Artykuł metodologiczny

Izolacja kardiomiocytów ze stałych serc do analizy immunocytochemicznej i ploidalnej

7.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60938

⸱

7 października 2020

 ,  , 
1Department of Integrative Biology and Physiology, University of Minnesota, 2Lillehei Heart Institute, Department of Medicine, University of Minnesota, 3Stem Cell Institute, University of Minnesota

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tej pracy jest opracowanie metody powtarzalnego izolowania kardiomiocytów od serca dorosłego człowieka oraz mierzenia zawartości DNA i zarodkowania.

Streszczenie

Serce dorosłego ssaka składa się z różnych typów komórek, w tym kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów. Ponieważ trudno jest wiarygodnie zidentyfikować jądra kardiomiocytów na odcinkach histologicznych, wiele grup polega na izolowaniu żywotnych kardiomiocytów przed utrwaleniem w celu przeprowadzenia barwienia immunologicznego. Jednak te techniki izolacji żywych kardiomiocytów wymagają optymalizacji w celu maksymalizacji wydajności, żywotności i jakości próbek, z nieodłącznymi wahaniami między próbkami pomimo maksymalnej optymalizacji. W tym miejscu przedstawiamy powtarzalny protokół, obejmujący utrwalanie przed trawieniem enzymatycznym serca, co prowadzi do maksymalnej wydajności przy zachowaniu morfologii in vivo poszczególnych kardiomiocytów. Następnie opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę analityczną w celu określenia liczby jąder i zawartości DNA w jądrze dla poszczególnych kardiomiocytów. Po odsłonięciu jamy klatki piersiowej serce zostało zatrzymane w rozkurczu przez perfuzję z 60 mM KCl w PBS. Następnie serce utrwalono w 4% roztworze paraformaldehydu (PFA), a następnie trawiono roztworem kolagenazy o stężeniu 60 mg/ml. Po trawieniu komórki były izolowane przez triturację, a frakcja kardiomiocytów została wzbogacona przez wirowanie różnicowe. Wyizolowane kardiomiocyty wybarwiono pod kątem troponiny T i α-aktyniny w celu oceny czystości uzyskanej populacji. Ponadto opracowaliśmy platformę do analizy obrazu w celu określenia zarodkowania kardiomiocytów i stanu ploidalności po barwieniu DAPI. Oceny ploidalności oparte na obrazach doprowadziły do uzyskania spójnych i powtarzalnych wyników. W ten sposób dzięki temu protokołowi możliwe jest zachowanie natywnej morfologii poszczególnych kardiomiocytów, aby umożliwić immunocytochemię i analizę zawartości DNA przy jednoczesnym osiągnięciu maksymalnej wydajności.

Wprowadzenie

Choroby serca są główną przyczyną zgonów w większości krajów zachodnich od wielu dziesięcioleci1,2. Chociaż wiele ulepszeń w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych poprawiło przeżycie, obecnie nie ma metod leczenia, które mogłyby zastąpić utracone kardiomiocyty. Dlatego badania związane z funkcjonowaniem kardiomiocytów, proliferacją, apoptozą i hipertrofią były i nadal są głównym przedmiotem zainteresowania społeczności naukowej. Ponieważ serce dorosłego ssaka ma bardzo ograniczoną zdolność regeneracyjną, a szacowane tempo odnawiania kardiomiocytów wynosi mniej niż 1% rocznie, niezwykle ważne jest wiarygodne identyfikowanie zdarzeń proliferacyjnych kardiomiocytów3,4. Większość strategii, które mierzą zdarzenia proliferacyjne, opiera się albo na barwieniu dla włączonych analogów nukleotydów DNA w celu oceny poprzedniej lub obecnej proliferacji, albo na barwieniu dla markerów jądrowych aktywnej proliferacji5. Szczególnie ważne jest wiarygodne identyfikowanie zdarzeń proliferacyjnych kardiomiocytów, ponieważ ogólna liczba proliferacyjnych kardiomiocytów jest tak niska3,6. Na przykład, w oparciu o 1% tempo odnawiania endogennych kardiomiocytów rocznie, można oczekiwać, że w dowolnym momencie u dorosłej myszy heart7,8 można oczekiwać, że w dowolnym momencie pojawi się od 25 do 50 kardiomiocytów endogennych. Wszelkie niedokładności w identyfikacji jąder kardiomiocytów mogą prowadzić do fałszywie dodatnich wyników. Dlatego tak ważne jest, aby wiarygodnie zidentyfikować jądra kardiomiocytów, co okazało się trudne i niewiarygodne na podstawie przekrojów histologicznych9. Identyfikacja kardiomiocytów jest znacznie dokładniejsza na podstawie pojedynczych komórek niż na podstawie skrawków tkanek, ponieważ odróżnienie kardiomiocytów od innych typów komórek może być trudne, nawet przy użyciu markerów takich jak α-aktynina, chociaż PCM1 może być wiarygodnym markerem jąder kardiomiocytów w sekcjach histologicznych10.

Obecne protokoły polegają na izolowaniu żywych kardiomiocytów przed fiksacją, co jest znane z tego, że powoduje śmierć co najmniej 30% kardiomiocytów i może prowadzić do niezamierzonej selekcji określonych populacji kardiomiocytów11. Co więcej, protokoły te są notorycznie trudne do optymalizacji, aby zapewnić powtarzalne wyniki. Nawet zoptymalizowane techniki izolacji mogą zazwyczaj wytworzyć nie więcej niż 65% żywych, pręcikowatych kardiomiocytów o różnej wydajności12.

