Artykuł metodologiczny

Ukierunkowane składanie białek podobnych do elastyny w zdefiniowane struktury supramolekularne i enkapsulacja ładunku in vitro

DOI:

10.3791/60935

⸱

8 kwietnia 2020

 ,  ,  ,  , 
1Center for Biological Systems Analysis, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg, 3Freiburg Institute for Advanced Studies (FRIAS), University of Freiburg, 4BIOSS Centre for Biological Signalling Studies, University of Freiburg, 5IMTEK Department of Microsystems Engineering, University of Freiburg, 6Cluster of Excellence livMatS at FIT - Freiburg Center for Interactive Materials and Bioinspired Technologies, University of Freiburg

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na styku rozpuszczalników organicznych i wodnych, dostosowane do potrzeb amfifilowe białka podobne do elastyny łączą się w złożone struktury supramolekularne, takie jak pęcherzyki, włókna i koacerwaty wywołane parametrami środowiskowymi. Opisane protokoły montażu pozwalają uzyskać kompartmenty oparte na błonach białkowych (PMBC) o przestrajalnych właściwościach, umożliwiające enkapsulację różnych ładunków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dopasowane białkowe bloki budulcowe są wszechstronnymi kandydatami do składania struktur supramolekularnych, takich jak minimalne komórki, nośniki leków i rusztowania enzymatyczne. Ze względu na ich biokompatybilność i możliwość dostrajania na poziomie genetycznym, białka podobne do elastyny (ELP) są idealnymi elementami budulcowymi do zastosowań biotechnologicznych i biomedycznych. Niemniej jednak składanie struktur supramolekularnych opartych na białkach o wyraźnych właściwościach fizykochemicznych i dobrym potencjale enkapsulacji pozostaje wyzwaniem.

Tutaj oferujemy dwa efektywne protokoły do samodzielnego montażu amfifilowych ELP w supramolekularne architektury białek, takie jak sferyczne koacerwaty, włókna i stabilne pęcherzyki. Przedstawione protokoły montażu generują kompartmenty białkowe oparte na błonach (PMBC) oparte na ELP o adaptacyjnych właściwościach fizykochemicznych. PMBC wykazują zachowanie separacji faz i ujawniają fuzję membranową zależną od metody oraz są w stanie hermetyzować chemicznie zróżnicowane fluorescencyjne cząsteczki ładunku. Powstałe w ten sposób PMBC mają duży potencjał aplikacyjny jako platforma do formułowania i dostarczania leków, sztuczna komórka i podzielona przestrzeń reakcyjna.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tworzenie struktur supramolekularnych do zastosowań biotechnologicznych staje się coraz ważniejsze1,2,3,4,5. W przypadku montażu funkcjonalnych architektur, takich jak koacerwaty, pęcherzyki i włókna o pożądanych właściwościach fizykochemicznych, ważne jest zrozumienie i kontrolowanie właściwości fizykochemicznych i konformacyjnych komponentów. Ze względu na molekularną precyzję cząsteczek występujących w przyrodzie, bloki budulcowe struktur supramolekularnych coraz częściej opierają się na lipidach, kwasach nukleinowych lub białkach. W porównaniu z polimerami syntetycznymi, białkowe bloki budulcowe pozwalają na precyzyjną kontrolę nad powstającymi strukturami supramolekularnymi6 na poziomie genetycznym. Sekwencja aminokwasów pierwszorzędowych (aa) poszczególnych bloków budulcowych białek wewnętrznie koduje informacje o ich potencjale składania od poziomu molekularnego do makroskopowego, a także o trójwymiarowym kształcie i właściwościach fizycznych końcowej struktury supramolekularnej7.

