Artykuł metodologiczny

Ślad białka rodnika hydroksylowego in vivo do badania interakcji białkowych w Caenorhabditis elegans

7.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60910

⸱

1 kwietnia 2020

 , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Maryland

W tym artykule

Podsumowanie

Szybkie fotochemiczne utlenianie białek in vivo (IV-FPOP) to technika śladu białek rodników hydroksylowych, która pozwala na mapowanie struktury białek w ich naturalnym środowisku. Protokół ten opisuje montaż i konfigurację mikroprzepływowego systemu przepływu IV-FPOP.

Streszczenie

Szybkie utlenianie białek (FPOP) to metoda hydroksylowego śladu białkowego (HRPF) używana do badania struktury białka, interakcji białko-ligand i interakcji białko-białko. FPOP wykorzystuje laser excimerowy KrF o długości fali 248 nm do fotolizy nadtlenku wodoru w celu wytworzenia rodników hydroksylowych, które z kolei oksydacyjnie modyfikują łańcuchy boczne aminokwasów dostępnych w rozpuszczalniku. Ostatnio rozszerzyliśmy zastosowanie FPOP znakowania oksydacyjnego in vivo w Caenorhabditis elegans (C. elegans), zatytułowane IV-FPOP. Przezroczyste nicienie były używane jako systemy modelowe dla wielu chorób człowieka. Badania strukturalne C. elegans za pomocą IV-FPOP są możliwe ze względu na zdolność zwierzęcia do wychwytywania nadtlenku wodoru, ich przezroczystość na promieniowanie laserowe przy 248 nm oraz nieodwracalny charakter modyfikacji. W niniejszym dokumencie opisano montaż mikroprzepływowego systemu przepływu do znakowania IV-FPOP, parametrów IV-FPOP, ekstrakcji białek i parametrów zoptymalizowanych pod kątem LC-MS/MS.

Wprowadzenie

Ślad białkowy sprzężony ze spektrometrią mas (MS) był używany w ostatnich latach do badania interakcji białek i zmian konformacyjnych. Metody śladu białka rodnika hydroksylowego (HRPF) badają dostępność rozpuszczalnika białkowego poprzez modyfikację łańcuchów bocznych aminokwasów białkowych. Metoda HRPF, szybkie fotochemiczne utlenianie białek (FPOP)1, została wykorzystana do zbadania struktury białka in vitro2, w komórce (IC-FPOP)3, a ostatnio in vivo (IV-FPOP)4. FPOP wykorzystuje laser excimerowy o długości fali 248 nm w celu szybkiego generowania rodników hydroksylowych poprzez fotolizę nadtlenku wodoru w celu wytworzenia rodników hydroksylowych1. Z kolei rodniki te mogą znakować 19 z 20 aminokwasów w skali mikrosekundowej, szybciej niż białka mogą się rozwinąć. Chociaż reaktywność każdego aminokwasu z rodnikami hydroksylowymi rozciąga się 1000-krotnie, możliwe jest znormalizowanie utleniania łańcucha bocznego poprzez obliczenie współczynnika ochrony (PF)5.

Ponieważ FPOP może oksydacyjnie modyfikować białka niezależnie od ich wielkości czy pierwotnej sekwencji, okazuje się to korzystne dla badań białek w komórkach i in vivo. IV-FPOP bada strukturę białka u C. elegans podobnie jak w badaniach in vitro i in-cell4. C. elegans należy do rodziny nicieni i jest szeroko stosowany jako model do badania chorób ludzkich. Zdolność robaka do wychwytywania nadtlenku wodoru zarówno przez dyfuzję bierną, jak i czynną, pozwala na badanie struktury białek w różnych układach organizmu. Ponadto C. elegans nadają się do IV-FPOP ze względu na ich przezroczystość przy długości fali lasera 248 nm potrzebnej dla FPOP6. Sprzężenie tej metody ze spektrometrią mas pozwala na identyfikację wielu zmodyfikowanych białek przy użyciu tradycyjnych podejść proteomicznych typu bottom-up.

W tym protokole opisujemy, jak wykonać IV-FPOP do analizy struktury białka u C. elegans. Protokół eksperymentalny wymaga montażu i konfiguracji mikroprzepływowego systemu przepływu dla IV-FPOP zaadaptowanego z Konermann et al7. Po IV-FPOP próbki są homogenizowane w celu ekstrakcji białek. Próbki białek są proteolizowane, a peptydy są analizowane za pomocą tandemowego chromatografu cieczowego (LC) MS, a następnie oznaczania ilościowego.

Protokół

1. Utrzymanie i hodowla C. elegans

  1. Wyhodować i zsynchronizować kolonie nicieni do czwartego stadium larwalnego (L4) zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi8.
  2. W dniu eksperymentu IV-FPOP wypłukać nicienie w stadium L4 z trawników bakteryjnych (OP50 E. coli) przy użyciu buforu M9 (0.02 M KH2PO4, 0.08 M Na2HPO4, 0.08 M NaCl, 1 mM MgSO4).
  3. Przygotować aliquoty o objętości 500 µL zawierające ok. 10 000 nicieni na każdą próbkę IV-FPOP.

