Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza wrodzonych wad serca w zarodkach myszy z wykorzystaniem jakościowych i ilościowych metod histologicznych

6.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60926

⸱

10 marca 2020

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Michigan State University, 2Institute for Quantitative Health Sciences and Engineering, Michigan State University

W tym artykule

Podsumowanie

W tym protokole opisujemy procedury jakościowej i ilościowej analizy fenotypów rozwojowych u myszy związanych z wrodzonymi wadami serca.

Streszczenie

Wrodzone wady serca (CHD) są najczęstszym rodzajem wad wrodzonych u ludzi, dotykając do 1% wszystkich żywych urodzeń. Jednak przyczyny leżące u podstaw choroby niedokrwiennej serca są nadal słabo poznane. Rozwijająca się mysz stanowi cenny model do badań nad chorobą niedokrwienną serca, ponieważ programy rozwojowe serca między myszami a ludźmi są wysoce konserwatywne. Protokół szczegółowo opisuje, w jaki sposób wytwarzać zarodki myszy w pożądanym stadium ciąży, metody izolowania i przechowywania serca do dalszego przetwarzania, metody ilościowe identyfikacji powszechnych typów choroby niedokrwiennej serca za pomocą histologii (np. Ubytki przegrody międzykomorowej, ubytki przegrody międzyprzedsionkowej, przetrwały przewód tętniczy) oraz ilościowe metody histomorfometrii do pomiaru typowych fenotypów zagęszczenia mięśni. Metody te opisują wszystkie etapy związane z przygotowaniem, pobieraniem i analizą próbek, umożliwiając naukowcom prawidłowy i powtarzalny pomiar CHD.

Wprowadzenie

CHD są najczęstszym typem wad wrodzonych u ludzi i są główną przyczyną zgonów związanych z wadami wrodzonymi1,2,3,4,5,6. Chociaż około 90% noworodków przeżywa chorobę niedokrwienną serca, często wiąże się ona ze znaczną zachorowalnością i interwencjami medycznymi na przestrzeni lat, stanowiąc duże obciążenie dla życia pacjentów i systemu opieki zdrowotnej7,8,9,10. Poza czynnikami czysto genetycznymi, przyczyny choroby niedokrwiennej serca są słabo poznane4. Niezidentyfikowane przyczyny stanowią ~56-66% wszystkich przypadków choroby niedokrwiennej serca według American Heart Association i innych źródeł2,3,4,11. Dobrze znane czynniki obejmują mutacje genetyczne, CNV, warianty pojedynczych nukleotydów de novo i aneuploidię. Podejrzewa się, że czynniki środowiskowe i dietetyczne są również ważnymi źródłami przyczyniającymi się do choroby niedokrwiennej serca, co sugerują badania epidemiologiczne łączące styl życia matki2,12, deprywacja ekonomiczna i rasa13, oraz badania nad czynnikami dietetycznymi, takimi jak kwas foliowy11,14 i bioaktywny lipid kwas retinowy15,16. Badanie mechanizmów i przyczyn choroby niedokrwiennej serca i innych wad sercowo-naczyniowych jest ważne dla opracowania strategii prewencyjnych i nowych opcji terapeutycznych1,4,17,18,19.

Rozwijająca się mysz jest podstawowym modelem do badania CHD u ssaków. Jednak niektóre z zastosowanych metod i analiz, takie jak sekcje z zachowaniem morfologii serca, analiza etapów rozwojowych i identyfikacja wad związanych z chorobą niedokrwienną serca, mogą być zniechęcające dla naukowców, którzy są nowicjuszami w analizie mysich serc. Celem metod opisanych w niniejszym protokole jest dostarczenie jakościowych i ilościowych wytycznych dla tych procesów. Dlatego w tym protokole wyjaśniamy, jak wykonywać krycia czasowe w celu wytworzenia zarodków w pożądanym stadium ciąży, preparować ciężarne samice w celu odzyskania nienaruszonego serca (w tym tkanek towarzyszących, takich jak droga odpływu), stabilizacji serca i przygotowania do sekcji kriostatu, podstawowe metody histologiczne, analizy ilościowe częstych wad serca oraz analiza jakościowa zagęszczenia mięśnia sercowego, powszechny fenotyp prekursorowy niektórych typów choroby niedokrwiennej serca.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie zwierzęta wykorzystane w eksperymentach opisanych w niniejszej pracy były traktowane zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami opracowanymi przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Stanowego w Michigan.

