Charakterystyka różnicowania in vitro ludzkich keratynocytów pierwotnych za pomocą analizy RNA-Seq

Podsumowanie

Przedstawiona tutaj jest stopniowa procedura różnicowania in vitro ludzkich pierwotnych keratynocytów poprzez hamowanie kontaktu, a następnie charakterystykę na poziomie molekularnym za pomocą analizy sekwencyjnej RNA.

Streszczenie

Ludzkie pierwotne keratynocyty są często używane jako modele in vitro do badań nad różnicowaniem naskórka i chorobami pokrewnymi. Opisano metody różnicowania in vitro keratynocytów hodowanych w dwuwymiarowym (2D) zanurzeniu w różnych warunkach indukcji. Opisano tutaj procedurę metody różnicowania keratynocytów 2D in vitro poprzez inhibicję kontaktową, a następnie charakterystykę molekularną za pomocą sekwencji RNA. Krótko mówiąc, keratynocyty są hodowane w określonym pożywce keratynocytowej uzupełnionej czynnikami wzrostu, aż do pełnego zlewania się. Różnicowanie jest indukowane przez bliskie kontakty między keratynocytami i dodatkowo stymulowane przez wykluczenie czynników wzrostu w pożywce. Za pomocą analiz sekwencyjnych RNA wykazano, że zarówno 1) zróżnicowane keratynocyty wykazują wyraźne sygnatury molekularne podczas różnicowania, jak i 2) dynamiczny wzorzec ekspresji genów w dużej mierze przypomina komórki podczas stratyfikacji naskórka. Jeśli chodzi o porównanie z normalnym różnicowaniem keratynocytów, keratynocyty przenoszące mutacje czynnika transkrypcyjnego p63 wykazują zmienioną morfologię i sygnatury molekularne, zgodne z ich defektami różnicowania. Podsumowując, protokół ten szczegółowo opisuje etapy różnicowania keratynocytów 2D in vitro i jego charakterystykę molekularną, z naciskiem na bioinformatyczną analizę danych sekwencyjnych RNA. Ponieważ procedury ekstrakcji RNA i sekwencjonowania RNA zostały dobrze udokumentowane, nie jest to przedmiotem tego protokołu. Eksperymentalna procedura różnicowania keratynocytów in vitro i analiza bioinformatyczna mogą być wykorzystane do badania zdarzeń molekularnych podczas różnicowania naskórka u zdrowych i chorych keratynocytów.

Wprowadzenie

Ludzkie pierwotne keratynocyty pochodzące z ludzkiej skóry są często używane jako model komórkowy do badania biologii naskórka^1,2,3,4. Stratyfikacja naskórka może być modelowana przez różnicowanie keratynocytów, zarówno w zanurzonym monowarstwowym modelu 2D, jak i w modelu organotypowym 3D z podnośnikiem powietrznym^2,3,5,6,7. Chociaż modele 3D stają się coraz ważniejsze do oceny struktury i funkcji naskórka, modele różnicowania 2D są nadal szeroko stosowane, ze względu na ich wygodę i możliwość generowania dużej liczby komórek do analiz.

Zastosowano różne warunki do indukowania różnicowania keratynocytów w 2D, w tym dodanie surowicy, wysokie stężenie wapnia, niższą temperaturę i hamowanie receptorów naskórkowego czynnika wzrostu^2,3. Każda z tych metod została zwalidowana przez szereg genów markera różnicowania keratynocytów i okazała się skuteczna w ocenie różnicowania keratynocytów, w tym w warunkach patologicznych. Jednak te warunki indukcji wykazują również różnice w ich efektywności różnicowania i kinetyce, gdy badane są określone panele genów markerowych^2,3.

Jedna z tych metod polega na hamowaniu kontaktu keratynocytów i wyniszczaniu czynników wzrostu w pożywce hodowlanej⁸. Wykazano, że keratynocyty mogą różnicować się spontanicznie, gdy komórki osiągną pełną gęstość. Wykluczenie czynników wzrostu z pożywki hodowlanej może jeszcze bardziej zwiększyć różnicowanie. Wykazano, że metoda łącząca hamowanie kontaktowe i zubożające czynniki wzrostu generuje zróżnicowane keratynocyty z wzorcami ekspresji genów podobnymi do normalnego warstwowego naskórka przy użyciu kilku markerów naskórka³, co sugeruje, że model ten jest odpowiedni do badania prawidłowego różnicowania keratynocytów. Ostatnio opisano dwie kompleksowe analizy ekspresji genów różnicowania keratynocytów przy użyciu tego modelu^9,10. Naukowcy zweryfikowali ten model na poziomie molekularnym i wykazali, że można go wykorzystać do badania prawidłowego i chorego różnicowania keratynocytów.