2. Montaż mikrofluidycznego systemu przepływowego

  1. Montaż układu przepływowego należy rozpocząć od odcięcia 2 cm odcinka rurki z fluorowanego etylenu propylenu (FEP) (średnica zewnętrzna (o.d.) 1/16 in. x średnica wewnętrzna (i.d.) 0,020 in.).
  2. Za pomocą czystej igły sekcyjnej należy poszerzyć i.d. rurki FEP, aby utworzyć niewielki otwór (krater) tylko na jednym końcu, o długości ok. 50 mm. Otwór powinien być wystarczająco duży, aby pomieścić dwa odcinki topionej krzemionki o o.d. 360 µm.
    UWAGA: Nie należy poszerzać przeciwległego końca, ponieważ będzie on służył wyłącznie do zamocowania kapilary wylotowej.
  3. Za pomocą przecinaka ceramicznego należy odciąć dwa 15 cm odcinki topionej krzemionki o i.d. 250 µm. Te dwa odcinki będą stanowić linie doprowadzające w układzie przepływowym.
  4. Przy użyciu taśmy samoprzylepnej należy złączyć obie kapilary o i.d. 250 µm, dbając o to, aby były one równoległe względem siebie, a ich końce znajdowały się w jednej płaszczyźnie (były idealnie zrównane).
    UWAGA: Aby upewnić się, że końce topionej krzemionki nie zostały zmiażdżone podczas cięcia oraz że są proste i idealnie zrównane względem siebie, zaleca się ich sprawdzenie za pomocą lupy lub pod mikroskopem stereoskopowym.
  5. Obie złączone kapilary należy wsunąć do wykonanego wcześniej otworu w rurce FEP. Kapilary należy dosunąć do samej krawędzi otworu.
    OSTROŻNIE: Aby zachować skuteczność układu przepływowego, nie należy wsuwać kapilar poza obszar otworu (Rycina 1a).
  6. Na czystą powierzchnię należy nanieść małą kroplę żywicy epoksydowej i wymieszać ją za pomocą igły sekcyjnej.
  7. Szybko, używając tej samej igły, należy nanieść małą kroplę żywicy na koniec kapilar doprowadzających w miejscu ich połączenia z rurką FEP i pozostawić żywicę do wyschnięcia przez kilka minut, trzymając układ końcem wylotowym do góry (Rycina 1a).
  8. Podczas schnięcia żywicy, która wiąże rurkę FEP z dwiema kapilarami, należy odciąć nową kapilarę o i.d. 250 µm. Nowa kapilara będzie stanowić kapilarę wylotową układu przepływowego. Pożądaną długość kapilary można obliczyć za pomocą poniższego równania:
    Wzór na szybkość przepływu, równanie dynamiki płynów, reprezentacja matematyczna.
    Gdzie ℓ to długość kapilary do odcięcia w centymetrach, t to pożądany czas reakcji w minutach, f to szybkość przepływu w mL/min, a i.d. to średnica wewnętrzna kapilary w centymetrach.
    UWAGA: Po odcięciu kapilary wylotowej należy sprawdzić jej końce, upewniając się, że są proste i nie są zmiażdżone.
  9. Po wyschnięciu żywicy należy wsunąć nową kapilarę przez wylotowy koniec rurki FEP. Wewnętrzne końce kapilary wylotowej i dwóch kapilar doprowadzających powinny stykać się ze sobą wewnątrz rurki FEP, co tworzy mieszacz w kształcie litery T (Rycina 1b).
  10. Kapilarę wylotową i rurkę FEP należy związać świeżą żywicą epoksydową, zgodnie z opisem w krokach 2.6 i 2.7.
  11. Żywicę należy pozostawić do wyschnięcia na noc, aby trwale połączyć układ przepływowy. Mikrofluidyczny układ przepływowy należy przygotować do pracy następnego dnia (Rycina 1c).

3. Mikrofluidyczny system przepływowy do badania FPOP in vivo

  1. Włóż cztery mieszadła magnetyczne do jednej strzykawki 5 mL. Strzykawka ta będzie pełnić funkcję strzykawki z próbką. Mieszadła magnetyczne zapobiegają osadzaniu się nicieni wewnątrz strzykawki podczas IV-FPOP (Rysunek 2A).
  2. Napełnij dwie strzykawki 5 mL pożywką M9. Upewnij się, że w każdej strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one wpływać na szybkość przepływu i efektywność mieszania.
  3. Podłącz adapter Luer do każdej strzykawki 5 mL, upewniając się, że są one dokręcone palcami i stabilnie zamocowane.
  4. Podłącz każdą strzykawkę do osobnego zaworu 3-2. Strzykawka powinna być podłączona do środkowego portu zaworu (Rysunek 2B).
  5. Zamocuj każdą strzykawkę 5 mL w podwójnej pompie strzykawkowej i dostosuj mechaniczny pierścień ograniczający, aby zapobiec nadmiernemu naciskowi bloku pchającego na strzykawkę. Pamiętaj o obecności mieszadeł magnetycznych podczas ustawiania pierścienia ograniczającego.
  6. Podłącz każdy koniec kapilary doprowadzającej domowej roboty mikrofluidycznego układu przepływowego do górnego portu każdego zaworu 3-2, używając nakrętki super-flangeless, tulei FEP i tulejki super-flangeless (Rysunek 2B).
  7. Do pozostałego otwartego portu zaworu 3-2 (port dolny) podłącz kapilarę o długości 10 cm i średnicy wewnętrznej 450 µm, używając nakrętki super-flangeless, tulei FEP i tulejki super-flangeless (Rysunek 2B). Kapilary te stają się kapilarami do pobierania próbki.
  8. Uruchom przepływ pompy i sprawdź wszystkie połączenia mikrofluidycznego układu przepływowego pod kątem widocznych wycieków. Przepuść co najmniej trzy objętości strzykawki przy zastosowaniu eksperymentalnej szybkości przepływu. Końcowa szybkość przepływu zależy od okna naświetlania laserem, częstotliwości lasera i objętości ułamka wykluczenia zero.
    UWAGA: Dla niniejszego protokołu końcowa szybkość przepływu 375,52 µL/min została obliczona dla okna naświetlania laserem o szerokości 2,55 mm, krzemionki topionej o średnicy wewnętrznej 250 µm, ułamka wykluczenia zero i częstotliwości 50 Hz.
    1. Ścieżka przepływu jest zaznaczona strzałkami na uchwycie zaworu 3-2. Każdą strzykawkę można napełnić ręcznie, przesuwając uchwyt zaworu z pozycji wypychania do pozycji pobierania.
      UWAGA: Wycieki przy zaworze 3-2 można usunąć poprzez ponowne dokręcenie nakrętki super-flangeless lub wymianę któregokolwiek z połączeń zaworu (nakrętki super-flangeless, tulei FEP lub tulejki super-flangeless). Wycieki w trójniku mieszającym wymagają ponownego montażu mikrofluidycznego układu przepływowego (kroki 2.1 do 2.11).
  9. Przenieś mikrofluidyczny układ przepływowy na stół eksperymentalny i przymocuj kapilarę wylotową do stolika naświetlania za pomocą stalowej złączki o średnicy zewnętrznej 360 µm (Rysunek 2C,D).
  10. Używając zapalniczki z długim dozownikiem, wypal powłokę krzemionki topionej w oknie naświetlania laserem. Oczyść wypaloną powłokę za pomocą tkaniny bezpyłowej i metanolu.
    UWAGA: Stosuj naprzemiennie cykle wypalania i cykle czyszczenia metanolem, aby uniknąć przegrzania kapilary, gdyż nadmierne ciepło może doprowadzić do stopienia i/lub pęknięcia kapilary.
  11. Ustaw blok mieszadła magnetycznego nad strzykawką 5 mL zawierającą mieszadła magnetyczne. Dostosuj prędkość i pozycję bloku mieszadła magnetycznego tak, aby mieszadła wewnątrz strzykawki 5 mL obracały się powoli i jednostajnie.

