Artykuł metodologiczny

Modelowanie 3D kolców dendrytycznych z plastycznością synaptyczną

DOI:

10.3791/60896

⸱

18 maja 2020

 , 
1Center for Mathematics, Computation and Cognition, Federal University of ABC

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół rozwija trójwymiarowy (3D) model segmentu dendrytycznego z kolcami dendrytycznymi do modelowania plastyczności synaptycznej. Skonstruowana siatka może być wykorzystana do modelowania obliczeniowego transportu receptora AMPA w długoterminowej plastyczności synaptycznej za pomocą oprogramowania Blender z CellBlender i MCell.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modelowanie obliczeniowe dyfuzji i reakcji związków chemicznych w geometrii trójwymiarowej (3D) jest podstawową metodą zrozumienia mechanizmów plastyczności synaptycznej w kolcach dendrytycznych. W tym protokole szczegółowa struktura 3D dendrytów i kolców dendrytycznych jest modelowana za pomocą siatek w oprogramowaniu Blender z CellBlenderem. Regiony synaptyczne i pozasynaptyczne są zdefiniowane na siatce. Następnie receptory synaptyczne i cząsteczki kotwicy synaptycznej są definiowane za pomocą ich stałych dyfuzji. Na koniec uwzględniono reakcje chemiczne między receptorami synaptycznymi a kotwicami synaptycznymi, a model obliczeniowy jest rozwiązywany numerycznie za pomocą oprogramowania MCell. Metoda ta opisuje ścieżkę czasoprzestrzenną każdej pojedynczej cząsteczki w strukturze geometrycznej 3D. W związku z tym bardzo przydatne jest badanie transportu receptorów synaptycznych do i z kolców dendrytycznych podczas występowania plastyczności synaptycznej. Ograniczeniem tej metody jest to, że duża liczba cząsteczek spowalnia szybkość symulacji. Modelowanie kolców dendrytycznych tą metodą pozwala na badanie homosynaptycznego wzmocnienia i depresji w obrębie pojedynczych kolców oraz plastyczności heterosynaptycznej między sąsiednimi kolcami dendrytycznymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plastyczność synaptyczna została powiązana z uczeniem się i pamięcią1. Plastyczność synaptyczna, taka jak długoterminowe wzmocnienie (LTP) i długotrwała depresja (LTD), jest związana odpowiednio z wprowadzaniem i usuwaniem receptorów AMPA (AMPAR) do i z błony synaptycznej 2. Synapsy AMPAR znajdują się na szczycie małych struktur objętościowych zwanych kolcami dendrytycznymi3. Każdy kręgosłup zawiera region gęstości białkowej w błonie postsynaptycznej zwany gęstością postsynaptyczną (PSD). Białka kotwiczące w PSD zatrzymują AMPAR w regionie synaptycznym. W obrębie jednej synapsy znajduje się niewiele kopii AMPAR, a transport i reakcja AMPAR z innymi gatunkami w kolcach dendrytycznych jest procesem stochastycznym2,4. Istnieje kilka kompartmentowych modeli transportu receptorów synaptycznych w kolcach dendrytycznych5,6,7,8. Brakuje jednak stochastycznych modeli obliczeniowych transportu AMPAR związanego z plastycznością synaptyczną w strukturach 3D dendrytów i ich kolców dendrytycznych.

Modelowanie obliczeniowe jest użytecznym narzędziem do badania mechanizmów leżących u podstaw dynamiki złożonych systemów, takich jak reakcja-dyfuzja AMPAR w kolcach dendrytycznych podczas występowania plastyczności synaptycznej9,10,11,12. Model może być używany do wizualizacji złożonych scenariuszy, zmieniania wrażliwych parametrów i dokonywania ważnych prognoz w warunkach naukowych obejmujących wiele zmiennych, które są trudne lub niemożliwe do kontrolowania experimental12,13. Zdefiniowanie poziomu szczegółowości modelu obliczeniowego jest podstawowym krokiem w uzyskaniu dokładnych informacji o modelowanym zjawisku. Idealny model obliczeniowy to delikatna równowaga między złożonością a prostotą, aby uchwycić podstawowe cechy zjawisk naturalnych bez zaporów obliczeniowych. Modele obliczeniowe, które są zbyt szczegółowe, mogą być kosztowne w obliczeniach. Z drugiej strony, systemom, które są słabo szczegółowe, może brakować podstawowych komponentów, które są niezbędne do uchwycenia dynamiki zjawiska. Chociaż modelowanie 3D kolców dendrytycznych jest obliczeniowo droższe niż 2D i 1D, istnieją warunki, takie jak w złożonych układach z wieloma zmiennymi nieliniowymi reagującymi i dyfundującymi w czasie i przestrzeni 3D, dla których modelowanie na poziomie 3D jest niezbędne do uzyskania wglądu w funkcjonowanie systemu. Co więcej, złożoność można ostrożnie zmniejszyć, aby zachować podstawowe cechy modelu niskowymiarowego.

W systemie stochastycznym z kilkoma kopiami danego gatunku w małej objętości, średnia dynamika systemu odbiega od średniej dynamiki dużej populacji. W tym przypadku wymagane jest stochastyczne modelowanie obliczeniowe cząstek dyfuzyjnych reakcji. W pracy przedstawiono metodę stochastycznego modelowania reakcji-dyfuzji kilku kopii AMPAR w kolcach dendrytycznych 3D. Celem tej metody jest opracowanie modelu obliczeniowego 3D segmentu dendrytycznego z kolcami dendrytycznymi i ich synapsami do modelowania plastyczności synaptycznej.

