Analiza wrodzonych wad serca w zarodkach myszy z wykorzystaniem jakościowych i ilościowych metod histologicznych

Podsumowanie

W tym protokole opisujemy procedury jakościowej i ilościowej analizy fenotypów rozwojowych u myszy związanych z wrodzonymi wadami serca.

Streszczenie

Wrodzone wady serca (CHD) są najczęstszym rodzajem wad wrodzonych u ludzi, dotykając do 1% wszystkich żywych urodzeń. Jednak przyczyny leżące u podstaw choroby niedokrwiennej serca są nadal słabo poznane. Rozwijająca się mysz stanowi cenny model do badań nad chorobą niedokrwienną serca, ponieważ programy rozwojowe serca między myszami a ludźmi są wysoce konserwatywne. Protokół szczegółowo opisuje, w jaki sposób wytwarzać zarodki myszy w pożądanym stadium ciąży, metody izolowania i przechowywania serca do dalszego przetwarzania, metody ilościowe identyfikacji powszechnych typów choroby niedokrwiennej serca za pomocą histologii (np. Ubytki przegrody międzykomorowej, ubytki przegrody międzyprzedsionkowej, przetrwały przewód tętniczy) oraz ilościowe metody histomorfometrii do pomiaru typowych fenotypów zagęszczenia mięśni. Metody te opisują wszystkie etapy związane z przygotowaniem, pobieraniem i analizą próbek, umożliwiając naukowcom prawidłowy i powtarzalny pomiar CHD.

Wprowadzenie

CHD są najczęstszym typem wad wrodzonych u ludzi i są główną przyczyną zgonów związanych z wadami wrodzonymi^1,2,3,4,5,6. Chociaż około 90% noworodków przeżywa chorobę niedokrwienną serca, często wiąże się ona ze znaczną zachorowalnością i interwencjami medycznymi na przestrzeni lat, stanowiąc duże obciążenie dla życia pacjentów i systemu opieki zdrowotnej^7,8,9,10. Poza czynnikami czysto genetycznymi, przyczyny choroby niedokrwiennej serca są słabo poznane⁴. Niezidentyfikowane przyczyny stanowią ~56-66% wszystkich przypadków choroby niedokrwiennej serca według American Heart Association i innych źródeł^2,3,4,11. Dobrze znane czynniki obejmują mutacje genetyczne, CNV, warianty pojedynczych nukleotydów de novo i aneuploidię. Podejrzewa się, że czynniki środowiskowe i dietetyczne są również ważnymi źródłami przyczyniającymi się do choroby niedokrwiennej serca, co sugerują badania epidemiologiczne łączące styl życia matki^2,12, deprywacja ekonomiczna i rasa¹³, oraz badania nad czynnikami dietetycznymi, takimi jak kwas foliowy^11,14 i bioaktywny lipid kwas retinowy^15,16. Badanie mechanizmów i przyczyn choroby niedokrwiennej serca i innych wad sercowo-naczyniowych jest ważne dla opracowania strategii prewencyjnych i nowych opcji terapeutycznych^1,4,17,18,19.

Rozwijająca się mysz jest podstawowym modelem do badania CHD u ssaków. Jednak niektóre z zastosowanych metod i analiz, takie jak sekcje z zachowaniem morfologii serca, analiza etapów rozwojowych i identyfikacja wad związanych z chorobą niedokrwienną serca, mogą być zniechęcające dla naukowców, którzy są nowicjuszami w analizie mysich serc. Celem metod opisanych w niniejszym protokole jest dostarczenie jakościowych i ilościowych wytycznych dla tych procesów. Dlatego w tym protokole wyjaśniamy, jak wykonywać krycia czasowe w celu wytworzenia zarodków w pożądanym stadium ciąży, preparować ciężarne samice w celu odzyskania nienaruszonego serca (w tym tkanek towarzyszących, takich jak droga odpływu), stabilizacji serca i przygotowania do sekcji kriostatu, podstawowe metody histologiczne, analizy ilościowe częstych wad serca oraz analiza jakościowa zagęszczenia mięśnia sercowego, powszechny fenotyp prekursorowy niektórych typów choroby niedokrwiennej serca.

Protokół

Wszystkie zwierzęta użyte w eksperymentach, o których mowa w tym artykule, były leczone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Czasowe krycie myszy C57BL6/J w celu produkcji zarodków

