Ukierunkowane składanie białek podobnych do elastyny w zdefiniowane struktury supramolekularne i enkapsulacja ładunku in vitro

Tworzenie struktur supramolekularnych do zastosowań biotechnologicznych staje się coraz ważniejsze^1,2,3,4,5. W przypadku montażu funkcjonalnych architektur, takich jak koacerwaty, pęcherzyki i włókna o pożądanych właściwościach fizykochemicznych, ważne jest zrozumienie i kontrolowanie właściwości fizykochemicznych i konformacyjnych komponentów. Ze względu na molekularną precyzję cząsteczek występujących w przyrodzie, bloki budulcowe struktur supramolekularnych coraz częściej opierają się na lipidach, kwasach nukleinowych lub białkach. W porównaniu z polimerami syntetycznymi, białkowe bloki budulcowe pozwalają na precyzyjną kontrolę nad powstającymi strukturami supramolekularnymi⁶ na poziomie genetycznym. Sekwencja aminokwasów pierwszorzędowych (aa) poszczególnych bloków budulcowych białek wewnętrznie koduje informacje o ich potencjale składania od poziomu molekularnego do makroskopowego, a także o trójwymiarowym kształcie i właściwościach fizycznych końcowej struktury supramolekularnej⁷.

Zgłoszone metody składania różnych struktur supramolekularnych często obejmują białka amfifilowe, takie jak wrażliwe na temperaturę białka podobne do elastyny (ELP)^5,8,9, rekombinowane oleozyny¹⁰ i sztuczne białka amfifile¹¹. Metody wyzwalane temperaturą doprowadziły do złożenia miceli^4,10,12, fibers¹³, sheets¹⁴ and vesicles^9,15,16. Metody z użyciem rozpuszczalników organicznych zostały zastosowane do tworzenia dynamicznych pęcherzyków na bazie białek^8,11,14. Do tej pory stosowane protokoły tworzenia pęcherzyków często nie miały kontroli nad zespołami o rozmiarach mikrometrów^16,17 lub mają ograniczoną wydajność montażu⁵. Ponadto, niektóre zgłoszone pęcherzyki oparte na ELP mają upośledzony potencjał enkapsulacji¹² lub ograniczoną stabilność w czasie⁹. Rozwiązując te wady, przedstawione protokoły umożliwiają samoorganizację struktur supramolekularnych o rozmiarach mikrometrowych i submikrometrowych o odrębnych właściwościach fizykochemicznych, dobrym potencjale enkapsulacji i długotrwałej stabilności. Dostosowane amfifilowe ELP łączą się w struktury supramolekularne, obejmujące zakres od sferycznych koacerwatów i wysoce uporządkowanych skręconych wiązek włókien do pęcherzyków jednowarstwowych, w zależności od zastosowanego protokołu i związanych z nim warunków środowiskowych. Duże pęcherzykowe przedziały białkowe oparte na błonie białkowej (PMBC) ujawniają wszystkie główne fenotypy, takie jak fuzja błonowa i separacja faz, analogiczne do liposomów. PMBC skutecznie hermetyzują chemicznie zróżnicowane fluorescencyjne cząsteczki ładunku, które