Pobieranie próbek i analiza sygnałów zapachowych zwierząt

Podsumowanie

Opracowaliśmy skuteczną metodologię pobierania próbek i analizy sygnałów zapachowych, aby zrozumieć, jak mogą być one wykorzystywane w komunikacji zwierząt. W szczególności stosujemy mikroekstrakcję do fazy stałej w połączeniu z chromatografią gazową ze spektrometrią mas do analizy lotnych składników zapachów zwierzęcych i oznaczeń zapachowych.

Streszczenie

Opracowaliśmy skuteczną metodologię pobierania próbek i analizy sygnałów zapachowych, używając mikroekstrakcji fazy stałej w przestrzeni nad powierzchnią w połączeniu z chromatografią gazową i spektrometrią mas, aby zrozumieć, jak mogą być one wykorzystywane w komunikacji zwierząt. Technika ta pozwala na półilościową analizę lotnych składników wydzielin zapachowych, umożliwiając separację i wstępną identyfikację składników w próbce, a następnie analizę stosunków powierzchni pików w celu znalezienia trendów, które mogą oznaczać związki, które mogą być zaangażowane w sygnalizację. Kluczowymi mocnymi stronami tego obecnego podejścia są zakres typów próbek, które można analizować; brak konieczności skomplikowanego przygotowywania próbek lub ekstrakcji; umiejętność oddzielania i analizowania składników mieszaniny; identyfikację wykrytych składników; oraz zdolność do dostarczania półilościowych i potencjalnie ilościowych informacji na temat wykrytych składników. Główne ograniczenie metodyki dotyczy samych próbek. Ze względu na to, że składniki o szczególnym znaczeniu są lotne i mogą one łatwo zostać utracone lub ich stężenie może ulec zmianie, ważne jest, aby próbki były odpowiednio przechowywane i transportowane po ich pobraniu. Oznacza to również, że warunki przechowywania i transportu próbek są stosunkowo kosztowne. Metodę tę można zastosować do różnych próbek (w tym moczu, kału, włosów i wydzielin gruczołów zapachowych). Zapachy te składają się ze złożonych mieszanin, występujących w różnych matrycach, a zatem wymagają stosowania technik oddzielania poszczególnych składników i ekstrakcji związków o znaczeniu biologicznym.

Wprowadzenie

Bardzo mało wiadomo o zmianach chemicznych leżących u podstaw sygnałów węchowych u zwierząt¹, również z powodu wyzwań metodologicznych związanych z rejestracją i ilościowym określaniem lotnych profili chemicznych zapachów². Istnieje kilka potencjalnych pułapek podczas pracy z wysoce złożonymi, chemicznymi matrycami; Należą do nich pobieranie próbek i analizowanie próbek zapachów3.

W Centrum Naukowym Rosalind Franklin, University of Wolverhampton, przeprowadzamy analizę zapachów i śladów zapachowych, aby zrozumieć, w jaki sposób mogą być one wykorzystywane przez zwierzęta. Łączymy semiochemię z ekologią behawioralną, endokrynologią i cytologią, aby lepiej zrozumieć rolę, jaką odgrywają sygnały węchowe w komunikacji zwierząt.

Opracowaliśmy metodologię, a następnie przeanalizowaliśmy zapachy i znaki różnych gatunków, w tym kilku naczelnych niebędących ludźmi (np. lemury koronowane, lemury czerwone, makaki japońskie, pawiany oliwkowe, szympansy) i innych ssaków (np. kotów, krów). Zebraliśmy i przeanalizowaliśmy różne próbki, w tym mocz, kał, wydzieliny z włosów i gruczołów zapachowych. Te zapachy i ślady zapachowe składają się ze złożonych mieszanin związków, a zatem każda metodologia stosowana do ich analizy musi obejmować jakąś formę techniki separatora. Jak pokazano, występują one również w różnych matrycach, co wymaga zastosowania technik w celu wyodrębnienia interesujących ich składników.