1. Gdy myszy osiągną wiek rozrodczy (6-8 tygodni), umieść je razem w formacie hodowlanym haremowym (tj. dwie samice na jednego samca). Przygotuj je do hodowli po południu lub wieczorem.
   UWAGA: Myszy często rozmnażają się w ciągu 1 godziny po wyłączeniu świateł w ich obiekcie inwentarskim. Samice powinny być wycofane z hodowli w wieku około 6-8 miesięcy, a samce nie później niż w wieku 12 miesięcy.
2. Jeśli używasz metody ważenia do określenia zapłodnienia, hoduj myszy w dużych grupach, ponieważ metoda ważenia powoduje, że krycie w czasie przebiega w wolniejszym tempie niż metody, w których monitorowane są tylko korki kopulacyjne.
3. Następnego ranka sprawdź, czy nie ma zatyczek kopulacyjnych między 8 rano a 12 po południu. Upewnij się, że jest to robione we właściwych godzinach. Jeśli test zatyczki zostanie wykonany wcześniej niż o 8 rano, istnieje ryzyko, że czop znajduje się zbyt głęboko w kanale pochwy, aby można go było zaobserwować. Jeśli test zatyczki zostanie przeprowadzony później niż o godzinie 12, istnieje ryzyko wypadnięcia korka.
   1. Chwyć samicę za podstawę ogona i zbadaj otwór do kanału pochwy za pomocą końcówki do mikropipety. Zaczop kopulacyjny będzie wyglądał jak bariera błony śluzowej (ryc. 1A), która w niektórych przypadkach może być nieco trudna do zauważenia. Skorupiastość jest również wskazówką, że czop kopulacyjny jest lub był obecny. Jeśli nie ma bariery śluzówkowej (ryc. 1B), oznacza to, że samica prawdopodobnie nie pokryła się w pary lub czop kopulacyjny mógł już wypadnąć.
   2. Odnieś się do poranka kopulacji jako e0.5.
      UWAGA: W przypadku myszy C57BL6/J zatyczki kopulacyjne mogą być trudne do zidentyfikowania. Dlatego czasami myszy kojarzyły się, mimo że nie zaobserwowano żadnej wtyczki. Kopulacja nie zawsze prowadzi do poczęcia. Jest to często bardziej prawdopodobne u myszy C57BL6/J. Dlatego należy monitorować postęp masy ciała, aby potwierdzić ciążę (patrz krok 1.4). Ważenie może pomóc w identyfikacji samic, które są w ciąży i potwierdzić, że zatyczki doprowadziły do poczęcia. Zachowaj ostrożność podczas krycia samic przez kolejne noce. Jeśli zaobserwuje się, że konkretny samiec jest dobry w wytwarzaniu korka kopulacyjnego, można mu zaufać, że będzie kojarzył się przez kolejne noce z tą samą samicą.
   3. Należy pamiętać, że szanse na ciążę są większe w przypadku myszy, które są sprawdzonymi hodowcami, ponieważ zostały one wcześniej z powodzeniem wyhodowane. Aby zwiększyć szanse na posiadanie sprawdzonych hodowców, używane samce nie powinny być zbyt stare.
4. Po oznaczeniu zatyczek zważyć samice. Ważenie powinno być kontynuowane 7-10 dni później. Jeśli przyrost masy ciała przekracza 1,73 g, oznacza to, że mysz prawdopodobnie jest w ciąży²⁰. Jeśli przyrost masy ciała wynosi poniżej 1,73 g, prawdopodobnie nie jest to związane z ciążą i mysz powinna zostać ponownie wprowadzona do populacji hodowlanej.
   UWAGA: Myszy C57BL6/J produkują małe mioty (średnio od pięciu do sześciu zarodków). Metody ważenia w celu określenia ciąży są dokładne dla większości. Użycie tej metody zapewnia 12,8% odsetek wyników fałszywie dodatnich i wyklucza 3% kobiet, które są w ciąży²⁰. Jeśli badacz obawia się, że pożądany czas ciąży jest późniejszy, przejdź do kroku 1.5
5. Opcjonalnie: W dniu, w którym ma się odbyć sekcja, upewnij się, że ciąża postępowała poprzez kontrolę fizyczną. Chwyć samicę za podstawę ogona i rozciągnij ciało. Najłatwiej to zrobić, umieszczając mysz na nadgarstku i delikatnie pociągając za podstawę ogona. Jeśli samica jest w ciąży, prawdopodobnie nastąpi przyrost masy ciała, szczególnie w dolnej części tułowia, i pojawi się on jako małe grudki.
   UWAGA: Ciąża może być wyczuwalna palpacyjnie już od e12.5 i w większości przypadków będzie wyczuwalna przez e14.5. Myszy C57BL6/J mają małe rozmiary miotu, dlatego samica może być w ciąży, nawet jeśli nie ma żadnych fizycznych objawów.