Aby przezwyciężyć te problemy, opracowaliśmy protokół, który pozwala badaczom izolować stałe kardiomiocyty. Ponieważ próbki są utrwalane przed izolacją, wydajność jest maksymalizowana, a morfologia in vivo jest dobrze zachowana. Co więcej, dzięki temu protokołowi możliwe jest wyizolowanie kardiomiocytów z próbek klinicznych, które zwykle są utrwalane natychmiast po pobraniu. Ponadto, aby zidentyfikować nowo wygenerowane kardiomiocyty, ważne jest zmierzenie stanu zarodkowania i ploidalności poszczególnych kardiomiocytów, ponieważ zwykle zakłada się, że tylko diploidalne kardiomiocyty są nowo utworzone. Cytometria przepływowa nie jest w stanie odróżnić wielojądrowości od poliploidalności i jest protokołem wymagającym stosunkowo dużego czasu i zasobów. Ręczne obrysowywanie i mierzenie jąder na obrazach jest bardzo mało wydajne i podatne na stronniczość ludzką. Zautomatyzowana kwantyfikacja obrazów stałych, izolowanych kardiomiocytów barwionych DAPI rozwiązuje oba te problemy. Oparte na obrazowaniu oznaczanie rozkładów zarodkowania i ploidalności można uzyskać przy minimalnym nakładzie czasu i odczynników przy użyciu podstawowego sprzętu.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health i zatwierdzone przez University of Minnesota Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Przygotowanie roztworów i sprzętu chirurgicznego

  1. Przed izolacją wysterylizuj sprzęt chirurgiczny przy użyciu 70% roztworu etanolu.
  2. Dodać 2,24 g KCl do 500 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), aby uzyskać końcowe stężenie 60 mM. Roztwór KCl-PBS należy przechowywać w temperaturze pokojowej. Użyj 3 ml roztworu KCl-PBS na mysz.
  3. Rozcieńczyć 32% roztwór paraformaldehydu (PFA) z PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 4% PFA. Przygotuj 10 ml 4% PFA w PBS na mysz. Rozcieńczony roztwór PFA można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2-3 tygodnie w szklanym pojemniku.
    UWAGA: Przygotowany 4% roztwór PFA można przechowywać w temperaturze -20 °C przez dłuższy czas.
  4. Przygotuj 1 ml roztworu kolagenazy na mysz, dodając 60 mg kolagenazy typu 2 na 1 ml PBS.

2. Perfuzja i unieruchomienie serca

  1. Znieczulić zwierzę za pomocą 2-5% izofluranu o natężeniu przepływu tlenu 1 l/min. Potwierdź znieczulenie, potwierdzając brak ruchu i niższą szybkość oddychania.
    UWAGA: Wstrzyknięcie heparyny (100-500 U/kg) przed eutanazją może poprawić jakość i wydajność komórek, zapobiegając powstawaniu zakrzepów krwi, umożliwiając w ten sposób bardziej efektywną perfuzję serca z utrwalaczem.
  2. Poddaj zwierzę eutanazji zgodnie z zatwierdzonymi metodologiami.
    UWAGA: Postępowaliśmy zgodnie z wytycznymi Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynarii dotyczącymi eutanazji zwierząt i uzyskaliśmy lokalną zgodę IACUC na eutanazję.
  3. Umieść zwierzę poddane eutanazji w pozycji leżącej na plecach i przyklej taśmą wyprostowane kończyny.
  4. Przetnij klatkę piersiową, aby odsłonić serce, używając nożyczek o końcach. Przeciąć aortę zstępującą i żyłę kawalerską dolną.
  5. Wykonać perfuzję serca, wstrzykując 3 ml roztworu KCl-PBS przez lewą komorę z natężeniem przepływu 3 ml/min za pomocą pompy perystaltycznej dołączonej do zestawu infuzyjnego z igłą motylkową 23 G (26 G dla noworodków). Upewnij się, że nie przebijasz przegrody nosowej.
    UWAGA: Alternatywnie, do wstrzykiwania roztworów należy użyć igły dołączonej do strzykawki.
  6. Wykonaj perfuzję serca, wstrzykując 10 ml 4% roztworu PFA przez 10 minut za pomocą pompy perystaltycznej z szybkością 1 ml / min.
  7. Usuń całe serce za pomocą nożyczek. Po usunięciu serca możliwe jest wyizolowanie określonego obszaru serca poprzez nacięcie. Umieść serce lub jego fragment w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml 4% roztworu PFA. Inkubuj serce na bujaczku w temperaturze pokojowej z prędkością kołysania w zakresie 20-30 obr./min przez 1 godzinę.