Ten protokół opisuje procedurę metody różnicowania in vitro i analizy molekularnej zróżnicowanych komórek za pomocą sekwencji RNA. Ilustruje również charakterystykę transkryptomu komórek w dniu różnicowania 0 (etap proliferacji), dniu 2, dniu 4 i dniu 7 (odpowiednio wczesne, środkowe i późne różnicowanie). Wykazano, że zróżnicowane keratynocyty wykazują wzorce ekspresji genów, które w dużej mierze przypominają komórki podczas stratyfikacji naskórka. Aby sprawdzić, czy ta metoda może być wykorzystana do badania patologii skóry, zastosowaliśmy ten sam potok eksperymentalny i analityczny do zbadania keratynocytów przenoszących mutacje czynnika transkrypcyjnego p63, które pochodzą od pacjentów z ektrodaktylią, dysplazją ektodermalną i zespołem rozszczepu wargi/podniebienia (EEC) ^11,12. Protokół ten koncentruje się na różnicowaniu keratynocytów in vitro, a także na późniejszej analizie bioinformatycznej sekwencjonowania RNA. Inne etapy całej procedury, takie jak ekstrakcja RNA, przygotowanie próbki sekwencyjnej RNA i budowa biblioteki, są dobrze udokumentowane i można je łatwo wykonać, zwłaszcza w przypadku korzystania z wielu powszechnie używanych zestawów komercyjnych. W związku z tym kroki te są tylko pokrótce opisane w protokole. Dane pokazują, że ta linia produkcyjna nadaje się do badania zdarzeń molekularnych podczas różnicowania naskórka u zdrowych i chorych keratynocytów.

Protokół

Biopsje skóry zostały pobrane z tułowia zdrowych ochotników lub pacjentów z mutacjami p63, aby skonfigurować pierwotną hodowlę keratynocytów. Wszystkie procedury dotyczące ustalania ludzkich keratynocytów pierwotnych zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Centrum Medycznego Uniwersytetu Radboud w Nijmegen ("Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen"). Uzyskano świadomą zgodę.

1. Różnicowanie ludzkich keratynocytów pierwotnych przez hamowanie kontaktowe

1. W razie potrzeby przygotuj pożywkę wzrostową keratynocytów (KGM) z podłoża podstawowego keratynocytów (tabela materiałów).
2. Przygotować 500 ml pożywki proliferacyjnej, używając wcześniej przygotowanych zapasów (KGM-pro; patrz Tabela 1).
3. Przygotować 500 ml pożywki różnicującej (KGM-dif; patrz Tabela 2).
   UWAGA: KGM z suplementami można przechowywać w temperaturze 4 °C przez dwa tygodnie. W celu dłuższego przechowywania można go porcjować i przechowywać w temperaturze -20°C.
4. Wysiewaj pierwotne keratynocyty o gęstości 5,0–20 x 10³ komórki/^cm2, w zależności od zdolności proliferacyjnej komórki. Dodaj wystarczającą ilość pożywki KGM-pro, aby pokryć komórki.
   UWAGA: 1) Szczegółowe informacje na temat regularnej hodowli komórkowej w pożywce KGM można znaleźć na stronie internetowej Lonza¹³. 2) Gęstość wysiewu należy przetestować dla każdej linii komórkowej. Na przykład normalna pierwotna linia keratynocytów może być wysiewana o gęstości 5,0 x 10³ komórek/cm², podczas gdy linia niosąca mutacje w czynniku transkrypcyjnym p63, która jest mniej proliferacyjna, powinna być wysiewana o gęstości 20 x 10³ komórki / cm². 3) W zależności od konfiguracji doświadczalnej, należy wysiać kilka szalek lub studzienek komórek, aby umożliwić pobieranie próbek w różnych dniach różnicowania w replikach.
5. Odświeżać komórki pożywką KGM-pro przez dwa dni po wysiewie (siew w dniu 0, odświeżanie po raz 1 w dniu 3). Następnie odświeżaj pożywką KGM-pro co drugi dzień. Sprawdzaj komórki regularnie, przynajmniej co drugi dzień.
6. Indukuj różnicowanie komórek, gdy komórki zlewają się w ponad 90%, zmieniając pożywkę na KGM-dif. Dzień zmiany medium na KGM-dif jest definiowany jako dzień różnicowania 0. Zebrać komórki do dalszych analiz RNA, najpierw przemłukując 2x DPBS, a następnie dodając bufor do lizy (z zestawu do ekstrakcji RNA).
   UWAGA: Przy wyżej wymienionej gęstości wysiewu komórki powinny osiągnąć zbieżność w ciągu 7–10 dni. Komórki można zasiewać z większą gęstością początkową, aby szybciej osiągnąć konfluencję. Jeśli komórki nie są proliferacyjne, dłuższe oczekiwanie może nie doprowadzić do powstania w pełni zlewających się komórek. Może być wymagana większa gęstość wysiewu.
7. Codziennie odświeżaj komórki pożywką KGM-dif i zbieraj komórki w 2, 4 i 7 dniu różnicowania w celu dalszej ekstrakcji RNA.

