Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zwiększona żywotność kultur hydrożelowych ex vivo 3D ksenoprzeszczepów pobranych od pacjentów w perfuzjonej platformie mikroprzepływowej

5.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60872

⸱

5 grudnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of BioSciences, Rice University, 2Mimetas US Inc, 3Department of Genitourinary Medical Oncology Research, Division of Cancer Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Mimetas B.V., 5Department of Bioengineering, Rice University, 6Department of Diagnostic and Biomedical Sciences, The University of Texas Health Science Center, 7Sheikh Ahmed Center for Pancreatic Cancer Research, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół demonstruje metody umożliwiające rozszerzoną hodowlę in vitro ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX). Jeden etap zwiększa ogólną żywotność wielokomórkowych kultur klastrowych w hydrożelach 3D, poprzez proste usuwanie niezdolnych do życia pojedynczych komórek. Drugi krok demonstruje najlepsze praktyki dotyczące hodowli PDX w perfuzjowanej platformie mikroprzepływowej.

Streszczenie

Ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjenta (PDX), powstające podczas bezpośredniego wszczepiania tkanki nowotworowej pacjenta do myszy z obniżoną odpornością, pozostają biologicznie stabilne, zachowując w ten sposób cechy molekularne, genetyczne i histologiczne, a także heterogeniczność pierwotnego guza. Jednak wykorzystanie tych modeli do przeprowadzania wielu eksperymentów, w tym badań przesiewowych leków, jest zaporowe zarówno pod względem kosztów, jak i czasu. Trójwymiarowe (3D) systemy hodowli są powszechnie postrzegane jako platformy, w których komórki nowotworowe zachowują swoją integralność biologiczną poprzez interakcje biochemiczne, morfologię i architekturę. Nasz zespół ma duże doświadczenie w hodowli komórek PDX in vitro przy użyciu matryc 3D złożonych z kwasu hialuronowego (HA). W celu oddzielenia komórek zrębu fibroblastów myszy związanych z PDX używamy hodowli rotacyjnej, w której komórki zrębu przylegają do powierzchni płytek poddanych hodowli tkankowej, podczas gdy zdysocjowane komórki nowotworowe PDX unoszą się i łączą w wielokomórkowe klastry. W supernatancie unoszą się również pojedyncze, często martwe komórki, które stanowią wyzwanie w zbieraniu żywotnych klastrów PDX do dalszej enkapsulacji w hydrożele do hodowli komórek 3D. Aby oddzielić te pojedyncze komórki od klastrów żywych komórek, zastosowaliśmy wirowanie w gradionym gradieniu gęstości. Opisany tutaj protokół pozwala na wyczerpanie niezdolnych do życia pojedynczych komórek ze zdrowej populacji klastrów komórkowych, które zostaną wykorzystane do dalszych eksperymentów in vitro. W naszych badaniach włączamy kultury 3D do płytek mikroprzepływowych, które pozwalają na perfuzję pożywki podczas hodowli. Po ocenie powstałych kultur za pomocą opartego na obrazie fluorescencyjnym testu żywotności komórek oczyszczonych i nieoczyszczonych, nasze wyniki pokazują, że ten dodatkowy etap separacji znacznie zmniejszył liczbę niezdolnych do życia komórek z naszych hodowli.