3. Izolacja stałych kardiomiocytów

  1. Umieść serce na szalce Petriego zawierającej roztwór PBS. Ściśnij serce, aby pozbyć się pozostałego PFA w komorach i umyj w PBS.
  2. Umieścić nieruchome serce w nowej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej roztwór kolagenazy (60 mg/ml). Umieść probówkę na wahaczu (20-30 obr./min) w temperaturze 37 °C do inkubacji przez noc.
    UWAGA: Wydłuż czas inkubacji do 1 tygodnia i uzupełniaj roztwór kolagenazy co dwa dni, aby zmniejszyć możliwą zmienność plonów, jeśli przewiduje się, że serca będą zwłóknieniowe, co może wymagać dłuższego czasu trawienia kolagenazy w celu strawienia kolagenu zewnątrzkomórkowego
    3. .
  3. Umieść roztwór kolagenazy i serce na szalce Petriego o średnicy 35 mm. Rozdziel serce na kawałki o średnicy 1 mm za pomocą kleszczy lub nożyczek.
  4. Użyj pipety transferowej, aby dalej rozcierać zdysocjowaną tkankę przez 2 minuty. Jeśli cząstki tkanki nadal pozostają w naczyniu, użyj pipety transferowej z węższym otworem i kontynuuj rozcieranie. Kontynuuj, aż większość tkanki zostanie rozbita.
    UWAGA: Nadmierne roztarcie powoduje pękanie poszczególnych kardiomiocytów. Upewnij się, że nie przesadzasz, regularnie sprawdzając pod mikroskopem.
  5. Umieść siatkę nylonową o grubości 200-600 μm nad otworem w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
    UWAGA: W przypadku przerośniętych kardiomiocytów zaleca się stosowanie siatki nylonowej 400 μm zamiast 200 μm.
  6. Dodać 5 ml PBS do szalki Petriego zawierającej zdysocjowane komórki i przefiltrować roztwór przez siatkę nylonową, w tym cząstki tkanki. Umyj nylonową siatkę, przepuszczając dodatkowe 4 ml PBS.
  7. Odwirować przefiltrowany roztwór o stężeniu 10-100 x g przez 1 min.
    UWAGA: Wirowanie 100 x g nie da 100% czystej populacji kardiomiocytów, a niektóre komórki inne niż kardiomiocyty prawdopodobnie zostaną uwzględnione.
  8. Odrzuć supernatant, chyba że chce się również zabarwić/ocenić komórki serca nienależące do kardiomiocytów. Zawiesić osad w 10 ml PBS przed barwieniem.

4. Barwienie kardiomiocytów

  1. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 100 x g przez 1 minutę i dodać 5 ml roztworu przepuszczalnego (np. 0,5% Triton X-100 w PBS). Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej na rocker.
    UWAGA: W krokach 4.1, 4.2 i 4.4 należy użyć probówek wirówkowych o pojemności 15 ml, ponieważ łatwiej jest usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego w porównaniu z probówkami do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  2. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 100 x g przez 1 minutę, dodać 5 ml buforu blokującego (np. 3% albuminy surowicy bydlęcej [BSA] w PBS) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na kołysce.
  3. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 100 x g przez 1 minutę i dodać 1 ml roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (w PBS) o odpowiednim stosunku rozcieńczenia. Przenieść roztwór do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i inkubować kardiomiocyty w pierwotnym roztworze przeciwciała w optymalnych warunkach (np. 4 °C przez noc).
  4. Przenieś kardiomiocyty z roztworem przeciwciała pierwotnego do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodaj 9 ml PBS. Inkubuj kardiomiocyty przez 10 minut w temperaturze pokojowej na bujaku.
  5. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 100 x g przez 1 minutę i dodać 10 ml PBS. Inkubuj kardiomiocyty przez 10 minut w temperaturze pokojowej na bujaku. Powtórz ten krok jeszcze raz.
  6. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 100 x g przez 1 minutę i dodać drugorzędowy roztwór przeciwciał zawierający DAPI. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na bujaku, a następnie powtórzyć krok 4.5 dwa razy, aby umyć kardiomiocyty.
  7. Umieść komórki na szkiełkach nakrywkowych lub płytkach kompatybilnych z mikroskopem i kontynuuj obrazowanie.
    UWAGA: Zdjęcia zawarte w rękopisie zostały wykonane obiektywami 10x i 40x. Stosowane lasery to: 405 nm dla DAPI, 561 nm dla alfa aktyniny i 640 nm dla Edu.

5. Konfiguracja oprogramowania do obrazowania

UWAGA: Postępuj zgodnie z poniższymi krokami, korzystając z Pliku Uzupełniającego 1-SoftwareScreenshots.pdf.

  1. Pobierz dystrybucję ImageJ na Fidżi.
  2. Otwórz Fidżi. Kliknij Pomoc > Aktualizacja... > Zarządzaj witrynami aktualizacji. Sprawdź strony z aktualizacjami "IJPB-plugins" i "Biomedgroup", aby pobrać wtyczki zależności Ellipse Split i Morpholibj.
  3. Kliknij przycisk Zamknij. Fidżi powinno rozpocząć pobieranie zależności. Po zakończeniu uruchom ponownie Fidżi.
  4. Pobierz Rstudio i otwórz go.
  5. Skopiuj install.packages(c("ggplot2", "autothresholdr", "dplyr", "purrr", "jsonlite", "shiny")) do wiersza poleceń konsoli R i naciśnij Enter. Wpisz "y" w odpowiedzi na wszystkie monity, aby zainstalować wszystkie zależności języka R (zrzut ekranu 1 w pliku uzupełniającym 1).

