Tutaj opracowaliśmy nową, wielowarstwową, zmodyfikowaną strategię dla płynnych biotuszy (żelatyna metakryloyl o niskiej lepkości), aby zapobiec sedymentacji zamkniętych komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zastosowanie wielowarstwowego biotuszu hydrożelowego w trójwymiarowym biodruku w celu jednorodnego rozmieszczenia komórek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Podczas procesu trójwymiarowego biodruku opartego na ekstruzji, płynne biotusze o niskiej lepkości mogą chronić komórki przed uszkodzeniem błony wywołanym naprężeniem ścinającym i poprawić przeżywalność zamkniętych komórek. Jednak szybka sedymentacja komórek w zbiorniku napędzana grawitacją może prowadzić do niejednorodnego rozmieszczenia komórek w strukturach biodrukowanych, a tym samym utrudniać stosowanie biotuszy podobnych do płynnych. W tym miejscu opracowaliśmy nowatorską, wielowarstwową, zmodyfikowaną strategię dla biotuszów przypominających ciecz (np. żelatyny metakryloylu o niskiej lepkości), aby zapobiec sedymentacji zamkniętych w kapsułkach komórek. W wielowarstwowym biotuszu manipulowano wieloma płynnymi interfejsami, aby zapewnić retencję międzyfazową. W związku z tym działanie sedymentacji komórek przebiegające przez sąsiednie warstwy w systemie wielowarstwowym zostało opóźnione w zbiorniku biotuszu. Stwierdzono, że retencja międzyfazowa była znacznie wyższa niż przyciąganie osadowe komórek, co wskazuje na kluczową rolę retencji międzyfazowej w zapobieganiu sedymentacji komórek i promowaniu bardziej jednorodnej dyspersji komórek w wielowarstwowym biotuszu.
Wprowadzenie
Trójwymiarowy (3D) biodruk okazał się obiecującą metodą wytwarzania skomplikowanych architektonicznych i funkcjonalnych replik rodzimych tkanek w biofabrykacji i medycynie regeneracyjnej1,2,3. Typowe strategie biodruku, w tym druk atramentowy, ekstruzja i stereolitografia, mają zalety i wady z różnych perspektyw4. Wśród tych technik najczęściej stosowana jest procedura wytłaczania ze względu na jej opłacalność. Biotusz odgrywa kluczową rolę w stabilności procesu biodruku przez wytłaczanie. Idealny biotusz obciążony komórkami powinien być nie tylko biokompatybilny, ale także odpowiedni pod względem właściwości mechanicznych5. Biotusze o niskiej lepkości są zwykle przedstawiane w stanie podobnym do cieczy. Te biotusze można łatwo i szybko osadzać i unikać uszkodzenia błony komórkowej wywołanego dużym naprężeniem ścinającym podczas wytłaczania. Jednak w złożonych przypadkach wymagających długotrwałych okresów drukowania, niska lepkość często prowadzi do nieuniknionej sedymentacji zamkniętych komórek w zbiorniku biotuszu, co jest zwykle napędzane grawitacyjnie i prowadzi do niejednorodnej dyspersji komórek w biotuszu6,7. W związku z tym biotusz o niejednorodnej dyspersji komórkowej utrudnia biodrukowanie in vitro funkcjonalnego konstruktu tkankowego.
Kilka ostatnich badań skupiających się na biotuszach wykazało promowanie jednorodnej dyspersyjności zamkniętych komórek. Zmodyfikowany biotusz alginianowy oparty na dwustopniowym sieciowaniu został użyty do biodruku ekstruzyjnego8. W tym badaniu polimer alginianowy został zmodyfikowany peptydami i białkami. Komórki wykazywały bardziej jednorodny rozkład w tym zmodyfikowanym alginianie niż w powszechnie stosowanym alginianie ze względu na miejsca przyłączenia zapewniane przez peptydy i białka. Alternatywnie, mieszane biotusze zostały wykorzystane do rozwiązania sedymentacji komórek w biotuszu. W innym badaniu zastosowano mieszany biotusz zawierający glikol polietylenowy (PEG) i żelatynę lub żelatynę metakryloyl (GelMA) o zwiększonej wytrzymałości mechanicznej9. Kapsułkowane komórki charakteryzowały się jednorodnym rozkładem, głównie dlatego, że poprawiła się lepkość zmieszanego biotuszu. Ogólnie rzecz biorąc, istnieje kilka czynników wpływających na dyspersję zamkniętych komórek w biotuszu, takich jak lepkość biotuszu, grawitacja komórek, gęstość komórek i czas trwania okresu pracy. Wśród tych czynników grawitacja komórek odgrywa kluczową rolę w promowaniu sedymentacji. Wyporność i tarcie zapewniane przez lepki biotusz były do tej pory badane jako główne siły działające przeciwko grawitacji10.