Zgłoszone metody składania różnych struktur supramolekularnych często obejmują białka amfifilowe, takie jak wrażliwe na temperaturę białka podobne do elastyny (ELP)5,8,9, rekombinowane oleozyny10 i sztuczne białka amfifile11. Metody wyzwalane temperaturą doprowadziły do złożenia miceli4,10,12, fibers13, sheets14 and vesicles9,15,16. Metody z użyciem rozpuszczalników organicznych zostały zastosowane do tworzenia dynamicznych pęcherzyków na bazie białek8,11,14. Do tej pory stosowane protokoły tworzenia pęcherzyków często nie miały kontroli nad zespołami o rozmiarach mikrometrów16,17 lub mają ograniczoną wydajność montażu5. Ponadto, niektóre zgłoszone pęcherzyki oparte na ELP mają upośledzony potencjał enkapsulacji12 lub ograniczoną stabilność w czasie9. Rozwiązując te wady, przedstawione protokoły umożliwiają samoorganizację struktur supramolekularnych o rozmiarach mikrometrowych i submikrometrowych o odrębnych właściwościach fizykochemicznych, dobrym potencjale enkapsulacji i długotrwałej stabilności. Dostosowane amfifilowe ELP łączą się w struktury supramolekularne, obejmujące zakres od sferycznych koacerwatów i wysoce uporządkowanych skręconych wiązek włókien do pęcherzyków jednowarstwowych, w zależności od zastosowanego protokołu i związanych z nim warunków środowiskowych. Duże pęcherzykowe przedziały białkowe oparte na błonie białkowej (PMBC) ujawniają wszystkie główne fenotypy, takie jak fuzja błonowa i separacja faz, analogiczne do liposomów. PMBC skutecznie hermetyzują chemicznie zróżnicowane fluorescencyjne cząsteczki ładunku, które można monitorować za pomocą prostej mikroskopii epifluorescencyjnej. Powtarzające się domeny ELP użyte w tym badaniu są atrakcyjnymi elementami budulcowymi dla architektur supramolekularnych opartych na białkach18. Wiadomo, że jednostka powtórzeń pentapeptydu ELP (VPGVG) toleruje różne aa oprócz proliny na czwartej pozycji (walina, V), zachowując przy tym swoje właściwości strukturalne i funkcjonalne19. Projekt amfifilowych ELP zawierających charakterystyczne domeny hydrofilowe i hydrofobowe został zrealizowany poprzez wstawienie reszt gościa aa (X) do powtórzenia VPGXG z wyraźną hydrofobowością, polarnością i ładunkiem20. Amfifilowe domeny ELP były wyposażone w hydrofobową fenyloalaninę (F) lub izoleucynę (I), podczas gdy domena hydrofilowa zawierała naładowany kwas glutaminowy (E) lub argininę (R) jako reszty gości. Listę kwalifikujących się amfifilowych konstruktów ELP i odpowiadających im sekwencji aa można znaleźć w informacjach uzupełniających i odniesieniach8,21. Wszystkie elementy składowe zostały wyposażone w małe barwniki fluorescencyjne lub białka fluorescencyjne do wizualizacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. mEGFP i inne białka fluorescencyjne zostały N-końcowo połączone z hydrofilowymi domenami amfifilów ELP. Barwniki organiczne sprzężono za pomocą cykloaddycji alkinowo-azydkowej promowanej przez szczep bez miedzi (SPAAC) do kotranslacyjnie wprowadzonego nienaturalnego aminokwasu (UAA). Jednoczesna inkorporacja para-azydofenyloalaniny UAA (pAzF)22 pozwala na N-końcową modyfikację hydrofilowej domeny ELP. W ten sposób jako sondę fluorescencyjną można użyć zielonego barwnika fluorescencyjnego BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) lub dowolnej małej cząsteczki fluorescencyjnej z naprężoną cyklooktyną. Pomyślne włączenie UAA pAzF i cykloaddycja barwnika za pomocą SPAAC może być łatwo potwierdzona za pomocą LC-MS/MS dzięki wydajnej jonizacji odpowiednich peptydów tryptycznych8. Ten mały barwnik organiczny został zastosowany w celu poszerzenia wyboru rozpuszczalników do protokołów składania, ponieważ białka fluorescencyjne są niekompatybilne z większością rozpuszczalników organicznych. Poniżej opisano dwa najbardziej efektywne protokoły składania struktur supramolekularnych opracowane w naszym laboratorium. Metoda pęcznienia THF jest kompatybilna tylko z amfifilowym ELP modyfikowanym barwnikiem organicznym. Natomiast metoda ekstruzji 1-butanolu (BuOH) jest kompatybilna z wieloma białkami jako sonda fluorescencyjna, np. mEGFP, ponieważ opisana metoda w pełni zachowuje fluorescencję tych białek fuzyjnych. Ponadto enkapsulacja małych cząsteczek i zachowanie fuzji pęcherzykowej działa najlepiej przy zastosowaniu metody ekstruzji BuOH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie i klonowanie amfifilowych białek elastynopodobnych (ELP)