można monitorować za pomocą prostej mikroskopii epifluorescencyjnej. Powtarzające się domeny ELP użyte w tym badaniu są atrakcyjnymi elementami budulcowymi dla architektur supramolekularnych opartych na białkach¹⁸. Wiadomo, że jednostka powtórzeń pentapeptydu ELP (VPGVG) toleruje różne aa oprócz proliny na czwartej pozycji (walina, V), zachowując przy tym swoje właściwości strukturalne i funkcjonalne¹⁹. Projekt amfifilowych ELP zawierających charakterystyczne domeny hydrofilowe i hydrofobowe został zrealizowany poprzez wstawienie reszt gościa aa (X) do powtórzenia VPGXG z wyraźną hydrofobowością, polarnością i ładunkiem²⁰. Amfifilowe domeny ELP były wyposażone w hydrofobową fenyloalaninę (F) lub izoleucynę (I), podczas gdy domena hydrofilowa zawierała naładowany kwas glutaminowy (E) lub argininę (R) jako reszty gości. Listę kwalifikujących się amfifilowych konstruktów ELP i odpowiadających im sekwencji aa można znaleźć w informacjach uzupełniających i odniesieniach^8,21. Wszystkie elementy składowe zostały wyposażone w małe barwniki fluorescencyjne lub białka fluorescencyjne do wizualizacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. mEGFP i inne białka fluorescencyjne zostały N-końcowo połączone z hydrofilowymi domenami amfifilów ELP. Barwniki organiczne sprzężono za pomocą cykloaddycji alkinowo-azydkowej promowanej przez szczep bez miedzi (SPAAC) do kotranslacyjnie wprowadzonego nienaturalnego aminokwasu (UAA). Jednoczesna inkorporacja para-azydofenyloalaniny UAA (pAzF)²² pozwala na N-końcową modyfikację hydrofilowej domeny ELP. W ten sposób jako sondę fluorescencyjną można użyć zielonego barwnika fluorescencyjnego BDP-FL-PEG_4-DBCO (BDP) lub dowolnej małej cząsteczki fluorescencyjnej z naprężoną cyklooktyną. Pomyślne włączenie UAA pAzF i cykloaddycja barwnika za pomocą SPAAC może być łatwo potwierdzona za pomocą LC-MS/MS dzięki wydajnej jonizacji odpowiednich peptydów tryptycznych⁸. Ten mały barwnik organiczny został zastosowany w celu poszerzenia wyboru rozpuszczalników do protokołów składania, ponieważ białka fluorescencyjne są niekompatybilne z większością rozpuszczalników organicznych. Poniżej opisano dwa najbardziej efektywne protokoły składania struktur supramolekularnych opracowane w naszym laboratorium. Metoda pęcznienia THF jest kompatybilna tylko z amfifilowym ELP modyfikowanym barwnikiem organicznym. Natomiast metoda ekstruzji 1-butanolu (BuOH) jest kompatybilna z wieloma białkami jako sonda fluorescencyjna, np. mEGFP, ponieważ opisana metoda w pełni zachowuje fluorescencję tych białek fuzyjnych. Ponadto enkapsulacja małych cząsteczek i zachowanie fuzji pęcherzykowej działa najlepiej przy zastosowaniu metody ekstruzji BuOH.