Tutaj opracowaliśmy nowatorską strategię promowania jednorodnej dyspersji komórek zamkniętych w biotuszu poprzez manipulowanie wieloma płynnymi interfejsami w zbiorniku biotuszu. Te ciekłe interfejsy utworzone przez wielowarstwową modyfikację biotuszu mogą nie tylko zapewnić retencję międzyfazową, co opóźnia sedymentację komórek, ale także utrzymać odpowiednią biokompatybilność i zachowanie reologiczne biotuszu. W praktyce zmodyfikowaliśmy wodny roztwór GelMA (5%, w/v) z fibroiną jedwabiu (SF) w sposób wielowarstwowy, aby wzdłużnie wytworzyć cztery interfejsy, zapewniając napięcia międzyfazowe w mieszanym biotuszu. W rezultacie, obciążenie grawitacyjne komórek zostało zniwelowane przez napięcie międzyfazowe spowodowane przez człowieka, a dzięki mniejszej sedymentacji w sąsiednich warstwach komórek uzyskano prawie jednorodne rozproszenie zamkniętych komórek w biotuszu. Do tej pory nie zgłoszono podobnego protokołu spowalniającego sedymentację zamkniętych komórek poprzez manipulowanie retencją międzyfazową w płynnych biotuszach. Przedstawiamy tutaj nasz protokół, aby zademonstrować nowy sposób rozwiązywania sedymentacji komórek w biodruku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie wypełnionego komórkami SF-GelMA
- Wysterylizuj wszystkie materiały za pomocą strzykawkowych jednostek filtrujących 0,22 μm. Wykonaj wszystkie czynności w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
- Podgrzej 1x PBS do 50 °C i rozpuść żelatynę w podgrzanym 1x PBS, mieszając. Końcowe stężenie żelatyny w PBS powinno wynosić 10% (w/v).
- Dodać bezwodnik metakrylowy do roztworu żelatyny (stosunek wagowy bezwodnika metakrylowego do żelatyny wynosi 0,6 do 1) powoli, mieszając, i mieszać kompleks przez co najmniej 1 godzinę (50 °C). Zazwyczaj należy przygotować 200 ml 10% roztworu żelatyny z 12 g bezwodnika metakrylowego; Objętość zależy od potrzeb badania.
- Przenieść zmieszany roztwór zawierający żelatynę i bezwodnik metakrylowy do sterylnej probówki o pojemności 50 ml.
- Odwirować zmieszany roztwór o sile 3 500 x g. Uzyskanie dwóch warstw zajmuje zwykle 3-5 minut. Zebrać górną warstwę (GelMA) i wyrzucić dolną warstwę (nieprzereagowany bezwodnik metakrylowy).
- Rozcieńczyć roztwór górnej warstwy otrzymany w kroku 1.5 dwiema objętościami wody dejonizowanej (40−50 °C).
- Roztwór otrzymany w kroku 1.6 dializować za pomocą membrany dializacyjnej odcinającej masę cząsteczkową 12-14 kDa z wodą dejonizowaną przez 5-7 dni (40-50 °C). Zmieniaj wodę dwa razy dziennie.
- Zebrać i zamrozić roztwór GelMA w temperaturze -80 °C przez noc.
- Liofilizuj roztwór GelMA przez 3-5 dni w liofilizatorze w temperaturze ustawionej na -45 °C i ciśnieniu ustawionym na 0,2 mbar.
- Rozpuść liofilizowany GelMA (stopień podstawienia około 75%) w 1x PBS zawierającym 10% FBS (płodowa surowica bydlęca, v/v), 25 mM HEPES (kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-etano-sulfonowy) i fotoinicjatorze (0,5%, w/v) w celu otrzymania preparatu biotuszu GelMA.
UWAGA: Stopień podstawienia GelMA można obliczyć za pomocą testu ninhydryny3. - Zmieszać roztwór GelMA (10%, w/v) z różnymi objętościami początkowego roztworu SF (5%, w/v) i różnymi objętościami 1x PBS, aby otrzymać biotusze SF-GelMA o różnych stężeniach SF. Proporcję na 1 ml roztworu GelMA i SF w różnych biotuszach przedstawiono w tabeli 1.
UWAGA: Wszystkie biotusze muszą zawierać końcowe stężenie 5% (w/v) GelMA, ale stężenie SF jest różne: 0,5, 0,75, 1,0, 1,25 i 1,5% (w/v) w różnych biotuszach SF-GelMA. Użyj SF-M-Layered-GelMA, aby określić biotusz GelMA zmodyfikowany SF w sposób warstwa po warstwie. Użyj SF-X-GelMA, aby określić te GelMA zmodyfikowane SF w jednorodny sposób (np. GelMA z modyfikacją 1% SF została określona jako SF-1-GelMA). - Sonikuj wszystkie biotusze przez 10-20 minut.
- Hoduj komórki NIH3T3 przy użyciu DMEM (zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco) zawierające 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny w inkubatorze (37 °C z 5% CO2 ). Przejdź komórki w stosunku 1:3, gdy gęstość osiągnie 80%.
- Odwirować zawiesinę komórek NIH3T3 z prędkością 1500 obr./min przez 5 minut. Usunąć supernatant przez odsysanie i ponownie zawiesić osad komórek ze świeżym roztworem biotuszu w sterylnej probówce o pojemności 15 ml.