Metoda wykorzystuje oprogramowanie MCell do numerycznego rozwiązywania modelu, Blender do konstruowania siatek 3D, a CellBlender do tworzenia i wizualizacji symulacji MCell, w tym czasoprzestrzennej reakcji-dyfuzji cząsteczek w siatkach 3D14,15,16. Blender to pakiet do tworzenia siatek, a CellBlender to dodatek do podstawowego oprogramowania Blender. MCell to symulator Monte Carlo do reakcji-dyfuzji pojedynczych cząsteczek17.

Uzasadnienie zastosowania tej metody polega na modelowaniu plastyczności synaptycznej w celu lepszego zrozumienia tego zjawiska w mikrofizjologicznym środowisku kolców dendrytycznych14. W szczególności metoda ta pozwala na symulację wzmocnienia homosynaptycznego, depresji homosynaptycznej i plastyczności heterosynaptycznej między kolcami dendrytycznymi14.

Cechy tej metody obejmują modelowanie geometrycznej struktury 3D dendrytu i jego synaps, dyfuzję przez losowy spacer oraz reakcje chemiczne cząsteczek związanych z plastycznością synaptyczną. Zaletą tej metody jest tworzenie bogatych środowisk do testowania hipotez i przewidywania funkcjonowania złożonego systemu nieliniowego z dużą liczbą zmiennych. Ponadto metoda ta może być stosowana nie tylko do badania plastyczności synaptycznej, ale także do badania stochastycznej dyfuzji reakcji i dyfuzji cząsteczek w strukturach siatkowych 3D w ogóle.

Alternatywnie, siatki 3D struktur dendrytycznych mogą być konstruowane bezpośrednio w Blenderze z seryjnych rekonstrukcji mikroskopu elektronowego18. Mimo że siatki oparte na rekonstrukcjach seryjnych zapewniają struktury 3D, dostęp do danych eksperymentalnych nie zawsze jest możliwy. W związku z tym konstrukcja siatek zaadaptowanych z podstawowych struktur geometrycznych, jak opisano w niniejszym protokole, zapewnia elastyczność w opracowywaniu niestandardowych segmentów dendrytycznych z kolcami dendrytycznymi.

Inną alternatywną metodą obliczeniową jest masowa symulacja dobrze wymieszanych reakcji w regularnej objętości9,10,11,19,20,21,22. Symulacje masowe są bardzo skuteczne w rozwiązywaniu reakcji wielu gatunków w obrębie jednej dobrze wymieszanej objętości23, ale podejście masowe jest niezwykle powolne w rozwiązywaniu reakcji dyfuzji cząsteczek w wielu dobrze wymieszanych wokselach w siatce 3D o wysokiej rozdzielczości. Z drugiej strony, obecna metoda wykorzystująca symulacje MCell reakcji-dyfuzji pojedynczych cząstek działa efektywnie w siatkach 3D o wysokiej rozdzielczości15.

Przed użyciem tej metody, należy zapytać, czy badane zjawisko wymaga stochastycznego podejścia reakcyjno-dyfuzyjnego w siatce 3D. Jeśli zjawisko ma kilka kopii (mniej niż 1000) co najmniej jednego z reagujących gatunków dyfundujących w złożonej strukturze geometrycznej z małymi przedziałami objętościowymi, takimi jak kolce dendrytyczne, wówczas stochastyczne modelowanie reakcji-dyfuzji w siatkach 3D jest odpowiednie dla zastosowania.

Do skonstruowania modelu obliczeniowego 3D segmentu dendrytycznego zawierającego kolce dendrytyczne o plastyczności synaptycznej wymagane jest kilka kroków. Główne kroki to instalacja odpowiedniego oprogramowania do budowy modelu, budowa pojedynczego kolca dendrytycznego, który ma być wykorzystany jako szablon do tworzenia wielu kolców, oraz utworzenie segmentu dendrytycznego, który jest połączony z wieloma kolcami dendrytycznymi. Etap modelowania plastyczności synaptycznej polega na wstawieniu kotwic w regionie PSD i AMPAR w segmencie dendrytycznym i kolcach dendrytycznych. Następnie definiuje się reakcje kinetyczne między kotwicami znajdującymi się w PSD i AMPAR w celu wytworzenia skompleksowanych gatunków kotwiczących AMPAR, które zatrzymują AMPAR w regionie synaptycznym. Odpowiednio, wzrost i spadek powinowactwa między kotwicami a synaptycznymi AMPAR tworzy proces LTP i LTD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Proszę zapoznać się z plikiem uzupełniającym 1, aby zapoznać się z glosariuszem terminów używanych w tym protokole.

1. Zainstaluj Blendera, CellBlendera i MCell

UWAGA: Ten protokół wymaga instalacji MCell, Blendera i Cell Blendera.

  1. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie na stronie głównej MCell (https://mcell.org/tutorials_iframe.html). Przejdź do sekcji pobierania u góry strony, a następnie postępuj zgodnie z instrukcjami krok po kroku, aby pobrać i zainstalować oprogramowanie w wybranym środowisku (np. Linux, Mac OSX lub Windows).
    UWAGA: Wszystkie modele obliczeniowe i symulacje opisane w tym protokole zostały przetestowane na pakiecie CellBlender 1.1, który zawiera Blender 2.78 z MCell 3.4 i CellBlender 1.1. Działało to również na Blenderze 2.79b. Wszystkie te programy są dostępne w otwartym dostępie i nie wymagają zgody na ponowne drukowanie. Instrukcje dotyczące budowy i symulacji modelu mogą się nieznacznie różnić w zależności od wersji. Części tego protokołu zostały zaadaptowane z Czech et al.16.