1. Projektowanie i klonowanie amfifilowych białek elastynopodobnych (ELP)

1. Sklonuj i zaprojektuj konstrukcje zgodnie z opisem w innym miejscu^8,20. Plazmidy są dostępne na życzenie.

2. Ekspresja, oczyszczanie i przygotowanie białek

1. Ekspresja F20E20-mEGFP i F20E20-mCherry
   1. Zaszczepić główną kulturę ekspresji z nocnej kultury wstępnej do OD₆₀₀ 0,3. Inkubować w temperaturze 37 °C, 200 obr./min w sterylnym 400 ml pożywki LB uzupełnionej odpowiednimi antybiotykami w kolbie o pojemności 2 l.
   2. Przygotować roztwór podstawowy IPTG (1 M) do indukcji kultury ekspresji w wodzie ultraczystej.
   3. Po osiągnięciu OD₆₀₀ 0,5–0,8 dodać IPTG do hodowli ekspresji do końcowego stężenia 1 mM i zmniejszyć temperaturę inkubacji do 20 °C. Pozostawić do odciągania w temperaturze 20 °C przez około 20 godzin przy 200 obr./min.
2. Ekspresja amfifilowego ELP zawierającego UAA pAzF
   1. Inokulować główną kulturę ekspresji z nocnej hodowli wstępnej E. coli zawierającej dwa plazmidy pEVOL pAzF i np. pET28-NMBL-(TAG)R40F20-his do OD₆₀₀ 0,3 (patrz informacje uzupełniające dotyczące sekwencji aminokwasów). Inkubować w temperaturze 37 °C, 200 obr./min w sterylnym 400 ml pożywki LB uzupełnionej kanamycyną i chloramfenikolem w kolbie o pojemności 2 l.
   2. Przygotować 100 mM roztwór podstawowy pAzF w ultraczystej wodzie. Na 10 ml roztworu podstawowego pAzF odważyć 206,2 mg pAzF i ponownie zawiesić go w 8 ml ultraczystej wody. Aby rozpuścić pAzF, należy podnieść pH roztworu za pomocą 3 M NaOH i energicznie wymieszać. Po rozpuszczeniu pAzF ostrożnie obniż pH do 10,5 i dodaj ultraczystą wodę do końcowej objętości 10 ml. Użyć sterylnego filtra (0,22 μm) i poddzielić roztwór do probówek reakcyjnych o pojemności 2 ml.
   3. Przygotować 1 M roztwór podstawowy IPTG w wodzie ultraczystej i 20% roztwór podstawowy arabinozy w wodzie ultraczystej.
   4. Po osiągnięciu OD₆₀₀ 0,5–0,8 dodać pAzF do kultury ekspresji do końcowego stężenia 2 mM. Inkubować kulturę przez 10 minut, w temperaturze 37 °C, 200 obr./min, aby umożliwić wychwyt pAzF.
   5. Indukować ekspresję białka docelowego i ekspresję niezbędnej syntetazy tRNA/t-RNA poprzez jednoczesne dodawanie IPTG (1 mM) i arabinozy (2%) oraz obniżyć temperaturę inkubacji do 20 °C.
   6. Odciągać pokarm w temperaturze 20 °C przez około 20 godzin przy 200 obr./min. Kultura ekspresji zbiorów przez odwirowanie w temperaturze 4 °C, 4000 x g, 40 min.
3. Liza komórek i oczyszczanie białek
   1. Zawiesić osad E. coli w buforze do lizy (10 ml na litr kultury; 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M mocznik, 0,25% Triton X-100) zawierający lizozym (0,1 mg / ml) i PMSF (0,1 mM). Inkubować przez 30 minut na lodzie, a następnie dwukrotnie zamrozić i rozmrozić, zanurzając próbkę w ciekłym azocie.
   2. Sonikować zawiesinę (30%, 15 razy, 30 s: 10 s przerwy) i usunąć lizat przez odwirowanie (4 °C, 10 000 x g przez 40 min).
   3. Oczyszczać białko za pomocą chromatografii powinowactwa (np. na kolumnie niklowej o pojemności 1 ml przy użyciu systemu FPLC podłączonego do kolektora frakcji; patrz tabela materiałów). Eluować białko za pomocą buforu elucyjnego (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 4 M mocznik, 250–500 mM imidazolu) i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego przetwarzania.
   4. Analizuj skuteczność oczyszczania za pomocą SDS-PAGE.

3. Modyfikacja barwnika ELP za pomocą SPAAC

1. Z grubsza oszacować stężenie roztworu ELP. Absorpcja₂₈₀ do oceny stężenia nie jest wartościowa, ponieważ sekwencja pAzF-R40F20 nie zawiera aminokwasów absorbujących w zakresie UV. W związku z tym, wcześniej liofilizowany i ważony amfifil ELP może być używany jako odniesienie do porównania pasm SDS PAGE. Poprzez porównanie zsumowanej intensywności wartości szarości pasm SDS PAGE z roztworów ELP o znanych stężeniach i próbce, można oszacować przybliżone stężenie próbki.
2. Dodać 1 μl barwnika fluorescencyjnego BDP-FL-PEG4-DBCO (10 mM roztwór podstawowy; 20 μM stężenie końcowe) do 500 μL roztworu ELP (~20 μM). Inkubować reakcję przez około 10 godzin w temperaturze 15 °C, wstrząsając i chroniąc przed światłem.
3. W celu dalszego użycia należy dializować reakcję w celu usunięcia nadmiaru BDP.
   1. Wyrównać membranę dializacyjną (np. odcięcie 12 kDa) w ultraczystej wodzie przez 10 minut. Przyciąć membranę do dializy do odpowiedniego rozmiaru, który należy umieścić na otworze rurki reakcyjnej zawierającej kliknięty roztwór ELP. Aby zamocować membranę dializacyjną w otworze, należy umieścić pokrywę rurki reakcyjnej z wybitym rdzeniem na otworze, zamykając w ten sposób rurkę.
   2. Umieść probówkę reakcyjną do góry nogami w wybranym buforze. Wymieniaj bufor (2–5 l) dwa razy po dializie przez co najmniej 3 godziny za każdym razem. Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione między membraną dializacyjną a buforem, aby zapewnić skuteczną dializę.