1. Kontrolowane kojarzenie myszy C57BL6/J w celu pozyskania zarodków

  1. Gdy myszy osiągną wiek rozrodczy (6-8 tygodni), umieść je razem w systemie hodowli haremowej (tj. dwie samice na jednego samca). Rozpocznij proces kojarzenia po południu lub wieczorem.
    UWAGA: Myszy często kopulują w ciągu 1 h po zgaszeniu świateł w pomieszczeniu hodowlanym. Samice powinny zostać wycofane z rozrodu w wieku około 6-8 miesięcy, a samców nie należy wykorzystywać powyżej 12 miesiąca życia.
  2. W przypadku zastosowania metody ważenia w celu ustalenia zapłodnienia, kojarz myszy w dużych grupach, ponieważ metoda ta powoduje, że kontrolowane kojarzenie przebiega wolniej niż w metodach, w których monitoruje się jedynie obecność czopów kopulacyjnych.
  3. Następnego ranka, między godziną 8:0 a 12:0, sprawdź obecność czopów kopulacyjnych. Upewnij się, że badanie jest przeprowadzane w odpowiednim czasie. Jeśli analiza czopów zostanie wykonana przed 8:00, istnieje ryzyko, że czop znajduje się zbyt głęboko w kanale pochwy, aby go zauważyć. Jeśli analiza zostanie wykonana po godzinie 12:00, istnieje ryzyko, że czop już wypadł.
    1. Chwyć samicę za nasadę ogona i zbadaj otwór kanału pochwy za pomocą końcówki mikropipety. Czop kopulacyjny wygląda jak bariera śluzowa (Rysunek 1A), co w niektórych przypadkach może być trudne do zauważenia. Obecność strupów również wskazuje na obecność lub wcześniejsze występowanie czopa kopulacyjnego. Jeśli bariera śluzowa nie jest widoczna (Rysunek 1B), samica prawdopodobnie nie kopulowała lub czop kopulacyjny już wypadł.
    2. Dzień kopulacji oznacz jako e0.5.
      UWAGA: U myszy C57BL6/J czopy kopulacyjne mogą być trudne do zidentyfikowania. Zdarza się zatem, że myszy kopulowały, mimo że nie zaobserwowano czopa. Kopulacja nie zawsze prowadzi do zapłodnienia, co zdarza się częściej u myszy C57BL6/J. Dlatego należy monitorować przyrost masy ciała, aby potwierdzić ciążę (patrz krok 1.4). Ważenie pomaga zidentyfikować ciężarne samice i potwierdzić, że obecność czopów doprowadziła do zapłodnienia. Należy zachować ostrożność przy kojarzeniu samic przez kolejne noce. Jeśli zaobserwowano, że konkretny samiec skutecznie wytwarza czopy kopulacyjne, można go wykorzystać do kojarzenia przez kolejne noce z tą samą samicą.
    3. Należy pamiętać, że szanse na ciążę są wyższe u myszy, które są sprawdzonymi rozpłodnikami, ponieważ wcześniej udało im się uzyskać potomstwo. Aby zwiększyć szansę na posiadanie sprawdzonych rozpłodników, wykorzystywane samce nie powinny być zbyt stare.
  4. Po analizie czopów zważ samice. Ponowne ważenie powinno nastąpić po 7-10 dniach. Jeśli przyrost masy ciała przekracza 1,73 g, mysz jest prawdopodobnie w ciąży20. Jeśli przyrost masy ciała jest mniejszy niż 1,73 g, prawdopodobnie nie jest on związany z ciążą i mysz powinna zostać ponownie włączona do populacji rozrodczej.
    UWAGA: Myszy C57BL6/J dają małe mioty (średnio od pięciu do sześciu embrionów). Metody ważenia w celu ustalenia ciąży są dokładne w większości przypadków. Stosowanie tej metody wiąże się z 12,8% odsetkiem wyników fałszywie dodatnich i wykluczeniem 3% samic, które są faktycznie w ciąży20. Jeśli badacz obawia się, że pożądany czas gestacji jest późniejszy, należy przejść do kroku 1.5
  5. Opcjonalnie: W dniu planowanej sekcji upewnij się poprzez badanie fizykalne, że ciąża postępuje. Chwyć samicę za nasadę ogona i wyprostuj jej ciało. Najłatwiej zrobić to, kładąc mysz na nadgarstku i delikatnie pociągając za nasadę ogona. Jeśli samica jest w ciąży, prawdopodobnie pojawi się przyrost masy w dolnej części tułowia, widoczny jako małe grudki.
    UWAGA: Ciążę można wyczuć już w dniu e12.5, a w większości przypadków jest ona wyczuwalna do e14.5. Myszy C57BL6/J mają małe mioty, dlatego samica może być w ciąży nawet przy braku widocznych oznak fizycznych.