2. Utwórz pojedynczy kręgosłup dendrytyczny

UWAGA: Ta procedura tworzy siatkę pojedynczego kręgosłupa dendrytycznego z głową grzbietu i szyjką kręgosłupa przy użyciu zmodyfikowanej kuli.

  1. Skonfiguruj widok 3D Blendera w Panelu głównym.
    1. Otwórz Blendera z już zainstalowanym CellBlenderem. Naciśnij 5 na klawiaturze, aby zmienić widok z perspektywy na widok ortogonalny i naciśnij 1, aby zmienić widok z przodu. Widok perspektywiczny ma głębię, ale nie jest to teraz potrzebne. Zmiana z widoku perspektywicznego na widok ortogonalny umożliwia lepszą wizualizację siatki. Naciśnij Shift+C, aby wyśrodkować kursor (Rysunek 1A).
  2. Utwórz głowę kręgosłupa.
    1. Naciśnij Shift+A, aby otworzyć paletę siatki. Wybierz siatkę, a następnie wybierz opcję Sfera UV. Sfera UV to siatka odwzorowana na powierzchni 3D kuli. Kula UV reprezentuje kulistą głowę grzybowego grzbietu dendrytycznego. Oprogramowanie zakłada, że jednostkami kuli UV są mikrometry.
    2. Zmień parametry w panelu Dodaj sferę UV. Zmień rozmiar na 0,25, a pierścienie na 32 (Rysunek 1B). Naciśnij + lub – na klawiaturze, aby odpowiednio powiększyć i pomniejszyć wizualizację siatki. Alternatywnie, użyj przycisku przewijania w myszy, aby powiększać i pomniejszać (Rysunek 1C).
      UWAGA: Parametr size skaluje rozmiar oryginalnej sfery, a pierścienie parametrów definiują rozdzielczość siatki.
  3. Ułóż czubek głowy płasko.
    1. Naciśnij Tab, aby przełączyć Blendera z trybu obiektu, standardowego trybu interakcji z obiektami, do trybu edycji. Praca w trybie edycji w celu modyfikowania komponentów istniejącej siatki.
    2. Po automatycznym wybraniu utworzonej siatki naciśnij przycisk a, aby usunąć zaznaczenie utworzonej siatki. Naciśnij z, aby siatka była przezroczysta, co pomaga w wizualizacji części, które będą edytowane. Powiększ siatkę. Naciśnij b aby wybrać górne 3/4 kuli za pomocą myszy (Rysunek 2A). Naciśnij delete, wybierz wierzchołki i wprowadź, aby je usunąć (Rysunek 2B).
    3. Naciśnij b i wybierz górę. Naciśnij e, s, 0 i enter, aby uszczelnić górę z nadal wybranymi wierzchołkami. Przesuń niebieską strzałkę w dół, aby wyrównać ją do górnej części głowy kręgosłupa (Rysunek 2C). Naciśnij z, aby przejść do widoku bryły (Rysunek 3A). Naciśnij 7, aby przejść do widoku z góry.
      UWAGA: Górna część kuli jest płaska, aby modelować obszar PSD głowy kręgosłupa.
  4. Aby zwiększyć rozdzielczość siatki w górnej części grzbietu, najpierw wybierz Narzędzie i Nóż. Wytnij okrąg nożem wokół środka blatu (Rysunek 3B). Wybierz Narzędzie i Pętla Wycinanie i Przesuw. Powtórz ten krok cztery razy, aby utworzyć cztery koncentryczne okręgi wokół środka blatu (Rysunek 3C).
    UWAGA: Koncentryczne okręgi służą do dodawania nowych wokseli, które zwiększą rozdzielczość PSD.
  5. Utwórz szyję kręgosłupa.
    1. Naciśnij a, aby usunąć zaznaczenie siatki. Naciśnij 1, aby przejść do widoku z przodu. Naciśnij z, aby siatka była przezroczysta. Naciśnij b, a następnie wybierz dolną część siatki (Rysunek 4A). Naciśnij delete i wierzchołki (Rysunek 4B). Naciśnij b i wybierz dolną część siatki (Rysunek 4C). Naciśnij e i z, -0.45, aby utworzyć wyciągnięcie (Rysunek 4D).
      UWAGA: Spowoduje to wytłoczenie do pozycji osi z przy -0,45 μm. Naciśnij a, aby usunąć zaznaczenie całej siatki.
    2. Naciśnij b i wybierz dolną część szyi. Naciśnij e, s i 0, aby uszczelnić spód (Rysunek 4E). Naciśnij a, aby zaznaczyć całą siatkę.
  6. Spraw, aby siatka była kompatybilna z MCell.
    1. Naciśnij Crtl+T, aby dokonać triangulacji siatki. Siatka jest przekształcana w zestaw połączonych ze sobą trójkątów. Jest to wymagana procedura, aby siatka była kompatybilna z MCell. Wybierz Narzędzie i usuń podwójne. Użyj narzędzi Usuń podwojenia, aby usunąć zduplikowane wierzchołki, jeśli takie istnieją, które mają te same współrzędne lub są bardzo blisko siebie, aby siatka była zgodna z MCell.
      UWAGA: Podwójnie nałożone wierzchołki mogły zostać przypadkowo utworzone podczas procesu tworzenia i edycji siatki.
    2. Wybierz opcję Obiekty modelu w panelu CellBlender. Zmień nazwę aktywnego obiektu na grzbiet i naciśnij +, aby utworzyć grzbiet obiektu. W panelu CellBlender wybierz Analiza siatki, a następnie kliknij Analizuj siatkę (Rysunek 4F). Ta procedura spowoduje przeanalizowanie właściwości utworzonej siatki, w tym liczby wierzchołków, krawędzi, powierzchni, pola powierzchni, objętości i topologii siatki.
      UWAGA: Analiza wydrukuje informacje w panelu Analiza siatki i powinny to być normalne wodoszczelne, kolektorowe i skierowane na zewnątrz. Ten krok jest wymagany, aby upewnić się, że siatka będzie działać na MCell. W przeciwnym razie prawdopodobnie pominięto jakiś krok. W takim przypadku usuń siatkę i ponownie zacznij od kroku 2.1.
    3. Naciśnij z, aby wyświetlić widok kręgosłupa w bryle. Naciśnij Plik i Zapisz, aby mieć kopię pliku blendera z grzbietem na dysku.
      UWAGA: Wymiary (tj. długość, średnica, rozmiar) oczek podane są w mikrometrach. Zapoznaj się ze słowniczkiem, aby uzyskać informacje na temat znaczenia każdego skrótu klawiaturowego.