Wprowadzenie

W ciągu ostatniej dekady, dziedzina badań nad rakiem wykazała nowy entuzjazm dla ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) jako narzędzia do oceny zależności od szlaku komórek nowotworowych i podatności na leki1. Najczęstsze modele PDX są ustalane przez podskórne lub ortotopowe wszczepienie ludzkich komórek nowotworowych - fragmentu guza, klastra zdysocjowanych komórek pochodzących z guza lub próbki izolowanych krążących komórek nowotworowych (CTC) - do gospodarza gryzonia. Jeśli "pobranie" guza się powiedzie, komórki ksenoprzeszczepu będą się namnażać, unaczyniać i w inny sposób wchodzić w interakcje z tkanką gospodarza, tworząc guz, który można pobrać w optymalnym rozmiarze, podzielić i ponownie wszczepić do innych gospodarzy. Wśród ich wielu zalet jako systemu modelowego, PDX zazwyczaj zachowują znaczną część heterogeniczności natywnej populacji komórek nowotworowych i umożliwiają ocenę specyficznych dla człowieka ścieżek i odpowiedzi komórek2,3. Kontekst in vivo umożliwia interakcję guza z naczyniami krwionośnymi i innymi sąsiednimi zrębami oraz podsumowuje cechy tkanki, takie jak dynamika dyfuzji leków, napięcie tlenu i wpływ macierzy zewnątrzkomórkowej, które biologicznie i mechanicznie wpływają na progresję guza. Negatywnym aspektem PDX jest ich zależność od żywiciela gryzonia, zarówno w celu ekspansji guza, jak i ostatecznie w celu testowania hipotez. Ponieważ wiele PDX nie może przystosować się do tradycyjnej dwuwymiarowej (2D) hodowli polistyrenu do hodowli tkankowych bez utraty wielu pożądanych cech, badacze mieli minimalny kompromis między tą stosunkowo kontrolowaną metodą in vitro a znacznym wzrostem kosztów, obiektów i wymagań czasowych dotyczących stosowania PDX in vivo.

Opisaliśmy wiele modeli in vitro, które implementują hodowlę komórek 3D w matrycy wspomagającej, a ostatnio rozszerzyliśmy tę pracę, aby zademonstrować hodowlę ex vivo PDX pochodzących z mnogiego raka prostaty (PCa), zarówno samodzielnie, jak i w kokulturze z fibroblastami pochodzącymi ze szpiku kostnego4,5. Matryce hydrożelowe na bazie kwasu hialuronowego (HA) zapewniają konfigurowalne i biologicznie istotne wsparcie dla obu typów komórek, z łatwą kontrolą właściwości hydrożelu i przejrzystością optyczną do obrazowania za pomocą hydrożelu głębokość6.

Dojrzałe tkanki nowotworowe PDX stanowią zmienną mieszaninę heterogenicznych ludzkich komórek nowotworowych i zrębu myszy (fibroblasty, komórki śródbłonka itp.). Aby zbadać specyficzny dla typu komórki wkład w progresję guza in vitro, korzystne może być dysocjowanie guzów, oddzielenie populacji komórek i eksperymentalne włączenie ich w zorganizowany sposób w celu przeanalizowania ścieżek komunikacji międzykomórkowej. Mieszane populacje komórek w pofermentach tkankowych mają różną zgodność z określonymi warunkami hodowli. Na przykład żywotność fibroblastów związanych z nowotworem wymaga albo przylegania do powierzchni, albo matryc 3D funkcjonalizowanych ligandami integrynowymi, podczas gdy komórki PDX pochodzące z nabłonka zazwyczaj nie mają tych wymagań, zamiast tego faworyzują interakcje komórka-komórka. Różnice te można wykorzystać do osiągnięcia skutecznego oddzielenia komórek PDX od zanieczyszczających komórek zrębu myszy. Rotacyjna hodowla pofermentów tkankowych umożliwia przyleganie komórek zrębu do powierzchni hodowli tkankowej, podczas gdy adhezje komórka-komórka napędzają komórki PDX unoszące się nad obracającą się powierzchnią hodowli, tworząc wielokomórkowe klastry w supernatancie w ciągu 24−48 godzin. Specyficzne cechy tych skupisk różnią się w zależności od PDX (np. duże, ciasne, wysoce kuliste grona lub mniejsze, luźniejsze agregaty przypominające kiście winogron), ale zazwyczaj mają biologicznie istotne rozmiary (średnica 50−250 μm), wystarczające do oceny interakcji komórkowych, które opierają się na kontaktach międzykomórkowych.

Pobieranie i przetwarzanie guza nieuchronnie prowadzi do pewnego stopnia obustronnej śmierci komórki, albo z powodu krótkotrwałych uszkodzeń spowodowanych zakłóceniami mechanicznymi/enzymatycznymi, albo długotrwałej niezgodności subpopulacji z wybranymi warunkami hodowli. Pomimo użyteczności hodowli rotacyjnej jako początkowej separacji masowej, martwe lub umierające komórki są nieuchronnie przenoszone z klastrami PDX i mogą wpływać na wynikową hodowlę. Te martwe komórki są często pojedynczymi komórkami PDX, które nie zostały zintegrowane w klaster, fibroblastami zrębu myszy, które nie mogą przetrwać w wybranych warunkach hodowli, lub szczególnie delikatnymi komórkami śródbłonka. Takie umierające komórki mogą wpływać na wyniki eksperymentalne od "ocalałych" i mogą znacząco wpływać na kwantyfikację, np. za pomocą testów przesiewowych żywotności opartych na obrazach fluorescencyjnych. Aby poprawić selekcję żywych komórek PDX z tej metody, dostosowaliśmy metody wirowania z krokami gęstości, aby łatwo usunąć pojedyncze martwe/umierające komórki z mieszanin PDX i zachować głównie żywe klastry wielokomórkowe.