2. Ekstrakcja RNA

1. Wyizoluj całkowite RNA. Można to zrobić za pomocą komercyjnego zestawu do izolacji RNA (takiego jak Zymo Quick-RNA MicroPrep RNA) lub za pomocą phenol¹⁴. Jednak zestaw do izolacji zawierający leczenie DNAzy jest wysoce zalecany w przypadku próbek sekwencyjnych RNA, aby zapobiec zanieczyszczeniu DNA i fenolu. Przykład komercyjnego zestawu do izolacji RNA znajduje się w Tabeli materiałów.
2. Zmierz stężenie RNA za pomocą spektrometru. Zarówno DNA, jak i RNA mają szczyt absorpcji przy 260 nm.
   UWAGA: 1) Stosunek absorbancji przy 260 nm i 280 nm służy do oceny czystości RNA. Stosunek około 2,0 jest ogólnie akceptowany jako "czyste" RNA. Jeśli stosunek ten jest znacznie niższy niż 2,0, próbka może być zanieczyszczona zanieczyszczeniami, które absorbują się przy 280 nm, takimi jak białka, fenole lub inne substancje. 2) Stosunek absorbancji przy 260 nm i 230 nm mierzy czystość kwasu nukleinowego. Oczekuje się, że stosunek ten wyniesie od 2,0 do 2,2. Jeśli stosunek ten jest znacznie niższy, próbka może być zanieczyszczona zanieczyszczeniami, które absorbują się przy 230 nm, takimi jak EDTA, etanol lub inne substancje.

3. Kontrola jakości RNA

1. Uruchom RNA na chipie Pico bioanalizatora RNA, aby ilościowo zweryfikować liczbę integralności RNA (RIN), lub na żelu w celu pomiaru jakościowego. Ogólnie rzecz biorąc, RIN wynoszący co najmniej osiem jest wysoce wskazany. Jednak podczas ekstrakcji RNA z tkanek RIN może być niższy.
   UWAGA: Opcjonalnie kontrolę jakości można przeprowadzić za pomocą qPCR na materiale RNA.

4. Przygotowanie biblioteki sekwencyjnej RNA

UWAGA: Przygotowanie biblioteki sekwencyjnej RNA jest często wykonywane za pomocą zestawu komercyjnego lub w ustawieniach komercyjnych. Opisany protokół został zaadaptowany z komercyjnego zestawu, KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase (Illumina), z krótkim opisem wszystkich wymaganych kroków: zubożenie rRNA z oligonymedyzacją do ludzkich rybosomalnych RNA, fragmentacja RNA, synteza pierwszej nici, synteza drugiej nici i A-tailing oraz czyszczenie po każdym kroku¹⁵. W tym celu można również wykorzystać inne zestawy do przygotowania biblioteki. Zaleca się wykonanie tego kroku przy użyciu dostępnego na rynku zestawu, ponieważ jakość wygenerowanej biblioteki cDNA jest często bardziej spójna. 2) Poniższe kroki są opisane dla przygotowania biblioteki 1x. Jeśli przygotowujesz kilka próbek, przygotuj mieszanki wzorcowe z 10% dodatkową objętością.