3. Tworzenie dendrytu z wieloma kolcami

  1. Wygeneruj kręgosłup zgodnie z wcześniejszym opisem w sekcjach 2.1–2.6. Naciśnij a, aby odznaczyć grzbiet. Wpisz Shift+C, aby wyśrodkować kursor.
  2. Utwórz dendryt. Naciśnij Shift+A, aby otworzyć paletę siatki. Wybierz opcję Siatka, a następnie Walec. Zmień parametry w menu Dodaj cylinder: Promień = 0,3 μm, Głębokość = 2 μm. Naciśnij Enter.
    UWAGA: Parametry promień i głębokość są definiowane zgodnie z charakterystyką geometryczną dendrytu.
  3. Włóż grzbiet do dendrytu.
    1. Naciśnij r i wpisz 90, aby obrócić cylinder o 90° (Rysunek 5A). Użyj niebieskiej strzałki, aby przeciągnąć cylinder w dół do dolnej części grzbietu. Naciśnij 3 na klawiaturze, aby wyświetlić widok cylindra z przodu.
    2. Naciśnij z, aby siatka była przezroczysta. Użyj myszki, aby przesunąć niebieską normalną strzałkę cylindra w dół, aby przesunąć podstawę grzbietu do wnętrza cylindra (Rysunek 5B). Naciśnij a, aby odznaczyć wszystkie obiekty.
    3. Użyj prawego przycisku myszy, aby wybrać dendryt (Rysunek 5C). Wybierz Modyfikator w panelu Blendera (Rysunek 5D), wybierz Dodaj modyfikator. Następnie wybierz opcję Boolean, wybierz pozycję Operation Union i wybierz pozycję Object spine. Naciśnij Zastosuj, aby utworzyć siatkę łączącą dendryt i grzbiet (Rysunek 5E). Ta operacja tworzy nową siatkę, która łączy dwie siatki w jedną.
      UWAGA: Nowa siatka będzie połączoną dendrytem i grzbietem. Izolowany dendryt znika po połączeniu różnych siatek, ale izolowana siatka grzbietu pozostaje nałożona na nową siatkę i jest używana do generowania wielu kopii tego samego grzbietu. Usuń wszystkie izolowane kolce po zakończeniu siatki. Bardzo ważne jest, aby szyja grzbietu i dendryt całkowicie zachodziły na siebie, w przeciwnym razie siatka nie będzie wodoszczelna.
  4. Ustawia obiekt dendrytowy w środowisku CellBlender.
    1. Naciśnij przycisk a, aby usunąć zaznaczenie siatek. Kliknij prawym przyciskiem myszy dendryt, aby wybrać tylko dendryt. Wybierz CellBlender, Model Objects i zmień Active Object na Dendrite i naciśnij +, aby utworzyć obiekt Dendrit.
  5. Włóż nowe kolce do dendrytu.
    1. Naciśnij 1, aby zmienić widok cylindra z boku. Użyj myszki, aby wybrać siatkę izolowanego grzbietu. Aby wstawić więcej kolców, wykonaj krok 3.3, zmieniając pozycję i kąt włożenia każdego z nich, aby uzyskać rozkład fizjologiczny.
  6. Spraw, aby siatka była kompatybilna z MCell. Aby to zrobić, naciśnij Tab, aby przejść do trybu edycji. Naciśnij a, aby zaznaczyć całą siatkę. Naciśnij Crtl+T, aby dokonać triangulacji siatki. Wybierz Narzędzie w panelu Blendera i wybierz Usuń podwojenia.
  7. Stylizuj siatki.
    1. Wygładź siatkę. Naciśnij Tab, aby przejść do trybu obiektowego. Wybierz Narzędzie w panelu Blender i wybierz opcję Wygładzanie. Wybierz CellBlender, Modeluj obiekty i wybierz Dodaj materiał.
    2. Ustaw przezroczystość siatki, wybierając opcję Przezroczysty obiekt i Przezroczysty materiał. Zmień wartość alfa na 0,5 i wprowadź, aby siatka była częściowo przezroczysta. Naciśnij z, aby przejść do widoku bryły.
  8. Sprawdź, czy siatka jest nadal kompatybilna z MCell. Aby to zrobić, wybierz opcję Analiza siatki w panelu CellBlender, aby upewnić się, że siatka jest nadal wodoszczelna, ma siatkę kolektorową i jest normalnie skierowana na zewnątrz.
  9. Zapisz plik blendera jako dendrite_with_spines.blend.