4. Protokół pęcznienia THF

1. Dializować jednorodny roztwór ELP w stosunku do buforu fosforanowego lub trisowego (10 mM) o stabilnym pH 7,5 w celu usunięcia soli i pozostałych związków z oczyszczania his-tag.
2. Przygotuj liofilizator i ostudź do temperatury początkowej do liofilizacji.
3. Podwielokrotność dializowanego roztworu białka umieścić w probówkach reakcyjnych o pojemności 1,5 ml (50–500 μl na probówkę) i zamrozić szokowo w ciekłym azocie. Aby uniknąć niepożądanego mieszania różnych roztworów białkowych podczas liofilizacji, na probówkę reakcyjną można nałożyć nakrętki z małym otworem, aby ją częściowo uszczelnić.
4. Wyjmij zamrożone próbki białka z ciekłego azotu i natychmiast umieść je w liofilizatorze, aby rozpocząć liofilizację. Liofilizację kończy się, gdy próbka jest całkowicie sucha (około 24–48 godzin). Następnie przewietrzyć liofilizowane amfifilowe ELP suchym_N2, a następnie natychmiast zamknąć pokrywy probówek reakcyjnych, aby uniknąć kontaktu z wilgocią z powietrza.
5. Dodać czysty THF do liofilizowanych próbek (ELP, 5–10 μM) i umieścić roztwór w sonikatorze łaźni wodnej zawierającym lodowatą wodę na 15 minut, aby umożliwić pęcznienie ELP w THF.
6. Podgrzej termocykler do 30–60 °C w celu tworzenia pęcherzyków lub do 90 °C w celu tworzenia włókien i przygotuj nowe probówki reakcyjne zawierające ultraczystą wodę lub bufor (50 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 50 mM NaCl, pH 5–13). Kuliste koacerwaty gromadzą się głównie w temperaturze 20 °C i pH 9–13. Tworzenie pęcherzyków sprzyja tworzeniu się pęcherzyków w temperaturze 50–60 °C przy pH od 7 do 9. Powstawanie włókien jest głównie indukowane powyżej 60 °C w zakresie pH od 5 do 12.
7. Po etapie sonikacji umieść roztwór ELP/THF oraz przygotowaną wodę ultraczystą lub roztwór buforowy w termocyklerze i podgrzewaj do żądanej temperatury przez 5 minut. Po osiągnięciu temperatury podgrzany roztwór ELP/THF należy dokładnie rozwarstwić na wierzchu podgrzanej ultraczystej wody lub roztworu buforowego. Powinno być widoczne wyraźne oddzielenie dwóch faz z wyraźnym interfejsem.
8. Ponownie umieścić mieszaninę w termocyklerze i inkubować przez 20 minut, aby umożliwić tworzenie się pęcherzyków lub włókien na granicy faz. Następnie pozwól próbkom ostygnąć do temperatury pokojowej przez 10 minut przed analizą za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub dializy.
9. Roztwór zawierający struktury supramolekularne dializować z ultraczystą wodą lub buforem (50 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 50 mM NaCl, pH 7–10).

5. Protokół ekstruzji BuOH

1. Przygotuj 1–50 μM roztwór ELP w ultraczystej wodzie lub buforze (50 mM PB pH 7,5, 100 mM NaCl, może zawierać do 4 M mocznika). Stężenie amfifilowego roztworu ELP F20R20-mEGFP i F20R20-mCherry można określić za pomocą współczynników ekstynkcji molowej (F20R20-mEGFP A₂₈₀ = 22015 ^{M-1 cm-1} i F20R20-mCherry A₂₈₀ = 34380 ^{M-1 cm-1}) (patrz informacje uzupełniające dla sekwencji aa).
2. Dodać 10%-20% (v/v) 1-butanolu i natychmiast wymieszać roztwór, pipetując w górę i w dół lub kilkakrotnie pobierając go przez strzykawkę. Można zastosować zwykłą pipetę o pojemności 100 μl lub strzykawkę Hamilton wyposażoną w igłę 0,25 x 25 mm. Zmętnienie roztworu podczas mieszania powinno wzrosnąć, co wskazuje na tworzenie się pęcherzyków. 1-oktanol 5%–15% (v/v) może być również stosowany do wytłaczania pęcherzyków zamiast 1-butanolu.
3. W celu uzyskania wąskiego rozkładu wielkości należy wytłaczać pęcherzyki za pomocą mini ekstrudera przez membranę o wielkości porów 1 μm w temperaturze pokojowej. Rozmiar membrany użytej do wytłaczania określa górną granicę wielkości pęcherzyków.
4. Dializować pęcherzyki zgodnie z powyższym opisem (krok 3.3) w celu usunięcia pozostałości 1-butanolu.