2. Disekcja samic i embrionów w celu wyizolowania serca

  1. Przed rozpoczęciem sekcji przygotować następujące roztwory w temperaturze pokojowej.
    1. Rozpuścić kwas etylendiaminotetraoctowy (EDTA) w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) do stężenia 0,5 mM.
      UWAGA: Po przygotowaniu zaleca się przechowywać roztwór na lodzie i stosować wyłącznie w temperaturze 4 °C. W przypadku ryzyka zanieczyszczenia roztwór należy poddać autoklawowaniu przed użyciem.
    2. Rozpuścić paraformaldehyd (PFA) w PBS do stężenia 4%.
      UWAGA: Po przygotowaniu zaleca się przechowywać roztwór na lodzie i stosować wyłącznie w temperaturze 4 °C. Do długotrwałego przechowywania przechowywać w temperaturze 4 °C lub niższej. Stężenie roztworu PFA może się różnić w zależności od dalszych zastosowań próbek tkanek. Przedstawione stężenie jest stosowane do barwienia hematoksyliną i eozyną, immunohistochemii oraz barwienia immunofluorescencyjnego.
  2. Gdy samica osiągnie pożądany etap rozwoju płodowego, mysz należy poddać eutanazji o odpowiedniej porze dnia, zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi dotyczącymi wykorzystania zwierząt. Jeśli czas określono w połowie dnia (np. e15,5), eutanazję należy przeprowadzić w pobliżu godziny 12:0. Jeśli czas określono w pełnych dniach (np. e15,0), eutanazję należy przeprowadzić w pobliżu godziny 00:0.
    UWAGA: Przyjmuje się, że zapłodnienie następuje w okolicy północy w noc kojarzenia myszy. Trudno jest jednak określić dokładny czas zapłodnienia. Z tego powodu czas rozwoju jest szacunkowy, a nie precyzyjny.
  3. Po unieruchomieniu czterech kończyn szpilkami, ostrożnie wykonać nacięcie w kształcie litery I wzdłuż tułowia, zaczynając od okolic cewki moczowej w górę w stronę mostka.
  4. Macica prawdopodobnie znajduje się tuż nad regionem miednicy. Macica myszy ma kształt litery Y, w związku z czym prawdopodobnie będzie bardzo długa i owinięta wokół tułowia. Usunąć ją, delikatnie ją podnosząc. Należy to zrobić, używając boków precyzyjnej pęsety ruchem czerpiącym. Powierzchowne tkanki macicy można bardzo ostrożnie chwycić końcówkami precyzyjnej pęsety podczas początkowego wyciągania macicy. Użyć nożyczek, aby odciąć macicę od ciała.
    UWAGA: Mając na uwadze nietypowy kształt litery Y macicy, należy upewnić się, że została usunięta w całości.
  5. Zanurzyć macicę w lodowatym PBS. Unieruchomić jeden koniec macicy szpilką i rozprostować ją w linii prostej.
  6. Przeciąć macicę na sekcje, tak aby każda sekcja zawierała osobny embrion. Delikatnie wyciągnąć embrion precyzyjną pęsetą. Najłatwiej zrobić to, trzymając po jednej pęsecie w każdej dłoni. Po wyjęciu natychmiast umieścić embrion w nowej płytce Petriego wypełnionej roztworem PBS-EDTA w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Można również użyć zwykłego roztworu PBS, jednak EDTA zapobiega koagulacji w próbkach.
  7. Określić stadium rozwoju embrionów zgodnie z metodą Theiler Staging21. Ponieważ stadium może się różnić między embrionami z jednego miotu, należy ocenić każdy embrion z osobna.
    UWAGA: Może to również pozwolić na wczesne wykrycie możliwych wrodzonych wad serca u embrionów. Typowo objawy wrodzonej wady serca można zaobserwować w morfologii embrionalnej. Mogą być obecne inne główne wady często związane z określonymi schorzeniami serca.
  8. Serce można usunąć na kilka sposobów, w zależności od wieku embrionu.
    UWAGA: Jeśli nie jest jasne, czy trakt wywodzi zostanie zachowany w nienaruszonej formie podczas usuwania, należy usunąć więcej tkanek niż tylko samo serce (zachowując nienaruszony trakt wywodzi i minimalizując bezpośredni kontakt między sercem a pęsetą) lub przeanalizować cały embrion.
    1. Używając mikroskopu sekcyjnego i dwóch par precyzyjnych pęset, ułożyć embrion na plecach i ustabilizować dostęp do klatki piersiowej. Można to zrobić, unieruchamiając kończyny pęsetami lub usuwając je i utrzymując tułów w pozycji.
    2. Używając ostrego końca drugiej precyzyjnej pęsety, wykonać nacięcie wzdłuż mostka embrionu i przedłużyć je między obojczykami aż do pępka. Należy zacząć od bardzo drobnych i powierzchownych nacięć, stopniowo przesuwając się ku wnętrzu jamy klatki piersiowej. Serce powinno stać się ledwo widoczne. Nie wolno dotykać go pęsetą podczas tych powierzchownych nacięć.
    3. Otworzyć klatkę piersiową, używając pierwszej pary pęset, aby delikatnie ścisnąć tułów embrionu, nieco za klatką piersiową (strona grzbietowa). Serce powinno wysunąć się lub stać się widoczne. Wyjęcie serca może wymagać delikatnego wspomagania. Należy używać boku pęsety, dbając o to, aby ostrze pęsety nigdy nie miało kontaktu z sercem. Aby utrzymać czystość pola roboczego i pęset, należy trzymać w pobliżu ściereczkę niepozostawiającą włókien.
    4. Delikatnie chwycić naczynia krwionośne płuc bokami pęsety, dbając o to, aby nie przerwać tkanki, i wyciągnąć serce z jamy klatki piersiowej. Następnie oczyścić serce.
      UWAGA: W przypadku embrionów e13,5 i młodszych serce jest pokryte osierdziem. Musi ono zostać usunięte, aby dotrzeć do serca.
  9. Używając stereomikroskopu, wykonać zdjęcie serca do późniejszego odniesienia.
  10. Płukać serca w roztworze PBS-EDTA przez 1-2 min, a następnie umieścić je w 4% roztworze PFA na około 45-60 min w celu ich utrwalenia. W przypadku chęci analizy całego embrionu, namoczyć przez noc. Objętość roztworu PFA powinna być 5-6x większa od objętości utrwalanej tkanki.
    UWAGA: Ten czas inkubacji może się różnić w zależności od późniejszych badań. Ten czas inkubacji jest stosowany do barwienia hematoksyliną i eozyną, immunohistochemii oraz barwienia immunofluorescencyjnego.
  11. Przemyć 3x przez 5-10 min roztworem PBS-glicyna i ponownie umieścić w PBS. Aby zminimalizować wzrost bakterii i zachować nienaruszone tkanki, można dodać azydku sodu lub penicylinę/streptomycynę. Serca można teraz przechowywać krótko w temperaturze 4 °C.

