie wyjmij pudełko z końcówkami do pipet z kuchenki mikrofalowej, otwórz pokrywę i pozwól roztworowi ostygnąć w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej 20 minut.
  3. Przenieść szkiełka do słoika Coplin zawierającego PBST (sól fizjologiczna buforowana fosforanami z 0,1% polisorbatem 20/80). Myć PBST przez 5 min 3x. Jeśli nie przejdziesz od razu do następnego kroku, przechowuj szkiełka na tym etapie z PBST w słoiku Coplin w temperaturze pokojowej przez kilka godzin lub w temperaturze 4 °C przez 1-2 dni, jeśli nie przechodzisz natychmiast do następnego kroku.
  4. Do przygotowania roztworu blokującego należy użyć normalnej surowicy drugorzędowego gatunku gospodarza przeciwciała jako odczynnika blokującego. Można również stosować inne komercyjne odczynniki blokujące. W przypadku stosowania normalnej surowicy zastosowanej w badaniu przedstawionym w tym badaniu, dodaj 100 μl normalnej surowicy osła do 4,9 ml PBST. Roztwór blokujący można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 dni.
  5. W celu zablokowania strząśnij PBST ze szkiełek i szybko przykryj je odpowiednią ilością roztworu blokującego. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze przez 30 minut.
  6. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego (500 μl na dwie szkiełka) przy użyciu roztworu blokującego, aby rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe do pożądanego stężenia. Roztwór należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.
    1. W przypadku 3βHSD dodać 2 μl 3βHSD do 498 μl roztworu blokującego.
    2. W przypadku TH dodać 0,5 μl przeciwciała TH do 499 μl roztworu blokującego.
    3. W przypadku β-kateniny dodać 1 μl przeciwciała β-kateniny do 499 μl roztworu blokującego.
    4. W przypadku 20αHSD dodaj 1 μl przeciwciała 20αHSD do 499 μl roztworu blokującego.
    5. W przypadku CYP2F2 dodać 2 μl przeciwciała CYP2F2 do 498 μl roztworu blokującego.
  7. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym, strząsając roztwór blokujący ze szkiełek i szybko przykrywając je wystarczającą ilością roztworu przeciwciała pierwszorzędowego. Inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez noc w temperaturze 4 °C. Podczas inkubacji szkiełka mogą być przykryte małym kawałkiem folii parafinowej, aby zapobiec wysychaniu.
  8. Następnego ranka myj szkiełka PBST przez 5 minut 3x.
  9. Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego (500 μl na dwa szkiełka) przy użyciu roztworu blokującego w celu rozcieńczenia biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego do pożądanego stężenia (np. 1 μl przeciwciała przeciwko myszom osła lub przeciwciała przeciwko królikowi w 499 μl roztworu blokującego). Roztwór należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.
  10. Inkubować z drugim przeciwciałem, strząsając PBST ze szkiełek i szybko przykrywając je wystarczającą ilością roztworu przeciwciał drugorzędowych. Inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze RT.
    UWAGA: Jeśli problemem jest endogenna biotyna, należy użyć przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z peroksydazą zamiast biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego. Przejdź do kroku 1.14, jeśli używasz przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z peroksydazą w kroku 1.10.
  11. Myć szkiełka PBST przez 5 minut 3x.
  12. Przygotować roztwór streptawidyny sprzężonej z peroksydazą chrzanową (SA-HRP) (500 μl na dwie szkiełka), dodając 0,5 μl SA-HRP do 499 μl PBS. Końcowe stężenie wynosi 1 μg/ml.
  13. Inkubować z roztworem SA-HRP. Strząśnij PBST ze szkiełek i szybko przykryj szkiełka odpowiednią ilością roztworu SA-HRP. Inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez 0,5 godziny w temperaturze pokojowej.
  14. Myć szkiełka PBST przez 5 minut 3x.
  15. Przygotować roztwór fluoroforu i tyramidu przez rozcieńczenie fluoroforu tyramidu z jego buforem rozcieńczającym zgodnie z instrukcjami producenta (np. 5 μl fluorofor-tyramidu w 496 μl buforu rozcieńczającego).
  16. Przeprowadzić wytwarzanie sygnału za pomocą tyramidu fluoroforowego, strząsając PBST ze szkiełek i szybko pokrywając szkiełka wystarczającą ilością roztworu fluoroforu-tyramidu. Inkubować w wilgotnej komorze przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Czas inkubacji można dostosować w celu uzyskania pożądanej intensywności fluorescencji. Zatrzymaj reakcję, przenosząc szkiełka do słoika Coplin zawierającego PBST. Myć szkiełka preparatem PBST przez 3 min 2x.
  17. Sygnały można szybko sprawdzić pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby potwierdzić wynik na tym etapie. Jeśli szkiełka nakrywkowe nie są używane, nałóż kroplę glicerolu:PBS (1:1) na każdą sekcję, aby próbki były wilgotne. Myć szkiełka preparatem PBST przez 3 min 2x. Preparaty można przechowywać w PBST w temperaturze 4 °C przez kilka dni przed przejściem do następnego etapu.