6. Hermetyzacja barwnika za pomocą protokołu ekstruzji BuOH

1. Wymieszać około 40 μl roztworu ELP w 10 mM Tris-HCl, pH 8 z 1 μl dekstranu Texas Red (0,0025 mg/ml stężenie końcowe).
2. Do roztworu dodać 10 μL BuOH i 5–10 razy wycisnąć przez strzykawkę wyposażoną w igłę 0,25 x 25 mm.

7. Analiza struktur supramolekularnych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

1. Umieść pierścień wzmacniający na szkiełku podstawowym i mocno dociśnij stronę samoprzylepną do szkła.
2. Dodać 5 μl próbki do wnętrza pierścienia wzmacniającego i umieścić na nim szkiełko nakrywkowe.
3. Uszczelnić próbkę lakierem do paznokci na krawędziach szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć odparowania próbki podczas analizy.
4. Przeprowadź mikroskopię fluorescencyjną zgodnie z wcześniejszym opisem⁸.

Opracowanie protokołu do produkcji pęcherzyków
Rysunek 1 przedstawia dwie różne metody przygotowania pęcherzyków. Metoda pęcznienia THF po lewej stronie składa się z trzech następujących po sobie etapów i skutkuje różnymi zespołami supramolekularnymi ELP w zależności od temperatury. W klasie Rysunek 1A obrazy z mikroskopii epifluorescencyjnej pokazują pęcherzyki złożone z BDP-R20F20 i struktury fibrylarne złożone z BDP-R40F20. Metoda BuOH, zilustrowana po prawej stronie, prowadzi wyłącznie do tworzenia pęcherzyków ELP, dając około dwóch rzędów wielkości więcej pęcherzyków w porównaniu z metodą pęcznienia THF. Schemat przedstawia proces przygotowania pęcherzyków BuOH. Do przygotowania pęcherzyków w klasie Rysunek 1B BDP-R40F20 zmieszano z 10-15% (v/v) BuOH, a pęcherzyki przygotowano przez ekstruzję mieszaniny.

Prowadzenie samoorganizacji supramolekularnej w różne struktury
Rysunek 2 pokazuje schematyczną ilustrację i obrazy epifluorescencyjne różnych struktur supramolekularnych złożonych z BDP-R40F20 za pomocą protokołu pęcznienia THF. W tym przypadku zastosowano liofilizowany BDP-R40F20 do różnych protokołów montażu. pH buforu i temperaturę procesu składania dostosowano tak, aby tworzyły koacerwaty, fibryle lub pęcherzyki. Koacerwaty przedstawione na Rysunek 2A mają średnicę 1–2 μm i zostały złożone z BDP-R40F20 w temperaturze 20 °C i pH 13. Dostosowanie temperatury montażu do 90 °C powoduje powstanie wiązek nanowłókien ( Rysunek 2B) o pH 4–13 testowane za pomocą BDP-R40F20. Stabilne pęcherzyki mogą być składane z ELP w temperaturze 50 °C i pH 7 (Rysunek 2C). Drobne błędy na jednym z kluczowych etapów protokołu montażu mogą prowadzić do powstania agregatów przedstawionych w Rysunek 2D.

Hermetyzacja różnych ładunków
Rysunek 3 pokazuje hermetyzację różnych ładunków w świetle pęcherzyków złożonych z F20R20-mEGFP metodą ekstruzji BuOH. W celu enkapsulacji dodatnio naładowanego barwnika Atto Rho13 w Rysunek 3A, barwnik zmieszano z wodnym roztworem ELP przed dodaniem (15% v/v) BuOH i wytłaczaniem mieszaniny przez strzykawkę. Obrazy z mikroskopii konfokalnej pokazują pęcherzyki utworzone z F20R20-mEGFP w kanale zielonym, czerwony barwnik AttoRho13 w kanale czerwonym, a powstały połączony kanał pokazuje udaną enkapsulację wewnątrz światła pęcherzyka.

Polisacharyd Dextran Red 3000 został pomyślnie zamknięty przy użyciu metody ekstruzji BuOH, jak opisano powyżej. Obrazy zarejestrowane w kanale zielonym przedstawiają pęcherzyki utworzone z F20R20-mEGFP, podczas gdy kanał czerwony pokazuje ładunek polisacharydowy. Połączony zielony i czerwony obraz w Rysunek 3B potwierdza udaną enkapsulację czerwieni Dekstran 3000 w świetle pęcherzyka.