4. Definiowanie obszarów powierzchni

UWAGA: Ta procedura tworzy obszary powierzchni siatki, które później zostaną użyte do ustawienia, w jaki sposób regiony oddziałują z cząsteczkami.

  1. Otwórz plik dendrite_with_spines w środowisku Blendera. Aby to zrobić, wybierz Plik, Otwórz, dendrite_with_spines.blend i Otwórz plik Blendera.
  2. Przygotuj siatkę do zdefiniowania obszarów powierzchni. Aby to zrobić, naciśnij Tab, aby przejść do trybu edycji. Naciśnij z, aby zmienić widok na przezroczysty (cieniowanie rzutni, model szkieletowy). Naciśnij a, aby zaznaczyć całą siatkę dendrytu z kolcami. Wybierz opcję Obiekty modelu. Wybierz opcję Dendrite. Naciśnij t, aby ukryć panel CellBlender i lepiej wyświetlić całą siatkę w panelu głównym.
    1. Użyj + i – na klawiaturze, aby powiększać i pomniejszać lub przewijać za pomocą myszy. Jest to wymagane w celu lepszej wizualizacji górnej części grzbietów w celu wybrania i zdefiniowania obszarów powierzchni. Naciśnij a, aby usunąć zaznaczenie obiektu. Naciśnij Tab, aby przejść do trybu edycji. Naciśnij t, aby ponownie wyświetlić panel CellBlender.
  3. Zdefiniuj obszar powierzchni PSD. Aby to zrobić, naciśnij b i wybierz wierzchołek grzbietu dendrytycznego za pomocą myszy (Rysunek 6A,6B). Naciśnij przycisk + na zdefiniowanych obszarach powierzchni. Zmień nazwę regionu na PSD1 i kliknij przycisk Przypisz (Rysunek 6C). Naciśnij a, aby usunąć zaznaczenie obiektu.
  4. Zdefiniuj pozasynaptyczny obszar powierzchni. Aby to zrobić, naciśnij b i wybierz obszar wokół górnej części grzbietu dendrytycznego za pomocą myszy (Rysunek 6D). Powtórz krok 4.3, aby nazwa regionu Extra_syn1. Powtórz krok 4.3 dla pozostałych grzbietów, aby zdefiniować inne obszary siatki (PSD2, PSD3, PSD4, Extra_syn2, Extra_syn3 i Extra_syn4) (Rysunek 6F). Naciśnij a, aby usunąć zaznaczenie obiektu.
  5. Umożliwia zdefiniowanie obszarów powierzchni końców dendrytu. Aby to zrobić, naciśnij b i wybierz lewy koniec dendrytu. Zmień nazwę regionu na Left_end i kliknij przycisk Przypisz. Naciśnij a, aby usunąć zaznaczenie obiektu. Naciśnij b i wybierz prawy koniec dendrytu (Rysunek 6E). Zmień nazwę regionu na Right_end i kliknij przycisk Assign.
    UWAGA: Przesuń siatkę, aby znaleźć najlepszą pozycję do wybrania każdego zdefiniowanego regionu.

5. Tworzenie molekuł

  1. Utwórz AMPAR. Aby to zrobić, wybierz Cząsteczki w panelu CellBlender. Wybierz + w zdefiniowanych cząsteczkach, aby wstawić nową cząsteczkę i zmienić nazwę na AMPAR. Zmień typ cząsteczki na cząsteczkę powierzchniową i stałą dyfuzji na 0,05e-8 cm2/s14, aby zdefiniować stałą dyfuzji AMPAR w membranie (Rysunek 7A).
  2. Utwórz kotwice. Aby to zrobić, wybierz Cząsteczki w panelu CellBlender. Wybierz pozycję + w zdefiniowanych cząsteczkach, aby wstawić nową cząsteczkę i zmienić nazwę na zakotwiczenie. Zmień typ cząsteczki na cząsteczkę powierzchniową i zmień stałą dyfuzji na 0,001e-8 cm2/s14, aby zdefiniować stałą dyfuzji kotew w membranie (Rysunek 7A).
  3. Aby utworzyć kotwice powiązane z AMPAR, wybierz opcję Cząsteczki w panelu CellBlender. Wybierz pozycję + w obszarze Zdefiniowane cząsteczki, aby wstawić nową cząsteczkę. Zmień nazwę na anchor_AMPAR. Zmień typ cząsteczki na cząsteczkę powierzchniową. Zmień stałą dyfuzji na 0,001e-8 cm2/s14.
  4. Utwórz anchor_LTP i anchor_AMPAR_LTP. Aby to zrobić, powtórz krok 5.2. Nazwij cząsteczkę anchor_LTP. Powtórz krok 5.3. Nazwij cząsteczkę anchor_AMPAR_LTP.
    UWAGA: anchor_LTP ma wysokie powinowactwo do AMPAR; w związku z tym AMPAR zwiększają się w regionach synaptycznych.
  5. Utwórz anchor_LTD i anchor_AMPAR_LTD. Aby utworzyć _LTD zakotwiczenia, powtórz krok 5.2. Nazwij cząsteczkę anchor_LTD. Powtórz krok 5.3. Nazwij cząsteczkę anchor_AMPAR_LTD.
    UWAGA: anchor_LTD ma niskie powinowactwo do AMPAR; w związku z tym AMPAR zmniejszają się w regionie synaptycznym.

6. Definiowanie klas powierzchni

UWAGA: Ta procedura definiuje klasy z właściwościami, które są powiązane z obszarami powierzchni. Regiony pozasynaptyczne odzwierciedlają wolne kotwice i kotwice związane z AMPAR. Boczne końce dendrytu odbijają wszystkie cząsteczki.