Aby wzbogacić badania wynikowych klastrów pochodzących z PDX w hodowli 3D, wykorzystaliśmy platformę do hodowli perfuzyjnej opartą na mikrofluidyce, OrganoPlate (Rysunek 1), która jest wysokoprzepustową platformą narządów na chipie, która pozwala na jednoczesną hodowlę do 96 indywidualnych perfuzjonowanych, 3D kultur na 384-dołkowej mikropłytce (Rysunek 1A)7,8. W 2-pasmowej płytce mikroprzepływowej pojedynczy chip tkankowy jest połączony dwoma kanałami mikroprzepływowymi (Rysunek 1B, kanał żelowy: czerwony, kanał perfuzyjny: niebieski), które obejmują cztery dołki w rzędzie. Dwa kanały mikroprzepływowe są oddzielone krótkim plastikowym grzbietem zwanym Phaseguide, który zapobiega przelewaniu się jednego kanału do sąsiedniego kanału, a jednocześnie pozwala na bezbłonowe połączenie między zawartością żelu a kanałem perfuzyjnym9. Ponieważ spód płytki mikroprzepływowej składa się ze szkła klasy mikroskopowej, kultury można oglądać w oknie obserwacyjnym przez spód płytki za pomocą mikroskopu standardowego lub automatycznego. Perfuzja jest ustalana w płytce mikroprzepływowej za pomocą programowalnego kołyska, wykorzystującego grawitację do kierowania mediów przez kanały mikroprzepływowe między studzienkami zbiornika (Rysunek 1C). Przepływ perfuzyjny naśladuje dokładniej mikrośrodowisko guza niż hodowla statyczna, umożliwiając włączenie naprężeń ścinających i zwiększoną dystrybucję gazów i składników odżywczych. Korzyści płynące z utrzymywania perfundowanej hodowli komórek rakowych w płytce mikroprzepływowej zostały wcześniej opisane, ponieważ perfundowane hodowle raka piersi wykazywały optymalną żywotność w porównaniu ze statyczną hodowlą 3D tych samych komórek7.

Niniejszy raport opisuje dostosowaną metodę wirowania gradientu gęstości do izolowania żywych wielokomórkowych klastrów PDX i demonstruje jej użyteczność w tworzeniu kultur 3D PDX na perfuzyjnych płytkach mikroprzepływowych. Ponieważ coraz więcej laboratoriów badawczych poszukuje metod ułatwiających korzystanie z PDX, przewidujemy, że przedstawione tutaj protokoły okażą się natychmiast użyteczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Tkanka nowotworowa została pobrana za zgodą pacjenta i zgodnie z zatwierdzonym protokołem Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB). Ksenoprzeszczepy zostały wszczepione, wyhodowane i pobrane zgodnie z przyjętym protokołem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC).

UWAGA: Wszystkie prace mają być wykonywane w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby utrzymać sterylność. Wszystkie czynności należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej, chyba że określono inaczej.

1. Przygotowanie materiałów do obróbki PDX

  1. Kleszcze do autoklawu i rękojeść skalpela lub żyletki.
  2. Rozmrozić roztwór enzymu dysocjującego w temperaturze 4 °C przez noc lub w temperaturze pokojowej tego samego dnia, w którym następuje dysocjacja tkanek.
    UWAGA: Nie zaleca się rozmrażania w temperaturze 37 °C, ponieważ może to dezaktywować niektóre enzymy dysocjacyjne.
  3. Przygotować co najmniej 100 ml pożywki PDX (zmodyfikowana mieszanka składników odżywczych Eagle firmy Dulbecco F-12 [DMEM-F12] ze 100 j./ml penicyliny i streptomycyny oraz 30% płodowej surowicy bydlęcej [FBS]) i co najmniej 25 ml pożywki do przetwarzania PDX (DMEM-F12 ze 100 j/ml penicyliny i streptomycyny i bez FBS). Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do użycia.