4. FPOP in vivo

  1. Włącz laser excusemeryczny KrF i poczekaj na rozgrzanie tyratronu.
    OSTRZEŻENIE: Laser emituje widzialne i niewidzialne promieniowanie o długości fali 248 nm, które może uszkodzić oczy. Przed włączeniem lasera i otwarciem okna wyjściowego wiązki należy założyć odpowiednią ochronę oczu.
  2. Zmierz energię lasera przy częstotliwości 50 Hz przez co najmniej 100 impulsów, umieszczając czujnik optyczny przy oknie wyjściowym wiązki.
    UWAGA: W tym protokole zastosowano okno naświetlania o rozmiarze 2,55 mm przy energii lasera 150 ± 2,32 mJ.
  3. Pobierz około 10 000 nicieni (500 µL) i ręcznie wciągnij próbkę do strzykawki z próbką.
  4. Dopełnij strzykawkę z próbką 2,5 mL buforu M9, aby uzyskać końcową objętość próbki 3 mL. Upewnij się, że do strzykawki nie dostały się pęcherzyki powietrza.
  5. Napełnij drugą strzykawkę 3 mL 200 mM H2O2, ponownie upewniając się, że do strzykawki nie dostały się pęcherzyki powietrza.
  6. Na końcu kapilary wylotowej umieść owiniętą folią aluminiową probówkę stożkową o pojemności 15 mL zawierającą 6 mL roztworu 40 mM N’-dimetylotiomocznika (DMTU), 40 mM N-tert-butyl-α-fenylinitronu (PBN) oraz 1% dimsylosulfoksydy w celu odpowiednio: wygaszenia nadmiaru H2O2, neutralizacji rodników hydroksylowych oraz zahamowania aktywności reduktazy sulfotlenku metioniny.
  7. Uruchom laser excusemeryczny z okna oprogramowania, poczekaj na pierwszy impuls i rozpocznij przepływ próbki z podwójnej strzykawki.
    UWAGA: Próbki należy analizować w duplikatach biologicznych i triplikatach technicznych w trzech wariantach: naświetlanie laserem z H2O2 (próbka), brak naświetlania laserem z H2O2 oraz brak naświetlania laserem bez H2O2 (kontrole), co daje łącznie 9 próbek na zestaw biologiczny.
  8. Zbierz całą próbkę do probówki 15 mL, aktywnie monitorując przepływ pod kątem ewentualnych wycieków, ponieważ w strzykawce z próbką może czasami wytworzyć się ciśnienie wsteczne.
  9. Zgodnie z procedurą IV-FPOP, odwirowuj nicienie przy 805 x g przez 2 min. Usuń roztwór wygaszający, dodaj 250 µL buforu lizującego (8 M mocznik, 0,5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM fluorek fenylometylosulfonylowy [PMSF]). Przenieś próbkę do czystej probówki do mikrocentryfugi, zamroź błyskawicznie i przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu trawienia próbki.

5. Ekstrakcja, oczyszczanie i proteoliza białek

  1. Zamrożone próbki rozmrozić na lodzie i zhomogenizować poprzez sonikację przez 10 s, a następnie inkubować na lodzie przez 60 s. Może być wymagane przeprowadzenie kilku serii sonikacji; homogenat można obserwować pod stereomikroskopem, umieszczając aliquot 2 µL próbki na szkiełku przedmiotowym. Homogenizacja próbki jest zakończona, gdy nie widać już fragmentów nicieni lub są one bardzo małe.
  2. Zhomogenizowane nicienie odwirować przy 400 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C i zebrać nadsącz do czystej probówki do mikrocentryfugi.
  3. Oznaczyć stężenie białka w próbkach za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (test BCA) zgodnie z instrukcją producenta.
    UWAGA: Stężenie próbki można oznaczyć za pomocą dowolnie wybranego biochemicznego testu stężenia białka. Należy wziąć pod uwagę kompatybilność odczynników z buforem do lizy (8 M urea, 0.5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF). Dodatkowo może być konieczne rozcieńczenie buforu.
  4. Odmierzyć 100 µg białka z każdej próbki i przenieść do czystych probówek do mikrocentryfugi.
  5. Dodać ditiotreitol (DTT) do stężenia końcowego 10 mM w celu redukcji mostków dwusiarczkowych we wszystkich próbkach. Wymieszać na wortexie, odwirować i inkubować próbki w temperaturze 50 °C przez 45 min.
  6. Schłodzić próbki do temperatury pokojowej przez 10 min.
  7. Dodać jodoacetamid (IAA) do stężenia końcowego 50 mM w celu alkilacji zredukowanych reszt. Wymieszać na wortexie, odwirować i inkubować próbki przez 20 min w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem.
  8. Bezpośrednio po alkilacji wytrącić białko z próbki poprzez dodanie 4 objętości 100% schłodzonego wcześniej acetonu i inkubować w temperaturze -20 °C przez noc.
  9. Następnego dnia osad z wytrąconego białka zebrać przez wirowanie przy 16,000 x g przez 10 min. Przemyć osad 90% acetonem, usunąć nadsącz i pozostawić osad do wyschnięcia na 2–3 min.
  10. Zawiesić ponownie osad białkowy w 25 mM Tris-HCl (1 µg/µL). Dodać trypsynę w końcowym stosunku proteazy do białka 1:50 (w/w) i trawić próbki w temperaturze 37 °C przez noc.
  11. Następnego dnia zatrzymać reakcję trawienia trypsyną poprzez dodanie 5% kwasu mrówkowego.
    UWAGA: Do analizy LC-MS/MS (kroki 6.1-6.5) wymagane jest minimum 0.5 µg peptydów na próbkę. Stężenia peptydów w próbkach oznaczyć za pomocą ilościowego kolorymetrycznego testu peptydów (patrz Tabela materiałów) zgodnie z protokołem producenta.