1. Hybrydyzacja oligonukleoty i zubożenie rRNA
   1. Przygotować główną mieszankę oligonukleizacji (łącznie = 11 μl, z 4,4 μl buforu hybrydyzacyjnego, 4,4 μl oligonukleukleotydów hybrydyzacyjnych i 2,2 μl wody wolnej od RNaz) i główną mieszanką zubożoną (łącznie = 5,5 μl, z 3,3 μl buforu zubożającego i 2,2 μl RNazy H).
   2. Ustaw program reakcji PCR na termocyklerze: 95 °C przez 2 min; zmniejsz do 45 °C przy -0,1 °C/s; 45 °C pauza; 45 °C na 30 minut; 4 °C na zawsze.
      UWAGA: Rozważ rozpoczęcie od podwójnej ilości RNA niż jest to konieczne do amplifikacji. W pierwszej próbie użyj połowy kwoty, aby kontynuować wykonywanie kolejnych kroków. Ma to na celu upewnienie się, że nadal jest materiał do powtórzenia tych kroków z różną liczbą cykli (patrz krok 4.7.2), jeśli cykle amplifikacji okażą się niewystarczające lub nadmiernie wzmocnione.
   3. Użyć od 25 ng do 1 μg całkowitego RNA w 10 μl wody wolnej od RNAse, dodać 10 μl głównej mieszanki oligonowacyzacyjnej. Umieść próbki w zaprogramowanym termocyklerze i uruchom program.
   4. Gdy program osiągnie etap pauzy w temperaturze 45 °C, dodać 5 μl głównej mieszanki zubożonej do 20 μl reakcji hybrydyzacji bez wyjmowania jej z termocyklera. Dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.
   5. Wznów program termocyklera, aby kontynuować etap wyczerpywania (45 °C przez 30 min).
      UWAGA: 1) Umieść kulki do zubożenia rRNA (np. czyste kulki KAPA) w temperaturze pokojowej (RT) podczas etapu zubożenia dla następnej części protokołu. 2) Rozważ przygotowanie głównej mieszanki do wytrawiania DNazy (dla sekcji 4.2), ponieważ odczynniki są potrzebne bezpośrednio po oczyszczeniu ze zubożenia rRNA.
   6. Wykonaj 2,2-krotne czyszczenie kulek KAPA Pure Beads: połącz mieszaninę RNA (25 μL) i KAPA Pure Beads (55 μL), dokładnie ponownie zawieszając kulki w mieszance RNA, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.
   7. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby umożliwić wiązanie RNA z kulkami, a następnie umieścić probówkę (probówki) na stojaku magnetycznym, aby wychwycić kulki, aż płyn będzie klarowny, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić 60 μl supernatantu.
   8. Trzymając probówkę (rurki) na magnesie, przemyj 2x 200 μl 80% etanolu, inkubując kulki z etanolem przez ≥30 s i wyrzuć etanol. Spróbuj usunąć wszystkie resztki etanolu bez naruszania kulek po drugim praniu.
   9. Suszyć kulki w temperaturze pokojowej przez 3–5 minut lub do momentu, gdy cały etanol wyparuje.
      UWAGA: Nadmierne przesuszenie kulek może spowodować zmniejszenie wydajności.
2. Trawienie DNazy
   1. Przygotować główną mieszankę do wytrawiania DNazy (łącznie = 22 μl, z 2,2 μl buforu DNazy, 2 μl DNazy i 17,8 μl wody wolnej od RNaz).
   2. Zawiesić kulki w głównej mieszance do trawienia DNAzy (20 μl), kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Inkubować probówkę (probówki) w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, aby wymyć RNA z kulek.
   3. Umieść probówkę (probówki) na stojaku magnetycznym, aby uchwycić kulki, aż płyn będzie klarowny, i ostrożnie przenieś 20 μl supernatantu do czystej probówki.
   4. Inkubować probówkę (probówki) z supernatantem w temperaturze 37 °C przez 30 min.
      UWAGA: Rozważ przygotowanie głównych mieszanek do elucji, fragmentacji i gruntowania RNA (dla sekcji 4.3), ponieważ odczynniki są bezpośrednio potrzebne po oczyszczeniu trawienia DNazy.
   5. Wykonaj czyszczenie oparte na koralikach 2,2x, postępując zgodnie z 4.1.6–4.1.9.