2. Dysocjacja PDX i wstępne oczyszczanie składnika zrębu

  1. Zbierz autoklawowane naczynia, sitka do komórek 70 μm (2−3), okrągłe szalki do hodowli tkankowych o średnicy 60 mm (2), 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych, sterylne stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml i sterylną sól fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem (PBS). Podgrzej pożywkę do 37 °C i pozwól, aby roztwór enzymu dysocjującego osiągnął temperaturę pokojową.
  2. Gdy tkanka PDX osiągnie średnicę 1,0-1,5 cm u gospodarza myszy, chirurgicznie usuń guz z myszy standardowymi środkami (np. w przyjętym znieczuleniu) i przechowuj na lodzie w probówce o pojemności 50 ml z pożywką hodowlaną PDX (Figura 2A). Przetwarzaj tkankę szybko, wykonując poniższe czynności, aby zmaksymalizować żywotność komórek, najlepiej w ciągu 1-2 godzin po pobraniu.
  3. Przenieś tkankę nowotworową do wstępnie zważonej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Przepłukać 6x 30 ml sterylnego PBS w celu usunięcia krwi i zanieczyszczeń. Usuń jak najwięcej płynu i zważ tkankę nowotworową.
  4. Przenieś tkankę nowotworową do okrągłego naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm i zmiel na ~1 mm3 kawałki za pomocą sterylnej żyletki lub skalpela.
  5. Dodaj 5 ml pożywki do przetwarzania PDX, aby zebrać zawiesinę guza i przenieść do nowej sterylnej probówki o pojemności 50 ml. Przepłukać naczynie hodowlane kolejnym 5 ml pożywki do przetwarzania PDX, a następnie roztworem enzymu dysocjacyjnego (10 ml / g guza, co najmniej 5 ml), dodając wszystkie płukanki do probówki o pojemności 50 ml.
  6. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając. Delikatnie zakręć probówką w połowie czasu inkubacji.
  7. Delikatnie pipetować w górę i w dół pipetą serologiczną, aby rozbić grudki. Komórki filtracyjne z sitkiem o pojemności 70 μm umieszczonym na nowej sterylnej probówce o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Może być konieczne użycie więcej niż jednego sitka.
  8. Wirować przy 200 x g przez 5 minut do komórek osadzania. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 2-3 ml pożywki hodowlanej PDX. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
  9. Skorzystaj z tabeli 1, aby oszacować wymaganą liczbę zdysocjowanych komórek pochodzących z PDX, potrzebnych do osiągnięcia pożądanej gęstości komórek na chip.
    UWAGA: Wartości w tabeli 1 mają służyć jako punkt początkowy. Rzeczywiste wartości będą się różnić ze względu na żywotność tkanek/komórkowość i utratę komórek w wyniku zamrożenia/regeneracji. Guzy PDX są indywidualnymi osobnikami nawet w obrębie danego typu nowotworu, więc wartości te powinny być dostosowane empirycznie.
  10. Z liczby obliczonej w kroku 2.9, płytka 1−2 x 106 komórek w 5 ml pożywki hodowlanej PDX na dołek 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Inkubować (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności) przez 48 godzin z delikatnym potrząsaniem (50−55 obr./min), aby przyspieszyć tworzenie klastrów (Rysunek 2B). Po utworzeniu się klastra przejdź do sekcji 3 w celu odwirowania.
  11. Kriokonserwuj nieużywane komórki PDX przed początkową dysocjacją w 50% FBS + 40% DMEM-F12 + 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) lub dostępnym na rynku pierwotnym podłożu do zamrażania komórek.
    UWAGA: Przylegające komórki zrębu myszy można również odzyskać z powierzchni płytki tkankowej, w razie potrzeby, przez krótkie płukanie pożywką hodowlaną i rozszerzanie standardowymi środkami.
  12. W celu późniejszego wykorzystania kriokonserwowanych komórek nowotworowych PDX/zrębu myszy, rozmrażaj komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2 minuty. Policz i umieść płytki na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej, jak opisano w kroku 2.10 przed przejściem do sekcji 3. Zwiększ liczbę komórek PDX o ~20%, aby zrekompensować straty żywotności spowodowane krioprezerwacją.