6. Wysokosprawna chromatografia cieczowa sprzężona z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS)

  1. Należy zastosować następujące fazy ruchome LC: wodę w 0,1% FA (A) oraz ACN w 0,1% FA (B).
  2. Na kolumnę pułapkującą (180 µm × 20 mm) zawierającą C18 (5 µm, 100 Å) należy nanieść 0,5 µg peptydów, a następnie przemyć próbkę roztworem 99% rozpuszczalnika A i 1% B przez 15 min przy szybkości przepływu 15 µL/min.
  3. Peptydy należy rozdzielić przy użyciu kolumny pakowanej wewnętrznie (średnica wew. 0,075 mm × 20 mm) z materiałem do chromatografii odwróconej C18 (5 μm, 125 Å).
  4. Należy zastosować następującą metodę rozdziału analitycznego: gradient pompowano z prędkością 300 nL/min przez 120 min: 0−1 min, 3% B; 2−90 min, 10−45% B; 100−105 min, 100% B; 106−120 min, 3% B.
  5. Należy przeprowadzić akwizycję danych peptydów w dodatnim trybie jonizacji za pomocą nano-elektrosprayu (nESI) przy użyciu spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości.
    UWAGA: W tym protokole wykorzystano instrument ultra-wydajnej chromatografii cieczowej (UPLC) sprzężony z wysokorozdzielczym spektrometrem mas. Zastosowano akwizycję zależną od danych (DDA). Zakres skanowania m/z dla MS1 wynosił 3750–1500 przy rozdzielczości 60 000 i dynamicznym wykluczaniu przez 60 s. Wykluczono jony o stanach naładowania +1 oraz >6. Cel automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) ustawiono na 5,5e5 przy maksymalnym czasie wtrysku 50 ms i progu intensywności 5,5e4. Jony wybrane do MS2 poddano fragmentacji poprzez dysocjację kolizyjną o wysokiej energii (HCD), stosując 32% znormalizowanej energii kolizyjnej. Jony fragmentacyjne wykrywano w spektrometrze przy rozdzielczości 15 000 i celu AGC 5,0e4.

7. Analiza danych

  1. Przeszukaj pliki tandem MS za pomocą oprogramowania do analizy proteomiki bottom-up w odniesieniu do bazy danych C. elegans .
  2. Ustaw parametry wyszukiwania dla analizy białek w następujący sposób: jedno pominięcie cięcia przez trypsynę, zakres masy peptydów 375–1500 m/z, tolerancja masy fragmentów 0,02 oraz tolerancja masy prekursora 10 ppm. Karbamidometylację ustaw jako modyfikację statyczną, a wszystkie znane modyfikacje łańcuchów bocznych przez rodniki hydroksylowe9,10 jako dynamiczne. Identyfikację peptydów ustal na poziomie ufności 95% (średni), a pozostałości na poziomie ufności 99% (wysoki). Współczynnik fałszywych odkryć (FDR) ustaw na 1%.
  3. Wyeksportuj dane do elektronicznej bazy danych i podsumuj stopień utlenienia na peptyd lub pozostałość, korzystając z poniższego równania11:
    Równanie sumowania Σpole EIC zmodyfikowane/Σpole EIC; używane w schemacie analizy wyników chromatografii.
    UWAGA: Gdzie pole EIC zmodyfikowane to pole chromatogramu jonów wyekstrahowanych (EIC) peptydu lub pozostałości z modyfikacją utleniającą, a pole EIC to całkowite pole tego samego peptydu lub pozostałości z modyfikacją utleniającą i bez niej.

Wyniki

W układzie mikroprzepływowym stosowanym w IV-FPOP, H2O2 oraz nicienie są utrzymywane w separacji aż do momentu tuż przed naświetlaniem laserem. Separacja ta zapobiega rozkładowi H2O2 przez endogenną katalazę oraz inne mechanizmy komórkowe12. Zastosowanie kapilary o średnicy wewnętrznej 250 µm pozwala na całkowity odzysk próbki na poziomie 63–89% w dwóch powtórzeniach biologicznych, podczas gdy kapilara o średnicy wewnętrznej 150 µm wykazuje odzysk jedynie w zakresie 21–31% (Rycina 3A). Użycie kapilary o większej średnicy wewnętrznej (250 µm) zapewnia lepszy przepływ nicieni podczas IV-FPOP oraz przepływ pojedynczych osobników (Rycina 3B) w porównaniu do kapilary o mniejszej średnicy wewnętrznej (150 µm) (Rycina 3C). Kapilara o średnicy wewnętrznej 150 µm nie umożliwia przepływu pojedynczych nicieni (Rycina 3C), a w oknie naświetlania laserem obserwuje się przepływ wielu osobników jednocześnie, co zmniejsza dawkę ekspozycji laserowej przypadającą na pojedynczego nicienia.