2. Sekcja samic i embrionów w celu odzyskania serca

1. Przed rozpoczęciem sekcji należy przygotować następujące roztwory w temperaturze pokojowej.
   1. Rozpuścić kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) w stężeniu 0,5 mM.
      UWAGA: Po przygotowaniu zaleca się przechowywanie roztworu na lodzie i stosowanie go tylko w temperaturze 4 °C. Jeśli zanieczyszczenie stanowi problem, przed użyciem należy go sterylizować w autoklawie.
   2. Rozpuścić paraformaldehyd (PFA) w PBS w stężeniu 4%.
      UWAGA: Po przygotowaniu zaleca się przechowywanie roztworu na lodzie i używanie go tylko w temperaturze 4 °C. Przechowywanie w temperaturze 4 °C lub niższej do długotrwałego przechowywania. Stężenie roztworu PFA może się różnić w zależności od dalszych zastosowań próbek tkanek. Ten procent jest używany do barwienia hematoksyliną i eozyną, immunohistochemii i barwienia immunofluorescencyjnego.
2. Gdy samica osiągnie pożądany etap ciąży, mysz powinna zostać poddana eutanazji o odpowiedniej porze dnia, zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi dotyczącymi stosowania u zwierząt. Jeśli czas przypada na pół dnia (np. e15.5), należy go poświęcić około godziny 12. Jeśli czasy są całymi dniami (np. e15.0), należy je poświęcić blisko godziny 12.
   UWAGA: Zakłada się, że poczęcie następuje około północy w nocy, w której myszy są sparowane. Trudno jednak określić dokładny czas poczęcia. Z tego powodu czas jest szacunkowy, a nie dokładny.
3. Po przygwożdżeniu czterech kończyn ostrożnie wykonaj nacięcie w kształcie litery I wzdłuż tułowia, zaczynając od okolic cewki moczowej w kierunku mostka.
4. Macica prawdopodobnie będzie znajdować się tuż nad obszarem miednicy. Macica myszy ma kształt litery Y; Dlatego prawdopodobnie będzie bardzo długi i owinięty wokół tułowia. Usuń go, delikatnie podnosząc. Zrób to za pomocą boków cienkich kleszczy ruchem nabierającym. Powierzchowne tkanki macicy można bardzo ostrożnie chwycić za końcówki cienkich kleszczy podczas początkowego wyciągania macicy. Użyj nożyczek, aby odciąć macicę od ciała.
   UWAGA: Mając na uwadze nietypowy kształt litery Y macicy, upewnij się, że cała macica została usunięta.
5. Namocz macicę w lodowatym PBS. Przypnij jeden koniec macicy i rozciągnij go w jedną linię.
6. Pokrój macicę na sekcje, z których każda zawiera oddzielny zarodek. Delikatnie obierz zarodek cienkimi kleszkami. Najłatwiej to zrobić, trzymając parę kleszczy w każdej ręce. Po usunięciu zarodek należy natychmiast umieścić na nowej szalce Petriego wypełnionej roztworem PBS-EDTA w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Można również użyć zwykłego roztworu PBS, ale EDTA zapobiega koagulacji w próbkach.
7. Etap zarodków za pomocą Theiler Staging²¹. Ponieważ stopień zaawansowania zarodków w obrębie jednego miotu może się różnić, należy określić stopień zaawansowania każdego zarodka z osobna.
   UWAGA: Może to również zapewnić przewidywanie możliwych wrodzonych wad serca u zarodków. Zazwyczaj objawy wrodzonej wady serca można zaobserwować w morfologii zarodka. Mogą występować inne poważne wady, często związane z niektórymi chorobami serca.
8. Serce może zostać usunięte na różne sposoby, w zależności od wieku zarodka.
   UWAGA: Jeśli nie jest jasne, czy droga odpływu pozostanie nienaruszona podczas usuwania, należy usunąć więcej tkanek niż tylko serce (pozostawiając drogę odpływu w stanie nienaruszonym i minimalizując bezpośredni kontakt między sercem a kleszczami) lub przeanalizować cały zarodek.
   1. Za pomocą lunety preparacyjnej i dwóch par cienkich kleszczy ułóż zarodek na plecach i ustabilizuj dostęp do klatki piersiowej. Można to zrobić, przygwożdżając ramiona kleszczami lub usuwając ramiona i przytrzymując tułów w odpowiedniej pozycji.
   2. Użyj ostrego czubka drugiej pary cienkich kleszczy, aby wykonać nacięcie wzdłuż mostka zarodka i rozciągnąć między obojczykami do pępka. Zacznij od wykonania bardzo drobnych i powierzchownych nacięć, stopniowo kierując się do wnętrza jamy klatki piersiowej. Serce powinno stać się ledwo widoczne. Nie dotykaj go kleszczami podczas tych powierzchownych nacięć.
   3. Otwórz klatkę piersiową za pomocą pierwszej pary kleszczy, aby delikatnie ścisnąć tułów zarodka, lekko doogonowo do klatki piersiowej. Serce powinno wyskoczyć lub stać się widoczne. Serce może wymagać delikatnego nakłaniania, aby wyjść. Użyj boku kleszczy, upewniając się, że czubek kleszczy nigdy nie styka się z sercem. Aby utrzymać miejsce pracy i kleszcze w czystości, trzymaj w pobliżu niestrzępiącą się chusteczkę.
   4. Delikatnie chwyć naczynia krwionośne płuc bokami kleszczy, uważając, aby nie przeciąć tkanki, i wyciągnij serce z jamy klatki piersiowej. Następnie oczyść serce.
      UWAGA: W przypadku zarodków e13.5 i młodszych serce jest pokryte osierdziem. Musi on zostać usunięty, aby dotrzeć do serca.
9. Za pomocą stereoskopu zrób zdjęcie serca do późniejszego wykorzystania.
10. Opłucz serca w roztworze PBS-EDTA przez 1-2 minuty, a następnie umieść je w 4% roztworze PFA na około 45-60 minut, aby je utrwalić. Jeśli pożądana jest analiza całego zarodka, moczyć go przez noc. Objętość roztworu PFA powinna być 5-6 razy większa niż objętość utrwalanej tkanki.
    UWAGA: Ten czas inkubacji może się różnić w zależności od późniejszych badań. Ten czas inkubacji jest wykorzystywany do barwienia hematoksyliną i eozyną, immunohistochemii i barwienia immunofluorescencyjnego.
11. Umyć 5-10 minut PBS-glicyną 3x i umieścić z powrotem w PBS. Można również dodać azydek sodu lub penicylinę/streptomycynę, aby zminimalizować rozwój bakterii i zachować nienaruszone tkanki. Serca mogą być teraz przechowywane krótkoterminowo w temperaturze 4 °C.