3. Separacja klastrów pochodzących z PDX od pojedynczych komórek oparta na wirowaniu w gradicynie gęstości

  1. Przygotować 20 ml roztworu o 100% gradiencie gęstości, dokładnie mieszając 18 ml roztworu wirującego w gradiencie gęstości z 2 ml sterylnego 10-krotnego zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Przygotować po 10 ml roztworów gradientu gęstości 20%, 30%, 40% i 55%, rozcieńczając ten 100% roztwór sterylnym 1x HBSS i dobrze mieszając.
    UWAGA: Objętości te są wystarczające dla dwóch gradientów o pojemności 15 ml, z których każdy można oddzielić ~15 x 106 komórek. W przypadku oddzielania mniej niż ~15 x 106 komórek, drugi gradient powinien być użyty jako równowaga do wirowania.
  2. Dodaj 3 ml roztworu gradientu gęstości 55% na dno stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Trzymając probówkę pod kątem, bardzo delikatnie nałóż 3 ml roztworu gradientu gęstości 40% na warstwę 55%, powoli dozując płyn na kątową stronę probówki, aby uniknąć mieszania warstw. Powtórz z roztworem gradientu gęstości 30%.
  3. Zebrać sklarowany nad osadem kultur rotacyjnych PDX za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml, delikatnie przepłukując powierzchnię płytki. Wirować przy 200 x g przez 2 minuty do osadzania komórek.
  4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 3 ml roztworu gradientu gęstości 20% zgodnie z liczbą gradientów potrzebnych do oddzielenia komórek. Ostrożnie ułóż roztwór gradientu gęstości 20% z komórkami na wierzchu gradientu (gradientów). Jeśli używasz tylko jednej rurki gradientowej do komórek, przykryj rurkę gradientu równowagi roztworem gradientu o gęstości 20% bez komórek.
  5. Zakryj probówki i odwiruj w wirówce z wirnikiem kubełkowym przez 30 minut w temperaturze 4 °C, 2 000 x g i hamulcu 0.
  6. Po odwirowaniu widoczne będą frakcje (Rysunek 2C). Zebrać 2-3 ml frakcji do świeżych probówek o pojemności 15 ml. Dodaj 3-4 objętości sterylnego 1x HBSS do każdej frakcji i odwróć, aby dokładnie wymieszać.
  7. Wirować przy 1 000 x g przez 3 minuty do granulowania komórek. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1−2 ml podłoża do przetwarzania PDX.
    UWAGA: Żywotne klastry komórek PDX zwykle znajdują się na granicy faz roztworu gradientu gęstości 40−55% (Rysunek 2D) z pojedynczymi martwymi / umierającymi komórkami gromadzącymi się na granicy faz roztworu gradientu gęstości 20−40% dla większości testowanych PDX.
  8. Usunąć małą, reprezentatywną podwielokrotność (50−100 μl) w celu ponownej dysocjacji z równą objętością roztworu enzymu dysocjacyjnego w celu oceny liczby komórek w zgrupowanej zawiesinie komórek. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.