3. Przygotowanie tkanki

UWAGA: Tkanki można przygotować stosując zatapianie w OCT (optimal cutting temperature) lub zatapianie w parafinie. Obie metody mają swoje zalety i wady, dlatego przy wyborze metody zatapiania należy wziąć pod uwagę cel analizy.

  1. Zatapianie w OCT
    UWAGA: Metoda ta może być preferowana w stosunku do zatapiania w formalinie/parafinie, ponieważ mroźne skrawki zachowują reaktywność antygenową, mogą być nadal wykorzystywane do barwienia hematoksyliną i eozyną oraz pozwalają na szybsze uzyskanie przekrojów.
    1. Przygotować roztwór sacharozy rozpuszczonej w PBS o stężeniu 30% (w/v).
    2. Przenieść tkanki do nowej probówki stożkowej 15 mL lub probówki do mikrowirówki 1,5 mL zawierającej PBS z 30% sacharozą. Początkowo tkanka będzie unosić się na powierzchni.
    3. Przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C. Tkanka będzie gotowa do zatapiania w OCT, gdy opadnie na dno probówki, co zazwyczaj zajmuje od 24 do 40 h.
      UWAGA: Tkanki mięśniowe ulegają znacznemu uszkodzeniu podczas cykli zamrażania i rozmrażania, tracąc swoją natywną morfologię. Sacharoza jest wchłaniana przez tkankę i działa jako czynnik krioprotekcyjny, który pozwala na lepsze zachowanie morfologii. Należy upewnić się, że w probówce znajduje się wystarczająca ilość roztworu, aby można było odpowiednio monitorować opadanie tkanek. PBS z sacharozą łatwo ulega zanieczyszczeniu bakteriami, dlatego należy często sprawdzać roztwór pod kątem zmętnienia, które wskazuje na przerost grzybów lub bakterii. Aby zminimalizować ryzyko kontaminacji, do roztworu PBS-sacharozy można dodać penicylinę/streptomycynę lub azydku sodu.
    4. Wyjąć serca pipetą Pasteura, upewniając się, że otwór pipety jest wystarczająco szeroki, aby nie rozerwać tkanki. W razie potrzeby odciąć końcówkę pipety nożyczkami. W przypadku pracy z całymi embrionami użyć pęsety do wyjęcia próbki.
      UWAGA: Czynność tę należy wykonywać delikatnie. Nawet jeśli otwór pipety jest wystarczająco szeroki, aby wyjąć serca, krawędzie pipety mogą nadal rozerwać tkanki. Pęseta może wgniatać próbki tkankowe, jeśli jest używana zbyt agresywnie.
    5. Pozostawić tkankę przez krótką chwilę do wyschnięcia na chłonnej ściereczce niepozostawiającej włókien. Umieścić próbkę w formie OCT w pożądanej płaszczyźnie cięcia (np. strzałkowej, poprzecznej, czołowej). Dodać preparat OCT, aż próbka zostanie całkowicie zanurzona, upewniając się, że w kontakcie z tkanką nie ma pęcherzyków powietrza.
    6. Przechowywać formę w temperaturze -20 °C przez noc lub kilka dni, a następnie przenieść ją do -80 °C. Po 24 h forma jest gotowa do mroźnego skrawania. Tkanki w tej formie mogą być przechowywane długoterminowo.
  2. Zatapianie w parafinie
    1. Za pomocą etanolu odwodnić tkanki w następującej kolejności: etanol 50% przez 10 min, etanol 70% przez 10 min, etanol 80% przez 10 min, etanol 95% przez 10 min, etanol 100% przez 10 min (powtórzyć 3x).
    2. Namoczyć tkanki w serii roztworów etanol/ksylen w następującej kolejności: roztwór etanol/ksylen 2:1 przez 10-15 min, roztwór etanol/ksylen 1:1 przez 10-15 min, roztwór etanol/ksylen 1:2 przez 10-15 min, ksylen 10% przez 10-15 min (powtórzyć 3x).
    3. Aby zastąpić ksylen parafiną, namoczyć tkanki w piecu próżniowym (ustawionym na 54-58 °C) w następującej kolejności: roztwór ksylen/parafina 2:1 przez 30 min, roztwór ksylen/parafina 1:1 przez 30 min, roztwór ksylen/parafina 1:2 przez 30 min, parafina 10% przez 1-2 h, parafina 100% przez 1-2 h lub przez noc.
      UWAGA: Podgrzewanie tkanek powyżej 60 °C przez dłuższy czas spowoduje degradację polimerów parafiny i sprawi, że tkanka stanie się krucha.
    4. Używając świeżej parafiny, zatopić tkanki w pożądanej pozycji.