Kompatybilność komponentów membrany i separacja fazowa mieszanych pęcherzyków BuOH przed/po wytłaczaniu
Rysunek 4 pokazuje separację faz i zachowanie fuzji amfifilów ELP po zmieszaniu pojedynczych bloków budulcowych PMBC w porównaniu z złożonymi populacjami PMBC. Mieszanie amfifilowych bloków budulcowych ELP (F20R20-mEGFP i F20R20-mCherry) przed montażem PMBC prowadzi do jednorodnego rozmieszczenia cząsteczek w zmontowanej membranie PMBC. Jednorodny rozkład fluoroforów i związanych z nimi amfifilów ELP jest widoczny po połączeniu kanału czerwonego i zielonego odpowiednich obrazów fluorescencyjnych. Mieszając populacje pęcherzyków złożone z F20R20-mEGFP lub F20R20-mCherry, natychmiast po zmieszaniu widoczne są wyraźnie widoczne plamy błony o czerwonej lub zielonej fluorescencji. Oznacza to, że zachodzą zdarzenia fuzji PMBC inaczej oznakowanych PMBC i że te błony łączące i ich składniki pozostają oddzielone fazowo przez co najmniej 20 minut. Podobne zachowanie fazowe jest znane z tratw lipidowych, w obrębie błon lipidowych23.

Rysunek 1: Ilustracja metody pęcznienia THF i metody wytłaczania BuOH do sterowanego samoorganizowania amfifilowych ELP w struktury supramolekularne, takie jak pęcherzyki lub włókna. Schematyczny przebieg pracy i reprezentatywne obrazy epifluorescencji (A) metody pęcznienia THF z BDP-R20F20 i BDP-R40F20 skutkującej różnymi strukturami supramolekularnymi w zależności od temperatury i pH oraz (B) metody ekstruzji BuOH dającej wyłącznie pęcherzyki z BDP-R40F20 (podziałka 2 μm). Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Schreiber et al. 20198. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: dzięki zastosowaniu metody pęcznienia THF BDP-R40F20 samoorganizuje się w różne struktury supramolekularne. Warunki środowiskowe zastosowane podczas protokołu montażu (np. temperatura lub pH) determinują dominującą powstałą strukturę supramolekularną. Reprezentatywne struktury supramolekularne w odpowiednich warunkach podczas składania monitorowano za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej i wahały się od (A) koacerwatów i (B) włókienek do (C) stabilnych pęcherzyków. (D) Niepowodzenie w montażu określonych struktur podczas protokołu pęcznienia THF prowadzi do powstania niespecyficznych agregatów (podziałka 2 μm). Ten rysunek został zmodyfikowany z8. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Różne ładunki mogą być zamknięte w pęcherzykach ELP przy użyciu metody ekstruzji BuOH. (A) pokazuje reprezentatywne obrazy konfokalne pęcherzyków F20R20-mEGFP z enkapsulowanym dodatnio naładowanym barwnikiem AttoRho13 i (B) enkapsulację czerwieni polisacharydowej dekstranu (podziałka 5 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Kompatybilność składników membrany i zachowanie podczas fuzji błon pęcherzykowych złożonych z F20R20 metodą wytłaczania BuOH. (A) Mieszanie fluorescencyjnego roztworu białka F20R20-mEGFP i F20R20-mCherry przed ekstruzją strzykawką prowadzi do powstania błon PMBC z jednorodnie rozmieszczonymi białkami amfifilowymi widocznymi w kanale zielonym (zdjęcie po lewej), kanale czerwonym (zdjęcie środkowe) i kanale scalonym (zdjęcie po prawej). (B) PMBC złożone z F20R20-mEGFP lub F20R20-mCherry, a następnie zmieszane za pomocą wytłaczania strzykawki, prowadzą do oddzielenia łat amfifilowych ELP w błonach PMBC. Oddzielone amfifile ELP w błonie są widoczne po fuzji PMBC przez co najmniej 20 minut w kanale zielonym (zdjęcie po lewej), kanale czerwonym (zdjęcie środkowe) i kanale scalonym (zdjęcie po prawej). Podziałka odpowiada 5 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Schreiber et al. 20198. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.