4. Przygotowanie hydrożelu i mikroprzepływowe wysiewanie płytek

  1. Rozpuścić roztwory hydrożelu HA (HA-SH modyfikowany tiolem; dikrylan glikolu polietylenowego reagujący z tiolami, PEGDA) zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 50 μl HBSS do wszystkich studzienek w kolumnach okienka obserwacyjnego (kolumna 3, 7, 11, 15, 19, 23) 2-pasmowej płytki mikroprzepływowej, aby utrzymać wilgotność hodowli i optymalne warunki obrazowania.
  3. Obliczyć objętość zawiesiny komórek z sekcji 3 potrzebną do uzyskania 50 μl hydrożelu o pożądanej gęstości komórek (tj. 5 000 komórek/μl). W przypadku wysiewu jednej płytki mikroprzepływowej, należy podzielić obliczoną objętość na każdą z 4 sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Hydrożele HA mają stały czas do żelowania. Dostosuj objętość porcji roztworu żelu do wydajności użytkownika podczas dozowania, jeśli wystąpi przedwczesne żelowanie.
  4. Bezpośrednio przed użyciem dostosować pH roztworu HA-SH do 8,0 z 1 N NaOH. Przeprowadzić testowe żelowanie, mieszając 40 μl HA-SH z 10 μl PEGDA i monitorując żelowanie w czasie. Żelowanie zwykle rozpoczyna się 5-8 minut po zmieszaniu HA-SH z środkiem sieciującym PEGDA.
  5. Zawiesinę komórek wirować przez 2 minuty (200 x g, temperatura pokojowa) do komórek osadzanych. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości HA-SH.
    UWAGA: Końcowy hydrożel to roztwór 4:1 HA-SH:PEGDA (objętościowo), więc komórki należy ponownie zawiesić w 40 μl HA-SH, aby uzyskać 50 μl końcowej objętości.
  6. Dodać 10 μl PEGDA do jednej porcji komórek w HA. Dobrze wymieszaj i odczekaj 1−3 minuty (w zależności od czasu żelowania z kroku 4.4) przed wysiewem płytki mikroprzepływowej.
    UWAGA: Umożliwienie reakcji żelowania na początku przed siewem pomaga zminimalizować osiadanie komórek.
  7. Umieść końcówkę do dozowania objętości 1,5 μl do jednokanałowej pipety powtarzalnej i załaduj komórki roztworem hydrożelu HA. Pamiętaj, aby podwielokrotność hydrożelu była dobrze wymieszana, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek.
  8. Aby umieścić płytkę mikroprzepływową, ustaw końcówkę pipety prostopadle do płytki, delikatnie umieszczając końcówkę na środku wlotu żelu (kolumny 1, 5, 9, 13, 17, 21), aby zapewnić kontakt, ale nie nacisk podczas dozowania roztworu hydrożelu. Działając szybko, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu hydrożelu, dozować 1,5 μl roztworu żelu do każdego wlotu żelu.
  9. Obserwuj stan napełnienia kanałów mikroprzepływowych, patrząc od góry płytki, od dołu płytki lub pod mikroskopem, i oceń obciążenie, używając Rysunek 3 jako wskazówkę (udane ładowanie w Rysunek 3A, wskazówki dotyczące rozmieszczenia pipet w Rysunek 3B, nieodebrane ładowanie w Rysunek 3C, nie wypełniony, aby zakończyć się na Rysunek 3D, przepełnienie w Rysunek 3E). Zidentyfikuj wszelkie niezbędne zmiany w technice, które mogą poprawić sukces napełniania w następnej rundzie chipsów (zobacz dyskusję, aby uzyskać wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów).
  10. Powtórz kroki 4.6−4.9 z pozostałymi 3 podwielokrotnościami komórek w roztworze HA. Odwróć talerz, przygotowując następną porcję (~1 min).
    UWAGA: 1-minutowy czas oczekiwania i odwrócenie płytki poprawiają rozkład 3D komórek, zmniejszając osadzanie się komórek podczas żelowania.
  11. Po napełnieniu wszystkich wiórów inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze, aż do zakończenia żelowania (~45 min).
  12. Korzystając z dołączonej instrukcji, upewnij się, że perfuzji jest zainstalowany w inkubatorze do hodowli komórkowych z prawidłowymi ustawieniami perfuzji (kąt 14°, odstępy 4 min).
  13. Dodać 50 μl pożywki PDX do wszystkich wlotów pożywki (kolumny 2, 6, 10, 14, 18, 22) i sprawdzić, czy kanały wypełniły się prawidłowo, odwracając płytkę. Delikatnie postukaj płytką o powierzchnię, aby zachęcić płyn do wypełnienia kanałów mikroprzepływowych.
  14. Dodać 50 μl DMEM-F12 (10% FBS) dla wszystkich wylotów pożywki (kolumna 4, 8, 12, 16, 20, 24). Jeśli jakiekolwiek pęcherzyki powietrza są uwięzione w kanale perfuzyjnym, usuń je, delikatnie stukając płytką o powierzchnię.
  15. Korzystając z mikroskopu i formularza układu płytki (rysunek uzupełniający 1), zarejestruj pomyślne napełnianie wiórów. Wyklucz niewłaściwie wypełnione wióry z dalszego użytku eksperymentalnego.
  16. Umieść płytkę na uchylnym wahaczu ustawionym na nachylenie 14° i cykl 4-minutowy, aby rozpocząć perfuzję. Pożywkę PDX należy wymieniać co 2 dni (najpierw 50 μl na wlocie, a następnie 50 μl na wylocie).