6. Kwantyfikacja obrazu

  1. Otwórz Fidżi i przeciągnij "AnalyzeNucleation.py" (dostarczony jako dodatkowy plik kodu) na pasek stanu Fidżi. Spowoduje to otwarcie okna edycji skryptu. Kliknij Uruchom w lewym dolnym rogu, aby go rozpocząć (zrzut ekranu 2 w pliku uzupełniającym 1).
  2. Pojawi się okno dialogowe (Plik uzupełniający 1: Zrzut ekranu 3) z pytaniem o lokalizację katalogu danych wyjściowych. Wszystkie dane analityczne, rysunki i inne dane używane przez to oprogramowanie będą przechowywane w tym folderze. Pojawi się kolejne, większe okno dialogowe, w którym wyświetlane są wszystkie ustawienia analizy obrazu (Plik uzupełniający 1: Zrzut ekranu 4).
    1. Wybierz lokalizację katalogu zawierającego obrazy do analizy.
    2. Wprowadź format nazwy pliku obrazu za pomocą wyrażeń regularnych. Wprowadź format nazwy pliku obrazu, wskazując, które części nazwy pliku odpowiadają wierszowi, kolumnie, kanałowi i (opcjonalnie) witrynie w nawiasach klamrowych, używając wyrażeń regularnych. Nie wstawiaj spacji w nawiasach klamrowych. Umieść zmienne części formatu nazwy pliku w nawiasach klamrowych {}. Sposób zapisywania plików zależy od oprogramowania do przetwarzania obrazu, a ten krok spowoduje pobranie odpowiednich informacji z pliku obrazu.
      UWAGA: Na przykład ciąg formatu
      r" Tabliczka 1-(? P[A-Za-z]+)(? P[0-9]+)-(? P[A-Za-z]+).tif"
      opisuje nazwę pliku, która zaczyna się od "Tablica 1-", po której następuje jedna lub więcej liter alfabetu wskazujących wiersz, po której następuje jedna lub więcej cyfr wskazujących kolumnę, po której następuje "-", po której następuje jedna lub więcej liter wskazujących kanał, po której następuje ".tif". Litery w nawiasach ostrych, takie jak "<>", są nazwami zmiennych i są automatycznie kopiowane do danych po ich zebraniu. Jedną z nazw zmiennych musi być ""
    3. Należy wskazać nazwę kanałów, w których widoczne jest plamie jądrowe i w których widoczne są kardiomiocyty. Nazwy te muszą być dokładnie takie, jakie są w części dopasowanej przez zmienną "" w nazwach plików wyrażeń regularnych.
    4. Wskaż sposób grupowania obrazów przy użyciu nazw zmiennych rozdzielanych przecinkami. Wszystkie obrazy w danej grupie zostaną otwarte i przeanalizowane w jednej partii. Na przykład, jeśli obrazy są podzielone na zestawy dla każdej studni, a dla każdej unikalnej kombinacji wiersza i kolumny istnieje studnia, wpisz w tym polu "wiersz, kolumna".
      UWAGA: Te zmienne grupujące muszą być podzbiorem zmiennych używanych w ciągu formatu. Nie używaj "kanału" jako zmiennej grupującej, spowoduje to oddzielenie od siebie odpowiednich obrazów kanałów.
    5. Wskaż, czy obrazy są zszyte razem w jednym obrazie studzienki, czy też są oddzielne dla każdej lokalizacji. W pierwszym przypadku witryna nie powinna być wskazywana w ciągu formatu nazwy pliku.
    6. Wybierz metodę progowania, której chcesz użyć do oddzielenia jąder od tła. Dostępne są wszystkie standardowe metody progowania na Fidżi. Przetestuj różne metody progowania, aby określić, która z nich najlepiej pasuje do zestawu obrazów. W tym przykładzie wybierz metodę Otsu.
    7. Wskaż, czy próg powinien zostać ponownie obliczony dla każdego obrazu witryny, czy też ten sam próg powinien być używany dla każdego obrazu w grupie. Wskaż, czy obrazy kardiomiocytów są w jasnym polu, czy używają markera fluorescencyjnego.
    8. Wskaż metodę progowania kardiomiocytów. Jeśli w poprzednim kroku wybrano jasne pole, ta metoda progowania zostanie zastosowana do obrazów z filtrowanym krawędziowo jasnym polem. Wskaż, czy próg powinien zostać ponownie obliczony dla każdego obrazu witryny, czy też ten sam próg powinien być używany dla każdego obrazu w grupie.
    9. Wskaż liczbę rzędów obrazów witryny, które pokrywają każdą studzienkę. Wskaż liczbę kolumn obrazów witryny, które pokrywają każdą studnię. Należy wskazać minimalną powierzchnię jąder w pikselach. Użyj znacznie niskiego rozmiaru minimalnego, wyższy i bardziej precyzyjny próg zostanie obliczony na etapie analizy. Wskaż minimalną powierzchnię kardiomiocytów.
    10. Po wybraniu żądanych ustawień kliknij przycisk OK.
  3. Na ekranie pojawią się obrazy przypominające te, które znajdują się w Rysunek 3 i Rysunek 4 pojawi się na ekranie, pokazując różne etapy procesu analizy. Sprawdź te obrazy, aby upewnić się, że progowanie i segmentacja występują prawidłowo.
  4. Wybrany folder wyników powinien być teraz wypełniony danymi analizy (Plik uzupełniający 1: Zrzut ekranu 5). Pliki inne niż dane analityczne można bezpiecznie zapisywać w tym folderze, o ile ich nazwy nie zaczynają się od "cm_", "nuclei_" lub "nucleilink_".

7. Analiza danych

UWAGA: Pliki csv, które są tworzone, mogą być analizowane ręcznie. Każdy analizowany podzbiór obrazów tworzy tryplet plików csv o nazwach "nuclei(metadata).csv", "nucleilink(metadata).csv" i "cardiomyocytes(metadata),csv", gdzie (metadane) są zastępowane sekwencją par nazwa-wartość w postaci "_(nazwa)=(wartość)", gdzie (nazwa) i (wartość) są sekwencjami znaków alfanumerycznych pochodzącymi z ciągów dopasowanych w wyrażeniu regularnym podanym wcześniej. (Na przykład, jeśli wiersz i kolumna zostały wskazane w nazwach plików, to ciągi takie jak "_row=F" i "_column=8" będą obecne). Nienazwana skrajna lewa kolumna każdego jądra i pliku jądra jest numerem identyfikacyjnym jądra. Kolumna "Min" pliku nucleilink to identyfikator kardiomiocytu, który zawierał to jądro w całości lub 0 w przeciwnym razie. Kolumna "Max" jąder to ID kardiomiocytu o najwyższym numerze, który zawierał częściowo wspomniane jądro, lub 0 w przeciwnym razie. Kolumna "Średnia" w pliku kardiomiocytów to numer identyfikacyjny kardiomiocytów.