Poprzednie badania przeprowadzone przez Vaglio et al.⁴ i inni autorzy⁵ używały dynamicznej ekstrakcji przestrzeni nad powierzchnią (DHS) z chromatografią gazową ze spektrometrią mas (GC-MS), podczas gdy bezpośrednia ekstrakcja rozpuszczalnikiem⁶ i złożone ekstrakcje rozpuszczalnikiem⁷ również zostały użyte. W szczególności dynamiczne pobieranie próbek w przestrzeni nad powierzchnią polega na przedmuchiwaniu przestrzeni nad powierzchnią znaną objętością gazu obojętnego, która ostatecznie usuwa wszystkie lotne związki, z wyjątkiem tych, które wykazują silne powinowactwo do matrycy próbki (na przykład związki polarne w próbkach wodnych).

Dla obecnej metodologii, przyjęliśmy technikę mikroekstrakcji w fazie stałej (HS-SPME) w połączeniu z GC-MS. W szczególności opracowaliśmy i udoskonaliliśmy metodologię już używaną przez Vaglio et al. w poprzednim laboratorium GC-MS^8,9,10.

Techniki ekstrakcji bezrozpuszczalnikowej są bardzo skuteczne w analizie małych, wysoce lotnych związków (które w przeciwnym razie mogą być łatwo utracone z próbki), ponieważ te metody unieruchamiają związki na stabilnym, stałym nośniku fazy. HS-SPME wykorzystuje włókno pokryte polimerem adsorbującym do wychwytywania lotnych związków w przestrzeni nad próbką lub do ekstrakcji rozpuszczonych związków przez zanurzenie w wodnym płynie biologicznym¹¹. Powłoka polimerowa nie wiąże silnie związków, dlatego poprzez podgrzanie w porcie wtryskowym GC można je usunąć. Ta metoda jest silniejsza niż techniki ekstrakcji rozpuszczalnikiem, a także bardziej skuteczna niż DHS.

W obecnym podejściu próbki znajdują się w szklanych fiolkach. Fiolki te są podgrzewane do temperatury 40 °C w celu symulacji temperatury ciała zwierzęcia w celu pobudzenia zajęcia przestrzeni nad głową fiolki przez lotne składniki znaku. Włókno SPME, pokryte 65 μm sorbentu z polidimetylosiloksanu/diwinylobenzenu (PDMS/DVB), jest wystawione na działanie środowiska nadpowierzchniowego, a lotne składniki próbki są adsorbowane na włóknie. Po podgrzaniu włókna w porcie wlotowym GC-MS, lotne składniki są desorbowane z włókna, a następnie oddzielane przez GC. Wzorce fragmentacji widma mas uzyskuje się dla każdego składnika za pomocą MS. Porównując te widma masowe z bazami danych widma masowego, możliwa jest wstępna identyfikacja składników znaku zapachowego. Dzięki zastosowaniu automatycznego próbnika jesteśmy w stanie w spójny sposób analizować wiele próbek w partiach.

Biorąc pod uwagę, że każdy rodzaj światłowodu SPME ma inne powinowactwo do polarnych związków chemicznych, zazwyczaj wybiera się włókno w zależności od polarności i/lub masy cząsteczkowej docelowych związków chemicznych. Ponadto warunki GC zmieniają się w zależności od rodzaju kolumny GC i charakterystyki docelowych związków chemicznych.

Ta technika pozwala na półilościową analizę lotnych składników znakowania zapachowego, umożliwiając separację i wstępną identyfikację składników w próbce, a następnie analizę proporcji powierzchni pików w poszukiwaniu trendów, które mogłyby oznaczać składniki znakowania zapachowego, które mogą być zaangażowane w sygnalizację.

Kluczowymi zaletami obecnego podejścia są:

• Zakres typów próbek, które mogą być analizowane.
• Nie jest wymagane skomplikowane przygotowanie próbki ani ekstrakcja.
• Możliwość analizy składników lotnych.
• Możliwość oddzielenia składników mieszaniny.
• Aby móc zidentyfikować wykryte komponenty.
• Zdolność do dostarczania półilościowych i potencjalnie ilościowych informacji na temat wykrytych składników.