3. Elucja, fragmentacja i gruntowanie RNA
   1. Przygotować główną mieszankę Fragment, Prime i Elute Buffer (1x) z 11 μl Fragmentu, Prime i Elute Buffer (2x) oraz 11 μL wody wolnej od RNaz.
   2. Dokładnie zawiesić kulki z oczyszczonym, potraktowanym DNazą RNA w 22 μl buforu fragmentacyjnego, pierwotnego i elutu (1x), kilkakrotnie pipetując w górę iw dół.
   3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3minuty, aby wymyć RNA z kulek, a następnie umieścić probówkę (probówki) na magnesie, aby wychwycić kulki, aż płyn będzie klarowny.
   4. Ostrożnie przenieść 20 μl supernatantu do probówki (probówek). Wyrzuć probówkę (rurki) z koralikami.
      UWAGA: Jest to bezpieczny punkt zatrzymania, ponieważ próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez ≤24 godziny.
   5. Umieścić probówkę (probówki) w termocyklerze i przeprowadzić rozdrobnienie i zalewanie w temperaturze 94 °C przez 6 minut. W wyniku uzyskania fragmentów o długości około 200–300 pz.
      UWAGA: Inkubować przez 8 minut w temperaturze 94 °C dla fragmentów o objętości 100–200 pz. W przypadku częściowo zdegradowanego RNA fragmentacja trwa od 1 do 6 minut w temperaturze 85 °C, w zależności od stopnia degradacji.
   6. Umieścić probówkę (probówki) na lodzie i natychmiast przystąpić do syntezy pierwszej nici.
4. Synteza pierwszej nici
   1. Przygotować główną mieszankę syntezy pierwszej nici (całkowita = 12 μl, z 11 μl buforu do syntezy pierwszej nici i 1 μl skryptu KAPA).
   2. Ustaw program reakcji PCR na termocyklerze: 25 °C przez 10 min; 42 °C przez 15 min; 70 °C przez 15 min; 4 °C na zawsze.
   3. Na lodzie połączyć 20 μl rozdrobnionego zagruntowanego RNA z 10 μl głównej mieszanki syntezy pierwszej nici. Trzymaj probówkę (probówki) na lodzie, dokładnie wymieszaj, delikatnie pipetując kilkakrotnie reakcję w górę i w dół.
   4. Umieść probówkę (rurki) w zaprogramowanym termocyklerze i rozpocznij program.
5. Synteza drugiej nici i ogon A
   1. Przygotować syntezę drugiej nici i mieszankę główną A-tailing na lodzie (łącznie = 33 μL, z 31 μL buforu do syntezy drugiej nici i 2 μL mieszanki enzymów syntezy drugiej nici i A-ogoniasków).
   2. Ustaw program reakcji PCR na termocyklerze: 16 °C na 30 min; 62 °C na 10 minut; 4 °C na zawsze.
   3. Połączyć 30 μl produktu syntezy pierwszej nici z 30 μl syntezy drugiej nici i mieszance głównej ogona A, a następnie dokładnie wymieszać, odpipetowując kilkakrotnie w górę i w dół na lodzie.
   4. Umieść probówkę (rurki) w zaprogramowanym termocyklerze i rozpocznij program.
6. Podwiązanie adaptera i czyszczenie po podwiązaniu
   1. Rozcieńczyć adaptery (kody kreskowe DNA NEXTflex, 25 μM) 3,57x w wodzie wolnej od RNaz do 7 μM.
   2. Przygotować główną mieszankę do ligacji adaptera (łącznie = 50 μl, z 40 μl buforu ligacyjnego i 10 μl ligazy DNA).
   3. Połączyć 60 μl produktu syntezy drugiej nici, 45 μl mieszanki głównej ligacji adaptera i 5 μl rozcieńczonych łączników. Dokładnie wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół na lodzie.
   4. Inkubować probówki w temperaturze 20 °C przez 15 minut i natychmiast kontynuować pierwsze czyszczenie po podwiązaniu.
   5. Wykonaj 0,63-krotne czyszczenie na bazie kulek, łącząc związane adapterowo DNA (110 μl) i czyste kulki KAPA (70 μl), a następnie dokładnie ponownie zawiesić kulki w mieszance DNA, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.
   6. Powtórz kroki 4.1.7–4.1.9.
   7. Wyjmij rurki z magnesu. Dokładnie zawiesić kulki w 50 μl 10 mM Tris HCL (pH = 8,0–8,5) i inkubować kulki w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