  1. Otwórz plik "AnalyzeMultinucleatedServer.R" w programie Rstudio (dostarczony jako uzupełniający plik kodu).
  2. W górnej części tego pliku znajduje się zmienna o nazwie "folderName". Obok niego znajduje się ścieżka do pliku. W tym miejscu wpisz ścieżkę do folderu danych wyjściowych wybranego w ostatnim kroku, bez ostatniego ukośnika (Plik uzupełniający 1: Zrzut ekranu 6).
  3. W lewym górnym rogu okna edycji skryptu powinna znajdować się zielona strzałka oznaczona jako Uruchom aplikację. Kliknij tę strzałkę. Załadowanie danych i wyświetlenie aplikacji może zająć trochę czasu.
  4. Początkowo widoczne będą trzy wykresy bramkowania, jeden wskazujący minimalny ważny próg powierzchni jądrowej, jeden wskazujący minimalny ważny próg średniej intensywności jądrowej i jeden wskazujący maksymalną ważną minimalną średnicę fereta dla kardiomiocytów. Użyj suwaków, aby ustawić te progi (Plik uzupełniający 1: Zrzut ekranu 7).
    UWAGA: Na każdym z tych wykresów powinien znajdować się duży, szeroki pik odpowiadający prawidłowym jądrom lub kardiomiocytom, otoczony szerokimi ogonami reprezentującymi szczątki lub błędnie segmentowane kardiomiocyty. Użyj progów, aby odciąć po jednym ogonie każdego ze szczytów.
  5. Przewiń w dół. Kliknij przycisk Zastosuj wybrane progi (na dole pliku uzupełniającego 1: zrzut ekranu 7).
  6. Kliknij przycisk Rozkład intensywności działki. Spowoduje to wyrenderowanie wykresu rozkładu intensywności jądrowej zarówno całej próbki, jak i oddzielnych wykresów podrzędnych dla każdej zmiennej grupującej.
    UWAGA: Na przykład, jeśli zmienne grupujące i zostały wprowadzone do wyrażenia regularnego w oknie dialogowym Fidżi, pojawią się tutaj wykresy wskazujące rozkład intensywności według wierszy i kolumn (Plik uzupełniający 1: Zrzut ekranu 8). Jeżeli warunki oświetlenia i barwienia były stałe w różnych częściach próbki, wszystkie te wykresy powinny wyraźnie pokazywać dwa piki intensywności, ciemniejszy, wyższy dla jąder diploidalnych i jaśniejszy, krótszy dla jąder tetraploidalnych.
  7. Zmienność wewnątrz próby spowoduje, że ten wzór nie będzie widoczny na wykresie całej próby i będzie duża różnorodność w lokalizacji pików diploidalnych i tetraploidalnych w zależności od wiersza, kolumny lub innej zmiennej grupującej. W tym drugim przypadku przewiń w dół i zaznacz pole wyboru Normalizuj oddzielnie według grupy, aby uwzględnić tę odmianę (Plik uzupełniający 1: Zrzut ekranu 9).
  8. Kliknij przycisk Oblicz ploidalność (Plik uzupełniający 1: Zrzut ekranu 9). Kliknij przycisk Wykreśl szacowany rozkład ploidalny. Wykresy pojawią się w pustych oknach po prawej stronie. Na znormalizowanym wykresie całej próby wzorzec dwóch szczytów powinien być widoczny, jeśli nie był wcześniej.
  9. Wybierz progi, aby odizolować piki diploidalne i tetraploidalne zarówno od siebie, jak i od wartości odstających za pomocą suwaków (Plik uzupełniający 1: Zrzut ekranu 9). Przewiń w dół. Kliknij przycisk Oblicz ploidalność i zarodkowanie (Plik uzupełniający 1: Zrzut ekranu 10).
  10. Kliknij przycisk Drukuj i zapisz w folderze wyników. Wykres zapisany w wybranym folderze wyników pojawi się również w tym interaktywnym oknie (Plik uzupełniający 1: Zrzut ekranu 10).

Wyniki

Kardiomiocyty wyizolowano zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Stosując tę metodę, zazwyczaj otrzymujemy jednorodnie pojedyncze kardiomiocyty o wysokiej czystości, bez zanieczyszczeń innymi typami komórek (Rycina 1A). Kardiomiocyty są łatwo identyfikowalne w mikroskopii w polu jasnym ze względu na ich charakterystyczny rozmiar i dwójłomność. Technika ta jest łatwa w implementacji i zapewnia spójne wyniki w różnych izolacjach, z porównywalną wydajnością i jakością uzyskiwanych kardiomiocytów (Rycina 1B). Wyizolowane kardiomiocyty można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni przed dalszym użyciem.

Kardiomiocyty wyizolowane zgodnie z powyższym protokołem mogą być wykorzystane w różnych dalszych analizach, takich jak pomiar wielkości kardiomiocytów, oznaczenie ploidalności kardiomiocytów oraz immunocytochemia. Jako reprezentatywny wynik pokazujemy, że kardiomiocyty wyizolowane zgodnie z tym protokołem mogą być barwione za pomocą przeciwciał oraz azydów sprzężonych z fluorochromami w reakcji click chemistry, odpowiednio w celu wykrycia lokalizacji specyficznych białek lub wykrycia replikacji DNA w kardiomiocytach. Na przykład, zabarwiliśmy kardiomiocyty przeciwciałami rozpoznającymi α-actinin, aby ukazać charakterystyczny wzór barwienia linii Z sarkomerów (Rysunek 2A). W osobnym eksperymencie podaliśmy myszom analog tymidyny 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) przed izolacją utrwalonych kardiomiocytów. Po izolacji kardiomiocytów przeprowadziliśmy barwienie wbudowanego EdU zgodnie ze standardowymi protokołami13, co pozwoliło nam wykryć kardiomiocyty, które przeszły fazę S, zarówno w komórkach jednojądrowych, dwujądrowych, jak i trójjądrowych (Rysunek 2B).