  1. Zdefiniuj właściwości regionów pozasynaptycznych.
    1. Naciśnij Tab, aby przejść do trybu obiektowego. Wybierz opcje Klasy powierzchni w panelu CellBlender. Naciśnij przycisk + w klasie powierzchni, aby zdefiniować nową klasę powierzchni.
    2. Spraw, aby region pozasynaptyczny odbijał AMPAR związany z cząsteczkami kotwiczącymi.
      UWAGA: Ta procedura uwięzi kotwice i wszystko, co jest z nimi związane w regionie synaptycznym.
      1. Zmień nazwę klasy powierzchni na reflective_extra_syn. Naciśnij + na reflective_extra_syn Właściwości, aby skojarzyć go z cząsteczką. Wybierz cząsteczki | Pojedyncza cząsteczka. Wybierz opcję anchor_AMPAR. Wybierz Orientacja = Ignoruj. Wybierz Typ = Odblaskowy, aby region pokazywał anchor_AMPAR cząsteczki.
      2. Powtórz krok 6.1.2.1 dla anchor_AMPAR_LTP i anchor_AMPAR_LTD.
    3. Spraw, aby region pozasynaptyczny odbijał kotwice.
      1. Naciśnij + na reflective_extra_syn Właściwości, aby skojarzyć go z cząsteczką. Wybierz cząsteczki | Pojedyncza cząsteczka. Wybierz kotwicę. Wybierz Orientacja = Ignoruj. Wybierz Typ = Odblaskowy, aby region odbijał cząsteczki kotwicy.
      2. Powtórz krok 6.1.3.1 dla anchor_LTP i anchor_LTD.
  2. Umożliwia zdefiniowanie właściwości końcówek dendrytów. W tym celu należy nacisnąć przycisk + na polu Klasa powierzchni, aby zdefiniować nową klasę powierzchni. Zmień nazwę klasy powierzchni na reflective_ends. Naciśnij + na Właściwościach, aby skojarzyć go z cząsteczką. Wybierz cząsteczki | wszystkie cząsteczki powierzchniowe. Wybierz orientację | Ignoruj. Wybierz punkt Typ | Odblaskowy, aby odbijał wszystkie cząsteczki powierzchniowe.

7. Przypisz utworzone klasy do każdego regionu powierzchni

UWAGA: Ten krok przypisuje klasy powierzchni do obszarów powierzchni.

  1. Przypisz właściwości końców dendrytu.
    1. Naciśnij +, aby przypisać klasę powierzchni do regionu. Wybierz reflective_ends dla nazwy klasy powierzchni (Rysunek 7C). Wybierz opcję Dendryt w polu Nazwa obiektu. Wybierz określony region dla wyboru regionu. Wybierz pozycję Left_end dla nazwy regionu.
    2. Powtórz krok 7.1.1 dla Right_end (Rysunek 7D).
  2. Przypisz właściwości regionów pozasynaptycznych.
    1. Naciśnij +, aby przypisać klasę powierzchni do regionu. Wybierz opcję reflective_extra_syn dla nazwy klasy powierzchni. Wybierz opcję Dendryt w polu Nazwa obiektu. Wybierz określony region dla wyboru regionu. Wybierz pozycję Extra_syn1 dla nazwy regionu.
    2. Powtórz krok 7.2.1 dla Extra_syn2, Extra_syn3 i Extra_syn4.

8. Umieść cząsteczki na siatce

UWAGA: Ten krok umieszcza AMPARs, kotwice i AMPAR powiązane z kotwicami na siatce.

  1. Aby umieścić cząsteczki AMPAR na siatce, wybierz opcję Rozmieszczenie cząsteczek w panelu CellBlender. Naciśnij przycisk + w witrynach wydania/umiejscowienia, aby utworzyć nową witrynę wydania. Zmień nazwę witryny na relAMPAR (Rysunek 7B). Wybierz cząsteczkę = AMPAR. Obiekt/region = Dendryt[ALL]-(Dendryt[Left_end]+Dendryt[Right_end]). Ilość do uwolnienia = 1,000.
  2. Umieść cząsteczki kotwicy na siatce.
    1. Wybierz opcję Molecule Placement (Rozmieszczenie molekuł) w panelu CellBlender. Naciśnij przycisk + w witrynach wydania/umiejscowienia, aby utworzyć nową witrynę wydania. Zmień nazwę witryny na rel_anchor_PSD1. Wybierz Zakotwiczenie cząsteczki. Obiekt/Region = Dendryt[PSD1]. Ilość do zwolnienia = 200.
    2. Powtórz krok 8.2.1 dla PSD2, PSD3 i PSD4.
  3. Umieść anchor_LTP cząsteczki na siatce. Aby to zrobić, wybierz opcję Molecule Placement (Rozmieszczenie molekuł) w panelu CellBlender. Naciśnij przycisk + w witrynach wydania/umiejscowienia, aby utworzyć nową witrynę wydania. Zmień nazwę witryny na rel_anchor_LTP_PSD1. Wybierz cząsteczkę = anchor_LTP. Obiekt/region = dendryt [PSD1]. Ilość do uwolnienia = 0.
    UWAGA: anchor_LTP jest kotwicą o wysokim powinowactwie wiązania do AMPAR.
  4. Umieść anchor_LTD cząsteczki na siatce, powtarzając krok 8.3 dla anchor_LTD.
    UWAGA: anchor_LTD jest kotwicą o niskim powinowactwie wiązania do AMPAR.