   8. Umieść płytkę na magnesie i poczekaj, aż płyn będzie klarowny. Przenieść 50 μl klarownego supernatantu do nowej probówki.
      UWAGA: Bezpieczny punkt zatrzymania na mniej niż 24 godziny w temperaturze 4 °C.
   9. Wykonaj 0,7-krotne czyszczenie na bazie kulek, łącząc 50 μl kulek z oczyszczonym DNA ligowanym adapterowo z 35 μl roztworu PEG/NaCL. Dokładnie wymieszaj przez wirowanie.
   10. Wykonaj kroki czyszczenia 4.1.7–4.1.9. Dokładnie zawiesić kulki w 20 μl 10 mM Tris HCL (pH = 8,0–8,5) i inkubować kulki w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
   11. Umieść płytkę na magnesie i poczekaj, aż płyn będzie klarowny. Przenieść 20 μl klarownego supernatantu do nowej probówki i przejść do sekcji 4.7.
       UWAGA: Bezpieczny punkt zatrzymania na mniej niż 1 tydzień w temperaturze 4 °C lub krócej niż 1 miesiąc w temperaturze -20 °C.
7. Wzmacnianie i czyszczenie biblioteki
   1. Przygotuj bibliotekę amplifikacji master mix (łącznie = 33 μL, z 27,5 μl 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix i 5,5 μl 10x biblioteki amplifikacyjnej mieszanki starterów).
   2. Ustaw program reakcji PCR na termocyklerze, używając następujących parametrów. 98 °C przez 45 s; N cykli (zob. uwaga poniżej): 98 °C przez 15 s; 60 °C przez 30 s; 72 °C przez 30 s; 72 °C przez 1 min; i 4 °C na zawsze.
      UWAGA: Cykle wzmocnienia biblioteki zależą od materiału wejściowego. Można to z grubsza oszacować w następujący sposób: zaczynając od RNA = 25–100 ng, N = 11–15 cykli; 100–250 ng, N = 9–12 cykli; 250–500 ng, N = 7–10 cykli.
   3. Wykonaj 0,8-krotne czyszczenie na bazie kulek, łącząc amplifikowane DNA z biblioteki (50 μL) i czyste kulki KAPA (40 μL), a następnie dokładnie zawieś kulki w mieszance DNA, pipetując kilkakrotnie w górę iw dół.
   4. Wykonaj kroki czyszczenia 4.1.7–4.1.9. Dokładnie zawiesić kulki w 50 μl 10 mM Tris HCL (pH = 8,0–8,5) i inkubować kulki w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
   5. Przenieść 50 μl klarownego supernatantu do nowej probówki i przystąpić do drugiego czyszczenia wzmacniacza bibliotecznego.
   6. Wykonaj 1x czyszczenie na podstawie kulek, łącząc amplifikowane DNA z biblioteki (50 μL) i czyste kulki KAPA (50 μL), a następnie dokładnie ponownie zawiesić kulki w mieszance DNA, pipetując kilka razy w górę iw dół.
   7. Wykonaj kroki czyszczenia 4.1.7–4.1.9. Dokładnie zawiesić kulki w 22 μl 10 mM Tris HCL (pH = 8,0–8,5) i inkubować kulki w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
   8. Przenieść 20 μl klarownego supernatantu do nowej probówki, przejść do pomiarów Qbit i bioanalizatora.
8. Koncentracja i wielkość rozdrobnienia
   1. Zmierz stężenia DNA w próbkach. Używając bardzo czułego zestawu na bazie barwnika fluorescencyjnego (np. Denovix Qbit, patrz tabela materiałów) lub jeśli stężenie wydaje się być poniżej 0,5 ng/μl, należy dokonać rekwantyfikacji przy użyciu bardziej czułego podejścia qPCR (np. Kappa Quantification, patrz Tabela materiałów).
   2. Określ rozmiar fragmentu biblioteki za pomocą bardzo czułej elektroforezy (np. bioanalizatora).
      UWAGA: Opcjonalnie kontrolę jakości za pomocą qPCR można przeprowadzić przed sekwencjonowaniem (Dodatek) przy użyciu rozcieńczonej przygotowanej biblioteki zamiast cDNA.
9. Sekwencjonowanie
   1. Wyślij bibliotekę do sekwencjonowania. W przypadku analizy różnicowej ekspresji genów w sekwencjach RNA głębokość sekwencjonowania odczytów między 10–25 milionami na próbkę jest na ogół wystarczająca.