Aby dalej rozszerzyć użyteczność metody izolacji, opracowaliśmy proces umożliwiający kwantyfikację ploidii kardiomiocytów na podstawie zintegrowanego barwienia DNA. Aby móc zmierzyć status ploidii komórek lub jąder, konieczna była segmentacja jąder oraz kardiomiocytów. Rysunek 3 przedstawia strategię, którą zastosowaliśmy w celu identyfikacji poszczególnych jąder. Najpierw oryginalny obraz z barwieniem DNA (Rysunek 3A) zostaje poddany progowaniu na podstawie intensywności (Rysunek 3B). W tym przypadku do barwienia DNA użyliśmy DAPI, jednak odpowiedni będzie każdy inny barwnik jądrowy wykazujący liniową korelację z zawartością DNA. Program umożliwia wybór dowolnej z metod progowania intensywności dostępnych w Fiji, lecz w tym przykładzie zastosowano metodę Otsu. Maski jąder, które dotykają krawędzi obrazu lub są mniejsze niż określony minimalny próg pola powierzchni w pikselach, zostają wykluczone. Następnie do masek jąder dopasowywane są elipsy, co pozwala na segmentację poszczególnych jąder. Rysunek 3C przedstawia te elipsy nałożone na oryginalny obraz. W kolejnym kroku dziury w maskach są wypełniane, a piksele obrazu są dzielone na terytoria w zależności od tego, do której elipsy znajdują się najbliżej (Rysunek 3D). Granice tych terytoriów są następnie wykorzystywane do wykreślenia linii przechodzących przez skupiska jąder, co kończy proces segmentacji jąder (Rysunek 3E).

Kolejnym krokiem jest detekcja kardiomiocytów. W przypadku obrazów kardiomiocytów uzyskanych na podstawie komórek barwionych fluorescencyjnie (Rycina 4A), proces jest bardzo podobny do tego stosowanego dla jąder komórkowych. Obraz poddawany jest progowaniu w oparciu o wartość intensywności obliczoną wybraną metodą progowania, w tym przypadku metodą trójkąta (triangle method). Zidentyfikowane maski kardiomiocytów, które dotykają krawędzi obrazu lub mają rozmiar poniżej określonej wartości, są wykluczane, a otwory w maskach są wypełniane, aby uzyskać prawidłowo segmentowane kardiomiocyty (Rycina 4B). Ponieważ kardiomiocyty mają bardziej nieregularny kształt niż jądra, nie podejmuje się prób segmentacji skupisk kardiomiocytów. Zamiast tego skupiska te są wykluczane podczas etapu analizy na podstawie ich wysokiej minimalnej średnicy Fereta. Segmentacja z obrazów w jasnym polu przebiega nieco inaczej. Najpierw oryginalny obraz w jasnym polu (Rycina 4C) jest przetwarzany za pomocą filtra krawędziowego Sobela. Filtr ten oblicza wartość bezwzględną gradientu każdego piksela w obrazie. Piksele w obszarach o gwałtownych zmianach otrzymują wysokie wartości, a piksele w gładkich obszarach obrazu otrzymują niskie wartości. Tak przefiltrowany obraz krawędziowy jest następnie poddawany progowaniu według intensywności z wykorzystaniem metody trójkąta, co daje w efekcie zamaskowane kardiomiocyty (Rycina 4D). Te wysoce nieregularne maski są następnie wygładzane i łączone za pomocą morfologicznego zamykania (closing) przy użyciu koła o promieniu 2 pikseli, co wypełnia wszystkie białe obszary w obrazie, w których koło nie może zmieścić się bez nakładania się na obszar czarny (Rycina 4E). Na koniec otwory w maskach są wypełniane, obszary dotykające krawędzi są wykluczane, a małe cząstki usuwane, co kończy proces segmentacji kardiomiocytów (Rycina 4F).

Wykorzystując opisaną strategię segmentacji, możemy następnie określić stan nukleacji poszczególnych kardiomiocytów. Stosując to podejście, określiliśmy stan nukleacji kardiomiocytów izolowanych z serc myszy CD-1 (linia outbred) we wczesnych punktach czasowych po urodzeniu. Serca noworodków myszy (pierwszy dzień życia) wykazały, że w tym momencie większość kardiomiocytów jest mononuklearna (Rycina 5: neonatal). Ta wysoka częstotliwość występowania kardiomiocytów mononuklearnych jest znacznie niższa u myszy młodocianych (2. tydzień życia), gdzie kardiomiocyty mononuklearne stanowią około 25% całkowitej populacji kardiomiocytów (Rycina 5: juvenile). Wreszcie możemy zmierzyć status ploidii poszczególnych jąder w obrębie kardiomiocytów i określić, czy są one diploidalne, czy tetraploidalne. Wyniki te wskazują na wyższą częstotliwość występowania jąder tetraploidalnych u myszy w okresie dojrzewania (Rycina 6).