3. Przygotowanie tkanek

UWAGA: Tkanki mogą być przygotowywane za pomocą zatapiania OCT (optymalna temperatura cięcia) lub zatapiania parafiny. Każda z tych metod ma swoje zalety i wady, a cel analizy powinien być brany pod uwagę przy podejmowaniu decyzji, którą metodę osadzania należy zastosować.

1. OCT embedding
   UWAGA: Ta metoda może być lepsza niż zatapianie formaliny/parafiny, ponieważ kriosekcje zachowują reaktywność antygenu, nadal mogą być używane do barwienia hematoksyliną i eozyną oraz szybciej wytwarzają plastry.
   1. Przygotować roztwór sacharozy rozpuszczony w PBS o stężeniu 30% (w/v).
   2. Przenieść tkanki do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml lub probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej PBS-30% sacharozy. Początkowo tkanka będzie unosić się na wodzie.
   3. Wstaw do lodówki w temperaturze 4 °C. Tkanka będzie gotowa do zatopienia OCT, gdy opadnie na dno probówki, zwykle w ciągu 24-40 godzin
      UWAGA: Tkanki mięśniowe znacznie cierpią podczas cykli zamrażania/rozmrażania i tracą swoją natywną morfologię. Sacharoza jest wchłaniana przez tkankę i działa jako środek krioprezerwujący, który pozwala na lepsze zachowanie morfologii. Upewnij się, że w probówce jest wystarczająca ilość roztworu, aby unoszenie się tkanek było wystarczająco monitorowane. PBS-sacharoza jest łatwo zanieczyszczona bakteriami, dlatego często sprawdzaj roztwór pod kątem zmętnienia, które wskazuje na przerost grzybów lub bakterii. Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia, do roztworu PBS-sacharozy można dodać penicylinę/streptomycynę lub azydek sodu.
   4. Wyjmij serca pipetą Pasteura, upewnij się, że otwór pipety jest wystarczająco szeroki, aby nie rozerwać tkanki. W razie potrzeby przeciąć pipetę nożyczkami. W przypadku pracy z całymi zarodkami należy użyć kleszczy, aby pobrać próbkę.
      UWAGA: Rób to delikatnie. Nawet jeśli otwór pipety jest wystarczająco szeroki, aby wyjąć serca, krawędzie pipety mogą nadal rozerwać tkanki. Kleszcze mogą wgniatać próbki tkanek, jeśli są używane zbyt agresywnie.
   5. Na krótko pozostaw chusteczkę do wyschnięcia na powietrzu na niestrzępiącej się chusteczce. Umieść próbkę w formie OCT w żądanej pozycji do cięcia (tj. strzałkowa, poprzeczna, czołowa). Dodawaj związek OCT, aż próbka zostanie całkowicie zanurzona, upewniając się, że nie ma pęcherzyków stykających się z tkanką.
   6. Umieść formę w temperaturze -20 °C na noc lub kilka dni, a następnie przenieś formę do -80 °C. Po 24 godzinach forma jest gotowa do kriosekcji. Tkanki w tym formacie mogą być przechowywane przez długi czas.
2. Osadzanie parafiny
   1. Za pomocą etanolu odwodnij tkanki w tej sekwencji: 50% etanolu przez 10 minut, 70% etanolu przez 10 minut, 80% etanolu przez 10 minut, 95% etanolu przez 10 minut, 100% etanolu przez 10 minut (zrób to 3x).
   2. Namocz tkanki w szeregu roztworów etanolu/ksylenu w następującej kolejności: roztwór etanolu/ksylenu w proporcji 2:1 przez 10-15 min, roztwór etanolu/ksylenu w stosunku 1:1 przez 10-15 min, roztwór etanolu/ksylenu w stosunku 1:2 przez 10-15 min, 100% ksylenu przez 10-15 min (zrób to 3x).
   3. Aby zastąpić ksylen parafiną, należy namoczyć tkanki w piecu próżniowym (ustawionym w temperaturze 54-58 °C) w następujących sekwencjach: 2:1 roztwór ksylenu/parafiny przez 30 min, roztwór ksylenu/parafiny 1:1 przez 30 min, roztwór ksylenu/parafiny 1:2 przez 30 min, 100% parafina przez 1-2 h, 100% parafina przez 1-2 h lub przez noc.
      UWAGA: Podgrzewanie tkanek powyżej 60 °C przez dłuższy czas spowoduje degradację polimerów parafinowych i kruchość tkanki.
   4. Używając świeżej parafiny, osadź tkanki w żądanej pozycji.