  1. Sklonuj i zaprojektuj konstrukcje zgodnie z opisem w innym miejscu8,20. Plazmidy są dostępne na życzenie.

2. Ekspresja, oczyszczanie i przygotowanie białek

  1. Ekspresja F20E20-mEGFP i F20E20-mCherry
    1. Zaszczepić główną kulturę ekspresji z nocnej kultury wstępnej do OD600 0,3. Inkubować w temperaturze 37 °C, 200 obr./min w sterylnym 400 ml pożywki LB uzupełnionej odpowiednimi antybiotykami w kolbie o pojemności 2 l.
    2. Przygotować roztwór podstawowy IPTG (1 M) do indukcji kultury ekspresji w wodzie ultraczystej.
    3. Po osiągnięciu OD600 0,5–0,8 dodać IPTG do hodowli ekspresji do końcowego stężenia 1 mM i zmniejszyć temperaturę inkubacji do 20 °C. Pozostawić do odciągania w temperaturze 20 °C przez około 20 godzin przy 200 obr./min.
  2. Ekspresja amfifilowego ELP zawierającego UAA pAzF
    1. Inokulować główną kulturę ekspresji z nocnej hodowli wstępnej E. coli zawierającej dwa plazmidy pEVOL pAzF i np. pET28-NMBL-(TAG)R40F20-his do OD600 0,3 (patrz informacje uzupełniające dotyczące sekwencji aminokwasów). Inkubować w temperaturze 37 °C, 200 obr./min w sterylnym 400 ml pożywki LB uzupełnionej kanamycyną i chloramfenikolem w kolbie o pojemności 2 l.
    2. Przygotować 100 mM roztwór podstawowy pAzF w ultraczystej wodzie. Na 10 ml roztworu podstawowego pAzF odważyć 206,2 mg pAzF i ponownie zawiesić go w 8 ml ultraczystej wody. Aby rozpuścić pAzF, należy podnieść pH roztworu za pomocą 3 M NaOH i energicznie wymieszać. Po rozpuszczeniu pAzF ostrożnie obniż pH do 10,5 i dodaj ultraczystą wodę do końcowej objętości 10 ml. Użyć sterylnego filtra (0,22 μm) i poddzielić roztwór do probówek reakcyjnych o pojemności 2 ml.
    3. Przygotować 1 M roztwór podstawowy IPTG w wodzie ultraczystej i 20% roztwór podstawowy arabinozy w wodzie ultraczystej.
    4. Po osiągnięciu OD600 0,5–0,8 dodać pAzF do kultury ekspresji do końcowego stężenia 2 mM. Inkubować kulturę przez 10 minut, w temperaturze 37 °C, 200 obr./min, aby umożliwić wychwyt pAzF.
    5. Indukować ekspresję białka docelowego i ekspresję niezbędnej syntetazy tRNA/t-RNA poprzez jednoczesne dodawanie IPTG (1 mM) i arabinozy (2%) oraz obniżyć temperaturę inkubacji do 20 °C.
    6. Odciągać pokarm w temperaturze 20 °C przez około 20 godzin przy 200 obr./min. Kultura ekspresji zbiorów przez odwirowanie w temperaturze 4 °C, 4000 x g, 40 min.
  3. Liza komórek i oczyszczanie białek
    1. Zawiesić osad E. coli w buforze do lizy (10 ml na litr kultury; 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M mocznik, 0,25% Triton X-100) zawierający lizozym (0,1 mg / ml) i PMSF (0,1 mM). Inkubować przez 30 minut na lodzie, a następnie dwukrotnie zamrozić i rozmrozić, zanurzając próbkę w ciekłym azocie.
    2. Sonikować zawiesinę (30%, 15 razy, 30 s: 10 s przerwy) i usunąć lizat przez odwirowanie (4 °C, 10 000 x g przez 40 min).
    3. Oczyszczać białko za pomocą chromatografii powinowactwa (np. na kolumnie niklowej o pojemności 1 ml przy użyciu systemu FPLC podłączonego do kolektora frakcji; patrz tabela materiałów). Eluować białko za pomocą buforu elucyjnego (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 4 M mocznik, 250–500 mM imidazolu) i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego przetwarzania.
    4. Analizuj skuteczność oczyszczania za pomocą SDS-PAGE.