4. Cięcie kriotomem tkanek zatopionych w OCT

  1. W kriostacie umieść wszystkie próbki na minimum 1 h, jeśli były one wcześniej przechowywane w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Próbki powinny tam pozostać do czasu zebrania wszystkich sekcji.
  2. Upewnij się, że kriostat jest ustawiony na odpowiednie temperatury. Temperatura otoczenia wewnątrz komory kriostatu powinna wynosić około -20 °C, a ramię kriostatu około -24 °C.
    UWAGA: Temperatura ta może się różnić w zależności od tego, jak blok reaguje na krojenie. Jeśli problemem jest nierówne krojenie, można obniżyć temperaturę otoczenia.
  3. Wyjmij blok OCT z formy, pociągając za krawędzie otwartej strony formy, aby go poluzować, a następnie ściskając blok na zamkniętym końcu, gdzie forma się zwęża.
  4. Aby zamocować blok OCT, nałóż OCT o temperaturze pokojowej na uchwyt (chuck), zaczynając od środka i kierując się ku krawędzi. Nie ma potrzeby pokrywania całego uchwytu.
  5. Umieść blok OCT (patrz krok 3.1) na formie. Krawędź bloku, która przylegała do zamkniętej strony formy, powinna być skierowana ku górze na uchwycie. Pozostaw OCT na uchwycie do zamrożenia, aż stanie się nieprzezroczysty i biały, co zajmuje około 5-10 min.
  6. Umieść uchwyt na ramieniu na kolejne 5-10 min, aby blok osiągnął temperaturę ramienia. Aby uzyskać równoległy przekrój, dostosuj ramię tak, aby krawędź bloku była równoległa do stołu, a odległość między stołem a dolną krawędzią bloku była taka sama, jak między stołem a górną krawędzią bloku.
  7. Włóż ostrze i dostosuj odległość bloku od ostrza, aby wykonać sekcje.
  8. Wykonuj przekroje o grubości 10 µm. Kontynuuj krojenie, aż do osiągnięcia punktu zainteresowania, robiąc to ręcznie lub korzystając z funkcji przycinania (trim).
  9. Do zbierania przekrojów użyj małego płaskiego pędzla oraz pędzla do detali. Gdy zacznie być wycinana forma, użyj płaskiego pędzla, aby delikatnie przyciągnąć przekrój do podstawy. Podczas wycinania próbki ruch musi być ciągły i bez przerw, choć prędkość może zależeć od twardości próbki.
  10. Podczas krojenia używaj płaskiego pędzla do delikatnego prowadzenia powstającego przekroju. Na tym etapie przekrój nie musi przylegać ściśle do stołu; pozwól mu lekko wybrzuszyć, aby uniknąć rozdarć lub naciągnięć, które mogłyby wpłynąć na histologię.
    UWAGA: Przy krojeniu całych embrionów ta część może być szczególnie trudna, zwłaszcza przy zmianie typów tkanek. Upewnij się, że przekroje są wykonywane bez przerw i że pędzel nie naciąga przekrojów zbyt agresywnie. Przy zmianie typów tkanek przekrój może pękać, dlatego kluczowe jest utrzymanie niskiej temperatury. Jeśli pękanie jest problemem, obniż temperaturę lub zwiększ grubość próbki.
  11. Zatrzymaj ruch bloku, gdy próbka zostanie całkowicie przecięta, ale przekrój nie jest jeszcze oddzielony od bloku. Nie odsuwając płaskiego pędzla od przekroju, użyj pędzla do detali, aby asekuracyjnie dociśnąć przekrój, sprawić, by był płaski i zamarzł na stole.
  12. Przytrzymaj przekrój w tej pozycji przez ~10 s, zanim usuniesz pędzel do detali i zakończysz pobieranie sekcji. Użyj obu pędzli, aby delikatnie spłaszczyć przekrój na stole, zapobiec jego zwijaniu i przytrzymać go przy stole przez ~20-30 s.
  13. Odwróć przekrój i ponownie spłaszcz go na stole. Przesuń naelektryzowane slidy wystarczająco blisko, aby przekrój został przyciągnięty i przywarł do slajdu, bez konieczności dotykania slajdem do stołu. Opisz slajdy ołówkiem.
  14. Przechowuj slajdy w szczelnym pudełku, aby chronić tkanki przed osadzaniem się lodu podczas przechowywania. W przypadku przechowywania krótkoterminowego slajdy należy trzymać w temperaturze -20 °C przed barwieniem. Do długoterminowego przechowywania używaj temperatury -80 °C.

5. Cięcie mikrotomem tkanek zatopionych w parafinie

  1. Przed przystąpieniem do krojenia umieścić bloki na lodzie w celu schłodzenia próbek. Schłodzona parafina jest łatwiejsza do cięcia, co pozwala na uzyskanie cieńszych skrawków.
  2. Przygotować kąpiel wodną o temperaturze 40-45 °C, używając wody ultraczystej.
  3. Zamontować nóż w uchwycie mikrotomu. Upewnić się, że jest stabilnie zamocowany, a następnie ustawić kąt prześwitu. Należy zweryfikować poprawność kąta prześwitu zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Umieścić blok parafiny w mikrotomie. Upewnić się, że jest on odpowiednio zorientowany, tak aby nóż przecinał blok prostopadle.
  5. Wykonując kilka wstępnych cięć, upewnić się, że nóż jest prawidłowo ustawiony względem bloku. Należy robić to ostrożnie, aby umożliwić ewentualną korektę.
  6. Przycinać blok, aż do momentu osiągnięcia obszaru zainteresowania.
  7. Wykonować skrawki o pożądanej grubości. Należy wziąć pod uwagę, że pierwsze kilka skrawków prawdopodobnie zostanie odrzuconych.
  8. Pobrać skrawki i za pomocą pęsety przenieść je do kąpieli wodnej. Powoduje to rozprostowanie się tkanek. Używać pęsety do ich wyrównania w razie potrzeby.
  9. Zbliżyć naładowane elektrostatycznie szkiełko tak, aby skrawka przyciągnęło i przywarło do powierzchni. Opisać szkiełka ołówkiem.
  10. Umieścić wszystkie zebrane szkiełka w kasecie. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia na noc w temperaturze 37 °C.