5. Barwienie komórek, obrazowanie i kwantyfikacja obrazu

  1. Przygotować roztwór do oznaczania żywotności komórek zawierający trzy barwniki fluorescencyjne (Hoechst 33342, ethidium homodimer-1, kalceina acetoksymetylowa [AM]).
    1. Przygotować roztwory podstawowe każdego barwnika w następujący sposób: Hoechst 33342 przy 1,6 mM (1 mg/ml) w wodzie dejonizowanej; kalceina AM przy 4 mM w bezwodnym DMSO; homodimer-1 etydyny przy 2 mM w DMSO/H2O (1:4, v/v).
      UWAGA: Podstawowe roztwory kalceiny AM i homodimeru etydyny-1 znajdują się w zanotowanym zestawie w Tabeli materiałów.
    2. Przygotować pojedynczy roztwór roboczy w pożywce HBSS lub pożywce wolnej od czerwieni fenolowej, zawierający wszystkie trzy barwniki. Zoptymalizuj końcowe stężenie robocze dla każdego typu ogniwa i matrycy, w zakresach 1,6−8,0 μM dla Hoechst 33342, 0,1−10 μM dla kalceiny AM i 0,1−10 μM dla homodimeru etydyny-1.
  2. Usunąć pożywkę hodowlaną i nałożyć roztwór barwnika żywotności roboczej na wybrane wióry mikroprzepływowe (75 μl na wlocie, 25 μl na wylocie) i umieścić z powrotem na perfuzyjnym w inkubatorze do hodowli komórkowych na 1 godzinę.
  3. Zobrazuj okna obserwacyjne barwionych kultur za pomocą ręcznego lub automatycznego mikroskopu konfokalnego (tabela materiałów) z filtrami fluorescencyjnymi (wymienionymi jako długości fal wzbudzenia/emisji, w nm) w celu obserwacji wszystkich jąder (Hoechst 33342, 350/461), jąder martwych komórek (ethidium homodimer-1, 528/617) i cytoplazmy żywych komórek (calceina AM, 494/517).
  4. Uchwyć stosy Z 140 μm z krokiem ≤1 μm za pomocą obiektywu pneumatycznego o rozmiarze 20x. Do zobrazowania całego mikrokanału z niewielkim nakładaniem się na siebie potrzebne są trzy pola widzenia. Aby uniknąć podwójnego próbkowania, należy obrazować tylko dwa pola widzenia na chip.
    UWAGA: Warunki obrazowania powinny być zoptymalizowane, aby zapewnić prawidłowe próbkowanie NyQuist. Z doświadczenia autorów wynika, że szybki system obrazowania, oparty na dekonwolucji konwencjonalnego źródła epi-fluorescencji lub trybie skanowania rezonansowego na konfokalu, jest niezbędny do pełnego oznaczenia kompletnego stosu Z, z trzema kolorami lasera, na 96 chipach na płytce w rozsądnym czasie (około 3,5 godziny z automatycznym obrazowaniem, w tym konfiguracją).
  5. Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, przetestuj obrazy stosu Z pod kątem żądanych danych ilościowych, takich jak morfologia, stan agregacji lub inne cechy. Aby określić ilościowo żywotność komórek, policz liczbę martwych komórek (kolor czerwony) i całkowitą liczbę jąder komórkowych (kolor niebieski).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Programowalny kołyskowy system perfuzyjny przygotowano w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych z płaszczem wodnym, a dwukanałowe płytki mikroprzepływowe przygotowano w standardowej komorze z laminarem w celu załadunku (Rycina 1). Guz PDX MDA-PCA-18b powiększono in vivo, pobrano po osiągnięciu maksymalnego rozmiaru i poddano dysocjacji zgodnie z opisem w sekcji 2 protokołu, aby utworzyć zawiesinę komórkową w stanie zbliżonym do pojedynczych komórek (Rycina 2A