4. Cięcie kriostatu dla tkanek osadzonych w OCT

1. W kriostacie umieścić wszystkie próbki w środku na co najmniej 1 godzinę, jeśli próbki były wcześniej przechowywane w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Powinny one tam pozostać do momentu zebrania wszystkich sekcji.
2. Upewnij się, że kriostat jest ustawiony na prawidłowe ustawienia temperatury. Temperatura otoczenia wewnątrz komory kriostatu powinna wynosić około -20 °C, a ramię kriostatu powinno wynosić około -24 °C.
   UWAGA: Ta temperatura może się różnić w zależności od tego, jak blok reaguje na krojenie. Jeśli problemem jest niespójne krojenie, temperatura otoczenia może zostać obniżona.
3. Wyjmij blok OCT z formy, pociągając za krawędzie otwartej strony formy, aby go poluzować, a następnie ściskając blok na zamkniętym końcu, gdzie forma się zwęża
.
4. Aby zamontować blok OCT, umieść OCT o temperaturze pokojowej na uchwycie, zaczynając od środka i pracując do krawędzi. Cały uchwyt nie musi być zakrywany.
5. Umieść blok OCT (patrz krok 3.1) na formie. Krawędź bloku, która przylegała do zamkniętej strony formy, powinna być skierowana do góry na uchwycie. Pozwól OCT na uchwycie zamarznąć, aż stanie się nieprzezroczysty biały, około 5-10 minut.
6. Umieść uchwyt na ramieniu na kolejne 5-10 minut, aby blok osiągnął temperaturę ramienia. Aby uzyskać równoległy wycinek, wyreguluj ramię, aż krawędź bloku będzie równoległa do stołu montażowego, a odległość między stolikiem a dolną krawędzią bloku będzie taka sama jak stolik i górna krawędź bloku.
7. Włóż ostrze i wyreguluj odległość bloku od ostrza, aby pobrać sekcje.
8. Weź plastry o grubości 10 μm. Kontynuuj krojenie, aż do osiągnięcia interesującego Cię miejsca, ręcznie lub za pomocą funkcji przycinania.
9. Aby zebrać plasterki, użyj małego płaskiego pędzla i pędzla do detali. Gdy forma zacznie się ciąć, użyj płaskiej szczotki, aby delikatnie pociągnąć plasterek do podstawy. Podczas przecinania próbki ruch musi być ciągły i bez przerw, chociaż prędkość może zależeć od twardości próbki.
10. Podczas krojenia użyj płaskiej szczotki, aby delikatnie poprowadzić plasterek podczas jego przygotowania. W tym momencie plasterek nie musi znajdować się równo ze sceną, więc pozwól mu się wychylić, aby nie powodować rozdarć ani ciągnięć i nie wpływać na histologię.
    UWAGA: Podczas krojenia całych zarodków ta część może być szczególnie trudna, zwłaszcza przy zmianie typu tkanki. Upewnij się, że plastry są wykonane bez przerw, a szczotka nie ciągnie ich zbyt agresywnie. Kiedy zmieniają się rodzaje tkanek, plasterek może pęknąć, dlatego kluczowe jest utrzymanie niskiej temperatury. Jeśli problemem jest pękanie, zmniejsz temperaturę lub zwiększ grubość próbki.
11. Wstrzymaj ruch bloku, gdy próbka zostanie całkowicie przecięta, ale wycinek nie jest jeszcze wolny od bloku. Nie odsuwając płaskiego pędzla od plasterka, użyj pędzla szczegółów, aby poklepać plasterek, aby był płaski i zamrożony na stole montażowym.
12. Przytrzymaj plasterek przez ~10 s przed wyjęciem pędzla do detali i zakończeniem plasterka. Użyj dwóch pędzli, aby delikatnie spłaszczyć plasterek na scenie, zapobiec toczeniu się i przytrzymać go przy stole przez ~20-30 sekund.
13. Odwróć plasterek i ponownie spłaszcz go na stole montażowym. Przesuń naładowany elektrostatycznie slajd na tyle blisko, aby wycinek został przyciągnięty i przylegał do slajdu bez konieczności dotykania slajdu do stolika. Oznacz slajdy ołówkiem.
14. Przechowuj szkiełka w hermetycznym pudełku, aby chronić tkanki przed gromadzeniem się lodu podczas przechowywania. W przypadku krótkotrwałego przechowywania szkiełka należy przechowywać w temperaturze -20 °C przed barwieniem. W przypadku długotrwałego przechowywania należy je przechowywać w temperaturze -80 °C.