6. Deparafinizacja tkanek

  1. Przemyj preparaty w następującej kolejności: 3 min w ksylenie (2x), 3 min w roztworze ksylenu i 10% etanolu w stosunku 1:1, 3 min w 10% etanolu (2x), 3 min w 95% etanolu, 3 min w 70% etanolu, 3 min w 50% etanolu.

7. Barwienie hematoksyliną i eosiną

  1. Przygotowanie preparatów do barwienia.
    1. W przypadku tkanek przygotowanych w OCT, należy je moczyć w wodzie destylowanej przez ok. 4 min, aż OCT zostanie rozpuszczony, a następnie pozostawić do wyschnięcia.
    2. W przypadku tkanek zatopionych w parafinie, należy je poddać deparafinizacji. Patrz krok 6.1.
  2. Umieścić preparat w przefiltrowanej 0,1% hematoksylinie na 10 min. Przenieść preparat do wody destylowanej, wymieniając wodę raz natychmiast, a następnie ponownie po 3 min.
  3. Umieścić preparat w 0,5% eozynie na 10 s lub zanurzyć 12 razy. Płukać preparat w wodzie destylowanej do momentu, aż eozyna przestanie zostawiać smugi, co wymaga około 2-3 zanurzeń.
  4. Odwodnić preparat, mocząc go kolejno w: 50% etanolu przez 10 s, 75% etanolu przez 10 s, 95% etanolu przez 30 s i 10% etanolu przez 1 min. Zanurzać w ksylenie, aż ksylen będzie spływał gładko, ok. 5-7 zanurzeń.
  5. Pozwolić ksylenowi odparować, a następnie zamontować preparat, używając szybkoschnącego medium montażowego o współczynniku załamania światła zbliżonym do szkła.

8. Analiza jakościowa pospolitych wad serca

  1. Wykonaj zdjęcia wszystkich próbek za pomocą mikroskopu odwróconego lub stereoskopowego oraz odpowiedniej kamery. Należy wykonać obrazy makroskopowe i mikroskopowe, w zależności od analizowanych typów wad. Obrazy makroskopowe mogą być wykonane przy dowolnym powiększeniu poniżej 10x. Obrazy mikroskopowe powinny być wykonane przy powiększeniu 40x lub większym. Zdjęcia zamieszczone w niniejszej pracy wykonano przy powiększeniu 5x za pomocą mikroskopu stereoskopowego oraz przy powiększeniu 40x za pomocą obiektywu powietrznego (apertura numeryczna soczewki N.A. 0,5) w mikroskopie odwróconym.
    UWAGA: Obrazy makroskopowe stanowią dobry punkt wyjścia, ponieważ zapewniają widok całego serca (Rysunek 3). Po zidentyfikowaniu wzorców można skupić się na konkretnych obszarach i poddać je dalszej analizie.
  2. Ustaw wszystkie obrazy obok siebie na ekranie komputera. Zdjęcia próbek kontrolnych umieść po jednej stronie ekranu, a zdjęcia próbek eksperymentalnych po drugiej stronie. Najlepiej analizować jedną grupę traktowanej po raz jeden.
  3. Poszukaj różnic w fenotypach między grupami traktowanymi, zaczynając od kluczowych obszarów, w których najczęściej występują wady serca. Sposób analizy będzie zależeć od tego, czy obrazy są makroskopowe, przedstawiające ogólną anatomię serca, czy mikroskopowe, przedstawiające anatomię mikroskopową tkanki serca.
  4. Rozpocznij poszukiwanie powszechnych makroskopowych wad serca, takich jak ubytki w przegrodzie międzykomorowej (Rysunek 2A), ubytki w przegrodzie międzyprzedsionkowej (Rysunek 2B) oraz otwarcieماtusa tętniczego (Rysunek 2C). Wszystkie te wady są najlepiej widoczne w przekroju poprzecznym serca.
  5. Aby zidentyfikować ubytki w przegrodach, rozważ analizę wielu przekrojów, ponieważ mogą one być widoczne w jednej płaszczyźnie tkanki, a nie w drugiej.
    UWAGA: Czasami wadą nie jest brak przegrody, lecz otwór w przegrodzie. Należy zatem uważać, aby nie pomylić rozdarcia z ubytkiem w przegrodzie. Analiza spójności między sąsiednimi przekrojami w konkretnym obszarze pozwala potwierdzić, czy jest to rzeczywiście wada, czy rozdarcie powstałe podczas krojenia.
  6. Aby zidentyfikować wady w drodze odpływu, takie jak otwarcie ductus arteriosus, wykorzystaj wiele przekrojów, aby śledzić główne naczynia krwionośne opuszczające serce. Stwórz schemat rozmieszczenia głównych naczyń krwionośnych względem siebie. Przykład przedstawiono na Rysunku 2C.
    UWAGA: Niektóre nieprawidłowości mogą wynikać z etapu rozwoju embrionu (np. ductus arteriosus zamyka się po narodzinach, krótko po urodzeniu; przegroda międzykomorowa nie zamyka się całkowicie aż do ok. e14.5). Inne powszechne makroskopowe wady serca, które nie zostały uwzględnione na rysunkach, to trwały wspólny pień tętniczy, który najłatwiej wykryć w e16.5 i później; podwójny odpływ z prawej komory (DORV), który można wykryć w przekrojach, w których serce przechodzi w drogę odpływu, oraz aortalna jazda nadgrzbietowa2. Powszechną mikroskopową wadą serca jest zmniejszona kompakcja mięśnia (Rysunek 4).