Protokół

1. Pobieranie próbek

1. Przykładowe zapachy, które są jednym z poniższych:
   1. Zbieraj spontanicznie uwalniane przez przyzwyczajonych uczestników badania (np. naczelne z zoo) poprzez znakowanie zapachowe na sterylnej bibule filtracyjnej (np. wydzieliny zapachowe gruczołów zapachowych) lub bezpośrednio do fiolek (np. moczu).
   2. Zbieraj, pocierając sterylne waciki bawełniane po szkoleniu badanych osób, stosując trening pozytywnego wzmocnienia.
   3. Zbieraj, pocierając sterylne waciki bawełniane po uspokojeniu badanych.
2. Umieścić próbki w sterylnych fiolkach z przezroczystego szkła o pojemności 10 ml z zakręcaną nakrętką i zamknąć nakrętkami zawierającymi FTFE/silikonowe przegrody. Natychmiast przechowywać je w temperaturze -20 °C.
   UWAGA: Konieczne jest stosowanie czystych środków ochrony osobistej, takich jak rękawice nitrylowe; często je zmieniaj; Unikać bezpośredniego kontaktu skóry z próbkami i fiolkami. Zaleca się używanie zupełnie nowych fiolek; Jednak w przypadku zużytych fiolek konieczne jest ich wstępne oczyszczenie, a następnie zastosowanie tego samego protokołu.
3. Bierz puste miejsca środowiskowe za każdym razem, gdy zbierane są ślady zapachowe. Na przykład należy pobrać pożywkę do pobierania próbek (np. bibułę filtracyjną lub wacik) oraz fiolkę z przestrzenią nad roztworem, które są wystawione na działanie środowiska podczas pobierania próbek.

2. Przygotowanie próbki

1. Przygotować próbki w terenie, wycinając ostrzem około 10 mm kwadratu z oznaczonej zapachem bibuły filtracyjnej lub główki wacika i umieszczając ją w 10 ml zakręcanej fiolce z przestrzenią na głowę.
2. Po przygotowaniu każdej próbki należy wyrzucić lub oczyścić ostrze używane do cięcia pożywki do pobierania próbek za pomocą odpowiedniej chusteczki antybakteryjnej i/lub alkoholu i dokładnie wysuszyć.
3. Wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
   UWAGA: Preferowane w temperaturze -20 °C lub w inny sposób tak niskiej, jak to praktycznie możliwe w terenie.

3. Przygotowanie do analizy

1. Wyjąć próbki z zamrażarki i pozostawić do naturalnego ogrzania do temperatury pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
2. Skonfiguruj metodę analityczną na GC-MS w następujący sposób:
   1. W przypadku warunków analizy SPME należy postępować zgodnie ze wskazówkami producenta, aby kondycjonować włókna SPME przed pierwszym użyciem: wstępne kondycjonowanie włókien (260 °C przez 5 min), inkubacja próbki (40 °C przez 2 min), czas ekstrakcji (15 min), czas desorpcji (2 min) i kondycjonowanie końcowe włókna (260 °C przez 20 min).
   2. Stosować następujące warunki GC: kolumna (HP5-MS 30 m x 0,25 mm; 0,25 μm), temperatura wtryskiwacza (270 °C), natężenie przepływu (1 ml/min), tryb wtrysku (bez podziału), profil pieca GC (45 °C przez 2 min; 4 °C/min do 170 °C; 20 °C/min do 300 °C), przewód przesyłowy MSD (280 °C).
      UWAGA: Aby poprawić spójność czasu retencji próbki, metoda analityczna jest zablokowana w czasie retencji).
   3. Stosować następujące warunki MSD: opóźnienie rozpuszczalnika (2,5 min) i zakres skanowania (od 29 do 400 amu).
      UWAGA: Zakres od 10 do 400 był używany w poprzednich protokołach⁴.
3. Upewnij się, że dopływ gazu płuczącego do jednostki kondycjonowania światłowodów jest włączony.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby zespół SPME był prawidłowo zainstalowany w automatycznym próbniku i aby był wyrównany z tacami automatycznego próbnika, jednostką kondycjonowania światłowodu i portem wlotowym GC. Nieprawidłowe wyrównanie może spowodować uszkodzenie lub zniszczenie światłowodu SPME.