IV-FPOP to technika znakowania kowalencyjnego służąca do badania dostępności rozpuszczalnika w C. elegans. Rysunek 4A przedstawia reprezentatywne chromatogramy jonów wyekstrahowanych (EIC) peptydu zmodyfikowanego i niezmodyfikowanego metodą FPOP. Znakowanie rodnikami hydroksylowymi zmienia właściwości chemiczne peptydów zmodyfikowanych utleniająco, co sprawia, że peptydy zmodyfikowane metodą FPOP są bardziej polarne. W chromatografii odwróconej peptydy zmodyfikowane metodą IV-FPOP wykazują krótsze czasy retencji niż peptydy niezmodyfikowane. Fragmentacja MS/MS wyizolowanych peptydów umożliwia identyfikację reszt zmodyfikowanych utleniająco (Rysunek 4B).

Wykazano, że IV-FPOP utlenia łącznie 545 białek w dwóch powtórzeniach biologicznych u C. elegans (Rycina 5A,B). Przewaga IV-FPOP jako metody mapowania powierzchni białek (protein footprinting) wynika z możliwości modyfikowania białek w różnych układach organizmu nicieni (Rycina 5C). Metoda ta pozwala na badanie struktury białek i oddziaływań białko-białko niezależnie od tkanki lub narządu w organizmie nicienia. Ponadto analiza tandemowa MS potwierdza, że IV-FPOP bada dostępność rozpuszczalnika in vivo. Przeanalizowano wzór utleniania białka szoku cieplnego 90 (Hsp90) w kompleksie z białkiem opiekuńczym miozyny UNC-45 (Rycina 6). Analiza MS/MS dla Hsp90 wykazuje cztery utlenione reszty (Rycina 6C,D); znormalizowany stopień modyfikacji FPOP (ln(PF))5 wskazuje, że reszta M698 białka Hsp90 jest mniej dostępna dla rozpuszczalnika niż reszty R697, E699 i E700 w stanie związania z UNC-45 (Rycina 6C). Różnice w utlenianiu zostały potwierdzone obliczeniami dostępnej powierzchni rozpuszczalnika (SASA) zgodnie z literaturą (PDB 4I2Z13). Reszta M698 posiada wartość SASA wynoszącą 0,03, co uznaje się za resztę pogrzebaną w porównaniu z resztami R697, E699 i E700, które mają wyższe wartości SASA (Rycina 6C).14