5. Mikrotomowe cięcie tkanek zatopionych w parafinie

1. Przed podziałem na sekcje należy umieścić bloki na lodzie w celu schłodzenia próbek. Po ostygnięciu parafina łatwiej się plastrach i może wytwarzać cieńsze plastry.
2. Przygotuj łaźnię wodną o temperaturze 40-45 °C z użyciem ultraczystej wody.
3. Umieść ostrze w uchwycie w mikrotomie. Upewnij się, że jest bezpieczny, a następnie ustaw kąt przyłożenia. Upewnij się, że kąt luzu jest prawidłowy. Można to sprawdzić zgodnie z instrukcjami producenta.
4. Umieść blok parafiny w mikrotomie. Upewnij się, że jest prawidłowo ustawiony, aby ostrze przecinało prosto w poprzek bloku.
5. Upewnij się, że ostrze jest prawidłowo zorientowane z blokiem, wykonując kilka plasterków. Zrób to ostrożnie, aby można było dokonać regulacji.
6. Przycinaj blok, aż zostanie osiągnięty punkt zainteresowania.
7. Ułóż plastry o żądanej grubości. Weź pod uwagę, że kilka pierwszych plasterków prawdopodobnie zostanie wyrzuconych.
8. Podnieś skrawki i przenieś je do łaźni wodnej za pomocą kleszczy. Powinno to spowodować spłaszczenie sekcji. Użyj kleszczy, aby dostosować je w razie potrzeby.
9. Przesuń naładowany elektrostatycznie szkiełko wystarczająco blisko, aby plasterek został przyciągnięty i przylegał do szkiełka. Oznacz slajdy ołówkiem.
10. Umieść wszystkie zebrane szkiełka w stojaku na slajdy. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia na noc w temperaturze 37 °C.

6. Deparafinizacja tkanek

1. Umyj szkiełka w następującej kolejności: 3 min w ksylenie (2x), 3 min w roztworze 1:1 ksylenu/100% etanolu, 3 min w 100% etanolu (2x), 3 min w 95% etanolu, 3 min w 70% etanolu, 3 min w 50% etanolu.

7. Barwienie hematoksyliną i eozyną

1. Przygotuj szkiełka do barwienia.
   1. Jeśli używasz chusteczek przygotowanych przez OCT, moczyć w wodzie destylowanej przez ~ 4 minuty, aż OCT się rozpuści i pozostaw do wyschnięcia.
   2. W przypadku stosowania tkanek zatopionych w parafinie, muszą one zostać odparafinowane. Patrz krok 6.1.
2. Umieść szkiełko w przefiltrowanej 0,1% hematoksylinie na 10 min. Umieść szkiełko w wodzie destylowanej, zmieniając wodę 1x natychmiast, a następnie ponownie po 3 min.
3. Umieść szkiełko w 0,5% eozynie na 10 s lub zanurz 12 razy. Zanurz szkiełko w wodzie destylowanej, aż eozyna przestanie powstawać smugi, około 2-3 zanurzenia.
4. Odwodnić szkiełko, mocząc w 50% etanolu przez 10 s, 75% etanolu przez 10 s, 95% etanolu przez 30 s i 100% etanolu przez 1 min. Zanurz w ksylenie, aż ksylen wyjdzie gładki, ~ 5-7 zanurzeń.
5. Poczekaj, aż ksylen odparuje i zamontuj za pomocą szybkoschnącego medium montażowego o współczynniku załamania światła zbliżonym do szkła.