4. Analiza

1. Umieścić pustą fiolkę z przestrzenią nad roztworem (aby działała jako ślepa próba systemowa) w pierwszym miejscu tacki automatycznego próbnika GC-MS. Umieść ślepy półfabrykat środowiskowy w drugiej pozycji tacy automatycznego próbnika. Umieść próbki do analizy w kolejnych pozycjach tacy z automatycznymi próbkami.
2. Utwórz sekwencję analityczną, aby przeanalizować każdą próbkę w zasobniku na próbki.
   1. Na ekranie głównym MassHunter wybierz Sekwencja | Sekwencja ładowania.
   2. Wypełnić tabelę sekwencji dla wszystkich ślepych prób i próbek, wprowadzając odpowiednie informacje. Zapisz ukończoną tabelę sekwencji.
      UWAGA: Dokładne informacje dotyczące tabeli sekwencji będą zależeć od formatowania tabeli przez laboratoria. Minimalne informacje zwykle obejmują typ próbki, nazwę próbki, lokalizację i numer fiolki, metodę analityczną oraz lokalizację i nazwę pliku danych (przypisanie nazwy pliku danych, która jest zgodna z nazwą próbki, pomaga w przyszłym przetwarzaniu danych). Podczas analizy do sekwencji można dodać dodatkowe próbki.
3. Uruchom sekwencję, wybierając pozycję Sekwencja | Uruchom sekwencję.
4. Po analizie należy jak najszybciej umieścić próbki w zamrażarce.
   UWAGA: może być możliwa ponowna analiza próbek, ale należy zauważyć, że niektóre składniki lotne mogły zostać całkowicie wyekstrahowane podczas wstępnej analizy, a niektóre związki mogły zostać poddane rozkładowi termicznemu i bakteryjnemu w temperaturze 40 °C, w związku z czym otrzymany chromatogram może nie być w pełni reprezentatywny dla oryginalnego znakowania zapachowego.

5. Analiza danych

UWAGA: Wstępna analiza danych obejmuje integrację chromatogramów w celu uzyskania danych o czasie retencji i obszarze pików wraz ze wstępną identyfikacją pików za pomocą oprogramowania ChemStation i baz danych spektralnych mas NIST (National Institute of Standards and Technology), wersja MSD F.01.01.2317. Analiza danych może być przeprowadzana ręcznie lub metodą półautomatyczną. Jeśli stosowana jest metoda półautomatyczna, czasami korzystne jest przeprowadzenie pewnej ręcznej analizy danych w celu zweryfikowania wstępnych identyfikacji.