3. Modyfikacja barwnika ELP za pomocą SPAAC

  1. Z grubsza oszacować stężenie roztworu ELP. Absorpcja280 do oceny stężenia nie jest wartościowa, ponieważ sekwencja pAzF-R40F20 nie zawiera aminokwasów absorbujących w zakresie UV. W związku z tym, wcześniej liofilizowany i ważony amfifil ELP może być używany jako odniesienie do porównania pasm SDS PAGE. Poprzez porównanie zsumowanej intensywności wartości szarości pasm SDS PAGE z roztworów ELP o znanych stężeniach i próbce, można oszacować przybliżone stężenie próbki.
  2. Dodać 1 μl barwnika fluorescencyjnego BDP-FL-PEG4-DBCO (10 mM roztwór podstawowy; 20 μM stężenie końcowe) do 500 μL roztworu ELP (~20 μM). Inkubować reakcję przez około 10 godzin w temperaturze 15 °C, wstrząsając i chroniąc przed światłem.
  3. W celu dalszego użycia należy dializować reakcję w celu usunięcia nadmiaru BDP.
    1. Wyrównać membranę dializacyjną (np. odcięcie 12 kDa) w ultraczystej wodzie przez 10 minut. Przyciąć membranę do dializy do odpowiedniego rozmiaru, który należy umieścić na otworze rurki reakcyjnej zawierającej kliknięty roztwór ELP. Aby zamocować membranę dializacyjną w otworze, należy umieścić pokrywę rurki reakcyjnej z wybitym rdzeniem na otworze, zamykając w ten sposób rurkę.
    2. Umieść probówkę reakcyjną do góry nogami w wybranym buforze. Wymieniaj bufor (2–5 l) dwa razy po dializie przez co najmniej 3 godziny za każdym razem. Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione między membraną dializacyjną a buforem, aby zapewnić skuteczną dializę.