9. Ilościowa analiza zagęszczenia mięśnia sercowego z wykorzystaniem tkanek barwionych hematoksyliną i eozyną

  1. Wykorzystując widok makroskopowy barwionych próbek tkanek (Rysunek 4A), zidentyfikuj obszar zainteresowania do obrazowania przy powiększeniu 40x (Rysunek 4B). W niniejszej pracy wykorzystano ścianę lewej komory. Obraz należy zapisać w żądanym formacie. W niniejszej pracy obrazy zapisano w formacie plików .tif.
  2. Otwórz obraz w oprogramowaniu ImageJ.
  3. Ustaw obraz w formacie 8-bitowym. Pozwoli to na zastosowanie narzędzia progowania w kolejnym kroku.23,24Aby to zrobić, wybierz „Obraz | Typ | 8-bitowy".
  4. Ustaw próg zdjęcia. Celem tego kroku jest zaznaczenie wyłącznie pikseli reprezentujących tło, z wyłączeniem pikseli reprezentujących tkanki.23,24.
    UWAGA: Ta powierzchnia zostanie odjęta w późniejszym etapie. Odpowiednio dobrany próg pozwoli na zaznaczenie pikseli, które badacz chce wykluczyć z powierzchni tkanki mięśniowej. W związku z tym wynik końcowy powinien przedstawiać tkankę w skali szarości, natomiast zaznaczone powinno pozostać tło.
    1. Kliknij „ImageJ | Obraz | Regulacja | PrógPrzesuń górny pasek, aby dostosować wartości progowe. Po zaznaczeniu pożądanych obszarów zamknij okno regulacji progów, nie wprowadzając żadnych innych zmian.21.
  5. Użyj Zaznaczanie wielokątami narzędzie do zaznaczenia obszaru zajmowanego przez tkankę. Należy starannie upewnić się, że obrysy pokrywają się z krawędziami tkanki, ponieważ niedokładne zaznaczenie doprowadzi do uzyskania błędnych pomiarów.
  6. Skonfiguruj ustawienia pomiaru w programie ImageJ w taki sposób, aby oprogramowanie mierzyło powierzchnię wyłącznie tych pikseli, które zostały zaznaczone za pomocą narzędzia progowania (threshold) w kroku 9.4.23. "ImageJ | Analiza | Ustawienia pomiarów | Obszar i Ograniczenie do proguWybierz tylko Obszar i Ograniczenie do progu.
  7. Zmierz pole powierzchni zaznaczonych pikseli.ImageJ | Analiza | PomiarWartość ta reprezentuje powierzchnię przestrzeni negatywnej.
  8. Zmierz pole powierzchni całego obszaru zainteresowania. Jest to obszar, który został wybrany za pomocą Zaznaczenia wielokątne narzędzieImage J | Analiza | Ustawienia pomiarów | ObszarWybierz tylko Obszar i odznacz Ograniczenie do wartości progowejNastępnie przeprowadź pomiar, wybierając „Image J | Analiza | Pomiar".
  9. Oblicz pole powierzchni zajmowanej przez właściwą tkankę mięśniową w obrębie obszaru zainteresowania. Od pole powierzchni całego obszaru zainteresowania odejmij pole powierzchni przestrzeni negatywnej. Otrzymana wartość stanowi pole powierzchni tkanki mięśniowej.
  10. Oblicz wskaźnik zagęszczenia mięśni (Muscle Compaction Index, MCI). Podziel pole powierzchni tkanki mięśniowej przez pole powierzchni obszaru zainteresowania.
    Równanie wskaźnika zagęszczenia mięśni, MCI = Pole powierzchni tkanki mięśniowej/Pole powierzchni obszaru zainteresowania, schemat.
    Im wyższa wartość MCI, tym bardziej zwarty jest mięsień. Wartości MCI te mogą być następnie wykorzystane w analizie statystycznej w celu zbadania istotnych zmian w zwartości mięśni pomiędzy grupami badawczymi (Rycina 4C).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wskaźnik zagęszczenia mięśni porównano pomiędzy sercami rozwijającymi się w dwóch różnych środowiskach: grupie kontrolnej i eksperymentalnej. Protokoły te wykorzystano do ilościowej analizy zagęszczenia tkanki mięśniowej, co umożliwiło przeprowadzenie analizy statystycznej. Wykazano, że zagęszczenie mięśni było znacznie mniejsze w sercach eksperymentalnych w porównaniu z embrionami rozwijającymi się w warunkach nieeksperymentalnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W protokole tym omówiono techniki związane z analizą rozwoju serca w sercach embrionalnych. Niektóre ograniczenia tej metody to wymagana sprawność fizyczna dla technik przygotowawczych, która może wymagać praktyki, oraz umiejętności obrazowania mikroskopowego. Jeśli plastry uzyskane w kriostacie są niechlujne, barwienie hematoksyliną i eozyną nie będzie wyraźne lub jeśli obrazy wykonane pod mikroskopem mają słabe oświetlenie, wówczas metoda zastosowana w przypadku ImageJ nie zadziała. Ograniczeniem funkcji progu w oprogr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych ujawnień do przekazania.