Schemat mieszania mikrofluidycznego z rurką FEP i mieszalnikiem w kształcie litery T; zestaw z żywicy epoksydowej do reakcji chemicznych.
Rysunek 1. Schemat mikrofluidycznego systemu przepływowego FPOP in vivo. (A) Dwie linie infuzyjne (pomarańczowe) systemu przepływowego IV-FPOP pokazane wewnątrz rurki FEP (żółta); prawidłową pozycję wiązania żywicy epoksydowej reprezentuje jasnoniebieskie koło. (B) Kompletny, zmontowany mieszalnik w kształcie litery T utworzony z trzech kapilar o średnicy wewnętrznej 250 µm. Prawidłową pozycję wiązania żywicy kapilary wylotowej z rurką FEP reprezentuje jasnoniebieskie koło. (C) Kompletny, zmontowany system przepływowy do kowalencyjnego znakowania in vivo C. elegans. Przed FPOP nicienie są oddzielone od H2O2 aż do momentu bezpośrednio poprzedzającego znakowanie; okno naświetlania laserem pokazano w kolorze jasnoniebieskim, a wiązkę lasera reprezentuje fioletowy symbol błyskawicy. Rysunki nie są w skali. Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Espino et al.4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mieszadła magnetyczne i zestaw strzykawkowy do mieszania cieczy oraz układ wzbudzenia optycznego.
Rycina 2. System mikrofluidyczny podczas IV-FPOP. (A) Reprezentacyjne zdjęcie C. elegans wewnątrz strzykawki 5 mL. Bez mieszania nicienie osiadają na dnie strzykawki (lewo). Mieszadła magnetyczne i blok mieszadła utrzymują nicienie w zawiesinie podczas eksperymentów IV-FPOP (prawo). (B) Reprezentacyjne zdjęcie strzykawki 5 mL, kapilary doprowadzającej i kapilary odprowadzającej połączonych z zaworem 3-2. Uchwyt zaworu 3-2 jest pokazany w pozycji odprowadzania. (C) Mikrofluidyczny system przepływowy podczas IV-FPOP, blok mieszadła magnetycznego jest umieszczony nad strzykawką 5 mL z nicieniami. (D) Kapilara wylotowa zamocowana do stolika promieniującego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy i obrazy mikroskopowe odzysku nicieni w eksperymencie z mikrorurkami; analiza porównawcza danych.
Rycina 3. Porównanie przepływu i odzysku C. elegans przy użyciu dwóch kapilar o różnej średnicy wewnętrznej (i.d.).(A) Procentowy odzysk nicieni po IV-FPOP dla dwóch powtórzeń biologicznych (BR) przy użyciu kapilar o średnicy wewnętrznej 250 μm (szary) i 150 μm (czarny). Słupki błędów obliczono na podstawie odchylenia standardowego z trzech powtórzeń technicznych. C. elegans przepływający przez okno naświetlania laserowego przez kapilary o średnicy wewnętrznej 250 µm (B) i 150 µm (C). Nicienie są bardziej ściśnięte w mniejszej kapilarze. W kapilarze o średnicy wewnętrznej 150 µm widoczne jest skupianie się nicieni. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Espino et al.4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy chromatograficzne peptydów zmodyfikowanych FPPO, przedstawiające względną obfitość w funkcji czasu i m/z.
Rycina 4. Reprezentatywne wyniki LC-MS/MS po IV-FPOP. (A) EIC peptydy zmodyfikowanego przez FPOP (czerwony) i niezmodyfikowanego (niebieski). Wybrany peptyd pochodzi z białka aktyny-1. (B) Widmo MS/MS dwukrotnie naładowanego niezmodyfikowanego peptydy aktyny-1 317-327. (C) Widmo MS/MS dwukrotnie naładowanego peptydy aktyny-1 317-327 zmodyfikowanego przez FPOP; w tym przykładzie P323 uległ modyfikacji oksydacyjnej (jon y5+, czerwony). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Diagramy Venna i wykres kołowy przedstawiające nakładanie się genetyczne, porównanie próbek z kontrolą oraz rozmieszczenie w tkankach.
Rycina 5. IV-FPOP utlenia białka w organizmach C. elegans. (A) Diagram Venna białek zmodyfikowanych oksydacyjnie w obecności 200 mM nadtlenku wodoru przy 50 Hz w dwóch powtórzeniach biologicznych (BR); BR1 zaznaczono kolorem niebieskim, a BR2 kolorem żółtym. (B) Diagram Venna białek zmodyfikowanych oksydacyjnie zidentyfikowanych w próbkach napromieniowanych, kontroli z nadtlenkiem wodoru oraz kontroli z samymi nicieniami w BR2 w trzech powtórzeniach technicznych. (C) Wykres kołowy białek zmodyfikowanych oksydacyjnie w różnych układach organizmu C. elegans . Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Espino et al.4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza struktury białka, mapowanie peptydów i miejsca oddziaływania; schemat z wynikami spektrometrii mas.
Rycina 6. Korelacja modyfikacji IV-FPOP z dostępnością dla rozpuszczalnika. (A) Białko opiekuńcze miozyny UNC-45 (szare) (PDB ID 4I2Z13) z zaznaczonymi dwoma zmodyfikowanymi peptydami zidentyfikowanymi w analizie LC/MS/MS: 669−680 i 698−706 (zielone, wstawka po lewej). UNC-45 jest związane z fragmentem peptydowym Hsp90 (niebieski). Utlenione reszty w obrębie tego fragmentu przedstawiono w formie prętów (czerwone), a UNC-45 przedstawiono jako powierzchnię (wstawka po prawej). (B) Widma tandemowej spektrometrii mas (MS/MS) peptydów UNC-45 669−680 (góra) oraz 698−706 (dół), wykazujące jony b i y dla utraty CO2, będącej modyfikacją FPOP. (C) Obliczone wartości ln(PF) dla utlenionych reszt Hsp90: R697, M698, E699 i E700. Obliczone wartości SASA dla Hsp90 naniesiono nad każdą resztą. (D) Widma tandemowej spektrometrii mas dla R697, M698, E699 i E700 wykazujące modyfikację FPOP +16. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Espino et al.4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Obecnym punktem odniesienia dla badań interakcji białko-białko (PPI) in vivo jest transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET). W swojej najprostszej formie technika ta bada PPI poprzez transfer energii między dwiema cząsteczkami, gdy znajdują się one w bliskiej odległości odsiebie15. W przeciwieństwie do technik MS, FRET nie ma rozdzielczości pozwalającej na scharakteryzowanie zmian konformacyjnych i miejsc interakcji na poziomie aminokwasów. Techniki oparte na stwardnieniu rozsianym są coraz częściej wykorzystywane do badania PPI16. IV-FPOP to metoda HRPF, która pozwala na analizę strukturalną białek in vivo u C. elegans. Aby skutecznie oznakować C. elegans za pomocą IV-FPOP, ważne jest, aby prawidłowo zmontować mikroprzepływowy system przepływu w celu zmniejszenia strat próbki. Wykazano, że kapila o średnicy wewnętrznej 250 μm maksymalizuje odzysk próbki w porównaniu z kapilarami o mniejszej średnicywewnętrznej 4. Kapilary o większej średnicy wewnętrznej nie zostały przetestowane, jednak system przepływu mikroprzepływowego został zaprojektowany przy użyciu kapilary o tym samym identyfikatorze, co dostępny na rynku system cytometrii przepływowej do sortowania C. elegans. 17 Wielkość próbki robaka jest również ważna, wielkość próbki mniejsza niż ~ 10 000 na próbkę przed FPOP nie daje wystarczająco wysokich stężeń białka do analizy LC-MS/MS. Większe rozmiary próbek (>10 000 robaków) mogą być również używane poprzez dostosowanie początkowej objętości początkowej (krok 4.5).

Ważny jest prawidłowy montaż układu przepływu mikroprzepływowego. Nieszczelności w ścieżce próbki powodują niespójny przepływ robaków lubH2O2. Tuleje, tuleje i 3-2 zawory mogą być ponownie wykorzystane z wielu eksperymentów IV-FPOP, jeśli zostaną odpowiednio wyczyszczone po każdym eksperymencie. Zalecamy jednak zmontowanie nowego mikroprzepływowego systemu przepływu dla każdej kontrpróby biologicznej. Jeśli mikrofluidyka jest prawidłowo zmontowana, ślimaki iH2O2 będą mieszać się w mieszalniku-T przy minimalnym przeciwciśnieniu. W ramach kontroli jakości (QC) mikroprzepływowego systemu przepływu zalecamy testowanie wydajności mieszania przy użyciu kolorowych barwników. Ważne jest, aby monitorować ruch mieszadeł magnetycznych wewnątrz strzykawki ślimakowej podczas IV-FPOP, niewłaściwe mieszanie próbki w strzykawce ślimakowej lub mieszaniu-T może spowodować przeciwciśnienie powodujące nieszczelności. Ponadto złe warunki mieszania prowadzą do dużych strat próbki, słabej ekspozycji lasera na robaki w oknie lasera i zatkania.