4. Protokół pęcznienia THF

  1. Dializować jednorodny roztwór ELP w stosunku do buforu fosforanowego lub trisowego (10 mM) o stabilnym pH 7,5 w celu usunięcia soli i pozostałych związków z oczyszczania his-tag.
  2. Przygotuj liofilizator i ostudź do temperatury początkowej do liofilizacji.
  3. Podwielokrotność dializowanego roztworu białka umieścić w probówkach reakcyjnych o pojemności 1,5 ml (50–500 μl na probówkę) i zamrozić szokowo w ciekłym azocie. Aby uniknąć niepożądanego mieszania różnych roztworów białkowych podczas liofilizacji, na probówkę reakcyjną można nałożyć nakrętki z małym otworem, aby ją częściowo uszczelnić.
  4. Wyjmij zamrożone próbki białka z ciekłego azotu i natychmiast umieść je w liofilizatorze, aby rozpocząć liofilizację. Liofilizację kończy się, gdy próbka jest całkowicie sucha (około 24–48 godzin). Następnie przewietrzyć liofilizowane amfifilowe ELP suchymN2, a następnie natychmiast zamknąć pokrywy probówek reakcyjnych, aby uniknąć kontaktu z wilgocią z powietrza.
  5. Dodać czysty THF do liofilizowanych próbek (ELP, 5–10 μM) i umieścić roztwór w sonikatorze łaźni wodnej zawierającym lodowatą wodę na 15 minut, aby umożliwić pęcznienie ELP w THF.
  6. Podgrzej termocykler do 30–60 °C w celu tworzenia pęcherzyków lub do 90 °C w celu tworzenia włókien i przygotuj nowe probówki reakcyjne zawierające ultraczystą wodę lub bufor (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 50 mM NaCl, pH 5–13). Kuliste koacerwaty gromadzą się głównie w temperaturze 20 °C i pH 9–13. Tworzenie pęcherzyków sprzyja tworzeniu się pęcherzyków w temperaturze 50–60 °C przy pH od 7 do 9. Powstawanie włókien jest głównie indukowane powyżej 60 °C w zakresie pH od 5 do 12.
  7. Po etapie sonikacji umieść roztwór ELP/THF oraz przygotowaną wodę ultraczystą lub roztwór buforowy w termocyklerze i podgrzewaj do żądanej temperatury przez 5 minut. Po osiągnięciu temperatury podgrzany roztwór ELP/THF należy dokładnie rozwarstwić na wierzchu podgrzanej ultraczystej wody lub roztworu buforowego. Powinno być widoczne wyraźne oddzielenie dwóch faz z wyraźnym interfejsem.
  8. Ponownie umieścić mieszaninę w termocyklerze i inkubować przez 20 minut, aby umożliwić tworzenie się pęcherzyków lub włókien na granicy faz. Następnie pozwól próbkom ostygnąć do temperatury pokojowej przez 10 minut przed analizą za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub dializy.
  9. Roztwór zawierający struktury supramolekularne dializować z ultraczystą wodą lub buforem (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 50 mM NaCl, pH 7–10).

5. Protokół ekstruzji BuOH

  1. Przygotuj 1–50 μM roztwór ELP w ultraczystej wodzie lub buforze (50 mM PB pH 7,5, 100 mM NaCl, może zawierać do 4 M mocznika). Stężenie amfifilowego roztworu ELP F20R20-mEGFP i F20R20-mCherry można określić za pomocą współczynników ekstynkcji molowej (F20R20-mEGFP A280 = 22015 M-1 cm-1 i F20R20-mCherry A280 = 34380 M-1 cm-1) (patrz informacje uzupełniające dla sekwencji aa).
  2. Dodać 10%-20% (v/v) 1-butanolu i natychmiast wymieszać roztwór, pipetując w górę i w dół lub kilkakrotnie pobierając go przez strzykawkę. Można zastosować zwykłą pipetę o pojemności 100 μl lub strzykawkę Hamilton wyposażoną w igłę 0,25 x 25 mm. Zmętnienie roztworu podczas mieszania powinno wzrosnąć, co wskazuje na tworzenie się pęcherzyków. 1-oktanol 5%–15% (v/v) może być również stosowany do wytłaczania pęcherzyków zamiast 1-butanolu.
  3. W celu uzyskania wąskiego rozkładu wielkości należy wytłaczać pęcherzyki za pomocą mini ekstrudera przez membranę o wielkości porów 1 μm w temperaturze pokojowej. Rozmiar membrany użytej do wytłaczania określa górną granicę wielkości pęcherzyków.
  4. Dializować pęcherzyki zgodnie z powyższym opisem (krok 3.3) w celu usunięcia pozostałości 1-butanolu.