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy metodę przetwarzania i hodowli żywotnych komórek nowotworowych pochodzących z PDX w wysokoprzepustowym, perfundowanym systemie hodowli 3D. Chociaż protokół ten wykorzystuje tkankę PCa PDX, jest równie skuteczny w przypadku innych nowotworów pochodzenia nabłonkowego. Charakterystyka guza różni się między poszczególnymi liniami PDX, nawet w obrębie tej samej tkanki pochodzenia (prostata, pierś itp.). Niektóre linie PCa PDX są bardziej zwłókniałe i trudne do wyizolowania żywych komórek, podczas gdy i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health, National Cancer Institute, SBIR Phase I (HHSN26120700015C) i P01CA098912.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1N NaOHdowolna odpowiednia klasa kultur tkankowych
60 mm okrągłe szalkiwszelkie odpowiednie
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych,dowolne odpowiednie
70 &mikro; m sitka do komórekCorning431751lub równoważny
WirówkaEppendorf5810R z odpowiednim wirnikiem i wiadrami do stożkowych probówek wirówkowych 15/50 mllub równoważnych
Roztwór wirujący z gradientem gęstościMillipore SigmaP1644Percoll
Dimethylsulfoxidedowolny odpowiedni stopień hodowli tkankowej
Roztwór enzymu dysocjacyjnegoStemCell Technologies07921ACCUMAX
DMEM-F12ThermoFisher Scientific11039021lub równoważne
Kleszczedowolny odpowiedni
zestaw hydrożelowy HAESI BIOGS311HyStem (kwas hialuronowy-SH i PEGDA)
Hanks Zrównoważony roztwór soliLonza10-527Flub równoważny
Inaktywowany termicznie płodowa surowica bydlęcaAtlanta BiologicalsS11150
HemocytometrFisher Scientific02-671-51B Hausser BrightLinelub odpowiednik
Hoechst 33342ThermoFisher ScientificH1398lub równoważny
Oprogramowanie do przetwarzania obrazuOxford InstrumentsImaris 9.3lub równoważne
ŻYWE/MARTWE Zestaw żywotności/cytotoksyczności komórek (Calcein-AM/ Ethidium Homodimer-1)ThermoFisher ScientificL3224lub równoważna
Płytka do hodowli mikroprzepływowejMimetas9603-400-B2-torowy mikroskop OrganoPlate
NikonA1Rlub równoważna
pipeta wielokanałowaEppendorf3125000036lub równoważna tkanka
nowotworowa pochodząca z PDXuzyskane na podstawie zatwierdzenia IRB dla tkanek ludzkich i zatwierdzenia IACUC dla gospodarza zwierzęcego
Penicylina-streptomycynaThermoFisher Scientific15140-122lub równoważna
Wahacz perfuzyjnyMimetasOrganoPlate Perfusion Rocker Mini
paski pH (pH 5-9)dowolny odpowiedni
roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanamiLonza17-516Flub równoważny
Żyletkidowolne odpowiednie
Wytrząsarka obrotowa XYWytrząsarka oscylacyjna VWR Advanced 3500lub równoważna
Skalpel Uchwytdowolny
odpowiedni Jednokanałowa pipeta powtarzalnaEppendorf22260201
Sterylne, 15 ml stożkowe probówkidowolne
Sterylne, 50 ml stożkowe probówkidowolne odpowiednie
do hodowli tkankowych, wirówkowe wirówkowe

Bibliografia

  1. Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).
  2. Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).
  3. Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).
  4. Fong, E. L. S., et al. Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).
  5. Fong, E. L. S., et al. A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions. Biomaterials. 77, 164-172 (2016).
  6. Engel, B. J., et al. Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures. Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).
  7. Lanz, H. L., et al. Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform. BMC Cancer. 17 (1), 709(2017).
  8. Wevers, N. R., et al. High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform. Scientific Reports. 6, 38856(2016).
  9. Vulto, P., et al. Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying. Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).
  10. Patru, C., et al. CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors. BMC Cancer. 10, 66(2010).
  11. Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5 (5), 10431(2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Trójwymiarowa hodowla w hydrożeluwirowanie w gradiencie gęstościhydrożel kwasu hialuronowegorocker perfuzyjnytest żywotnościtworzenie klastrówizolacja komórekmikrośrodowisko guza
Zwiększona żywotność kultur hydrożelowych ex vivo 3D ksenoprzeszczepów pobranych od pacjentów w perfuzjonej platformie mikroprzepływowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.