8. Analiza jakościowa częstych wad serca

1. Wykonaj zdjęcia wszystkich próbek za pomocą mikroskopu odwróconego lub stereoskopowego i odpowiedniej kamery. Wykonuj zdjęcia makroskopowe i mikroskopowe, w zależności od rodzajów analizowanych defektów. Zdjęcia makroskopowe można wykonywać w dowolnym powiększeniu poniżej 10x. Obrazy mikroskopowe powinny być wykonywane w powiększeniu 40x lub większym. Zdjęcia wykonane w tej pracy zostały wykonane z 5-krotnym powiększeniem przy użyciu mikroskopu stereoskopowego i 40-krotnego obiektywu pneumatycznego (obiektyw N.A. 0,55) przy użyciu mikroskopu odwróconego.
   UWAGA: Obrazy makroskopowe są dobrym punktem wyjścia, ponieważ zapewniają widok na całe serce (ryc. 3). W miarę identyfikowania wzorców można skupić się na określonych obszarach i je dalej badać.
2. Ustaw wszystkie obrazy obok siebie na ekranie komputera. Po jednej stronie ekranu należy umieścić wszystkie obrazy próbek kontrolnych, a po drugiej stronie ekranu wszystkie obrazy próbek eksperymentalnych. Najlepiej jest analizować jedną grupę leczoną na raz.
3. Szukaj różnic w fenotypach między grupami leczenia, zaczynając od kluczowych obszarów, w których występują powszechne wady serca. Będzie się to różnić w zależności od tego, czy obrazy są makroskopowe, które przedstawiają ogólną anatomię serca, czy mikroskopijne, które przedstawiają mikroskopijną anatomię tkanki serca.
4. Rozpocznij poszukiwanie typowych makroskopowych wad serca, takich jak ubytki przegrody międzykomorowej (ryc. 2A), ubytki przegrody międzyprzedsionkowej (ryc. 2B) i przetrwały przewód tętniczy (ryc. 2C). Wszystkie te wady najłatwiej dostrzec w przekrojowym widoku serca.
5. Aby zidentyfikować ubytki przegrody międzywarstwowej, rozważ przyjrzenie się wielu warstwom, ponieważ można je zaobserwować w jednej płaszczyźnie tkanki, a nie w innej.
   UWAGA: Czasami wadą nie jest brak przegrody, ale w przegrodzie. Dlatego zwróć szczególną uwagę, aby nie pomylić rozdarcia z ubytkiem przegrody nosowej. Szukanie spójności między pobliskimi plasterkami w określonym regionie może potwierdzić, czy jest to rzeczywiście wada, czy rozdarcie spowodowane krojeniem.
6. Aby zidentyfikować wady w drodze odpływu, takie jak przetrwały przewód tętniczy, użyj wielu plasterków, aby podążać za głównymi naczyniami krwionośnymi, gdy opuszczają serce. Utwórz obraz głównych naczyń krwionośnych względem siebie. Przykład przedstawiono na rysunku 2C.
   UWAGA: Niektóre nieprawidłowości mogą wynikać z etapu rozwoju zarodka (np. przetrwały przewód tętniczy zamyka się po urodzeniu, wkrótce po urodzeniu; przegroda komorowa nie zamyka się całkowicie do ~e14,5). Niektóre inne powszechne makroskopowe wady serca, które nie są uwzględnione na rycinach, obejmują przetrwały truncus atereriosus, który można najłatwiej wykryć w e16.5 i później; prawa komora z podwójnym wylotem (DORV), którą można wykryć w plasterkach, w których serce dostaje się do drogi odpływowej; i nadrzędną klasę aorta²². Częstą mikroskopową wadą serca jest zmniejszone zagęszczenie mięśni (ryc. 4).

9. Analiza ilościowa zagęszczenia mięśnia sercowego przy użyciu tkanek barwionych hematoksyliną i eozyną

1. Korzystając z makroskopowego widoku barwionych próbek tkanek (ryc. 4A), zidentyfikuj obszar zainteresowania do zobrazowania w 40-krotnym powiększeniu (ryc. 4B). W niniejszej pracy wykorzystano ścianę lewej komory. Zapisz obraz w żądanym formacie. W tym artykule obrazy zostały zapisane jako pliki .tif.
2. Otwórz obraz w oprogramowaniu ImageJ.
3. Ustaw obraz na 8-bitowy. Dzięki temu obraz może korzystać z narzędzia progowego w następnym kroku^23,24. Aby to zrobić, wybierz "Obraz | Rodzaj | 8-bitowy".
4. Ustaw próg zdjęcia. Celem tego kroku jest wybranie tylko tych pikseli, które reprezentują tło, z wyłączeniem pikseli reprezentujących tissues^23,24.
   UWAGA: Ta powierzchnia zostanie później odjęta. Prawidłowy próg wybierze piksele, które badacz chce wykluczyć z powierzchni tkanki mięśniowej. W związku z tym efekt końcowy powinien zawierać tkankę w skali szarości, a tło zostanie wybrane.
   1. Kliknij "ImageJ | Obraz | Dostosuj | Próg". Przesuń górny pasek, aby dokonać regulacji progu. Zamknij okno regulacji progów bez wprowadzania żadnych innych zmian po wybraniu żądanych sekcji²¹.
5. Użyj narzędzia Zaznaczanie wielokątów, aby zaznaczyć miejsce zajmowane przez tkankę. Ostrożnie upewnij się, że kontury śledzą granice tkanek, ponieważ luźne ślady zapewnią fałszywe pomiary.
6. Dostosuj ustawienia pomiaru w ImageJ tak, aby oprogramowanie mierzyło tylko obszar pikseli, które zostały wybrane za pomocą narzędzia progowego w kroku 9.4²³. "ImageJ | Analizowanie | Ustawianie pomiarów | powierzchni i granicy do progu". Wybierz tylko obszar i Ogranicz do progu.
7. Zmierz obszar podświetlonych pikseli. "ImageJ | Analizowanie | Środek". Ta wartość reprezentuje obszar przestrzeni ujemnej.
8. Zmierz obszar całego obszaru zainteresowania. Jest to obszar, który został zaznaczony za pomocą narzędzia Zaznaczanie wielokątów. "Obraz J | Analizowanie | Ustawianie pomiarów | obszar". Zaznacz tylko obszar i usuń zaznaczenie opcji Ogranicz do progu. Następnie zmierz, wybierając "Obraz J | Analizowanie | Środek".
9. Oblicz obszar, który zajmuje rzeczywista tkanka mięśniowa w obszarze zainteresowania. Odejmij obszar przestrzeni ujemnej od obszaru całego obszaru zainteresowania. Tą wartością jest obszar tkanki mięśniowej.
10. Oblicz wskaźnik zagęszczenia mięśni (MCI). Podziel obszar tkanki mięśniowej przez obszar obszaru zainteresowania.
    