1. Otwórz plik z danymi, klikając odpowiedni plik na pasku nawigacyjnym po lewej stronie. Chromatogram jonów całkowitych (TIC) zostanie wyświetlony w górnym oknie ekranu analizy danych.
2. Aby zintegrować TIC za pomocą integratora RTE, wybierz Chromatogram | Integracja.
3. Dostosuj parametry całkowania tak, aby całkowane były szczyty, które są większe niż 3 x szum linii bazowej. Wybierz chromatogram | Parametry integracji sygnału MS. W polu wyjściowym dostosuj odpowiednio minimalny obszar piku (1.0 daje akceptowalne wyniki w naszych przykładach).
4. Aby zidentyfikować szczyty i wygenerować raport podsumowujący, wybierz opcję Eksportuj raporty | Wyniki wyszukiwania w bibliotece są zgłaszane do XLS.
   UWAGA: Biblioteki spektralne, które mają być przeszukiwane, wraz z liczbą dopasowań bibliotek do wyświetlenia, muszą być wstępnie ustawione w oprogramowaniu, zanim będzie można rozpocząć przeszukiwanie biblioteki.
5. Wynikowy raport arkusza kalkulacyjnego zawiera dane integracji dla każdego piku oraz wstępne dopasowanie biblioteki spektralnej w celu przypisania tożsamości. Zazwyczaj dopasowanie jakości biblioteki/biblioteki powinno wynosić >80, aby zaakceptować wstępną identyfikację. Zapisz arkusz kalkulacyjny.
6. Zidentyfikuj pik bezpośrednio na podstawie TIC.
   1. Wybierz szczyt zainteresowania.
   2. Jeśli szczyt jest mały, powiększ go, rysując ramkę wokół szczytu, przytrzymując lewy przycisk myszy, rozciągnij ramkę nad szczytem i zwolnij.
   3. Umieść linię kursora tak, aby znajdowała się w najwyższym punkcie szczytu (lub tuż po).
   4. Kliknij dwukrotnie prawym przyciskiem myszy, a widmo masowe dla piku pojawi się w dolnym oknie ekranu analizy danych.
   5. Aby przeszukać bibliotekę spektralną, przesuń kursor w dowolne miejsce w oknie widma i kliknij dwukrotnie prawym przyciskiem myszy. Wyniki wyszukiwania w bibliotece pojawią się w nowym oknie.
   6. Aby usunąć szum tła z interesującego spektrum, najpierw kliknij dwukrotnie prawym przyciskiem myszy na danym szczycie. Następnie kliknij dwukrotnie prawym przyciskiem myszy w obszarze, w którym nie ma szczytów bezpośrednio przed szczytem zainteresowania. Wybierz chromatogram | Odejmij widma. Odjęte widmo zostanie wyświetlone w dolnym oknie ekranu analizy danych i wyświetli "(-)" obok danych SCAN w nagłówku okna.

Wyniki

Postępując zgodnie z tym protokołem, wstępnie zidentyfikowano łącznie 32 lotne związki chemiczne na podstawie analizy 14 znaczeń zapachowych z okolic odbytu i narządów płciowych, które zostały spontanicznie naniesione na papier filtracyjny przez lemury czerwone (Varecia variegata rubra), a następnie porównano profile zapachowe z cechami osobników wysyłających sygnały¹². W profilach tych obecne były naturalnie występujące związki lotne, takie jak węglowodory, terpeny, alkohole terpenowe i ...

Dyskusja

Wykorzystanie próbek kontrolnych, zarówno kontroli środowiskowych utworzonych w momencie pobierania próbek, jak i ślepych prób systemowych, ma kluczowe znaczenie dla interpretacji próbek znaków zapachowych. Wszelkie piki przypisane środowisku pobierania próbek lub systemowi instrumentalnemu muszą być wyłączone z próbek znakowania zapachowego, tak aby tylko piki będące przedmiotem zainteresowania były uwzględniane w jakiejkolwiek interpretacji. Kontrole te mogą również odgrywać rolę w ocenie i monitorowaniu "zdrowia" oprz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fiolki z autosamplerem 10 ml	Agilent	5188-5392	Fiolki zakręcane 10 ml z
kapslem 18 mm	Agilent	8010-0139	Magnetyczny z przegrodą PTFE/silikon
Autosampler	Agilent	GC120 PAL
Kolumna kapilarna	Agilent	HP5-MS	30 m x 0,25 mm; 0,25 &mikro; m
Oprogramowanie do analizy danych	Agilent-ChemStation
Chromatograf gazowy	Agilent	7890B
Przegroda wlotowa	Agilent	5182-3442	Merlin mikrouszczelka
Masowy detektor selektywny	Agilent	5977A
Oprogramowanie do raportowania		Microsoft-Excel
Biblioteka spektralna	NIST	-	NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library
Program do przeszukiwania bibliotek spektralnych	NIST-MS		Search v.2.2
Splitless Wkładka wlotowa	Agilent	5190-4048
Włókna SPME	Agilent	SU57345U	65 µ m Światłowód PDMS/DVB