9. Tworzenie reakcji chemicznych

  1. Tworzenie reakcji między kotwicą a AMPAR.
    1. Wybierz Reakcje (Rysunek 7D), aby utworzyć reakcje. Naciśnij +, aby dołączyć nową reakcję. Reagenty = kotwica' + AMPAR'. Typ reakcji = <->. Określa to reakcję dwukierunkową. Produkty = anchor_AMPAR'. Kurs terminowy = 0,03. Kurs wsteczny = 0,05.
  2. Utwórz reakcję między ANCHOR_LTP i AMPAR. Aby to zrobić, powtórz krok 9.1, ale zastąp kotwicę anchor_LTP i użyj szybkości wstecznej = 0,005, aby zwiększyć powinowactwo między reagentami.
  3. Utwórz reakcję między anchor_LTD a AMPAR i zapisz plik. Aby to zrobić, powtórz krok 9.2, ale zastąp kotwicę anchor_LTD i użyj szybkości wstecznej = 0,5, aby zmniejszyć powinowactwo między reagentami. Następnie zapisz plik.

10. Wykreśl dane wyjściowe modelu

  1. Wykreśl kotwice powiązane z AMPAR w PSD1 w warunku podstawowym. W tym celu należy wybrać opcję Drukuj ustawienia wyjściowe. Naciśnij +, aby zdefiniować cząsteczki. Wybierz anchor_AMPAR na molekułę. Wybierz dendryt na obiekcie. Wybierz PSD1 w regionie. Powtórz krok 10.1 dla wszystkich regionów PSD.
    UWAGA: Przydatne jest obserwowanie podstawowej liczby uwięzionych AMPAR do PSD każdego grzbietu dendrytycznego. Liczba kotwic związanych z AMPAR może się zwiększać lub zmniejszać w porównaniu z warunkami podstawowymi podczas LTP i LTD.
  2. Wykreśl kotwice powiązane z protokołami AMPAR w PSD1 podczas LTP. W tym celu powtórz krok 10.1. Zastąp anchor_AMPAR na anchor_AMPAR_LTP, następnie wykreśl kotwice powiązane z AMPAR w PSD1 podczas LTD i na koniec powtórz krok 10.1, ale zastąp anchor_AMPAR_LTP anchor_AMPAR_LTD.

11. Uruchom symulacje

  1. Aby uruchomić warunek podstawowy, wybierz opcję Uruchom symulację. Wybierz Iteracje = 30 000. Ustaw krok czasowy = 1e-3 s. Naciśnij Eksportuj i uruchom. Poczekaj, aż symulacja się zakończy. Może to potrwać od kilku minut do godzin.
    UWAGA: W stanie podstawowym nie dochodzi do uwalniania cząsteczek anchor_LTP i rel_anchor_LTD. Jeśli chodzi o parametry symulacji, liczba iteracji musi być wystarczająco długa, aby można było zaobserwować dyfuzję AMPAR z dendrytów i ich zakotwiczenie w PSD. Małe kroki czasowe są bardziej precyzyjne, ale wolniejsze do ukończenia symulacji.
  2. Wybierz opcję Załaduj ponownie dane wizualizacji. Wybierz opcję odtwarzania animacji, aby zwizualizować wyniki czasoprzestrzenne (Rysunek 8). Wybierz opcję Drukuj ustawienia wyjściowe. Naciśnij przycisk Plot.
    UWAGA: Wykresy generowane przez CellBlender są izolowanymi szeregami czasowymi wybranych związków chemicznych. Programy innych firm mogą być używane do importowania danych zapisanych z wielu symulacji w celu utworzenia nałożonych wykresów kilku warunków (np. basal, LTP, LTD; patrz Rysunek 8).
  3. Uruchom warunek wzmocnienia homosynaptycznego (tj. LTP; patrz Rysunek 8). Aby to zrobić, wybierz opcję Molecule Placement (Rozmieszczenie molekuł) w panelu CellBlender. Wybierz rel_anchor_LTP_PSD1 w witrynach wydania/umieszczenia.
  4. Zmień ilość na zwolnienie = 200. Wybierz rel_anchor_LTD_PSD1 w witrynach wydania/umieszczenia. Zmień ilość na zwolnienie = 0. Wybierz rel_anchor _PSD1 w witrynach wydania/umieszczenia. Zmień ilość na zwolnienie = 0. Powtórz kroki 11.1–11.2.
  5. Uruchom stan depresji homosynaptycznej (tj. LTD; patrz Rysunek 8). Aby to zrobić, rel_anchor_LTD_PSD1 wydania 200 zamiast rel_ANCHOR_LTP_PSD1. Ustaw wartość rel_anchor i rel_anchor_LTP_PSD1 na zero. Powtórz kroki 11.1–11.2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te wyniki przedstawiają kroki do budowy siatki 3D, która symuluje dendrytyczny kręgosłup z głową kręgosłupa i szyją kręgosłupa (Rysunek 1 do Rysunek 4). Ponadto, wiele kolców dendrytycznych można umieścić w jednym segmencie dendrytycznym (Rysunek 5) w celu zbadania plastyczności heterosynaptycznej AMPARs14. PSD na szczycie głowy kręgosłupa (Rysunek 6) to miejsce, w którym kotwice synaptyczne wiążą s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono metodę budowy siatek 3D do modelowania procesów plastyczności synaptycznej reakcyjno-dyfuzyjnej w segmencie dendrytycznym z kolcami dendrytycznymi. Opracowany model zawiera segment dendrytyczny z kilkoma kolcami dendrytycznymi. Dyfuzja boczna i reakcja AMPAR z kotwicami synaptycznymi pozwala na symulację dynamiki podstawowej. Krytycznymi krokami w protokole są przecięcie kuli w celu utworzenia górnej części głowy kręgosłupa (Rysunek 1, Rysunek 2<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez grant Sao Paulo State Science Foundation (FAPESP) #2015/50122-0 i IRTG-GRTK 1740/2, przez grant IBM/FAPESP #2016/18825-4 oraz przez grant FAPESP #2018/06504-4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fundacja BlenderaBlenderahttps://www.blender.org/
CellBlender, Uniwersytet w Pittsburghuhttps://mcell.org/
Mcell, Uniwersytet w Pittsburghuhttps://mcell.org/