UWAGA: Stężenie zamkniętych komórek w biotuszu powinno wynosić 1 x 106 komórek/ml, a stężenie należy obliczyć za pomocą cytometru. - Użyj 2 ml różnych biotuszy SF-GelMA, aby zawiesić granulki komórek, aby uzyskać różne biotusze zawierające komórki.
2. Ładowanie, podgrzewanie i biodrukowanie SF-M-Layered-GelMA
- Załadować 0,4 ml wypełnionego komórkami SF-0,5-GelMA do dolnej warstwy strzykawki.
UWAGA: W tym badaniu należy użyć strzykawki o pojemności 2 ml jako zbiornika na biotusz. Do strzykawki należy wkładać różne biotusze SF-GelMA warstwa po warstwie. - Umieścić strzykawkę w lodowatej łaźni wodnej (0 °C) na 5 minut, aby dolna warstwa biotuszu przekształciła się w stan żelowy.
- Załaduj 0,4 ml biotuszu SF-0,75-GelMA z komórkami nad dolną warstwą.
- Umieścić strzykawkę z dwiema warstwami biotuszy w lodowatej kąpieli wodnej (0 °C) na 5 minut, aby dwie warstwy biotuszy przekształciły się w stan żelowy.
- Wykonaj kolejne 3 cykle ładowania i chłodzenia z pozostałymi 3 rodzajami biotuszy (SF-1-GelMA, SF-1.25-GelMA, SF-1.5-GelMA), aby uzyskać wielowarstwowy system biotuszu o różnych stężeniach SF w różnych warstwach. Objętość użyta do załadowania wszystkich biotuszów powinna wynosić 0,4 ml.
- Podgrzej wielowarstwowy biotusz, umieszczając strzykawkę w inkubatorze (37 °C) na 30 minut przed biodrukowaniem.
- Użyj strzykawki o pojemności 2 ml jako zbiornika na biotusz z dyszą drukującą 27 G. Ustaw prędkość przepływu na 50 μl/min, prędkość ruchu dyszy na 2 mm/s, a wysokość dyszy na 1 mm. Procedurę biodruku należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej (około 20 °C).
- Wydrukuj konstrukt tkankowy w sposób ekstruzji za pomocą specjalnie zaprojektowanej biodrukarki zgodnie z parametrami zaadaptowanymi z naszych poprzednich badań11,12.
- Użyj światła ultrafioletowego (365 nm, 800 mW) przez 40 s, aby usieciować biodrukowany konstrukt tkankowy.
- Hodowla usieciowanego konstruktu tkankowego w DMEM (zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco) zawierającej 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny w inkubatorze (37 °C z 5% CO2 ). Pożywkę zmieniano co 8 godzin przez pierwsze 2 dni, a następnie co 2-3 dni.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Schemat przygotowania biotuszy obciążonych komórkami przedstawiono na Ryc. 1. Po przygotowaniu różnych biotuszów przeprowadzono ich załadunek, ponowne podgrzanie oraz biodruk (Ryc. 2). Aby ocenić rozkład zamkniętych wewnątrz komórek w zbiorniku z biotuszem, przeprowadzono procedurę biodruku z użyciem trzech różnych biotuszów obciążonych komórkami w trzech płytkach 96-dołkowych (Ryc. 3A). W celu zbadania dyspersyjności zamkniętych ko...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Stabilność systemu wielowarstwowego jest kluczowym elementem pomyślnego przeprowadzenia tego protokołu. Teoretycznie obliczyliśmy dyfuzję cząsteczek SF w roztworze GelMA w oparciu o badanie Naumana13. Stwierdzono, że dyfuzja białek w roztworze była powiązana z ich masą cząsteczkową. Średnia masa cząsteczkowa (MW) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) wynosi 66,5 kDa, a jej współczynnik dyfuzji to 64-72 μm2/s. Średnia MW fibrynogenu wynosi 339,7 kDa, a jego współczynnik dyfuzji to 23-34 μm
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują za granty od Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81771971, 81970442, 81703470 i 81570422), Narodowego Kluczowego Programu Badawczo-Rozwojowego Chin (2018YFC1005002), Komisji Nauki i Technologii Gminy Szanghaj (17JC1400200), Głównego Projektu Nauki i Technologii Miejskiej w Szanghaju (Grant nr 2017SHZDZX01) oraz Miejskiej Komisji Edukacji w Szanghaju (Program Innowacji 2017-01-07-00-07-E00027).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kwas 2-hydroksy-4′-(2-hydroksyetoksy)-2-metylopropiofenon (PI2959) | TCI | M64BK-QD Kwas | |
| 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| płodowa surowica bydlęca (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Żelatyna | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Bezwodnik metakrylowy (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicylina– antybiotyki streptomycyny | Gibco | 15140163 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Fibroina jedwabiu | Advanced BioMatrix | 5154 |
Bibliografia
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. , 1805510(2019).
- Daniela, L., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Pedde, R. D., et al. Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs. Advanced Materials. 29 (19), (2017).
- Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002(2016).
- Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).
- Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting. Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Chen, N., et al. Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).
- Zhu, K., et al. A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking. Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127(2018).
- Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels. Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