Podziękowania

Laboratorium Aguirre jest wspierane przez National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health pod numerem nagrody K01HL135464 oraz przez American Heart Association pod numerem nagrody 19IPLOI34660342.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka stożkowa 15 mLFisherScientific# 1495970C
C57BL/6J MyszyJackson LabsC57BL/6J - stockowe
Coplin (x6)VWR Scientific# 25457-006
Szkiełka nakrywkowe 24X50MM #1.5VWR Scientific# 48393-241
Kriostat - Leica CM3050SLeicaN/A
Naczynia preparacyjneFisher Scientific# 50930381
Dumont # 5 - Drobne kleszcze (x2)Narzędzia do naukiprecyzyjnej# 11254-20
Roztwór eozyny YMillipore Sigma# HT110116-500ML
Alkohol etylowy (czysty, 200 dowodów)Fisher Scientific# BP2818-500
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Millipore Sigma# E9884-100G
EukittMillipore Sigma# 03989-100ML
Cienkie nożyczkiNarzędzia naukowe14060-10
Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy Leica M165 FCLeicaN/A
GlicynaMillipore Sigma# 410225-250G
Kleszcze GraefeNarzędzia naukowe11052-10
Oprogramowanie Graphpad Prism 8Oprogramowanie Graphpad
ImageJImageJ
KimwipesFisher Scientific# 06666A
MayeraMillipore Sigma# MHS16-500ML
Końcówka do mikropipet - p200Fisher Scientific# 02707448
OprogramowanieMicrosoft ExcelZwiązek Microsoft
OCTVWR Scientific# 102094-106
Mikroskop Olympus CkX53Pędzle
(co najmniej 2)
ParaformaldehydVWR Scientific# 0215014601 Zrobićna 4% roztwór (rozpuszczony w PBS)
Pipeta(y) PasteuraFisherScientific# 13-711-7M
Penicylina-StreptomycynaThermoFisher Scientific# 15140122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)ThermoFisher Scientific# 70011044Rozcieńczyć od 10x do 1x przed użyciem
WagaMettler Toledo# Waga MS1602TS
WagaMettler ToledoMS105
#3VWR Scientific# 10161-918
Ostrza skalpelaVWR Scientific# 21909-612
Forma kwadratowaVWR Scientific# 100500-224Do form OCT
Milipor sacharozySigma# S9378-500G
Prowadnice Superfrost PlusFisher Scientific# 1255015
Nożyczki chirurgiczneNarzędzia do naukiprecyzyjnej # 14002-14
Tissue-Tek Accu-Edge Jednorazowe ostrza do mikrotomówVWR Scientific# 25608-964
Waga podróżnaAcculabVIC 5101
KsylenMillipore Sigma214736-1L
słoiki do barwienia 000664 # # Roztwór hematoksyliny malarskie Olympus # Rękojeść do skalpela

Bibliografia

  1. Kathiresan, S., Srivastava, D. Genetics of human cardiovascular disease. Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).
  2. Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments. Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).
  3. Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
  4. Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: The glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
  5. Pelech, A. N., Broeckel, U. Toward the etiologies of congenital heart diseases. Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).
  6. Zaidi, S., Brueckner, M. Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease. Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).
  7. Kenny, L. A., et al. Transplantation in the single ventricle population. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 152-159 (2018).
  8. Navaratnam, D., et al. Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation. The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).
  9. De Leval, M. R., Deanfield, J. E. Four decades of Fontan palliation. Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).
  10. Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).
  11. Jenkins, K. J., et al. Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge - A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young. Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).
  12. Botto, L. D., et al. Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study. Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).
  13. Knowles, R. L., et al. Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects. Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).
  14. Feng, Y., et al. Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies. Scientific Reports. 17 (5), 8506(2015).
  15. Rhinn, M., Dolle, P. Retinoic acid signalling during development. Development. 139 (5), 843-858 (2012).
  16. Liu, Y., et al. Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (February), 2015(2016).
  17. Kurian, L., et al. Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development. Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).
  18. Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond. Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).
  19. Srivastava, D. Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis. Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).
  20. Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
  21. Baldock, R., Bard, J., Davidson, D. Stage Definition. , https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html (1998).
  22. Newbern, J., et al. Mouse and human phenotypes indicate a critical conserved role for ERK2 signaling in neural crest development. , http://www.pnas.org/cgi/content/full (2008).
  23. Carleton College. Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center. , https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html (2017).
  24. Reinking, L. Examples of Image Analysis Using ImageJ. , https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf (2007).
  25. MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness. IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).
  26. Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy. Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , Elsevier. 269-290 (2018).
  27. Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza tkanekizolacja sercakriosekcjonowaniekompakcja mi nifiksacja paraformaldehydemanaliza obrazuilo ciowa histomorfometria
Analiza wrodzonych wad serca w zarodkach myszy z wykorzystaniem jakościowych i ilościowych metod histologicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.