2. Usuń pierwsze przeciwciało

  1. Umieścić szkiełka w 275 ml wrzącego roztworu cytrynianu sodu (10 mM, pH = 6,0) na co najmniej 8 minut. Utrzymuj roztwór w stanie wrzenia, umieszczając szkiełka płasko na dnie pudełka z końcówkami do pipet o wymiarach 14 x 9,5 x 9 cm(szer. x dł. x wys.) z pokrywką i podgrzewając roztwór w kuchence mikrofalowej o mocy 70% w kuchence mikrofalowej o mocy 700 W przez 8 minut. Jeżeli preferowany jest dłuższy czas oddzielania, może być konieczne uzupełnienie buforu wrzącym roztworem cytrynianu sodu, aby szkiełka były przez cały czas zanurzone w roztworze buforowym. Wyjmij pudełko końcówek do pipet z kuchenki mikrofalowej, otwórz pokrywę i pozwól roztworowi ostygnąć w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 minut.
  2. Przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego PBST. Myć PBST przez 5 min 3x. Jeśli następny krok nie zostanie wykonany natychmiast, przechowuj szkiełka w słoiku Coplin z PBST w temperaturze pokojowej przez kilka godzin lub w temperaturze 4 °C przez 1-2 dni.

3. Barwienie drugim przeciwciałem

  1. Zacznij od kroku blokowania i postępuj zgodnie z tymi samymi procedurami w kroku od 1.5 do kroku 1.14. Na etapach wytwarzania sygnału (krok 1.15 i krok 1.16) należy użyć tyramidu fluoroforowego w innym spektrum fluorescencji.
    UWAGA: Szkiełka można kilkakrotnie zdejmować przy użyciu tej metody, aby umożliwić barwienie multipleksowe. Ostatnie przeciwciało nie wymaga fluoroforu-tyramidu jako reportera. Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem może być użyte do pokazania sygnałów z ostatniego przeciwciała pierwszorzędowego.
  2. Inkubować szkiełka z 2 μg/ml roztworu 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) lub Hoechsta przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, jeśli potrzebne jest barwienie jądrowe. Następnie umyj szkiełka PBST przez 3 minuty 2x.

4. Obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego do wykrywania sygnałów

  1. Zamontuj szkiełko nakrywkowe z kroplą podłoża montażowego odpowiedniego do immunofluorescencji.
  2. Do obrazowania użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby wykryć sygnały każdego kanału fluorescencji. Zacznij od kanału barwienia jądrowego (DAPI) i soczewki 4x, aby zlokalizować tkankę na szkiełku.
  3. Przełącz się na obiektyw 10x do obrazowania. Dostosuj czas ekspozycji (300 ms) i intensywność źródła światła (intensywność 80%). Dostosuj te ustawienia, jeśli sygnał jest zbyt jasny lub zbyt ciemny. Rób zdjęcia każdego kanału bez przesuwania sceny. Dla każdego kanału może być konieczne ponowne ustawienie ostrości. Scal obrazy z każdego kanału za pomocą oprogramowania mikroskopu lub ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki uzyskano z próbek poddanych działaniu wszystkich opisanych kroków, w tym kroku pobierania antygenu 1.2. Wszystkie użyte tu przeciwciała drugorzędowe były biotynylowane. Fluorofor-tyramid został wykorzystany do opracowania sygnałów z pierwszego i drugiego przeciwciała pierwszorzędowego. Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kostkę FITC (dla zielonej fluorescencji), kostkę TxRED (dla Cy3) i kostkę DAPI (dla DAPI).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multipleksowe barwienie immunologiczne jest przydatne do badania kolokalizacji komórkowej dwóch lub więcej antygenów. Ta szeroko stosowana technika daje przekonujące wyniki kolokalizacji, gdy pierwszorzędowe przeciwciała są sprzężone z różnymi reporterami (barwienie bezpośrednie). Jednak barwienie bezpośrednie zwykle zapewnia słabsze sygnały w porównaniu z barwieniem pośrednim, które obejmuje sprzężone przeciwciała drugorzędowe w celu wykrycia przeciwciał pierwszorzędowych. W barwieniu pośrednim wysokiej jakości wynik ba...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez NIH R00 HD032636.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Antifade Mounting MediumVector LaboratoriesH-1000
Biotynylowany osioł anty-myszJacksonImmuno715-066-1511:500 rozcieńczenie
Biotynylowany osioł anty-królikJacksonImmuno711-066-1521:500 rozcieńczenie
DAPIBioLegend4228012 μ g / ml w wodzie destylowanej
Mikroskop fluorescencyjnyECHORevolve 4
Streptawidyna sprzężona z peroksydazą chrzanowąJacksonImmuno016-030-084Rozcieńczenie 1:1,000
Kuchenka mikrofalowa, 700 WGeneral ElectricJEM3072DH1BB
Mouse anty-CYP2F2Santa CruzSC-3745401:250 rozcieńczenie
Mysz anty-THSanta CruzSC-25269Rozcieńczenie 1:1,000
Normalna surowica osłaJacksonImmuno017-000-1212% surowica w PBST
Królik anty-20&alfa; HSDKerafastEB4002rozcieńczenie 1:500
Królik anty-3β HSDTransGenicKO6071:250 rozcieńczenie
Królik anty-THNOVUSNB300-1091:1,000 rozcieńczenie
Królik anty-β-kateninaAbcamab325721:500 rozcieńczenie
Streptawidyna Peroksydaza chrzanowa (SA-HRP)JacksonImmuno016-303-0841:1,000 rozcieńczenie
TSA Cy3 TyramidPerkinElmerSAT704B001EARozcieńczenie 1:100
TSA Fluoresceina TyramidPerkinElmerSAT701001EArozcieńczenie 1:100

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  2. Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
  3. Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
  4. Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization. PLoS One. 7 (2), e32043(2012).
  5. Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
  6. Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  7. Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
  8. Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
  9. Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
  10. Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
  11. Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
  12. Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
  13. Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
  14. Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Odtrawianie mikrofaloweodmaskowywanie antygen wawidyna biotyna peroksydazamikroskopia fluorescencyjnaskrawki FFPEreaktywno krzy owa przeciwcia

Powiązane artykuły