Utrzymanie C. elegans jest ważne w celu zmniejszenia utleniania tła. Zalecamy hodowlę robaków w niskich temperaturach w warunkach niskiego stresu, ponieważ wysokie temperatury mogą wpływać na całkowite utlenianie tła. Zestaw próbek kontrolnych składający się wyłącznie z robaków, bezH2O2i bez napromieniania laserowego, jest zalecany dla wszystkich eksperymentów IV-FPOP w celu uwzględnienia utleniania tła spowodowanego konserwacją laboratoryjną. Jednym z obecnych ograniczeń tej techniki jest całkowita liczba zidentyfikowanych peptydów modyfikowanych oksydacyjnie oraz całkowita liczba reszt utlenionych na peptyd w celu uzyskania wyższej informacji strukturalnej białka. Chociaż nie jest to zalecane, wzrost modyfikacji oksydacyjnych można osiągnąć, stosując wyższe stężenia nadtlenku wodoru. Wzrost nadtlenku wodoru może znacząco zmienić ważne szlaki biologiczne, a także doprowadzić do rozwoju wywołanego utlenianiem. W przypadku zwiększenia stężenia nadtlenku wodoru dla IV-FPOP zaleca się zbadanie żywotności robaków i utleniania tła, ponieważ nie badano stężeń wyższych niż 200 mM.

Opisany protokół LC-MS/MS może być optymalizowany i modyfikowany w celu spełnienia wymagań MS QC innych laboratoriów. Wcześniej wykazano, że zastosowanie technik chromatografii 2D zwiększa identyfikację oksydacyjnie modyfikowanych peptydów i białek18. Niemniej jednak techniki wzbogacania białek, które są ukierunkowane na określone białko będące przedmiotem zainteresowania, nie są zalecane, w tym między innymi wytrącanie przeciwciał lub testy ściągające. Techniki te mogą skłaniać się ku jednemu konkonformatorowi białkowemu, jeśli epitop/miejsce wiązania białka zostało oksydacyjnie zmodyfikowane przez IV-FPOP. Nowe osiągnięcia w zakresie śladów odczynników rodnikowych, takich jak anion rodnikowysiarczanowy 10 lub trifluorometylacja19 , mogą zwiększyć wszechstronność IV-FPOP. Chociaż jedynym odczynnikiem do znakowania przetestowanym do tej pory in vivo jest nadtlenek wodoru, inne rodniki aktywowane laserem można zoptymalizować. Stosowanie innych rodników powinno okazać się zgodne z żywotnością robaków, przepuszczalnością komórek i długością fali lasera 248 nm. Ze względu na wykorzystanie C. elegans jako systemu modelowego dla wielu chorób człowieka, IV-FPOP ma potencjał, aby wywrzeć silny wpływ na badanie roli struktury białka w patogenezie choroby.

Oświadczenia

Niniejsza publikacja została napisana w ramach częściowego wypełnienia pracy doktorskiej JAE. Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez fundusze start-up z University of Maryland, Baltimore oraz NIH 1R01 GM 127595 przyznany LMJ. Autorzy dziękują dr. Danielowi Deredge'owi za pomoc w redagowaniu manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stożkowe probówki wirówkowe 15 mlFisher Scientific14-959-53Awystarczy dowolna marka
5 ml gazoszczelna strzykawka, wyjmowana blokada Luer LockSGE Analytical Science0087602 minimum
60 Sonic DismembratorFisher ScientificFM3279Ten produkt nie jest już dostępny. Każdy sonikator o małej objętości będzie wystarczający
Aceton, Klasa HPLCFisher ScientificA929-4Ilość 4 L nie jest konieczna
Acetonitryl z 0,1% kwasem mrówkowym (v / v), LC / MSGrade Fisher ScientificLS120-500
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Kolumna pułapkowa, 100Å, 5 µ m, 180 i mikro; m x 20 mm, 2G, V/M, 1/opkWody186007496
ACQUITY UPLC M-Class SystemWody
Scientific01-213-100wystarczy dowolna marka
Aqua 5 µ m C18 125 i Aring; materiał opakowaniowyWirówka Phenomenex
Eppendorf022625501
Delikatne wycieraczki do zadańFisher Scientific06-666A
Igła preparcyjnaFisher Scientific50-822-525potrzebna jest tylko kilka
Dithiothreiotol (DTT)AmericanBioAB00490-00005
DMSO, bezwodnyInvitrogenD12345
Epoksydowa mieszanka błyskawiczna 5 minutLoctite1365868
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Fisher ScientificS311-100
EX350 laser ex350 (długość fali 248 nm)Rurki laserowe
GAM FEP 1/16" OD x 0,020" IDIDEX Zdrowie i Sciene1548L
Kwas mrówkowy, klasa LC / MSFisher ScientificA117-50
HEPESZAWÓR Fisher ScientificBP310-500
HV3-2 Hamilton867282 minimum
Kwas solnyFisher ScientificA144S-500
Nadtlenek wodoruFisher ScientificH325-100dowolne 30% Nadtlenek wodoru jest wystarczający
Jodoacetamid (IAA)ACROS Organics122270050
Pompa strzykawkowa Legato 101KD Scientific788101
Adapter Luer Żeński Luer na 1/4-28 Męski PolipropylenIDEX Zdrowie & ScieneP-618L2 minimum
siarczan magnezuFisher ScientificM65-500
Metanol, klasa LC/MSilość Fisher ScientificA454SK-44 L nie jest konieczna
MikrowirówkaThermo Scientific75002436
N,N′-dimetylotiomocznik (DMTU)ACROS Organics116891000
NanoTight Sleeve Zielony 1/16" ID x .0155" ID x1.6"''IDEX Zdrowie & ScieneF-242X
NanoTight Rękaw Żółty 1/16" OD x 0,027" ID x 1,6"IDEX Zdrowie & ScieneF-246
N-tert-butyl-&alfa;-fenylonitron (PBN)ACROS Organics177350250
OmniPur Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)Sigma-Aldrich7110-OPwystarczy dowolny inhibitor proteazy
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass SpectrometerThermo Scientificinne instrumenty o wysokiej rozdzielczości (np. Q exactive Orbitrap lub Orbitrap Fusion) może być używany
Miernik energii piroelektrycznej PE50-COphir Optronics7Z02936
Pierce Ilościowy kolorymetryczny test peptydowyThermo Scientific23275
Zestaw do oznaczania białek BCA Pierce Rapid GoldThermo ScientificA53225
Proteaza trypsyny Pierce, MS GradeThermo Scientific90058
Kamień do rozłupywania Polymicro, 1" x 1" x 1/32"Molex1068680064dowolny obcinak do rurek kapilarnych jest wystarczający
Elastyczne rurki kapilarne z topionej krzemionki Polymicro, średnica wewnętrzna 250 i mikro; m, Średnica zewnętrzna 350 i mikro; m, TSP250350Polymicro Technologies1068150026
Elastyczne rurki kapilarne z topionej krzemionki Polymicro, średnica wewnętrzna 450µ m, Średnica zewnętrzna 670µ m, TSP450670Polymicro Technologies1068150625
Elastyczne rurki kapilarne z topionej krzemionki Polymicro, średnica wewnętrzna 75µ m, Średnica zewnętrzna 375µ m, TSP075375Polymicro Technologies1068150019
Monobasic Fosforan potasuFisher ScientificP382-500
Proteome Discover (oprogramowanie proteomiczne od dołu do góry)Thermo ScientificOPTON-30799
Obrotowe magnetyczne mieszadło bębnoweV& P Naukowy, Inc.VP 710D3
Obrotowe magnetyczne mieszadło bębnowe, zestaw akcesoriów do użytku z pompami strzykawkowymiV& P Naukowy, Inc.VP 710D3-4
NożyczkiFisher Scientific50-111-1315wystarczą dowolne nożyczki
Samoprzylepna taśma do etykietFisher Scientific15937wystarczy jedna rolka
Mikrowirówka zatrzaskowa Rurki z elastyczną rurkąFisher Scientific05-402wystarczy dowolna marka
Chlorek soduFisher ScientificS271-500
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Fisher Scientific15-525-017
Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodnyFisher ScientificS373-500
Stereoskopowy mikroskop zmiennoogniskowyFisher Scientific03-000-014szkło powiększające
Super Flangeless Ferrule z pierścieniem SST, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, do 1/16" ODIDEX Health & ScieneP-259X
Super Nakrętka bezkołnierzowa PEEK 1/4-28 Płaskie dno, do 1/16" i 1/32" ODIDEX Zdrowie & Krążki mieszające ScieneP-255X
Super Tumble, Średnica 3,35 mm, Grubica 0,61 mmV& P Naukowy, Inc.VP 722F
Tris BaseFisher ScientificBP152-500
Uniwersalna płyta podstawy, 2,5" x 2,5" x 3/8"Thorlabs Inc.UBP2
MocznikFisher ScientificU5378
VHP MicroTight Union do 360 i mikro; m ODIDEX Zdrowie & ScieneUH-4362 minimum Woda
z 0,1% kwasem mrówkowym (v/v), LC/MS GradeFisher ScientificLS118-500
Woda, LC/MSGrade Fisher ScientificW6-4
Folia aluminiowa Fisher wystarczy