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sweatt, J. D. Neural plasticity and behavior - sixty years of conceptual advances. Journal of Neurochemistry. 139, 179-199 (2016).
  2. Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320 (5873), 201-205 (2008).
  3. Buonarati, O. R., Hammes, E. A., Watson, J. F., Greger, I. H., Hell, J. W. Mechanisms of postsynaptic localization of AMPA-type glutamate receptors and their regulation during long-term potentiation. Science Signaling. 12 (562), 6889(2019).
  4. Nair, D., et al. Super-Resolution Imaging Reveals That AMPA Receptors Inside Synapses Are Dynamically Organized in Nanodomains Regulated by PSD95. Journal of Neuroscience. 33 (32), 13204-13224 (2013).
  5. Czöndör, K., et al. Unified quantitative model of AMPA receptor trafficking at synapses. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (9), 3522-3527 (2012).
  6. Triesch, J., Vo, A. D., Hafner, A. S. Competition for synaptic building blocks shapes synaptic plasticity. eLife. 7, 37836(2018).
  7. Earnshaw, B. A., Bressloff, P. C. Biophysical model of AMPA receptor trafficking and its regulation during long-term potentiation/long-term depression. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12362-12373 (2006).
  8. Earnshaw, B. A., Bressloff, P. C. Modeling the role of lateral membrane diffusion in AMPA receptor trafficking along a spiny dendrite. Journal of Computational Neuroscience. 25 (2), 366-389 (2008).
  9. Antunes, G., Roque, A. C., Simoes-de-Souza, F. M. Stochastic Induction of Long-Term Potentiation and Long-Term Depression. Scientific Reports. 6, 30899(2016).
  10. Kotaleski, J. H., Blackwell, K. T. Modelling the molecular mechanisms of synaptic plasticity using systems biology approaches. Nature Reviews Neuroscience. 11 (4), 239-251 (2010).
  11. Bhalla, U. S. Molecular computation in neurons: a modeling perspective. Current Opinion in Neurobiology. 25, 31-37 (2014).
  12. Czöndör, K., Thoumine, O. Biophysical mechanisms regulating AMPA receptor accumulation at synapses. Brain Research Bulletin. 93, 57-68 (2013).
  13. Bromer, C., et al. Long-term potentiation expands information content of hippocampal dentate gyrus synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2410-2418 (2018).
  14. Antunes, G., Simoes-de-Souza, F. M. AMPA receptor trafficking and its role in heterosynaptic plasticity. Scientific Reports. 8 (1), 10349(2018).
  15. Kerr, R. A., et al. Fast monte carlo simulation methods for biological reaction-diffusion systems in solution and on surfaces. SIAM Journal on Scientific Computing. 30 (6), 3126(2008).
  16. Czech, J., Dittrich, M., Stiles, J. R. Rapid Creation, Monte Carlo Simulation, and Visualization of Realistic 3D Cell Models. Systems Biology. 500, 237-287 (2009).
  17. Stiles, J., Bartol, T., et al. Monte Carlo Methods for Simulating Realistic Synaptic Microphysiology Using MCell. Computational Neuroscience. De Schutter,, et al. , CRC Press. (2000).
  18. Jorstad, A., et al. NeuroMorph: A Toolset for the Morphometric Analysis and Visualization of 3D Models Derived from Electron Microscopy Image Stacks. Neuroinformatics. 13 (1), 83-92 (2015).
  19. Antunes, G., Roque, A. C., Simoes de Souza, F. M. Modelling intracellular competition for calcium: kinetic and thermodynamic control of different molecular modes of signal decoding. Scientific Reports. 6, 23730(2016).
  20. Antunes, G., Roque, A. C., Simoes-de-Souza, F. M. Molecular mechanisms of detection and discrimination of dynamic signals. Scientific Reports. 8 (1), 2480(2018).
  21. Hoops, S., et al. COPASI--a COmplex PAthway SImulator. Bioinformatics. 22 (24), 3067-3074 (2006).
  22. Faeder, J. R., Blinov, M. L., Hlavacek, W. S. Rule-based modeling of biochemical systems with BioNetGen. Methods in Molecular Biology. 500, 113-167 (2009).
  23. Gillespie, D. T. Exact stochastic simulation of coupled chemical reactions. Journal of Physical Chemistry. 81 (25), 21(1977).
  24. Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 461-469 (2012).
  25. Matsuda, S., Launey, T., Mikawa, S., Hirai, H. Disruption of AMPA receptor GluR2 clusters following long-term depression induction in cerebellar Purkinje neurons. EMBO Journal. 19 (12), 2765-2774 (2000).
  26. Ahmad, M., et al. Postsynaptic Complexin Controls AMPA Receptor Exocytosis during LTP. Neuron. 73 (2), 260-267 (2012).
  27. Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annual Review of Biochemistry. 76, 823-847 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Blender CellBlendersymulacja MCelltransport receptor w AMPAsta e dyfuzjireakcje chemicznetriangulacja siatkipot gowanie homosynaptyczne

Powiązane artykuły