figure-results-1
Rycina 1: Wydajność izolacji kardiomiocytów po fiksacji. (A) Reprezentatywny obraz izolowanych kardiomiocytów barwionych DAPI w celu uwidocznienia jąder komórkowych. (DAPI (niebieski), pole jasne (szary)) (B) Uzysk kardiomiocytów izolowanych od różnych myszy w wieku 3 miesięcy. Paski skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2: Immunocytochemia wyizolowanych kardiomiocytów. (A) Reprezentatywny obraz kardiomiocytów barwionych na α-actinin (α-actinin (czerwony) i DAPI (niebieski)). (B) Kardiomiocyty barwione na wbudowane EdU (czerwony) i DAPI (niebieski). Przedstawiono reprezentatywne kardiomiocyty jednojądrowe (lewo), dwujądrowe (środek) i trójjądrowe (prawo), które są dodatnie pod kątem EdU. Paski skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Strategia segmentacji jąder komórkowych. (A) Oryginalny obraz z kanału DAPI. (B) Obraz po progowaniu (w tym przykładzie zastosowano metodę Otsu). (C) Maski zidentyfikowane na obrazach po progowaniu, nałożone na oryginalny obraz barwiony DAPI. (D) Teselacja Voronoi oparta na maskach jąder. (E) Końcowe segmentowane jądra z wyróżnionymi rozdzielonymi skupiskami. Paski skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rycina 4: Strategia segmentacji kardiomiocytów. (A) Oryginalny obraz kardiomiocytów barwionych fluorescencyjnie na Troponinę I. (B) Obraz po zastosowaniu progu trójkątnego (triangle-thresholding), wypełnieniu otworów oraz wykluczeniu małych obiektów i tych dotykających krawędzi. (C) Oryginalny obraz kardiomiocytów w polu jasnym (D) Obraz kardiomiocytów po filtrowaniu krawędzi i zastosowaniu progu trójkątnego (E) Obraz po filtrowaniu krawędzi i domykaniu morfologicznym z promieniem dwóch pikseli (F) Ten sam obraz po wypełnieniu otworów oraz wykluczeniu małych obiektów i tych dotykających krawędzi. Paski skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rycina 5: Klasyfikacja kardiomiocytów na podstawie liczby jąder. Serca noworodkowe (1. dzień życia) zawierają więcej mononuklearnych kardiomiocytów niż serca młodociane (14. dzień życia). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-6
Rycina 6: Rozkład zawartości DNA kardiomiocytów na jądro. U noworodków (po lewej), 13,5% jąder mononuklearnych CM jest tetraploidalnych, a 11,9% jąder binuklearnych CM jest tetraploidalnych. U osobników młodocianych (po prawej), 33,9% jąder mononuklearnych CM jest tetraploidalnych, a 31,2% jąder binuklearnych CM jest tetraploidalnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Plik uzupełniający 1: Zrzuty ekranu oprogramowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Plik uzupełniający 2: AnalyzeNucleation.py. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Plik uzupełniający 3: AnalyzeMultinucleatedServer.R. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dyskusja

Ponieważ kardiomiocyty nie mogą być utrzymywane w hodowli, ważne jest, aby wyizolować pierwotne kardiomiocyty, aby móc badać ich architekturę i funkcję11. W związku z tym techniki izolacji kardiomiocytów są szeroko stosowane w dziedzinie serca. Jeśli celem jest określenie funkcjonalnych aspektów kardiomiocytów, ważne jest, aby wyizolować żywotne kardiomiocyty. Te żywe kardiomiocyty mogą być również wykorzystywane do barwienia immunologicznego izolowanych kardiomiocytów. Jednak optymalizacja techniki izolowania żywych kardiomiocytów jest technicznie trudna, a nawet najlepsze techniki zwykle dają tylko 60-65% żywych kardiomiocytów w kształcie pręcików, a pozostałe kardiomiocyty są zwinięte w kulki i umierają lub są martwe11,12. W tym przypadku opracowaliśmy technikę, która pozwoli naukowcom najpierw naprawić serce, a następnie skutecznie wyizolować kardiomiocyty. Ten nowy protokół pozwala na uzyskanie znacznie wyższej wydajności kardiomiocytów w kształcie pałeczek w porównaniu z wcześniej opublikowanymi protokołami. Ponadto opracowaliśmy platformę do analizy obrazowej w celu automatycznej kategoryzacji kardiomiocytów na podstawie zarodkowania i ploidalności. Dzięki tym nowym metodologiom grupy mogą barwić kardiomiocyty pod kątem różnych białek i badać ploidalność kardiomiocytów i stan zarodkowania jako substytuty potencjału regeneracyjnego serca.

Opisany tutaj protokół jest stosunkowo prosty i może być wykonany bez żadnego zaawansowanego sprzętu. Ilość kolagenazy i czas inkubacji do trawienia mogą się różnić w zależności od partii kolagenazy i firmy ją dostarczającej. Użyliśmy kolagenazy typu 2, ponieważ jest ona najczęściej stosowana do trawienia serca w celu uzyskania żywych kardiomiocytów. Na podstawie naszych obserwacji ustaliliśmy, że nocna inkubacja z kolagenazą typu 2 w dawce 60 mg/ml jest optymalna dla prawie wszystkich serc myszy, niezależnie od poziomu zwłóknienia. Nigdy nie mieliśmy problemu z nadmiernym trawieniem, ponieważ białka wewnątrzkomórkowe są stałe i nie są tak dostępne jak kolagen zewnątrzkomórkowy. Jeśli jednak serce nie jest trawione prawidłowo, może być potrzebne bardziej energiczne rozcieranie, co powoduje fragmentację komórek z powodu naprężenia ścinającego. Dlatego ważne jest, aby upewnić się, że serce jest prawidłowo trawione przed przejściem do roztarcia. Sztywność serca można zbadać, ściskając kleszczami, aby ocenić stopień trawienia. Po inkubacji z kolagenazą serca powinny być mniej sztywne i łatwe do rozerwania. Można również stosować inne rodzaje kolagenazy. W poprzednim raporcie stosowano kombinację kolagenaz B i D14.