Bibliografia

  1. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. J Am Soc Mass Spectrom. 16 (12), 2057-2063 (2005).
  2. Jones, L. M., Sperry, J. A., Carroll, J., Gross, M. L. Fast Photochemical Oxidation of Proteins for Epitope Mapping. Analytical Chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
  3. Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. In Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry for the Structural Analysis of Proteins in Live Cells. Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).
  4. Espino, J. A., Jones, L. M. Illuminating Biological Interactions with in Vivo Protein Footprinting. Analytical Chemistry. 91 (10), 6577-6584 (2019).
  5. Huang, W., Ravikumar, K. M., Chance, M. R., Yang, S. Quantitative mapping of protein structure by hydroxyl radical footprinting-mediated structural mass spectrometry: a protection factor analysis. Biophysical Journal. 108 (1), 107-115 (2015).
  6. Keller, C. I., Calkins, J., Hartman, P. S., Rupert, C. S. UV photobiology of the nematode Caenorhabditis elegans: action spectra, absence of photoreactivation and effects of caffeine. Photochemistry and Photobiology. 46 (4), 483-488 (1987).
  7. Konermann, L., Collings, B. A., Douglas, D. J. Cytochrome c Folding Kinetics Studied by Time-Resolved Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Biochemistry. 36 (18), 5554-5559 (1997).
  8. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  9. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
  10. Gau, B. C., Chen, H., Zhang, Y., Gross, M. L. Sulfate radical anion as a new reagent for fast photochemical oxidation of proteins. Analytical Chemistry. 82 (18), 7821-7827 (2010).
  11. Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. An efficient quantitation strategy for hydroxyl radical-mediated protein footprinting using Proteome Discoverer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (11), 3021-3031 (2016).
  12. Wagner, B. A., Witmer, J. R., van't Erve, T. J., Buettner, G. R. An Assay for the Rate of Removal of Extracellular Hydrogen Peroxide by Cells. Redox Biology. 1 (1), 210-217 (2013).
  13. Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
  14. Willard, L., et al. VADAR: a web server for quantitative evaluation of protein structure quality. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3316-3319 (2003).
  15. Broussard, J. A., Green, K. J. Research Techniques Made Simple: Methodology and of Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
  16. Kaur, U., et al. Evolution of Structural Biology through the Lens of Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (1), 142-155 (2019).
  17. Pulak, R. C. elegans: Methods and Applications. Strange, K. , Humana Press. 275-286 (2006).
  18. Rinas, A., Jones, L. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled to Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT): Expanding Footprinting Strategies to Complex Systems. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 540-546 (2015).
  19. Cheng, M., Zhang, B., Cui, W., Gross, M. L. Laser-Initiated Radical Trifluoromethylation of Peptides and Proteins: Application to Mass-Spectrometry-Based Protein Footprinting. Angewandte Chemie International Edition. 56 (45), 14007-14010 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

In vivo FPOPmikrofluidyczny system przepływowyszybkie utlenianie białekanaliza LC-MS/MSoddziaływania białko-białkonaświetlanie laserem ekscymerowymutlenianie nadtlenkiem wodorutest regeneracji nicieni
Ślad białka rodnika hydroksylowego in vivo do badania interakcji białkowych w Caenorhabditis elegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.