5. Wstępne przetwarzanie danych

1. Kontrola jakości plików Fastq
   1. Pobierz i zainstaluj Trimgalore¹⁶, aby usunąć pary podstawowe niskiej jakości i puste odczyty w plikach Fastq.
      UWAGA: 1) Większość wymienionych tutaj programów działa tylko w systemie Linux. W przypadku ograniczenia do komputera z systemem Windows, możliwe jest uruchamianie analiz na serwerze Linux za pomocą oprogramowania MobaXterm lub Putty. Należy pamiętać, że do indeksowania genomu wymagana jest duża ilość pamięci o dostępie swobodnym (RAM) (około 64 GB). 2) Zdecydowanie zaleca się zainstalowanie całego wymaganego oprogramowania w środowisku conda. Umożliwi to łatwą instalację oprogramowania i zarządzanie pakietami. Więcej informacji na temat conda można znaleźć na stronie .
   2. Utwórz katalog (folder) dla danych, np. folder 'RNA_seq_KC_diff'. Ustaw to jako katalog roboczy, wpisując: "cd /home/user/RNA_seq_KC_diff/".
      UWAGA: Aby zapoznać się z omówieniem struktury folderów, zobacz "folder_structure.txt" w dodatkowych plikach kodowania.
   3. Utwórz kilka folderów w katalogu roboczym o określonych nazwach: "Fastq", "CRCh38_fasta", "CRCh38", "scripts" i "Mapping".
   4. Przenieś pliki fasta z sekwencjonowanymi danymi do folderu fastq. Alternatywnie, wygeneruj miękkie linki za pomocą polecenia: "ln –s home/user/old_location_fastq/FastqFile home/user/RNAseq_KC_diff/Fastq/Fastqfile" do plików Fastq, aby zaoszczędzić miejsce na dysku.
   5. Uruchom Trim galore na plikach Fastq, zobacz plik TrimGalore.txt, aby uzyskać kod do skopiowania i wklejenia do bash. W razie potrzeby zmień nazwy folderów i ustawienia w poleceniu.
2. mapowanie
   1. Pobierz genom, aby zmapować odczyty na, np. hg38 ensembl release 97 (wersja niezamaskowana): ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCH38.primary_assembly.fa.gz ; i odpowiedni plik adnotacji genu: hg 38 gene annotation ensembl release 97, ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.97.gtf.gz. Przenieś oba pliki do folderu CRCh38_fasta.
      UWAGA: Alternatywnie można użyć innej wersji genomu, na przykład wersji UCSC hg38, jeśli preferowane jest mapowanie na identyfikatory transkrypcji, a nie na identyfikatory genów.
   2. Zainstaluj STAR 2.7.1¹⁷.
   3. Wygeneruj wewnętrzny genom referencyjny za pomocą STAR 2.7.1 za pomocą skryptu generowania genomu (patrz Uzupełniające pliki kodowania). Zmień liczbę wątków na tę, którą ma procesor (--runThreadN X). W razie potrzeby zmień nazwy folderów i ustawienia w tym skrypcie. Uruchom go, kopiując/wklejając do bash.
   4. Zainstaluj samtools 1.9¹⁸ do indeksowania plików bam i gzip do kompresji plików wiggle.
   5. Dopasuj odczyty sekwencjonowania zatwierdzonego przez Trim Galore do zestawu ludzkiego genomu hg38 (ensembl release 97) za pomocą STAR 2.7.1, a następnie indeksuj za pomocą samtools i gzip. Należy to zrobić za pomocą skryptu map_fastq.txt (patrz Dodatkowe pliki kodowania). W razie potrzeby zmień nazwy folderów i ustawienia w tym skrypcie. Uruchom go, kopiując/wklejając do bash.
      UWAGA: Mapowanie STAR generuje kilka plików wyjściowych, w tym plik bam, plik wiggle i tabelę zliczania odczytów o nazwie *_ReadsPerGene.out.tab, które mogą być bezpośrednio używane połączone przez R jako dane wejściowe dla Deseq2.
3. Wizualizacja przeglądarki genomu
   1. Zainstaluj wigToBigWig z narzędzi przeglądarki genomu UCSC, aby wygenerować pliki bigwig za pomocą skryptu big2bw¹⁹.
   2. Przenieś pliki "convertBigWigChroms.py" i "CRCH38_ensembl2UCSC.txt" z dodatkowych plików kodowania do folderu "skrypty" w katalogu roboczym.
   3. Spraw, aby convertBigWigChroms.py był wykonywalny (za pomocą polecenia: 'chmod +x scripts/convertBigWigChroms.py' na komputerze z systemem Linux).
   4. Wygeneruj pliki bigWig z plików Wiggle, korzystając z wig2bw.txt skryptu (zobacz Dodatkowe pliki kodowania). Uruchom go, kopiując/wklejając do bash.
   5. Wprowadź pliki BigWig w przeglądarce genomu UCSC lub przeglądarce Integrative Genomics Viewer (IGV) w celu wizualizacji.