    Im większa wartość MCI, tym bardziej zagęszczony jest mięsień. Te wartości MCI można następnie wykorzystać do analizy statystycznej w celu zbadania znaczących zmian w zagęszczeniu mięśni między grupami leczonymi (Figura 4C).

Wyniki

Wskaźnik zagęszczenia mięśni został porównany między sercami rozwijającymi się w dwóch różnych środowiskach, grupie kontrolnej i eksperymentalnej. Protokoły te wykorzystano do ilościowej analizy zagęszczenia tkanki mięśniowej, co umożliwiło analizę statystyczną. Wykazano, że zagęszczenie mięśni było znacznie zmniejszone w eksperymentalnych sercach w porównaniu z zarodkami, które rozwinęły się w warunkach nieeksperymentalnych.

Za...

Dyskusja

W protokole tym omówiono techniki związane z analizą rozwoju serca w sercach embrionalnych. Niektóre ograniczenia tej metody to wymagana sprawność fizyczna dla technik przygotowawczych, która może wymagać praktyki, oraz umiejętności obrazowania mikroskopowego. Jeśli plastry uzyskane w kriostacie są niechlujne, barwienie hematoksyliną i eozyną nie będzie wyraźne lub jeśli obrazy wykonane pod mikroskopem mają słabe oświetlenie, wówczas metoda zastosowana w przypadku ImageJ nie zadziała. Ograniczeniem funkcji progu w oprogr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówka stożkowa 15 mLFisher	Scientific	# 1495970C
C57BL/6J Myszy	Jackson Labs	C57BL/6J - stockowe
Coplin (x6)	VWR Scientific	# 25457-006
Szkiełka nakrywkowe 24X50MM #1.5	VWR Scientific	# 48393-241
Kriostat - Leica CM3050S	Leica	N/A
Naczynia preparacyjne	Fisher Scientific	# 50930381
Dumont # 5 - Drobne kleszcze (x2)	Narzędzia do nauki	precyzyjnej# 11254-20
Roztwór eozyny Y	Millipore Sigma	# HT110116-500ML
Alkohol etylowy (czysty, 200 dowodów)	Fisher Scientific	# BP2818-500
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Millipore Sigma	# E9884-100G
Eukitt	Millipore Sigma	# 03989-100ML
Cienkie nożyczki	Narzędzia naukowe	14060-10
Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy Leica M165 FC	Leica	N/A
Glicyna	Millipore Sigma	# 410225-250G
Kleszcze Graefe	Narzędzia naukowe	11052-10
Oprogramowanie Graphpad Prism 8	Oprogramowanie Graphpad
ImageJ	ImageJ
Kimwipes	Fisher Scientific	# 06666A
Mayera	Millipore Sigma	# MHS16-500ML
Końcówka do mikropipet - p200	Fisher Scientific	# 02707448
Oprogramowanie	Microsoft ExcelZwiązek Microsoft
OCT	VWR Scientific	# 102094-106
Mikroskop Olympus CkX53	Pędzle
(co najmniej 2)
Paraformaldehyd	VWR Scientific	# 0215014601 Zrobić	na 4% roztwór (rozpuszczony w PBS)
Pipeta(y) PasteuraFisher	Scientific	# 13-711-7M
Penicylina-Streptomycyna	ThermoFisher Scientific	# 15140122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	ThermoFisher Scientific	# 70011044	Rozcieńczyć od 10x do 1x przed użyciem
Waga	Mettler Toledo	# Waga MS1602TS
Waga	Mettler Toledo	MS105
#3	VWR Scientific	# 10161-918
Ostrza skalpela	VWR Scientific	# 21909-612
Forma kwadratowa	VWR Scientific	# 100500-224	Do form OCT
Milipor sacharozy	Sigma	# S9378-500G
Prowadnice Superfrost Plus	Fisher Scientific	# 1255015
Nożyczki chirurgiczne	Narzędzia do nauki	precyzyjnej # 14002-14
Tissue-Tek Accu-Edge Jednorazowe ostrza do mikrotomów	VWR Scientific	# 25608-964
Waga podróżna	Acculab	VIC 5101
Ksylen	Millipore Sigma	214736-1L