6. Hermetyzacja barwnika za pomocą protokołu ekstruzji BuOH

  1. Wymieszać około 40 μl roztworu ELP w 10 mM Tris-HCl, pH 8 z 1 μl dekstranu Texas Red (0,0025 mg/ml stężenie końcowe).
  2. Do roztworu dodać 10 μL BuOH i 5–10 razy wycisnąć przez strzykawkę wyposażoną w igłę 0,25 x 25 mm.

7. Analiza struktur supramolekularnych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

  1. Umieść pierścień wzmacniający na szkiełku podstawowym i mocno dociśnij stronę samoprzylepną do szkła.
  2. Dodać 5 μl próbki do wnętrza pierścienia wzmacniającego i umieścić na nim szkiełko nakrywkowe.
  3. Uszczelnić próbkę lakierem do paznokci na krawędziach szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć odparowania próbki podczas analizy.
  4. Przeprowadź mikroskopię fluorescencyjną zgodnie z wcześniejszym opisem8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowanie protokołu do produkcji pęcherzyków
Rysunek 1 przedstawia dwie różne metody przygotowania pęcherzyków. Metoda pęcznienia THF po lewej stronie składa się z trzech następujących po sobie etapów i skutkuje różnymi zespołami supramolekularnymi ELP w zależności od temperatury. W klasie Rysunek 1A obrazy z mikroskopii epifluorescencyjnej pokazują pęcherzyki złożone z BDP-R20F20 i struktury fibrylarne złożone z BDP-R40F20...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Błąd podczas postępowania zgodnie z opisanymi protokołami składania zdefiniowanych struktur supramolekularnych prowadzi głównie albo do tworzenia niespecyficznych agregatów (ryc. 2, IV), albo do jednorodnie rozmieszczonych amfifilów ELP. Krytyczne kroki protokołu omówiono poniżej:

Dla wysokiej wydajności ekspresji amfifilowego ELP optymalna jest stosunkowo niska temperatura wynosząca 20°C. Udowodniono, że w celu skutecznego oczyszczania amfifilowego ELP na podstaw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują BMBF za wsparcie finansowe oraz Centrum Analiz Systemów Biologicznych (ZBSA) za udostępnienie obiektu badawczego. Jesteśmy wdzięczni firmie P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, Kalifornia, USA za dostarczenie plazmidu pEVOL-pAzF. Dziękujemy personelowi Centrum Obrazowania Życia (LIC) w Centrum Analiz Systemów Biologicznych (ZBSA) Uniwersytetu Alberta Ludwigsa we Freiburgu za pomoc w udostępnieniu zasobów mikroskopii konfokalnej oraz doskonałe wsparcie w rejestrowaniu obrazu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 &mikro; m oraz 0,2 i mikro; m Filtr sterylnyVWR
1,4-DitiothreitolMerck
1-butanol. >99,5% rocznieRoth
2log DNA drabinkaNEB
2-merkaptoetanolRoth
50 ml Probówki FalconVWR
79249 Alkine Mega Stokes barwnikSigma Aldrich
Kwas octowy lodowatyVWR
Acetonitryl, bezwodny, 99,8%Sigma-Aldrich
Sól sodowa ampicyliny, 99%Roth
BDP-FL-PEG4-DBCOJena Bioscience
BiofugeHeraeus
Filtr butelkowy z membraną PES (45 &mikro; m, 22 i mikro; m)Thermo Scientific
Brillant Blue G250 (Coomassie)Roth
BspQINEB
Kamera DS Qi1Wirówka Nikon
5417rWirówka Eppendorf
5810rEppendorf
CF-400-Cu siatka miedziana o kwadratowej siatceEMS
ChloramfenikolRoth
CompactStar CS 4VWR
Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutralnyLife Technologies
Cyfrowy sonifierBranson
Dimethylsulfoxide (DMSO)Applichem
Dnase IApplichem
EarINEB
EcoRI-HFNEB
Inkubator z wytrząsarką środowiskową ES-20Biosan
Etanol absolutnyRoth
Roztwór bromku etydynyRoth
Płytki szklaneBio-Rad
Glicerol Proteomika KlasaAmresco
GlycinApplichem
H4-Azido-Phe-OHBachhem
Płyta grzewcza MR HeiTec Heidolph
HindIIINEB
HisTrap FF kolumna surowaGE Life Sciences Kolumnaniklowa
Chlorowodorek dymiący kwas, 37%, p.a. Merck
Illuminator ix 20INTAS
Illuminator LAS-4000Fujifilm
ImidazoleMerck
Immersions olejek do mikroskopiiMerck
Inkubatory Wytrząsarki Unimax 1010Heidolph
IPTG, >99%Roth
KanamycinsulfateRoth
L(+)-ArabinozaWagi
Extend ed2202s/224s-OCESartorius
LB-MediumRoth
Liofilizator Alpha 2-4 LSCChrist
Lizozym, 20000 U/mgMikroskop Roth
CM 100Mikroskop Philips
Eclipse TS 100Nikon
Okulary nakrywkowe do mikroskopii (15 x 15 mm)Szkiełka mikroskopowe VWR
mikrofalowego VWR
Avanti Polar Lipids
NaCl, >99,5%, rocznieRoth
Granulki wodorotlenku soduRoth
Ni-NTA Agaroza, PerfectPro5 Prime
Nucleopore Track-Etch MembraneAvanti
miernik pH 766 calimaticKnick
Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF)Kolumny
(1 mL)Qiagen
PowerPac basicBioRad
Propanol-2-olEmplura
Drabinka białkowa 10-250 kDaNEB
Chłodnica recyrkulacyjna F12Julabo
Pierścienie wzmacniająceHerma
SacI HFNEB
SDS GranulkiRoth
Dihydrat diwodorofosforanu sodu, NaH2PO4VWR
Sterylny filtr strzykawkowy 0,2 mm Octan celulozyVWR
T4 Ligaza DNANEB
TEMEDRoth
TexasRed Sondymolekularne
Thermomix komfortEppendorf
THF, >99.5% rocznieAcros
Triton X 100Roth
Trypton/Pepton z kazeinyRoth
Myjka ultradźwiękowaVWR
Mocznik p.a.Roth
Pompa próżniowa 2.5Vacuubrand
XbaINEB
XhoINEB
ZelluTrans membrana rurowa z regenerowanej celulozy (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V)Roth
Wsporniki filtracyjne Avanti Inkubator 1000 Heidolph laboratoryjne Roth Zestaw mini-ekstrudera polipropylenowe Roth z dekstranem

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).
  2. Jang, Y., Champion, J. A. Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins. Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).
  3. Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 35, 26-35 (2018).
  4. Dreher, M. R., et al. Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).
  5. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
  6. Matsuurua, K. Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures. RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).
  7. Rocklin, G. J., et al. Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing. Science. 357 (6347), 168-175 (2017).
  8. Schreiber, A., Stühn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library. Small. 15 (30), 1900163(2019).
  9. Jang, Y., Hsieh, M. -C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity. Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).
  10. Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin. Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).
  11. Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly. Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).
  12. Martín, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodríguez-Cabello, J. C. Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium. Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).
  13. Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2017).
  14. Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).
  15. Park, W. M., Champion, J. A. Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 136 (52), 17906-17909 (2014).
  16. Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862(2018).
  17. Vogele, K., et al. In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth. Journal of Visualized Experiments. (148), e59831(2019).
  18. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).
  19. Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
  20. Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials. Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).
  21. Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions. Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).
  22. Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  23. Sonnino, S., Prinetti, A. Membrane domains and the "lipid raft" concept. Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).
  24. Bräse, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. Organische Azide - explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse. Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).
  25. Li, Z., et al. Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran–Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT). The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).
  26. Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions. ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).
  27. Raghunathan, G., et al. A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).
  28. Sallach, R. E., et al. Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking. Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Elastin like ProteinsProtein AssemblyVesicle FormationFiber FormationCoacervate FormationProtein PurificationFluorescent Cargo EncapsulationDialysis MethodExtrusion TechniqueConfocal Microscopy

Powiązane artykuły