6. Analiza danych sekwencyjnych RNA

1. Wprowadź przykładowe dane do Deseq2
   1. Pobierz i zainstaluj Rstudio (wersja 1.1.456) i R (wersja 3.6).
   2. Zainstaluj wszystkie wymagane pakiety języka R (zobacz Dodatkowe pliki kodowania).
      UWAGA: Aby uzyskać szczegółowy plik R-markdown przedstawiający cały kod programowania i dane wyjściowe, zobacz załączone pliki: "RNA_seq_kc_differentiation_wt.html" i "RNA_seq_kc_differentiation_patient.html". Ogólny opis wszystkich kroków znajduje się poniżej.
   3. Wygeneruj tabelę zliczania na podstawie plików ReadsPerGene.out.tab.
   4. Zapisz przykładowy plik danych, zawierający wszystkie nazwy plików, dzień rozróżnienia i inne istotne dane przykładowe. Aby zapoznać się z przykładowym plikiem, zobacz "sample_data_example.csv" w dodatkowych plikach kodowania.
   5. Użyj tabeli zliczania i przykładowych danych, aby wygenerować obiekt Deseq2²⁰ zawierający zarówno dane zliczalne, jak i przykładowe.
2. Normalizacja ekspresji genów, odległość próbki i PCA
   1. Znormalizuj tabelę zliczania w obiekcie Deseq2 przy użyciu normalizacji Deseq2 rld lub vst. Normalizacja Rld jest preferowana, ale w przypadku wielu próbek normalizacja vst jest znacznie szybsza.
   2. Wykreśl odległość próbki na podstawie znormalizowanej intensywności zliczania odczytu za pomocą funkcji "dist" w R, a następnie wykonaj grupowanie "hclust" na podstawie odległości próbki. Narysuj samą mapę cieplną za pomocą pakietu pheatmap.
   3. Wygeneruj wykres PCA znormalizowanej intensywności liczby odczytów za pomocą funkcji plotPCA Deseq2.
      UWAGA: PCA służy jako narzędzie do eksploracyjnej analizy danych i może być używane do wizualizacji odległości i pokrewieństwa między różnymi próbkami.
3. Różnicowa/wysoce zmienna analiza ekspresji genów
   1. Oblicz geny różnicowe za pomocą funkcji wyniku Deseq2. Jednak oceniając zmiany w kilku punktach czasowych, w których porównania parami nie mają zastosowania, należy używać bardzo zmiennych genów. W takim przypadku wyodrębnij 500 najbardziej zmiennych genów, porządkując wariancję między próbkami z różnych punktów czasowych za pomocą funkcji rowVars.
      UWAGA: W naszej analizie, dla próbek kontrolnych, do dalszej analizy wykorzystano 500 najbardziej zmiennych genów (genów o najwyższym odchyleniu standardowym ich znormalizowanej intensywności w ciągu dni różnicowania). Jednak w przypadku analizy chorej i kontrolnej geny o zróżnicowanej ekspresji między chorą a zdrową grupą kontrolną w czasie zostały obliczone przez Deseq2 przy użyciu skorygowanej wartości p 1 x ^10-4 jako punktu odcięcia, skorygowanej w wielu testach. Innym możliwym etapem filtrowania jest wykluczenie genów różnicowych, które zmieniają się mniej niż pewna granica zmiany fałdowania.
   2. Wykonaj grupowanie kmeans na genach różnicowych lub wysoce zmiennych, aby zgrupować je według różnych wzorców ekspresji.
   3. Wizualizuj zróżnicowane lub wysoce zmienne geny na mapie cieplnej za pomocą pakietu pheatmap. Intensywność wykreślona na mapie cieplnej to znormalizowana intensywność Deseq2 z odjętą wartością mediany.
4. Analiza wzbogacania adnotacji Gene Ontology (GO)
   1. Wygeneruj listę wyrażonych genów tła, pobierając wszystkie geny z więcej niż 10 zliczeniami w jednej próbce.
   2. Wykonuj analizę GO za pomocą narzędzi online, takich jak GOrilla²¹. Użyj list genów różnicowych/wysoce zmiennych w klastrach jako "listy genów", a genów tła jako tła do porównania.
      UWAGA: Bardziej zaawansowani użytkownicy języka R mogą użyć pakietu clusterProfiler²², aby zautomatyzować analizę wzbogacania Go-term.

Wyniki

Normalne różnicowanie keratynocytów i analiza sekwencyjna RNA
W tym eksperymencie linie keratynocytów pochodzące od pięciu osób wykorzystano do różnicowania i analiz sekwencyjnych RNA. Rysunek 1 podsumowuje eksperymentalną procedurę różnicowania i wyniki analizy sekwencyjnej RNA. Przegląd procedur różnicowania in vitro prawidłowych keratynocytów i zmian morfologii komórek podczas różnicowania zilustrowano w Rysunek 1A. Analiza głównych składowych (PCA...

Dyskusja

W pracy opisano metodę indukowania różnicowania ludzkich keratynocytów i późniejszej charakterystyki za pomocą analiz sekwencyjnych RNA. W obecnym piśmiennictwie wiele badań nad różnicowaniem ludzkich keratynocytów wykorzystuje dwie inne metody, z wysokim stężeniem wapnia lub z surowicą jako metody indukowania różnicowania ^2,3,23. W poprzednim raporcie dokładnie porównano te trzy różne metody³ i wykazano,...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bioanalyzer 2100	Agilent	G2929BA
Ekstrakt z przysadki bydlęcej (BPE)	Lonza		Część zestawu bulletKit
CFX96 System czasu rzeczywistego	Maszyna Bio-Rad		qPCR
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)	Lonza		Część bulletKit
Etanoloamina >= 98%	Sigma-Aldrich	E9508
Chipy DNA o wysokiej czułości	Agilent	5067-4626
Hydrokortyzon	Lonza		Część zestawu bulletKit
Insulina	Lonza		Część zestawu bulletKit
iQ SYBR Green Kit	BioRad	170-8886
Synteza cDNA iScript	Bio rad	1708890
Zestaw ilościowy biblioteki KAPA	Roche	07960255001	Zestaw do pomiaru niskiego stężenia
Zestaw KAPA RNA HyperPrep z RiboErase	Roche	KK8540	RNAseq
KGM Gold Keratynocyte Growth Medium BulletKit	Lonza	192060
Nanodrop	deNovix	DS-11 FX (model)	Nanodrop i Qbit do pomiarów DNA i RNA
Kody kreskowe DNA NEXTflex -24	Illumnia	NOVA-514103	6 bp długie startery
Penicylina-Streptomycyna	Gibco	15140122
RNA Pico Chip	Agilent	5067-1513