Ponadto uważamy, że protokół ten może być wykorzystany do oceny ogólnej liczby kardiomiocytów w sercu15. Jeśli jednak celem jest uzyskanie i ilościowe określenie wszystkich kardiomiocytów z serca, ważne jest, aby inkubować serca przez dłuższy czas w roztworze kolagenazy (np. 3-7 dni), gdzie roztwór kolagenazy należy uzupełniać raz dziennie. Zminimalizuje to niespójności w skuteczności izolacji, eliminując wpływ stopnia roztarcia na wydajność kardiomiocytów.

Wykorzystanie zawartości DNA do pomiaru ploidalności nie jest nowe i jest stosowane w cytometrii przepływowej od dziesięcioleci. Niedawno wykazano, że mikroskopia może być podobnie wykorzystana do oszacowania zawartości DNA w jądrze16. Tutaj wdrożyliśmy tę strategię do pomiaru ploidalności jąder kardiomiocytów, jako substytutu dla nowo powstałych kardiomiocytów. Dogmatem w dziedzinie regeneracji serca jest to, że tylko jednojądrzaste, diploidalne kardiomiocyty mogą ulegać cytokinezie i dawać początek nowym kardiomiocytom. Ponieważ bardzo trudno jest zmierzyć powstawanie nowych kardiomiocytów in vivo, wyizolowanie kardiomiocytów, które były ścigane po podaniu analogu nukleotydu DNA i określenie poziomu monojądrowych, diploidalnych kardiomiocytów zostało wykorzystane jako przybliżenie zdolności serca do generowania nowych kardiomiocytów17. W tym miejscu udostępniamy makro dla ImageJ, które umożliwia łatwą kwantyfikację ploidalności kardiomiocytów. Jako minimum należy zmierzyć 500 jąder, aby uzyskać dokładne oszacowanie położenia piku G1. Jeśli zadba się o to, aby warunki barwienia i obrazowania były spójne w każdym dołku obrazowanej płytki, wystarczy zobrazować tylko 500 jąder w całej próbce, w przeciwnym razie musi być 500 jąder w grupie obrazów18,19. Ograniczenia pomiarów zarodkowania i ploidalności opartych na obrazowaniu obejmują trudności w odróżnieniu jąder od komórek przylegających od rzeczywistych jąder kardiomiocytów przy użyciu obrazów dwuwymiarowych. Takie przylegające komórki mogą powodować przeszacowanie ilości komórek wielojądrowych i zmniejszać dokładność pomiarów populacji jądra tetraploidalnego kardiomiocytów. Jedną z możliwych strategii rozwiązania tego problemu byłoby użycie markera jądrowego kardiomiocytów PCM1 6,20. Mieliśmy jednak trudności z uzyskaniem wiarygodnego barwienia PCM1 na prawidłowo utrwalonych komórkach lub tkankach.

Innym potencjalnym ograniczeniem jest to, że niektóre obrazy wybarwień jądrowych mogą mieć znaczne cytoplazmatyczne barwienie tła, uniemożliwiając prawidłowe progowanie przy użyciu wbudowanych metod Fidżi bez obszernego przetwarzania wstępnego. Ponadto, nieregularny udział tej fluorescencji tła w oszacowaniach ploidalności zmniejsza ich dokładność. Co więcej, jeśli komórki nie zostaną pozostawione w roztworze barwiącym DNA przez wystarczająco długi czas, barwnik fluorescencyjny nie zwiąże się z nasyceniem w jądrach, a założenie liniowej zależności między intensywnością integracji jądrowej a zawartością DNA nie będzie już dokładne.

Należy zauważyć, że oprogramowanie nie może segmentować klastrów kardiomiocytów, a zamiast tego usuwa je z analizy. Dlatego niezwykle ważne jest, aby wysiewać kardiomiocyty o stosunkowo niskiej gęstości (np. 1000 komórek/cm2). Co więcej, oprogramowanie nie jest w stanie odróżnić dwóch kardiomiocytów ustawionych w linii od końca do końca i długich, pojedynczych kardiomiocytów. Tego rodzaju klastry mogą błędnie zawyżać szacunki wielojądrowości.

Chociaż opisana metoda nie pozwala na uzyskanie żywotnych kardiomiocytów, a tym samym nie może być stosowana do pomiaru dynamicznych procesów komórkowych, jeśli celem jest przeprowadzenie barwienia immunologicznego, uważamy, że opisana metoda jest lepsza od istniejących protokołów z wyższą wydajnością kardiomiocytów i lepszą jakością pod względem morfologii i lokalizacji białek. Wreszcie, opisana metoda może być wykorzystana do wyizolowania kardiomiocytów z próbek klinicznych14,21. Uważamy, że opisana metodologia może pomóc różnym badaczom w uzyskaniu wysokiej jakości kardiomiocytów i zmierzeniu zarodkowania i ploidalności jako substytutów tworzenia nowych kardiomiocytów.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

JHvB jest wspierany przez granty z NIH, Medycyny Regeneracyjnej Minnesoty oraz indywidualną nagrodę za badania biomedyczne od Fundacji Hartwell.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 96-dołkowa do obrazowaniaCorning3340Używamy tych płytek, ponieważ nadają się do obrazowania, chociaż szklane płytki dolne byłyby lepsze do obrazowania konfokalnego
Alfa aktyninaNovus BiologicalsNBP1-32462To przeciwciało jest używane jako marker sarkomerów kardiomiocytów
nożyczkiDrobne narzędzia nożycowe14072-10Preferujemy nożyczki, ponieważ możliwość rozerwania tkanki serca jest mniejsza podczas odsłaniania serca
C57BL/6JThe Jackson Laboratory664Służy do obrazowania, oceny ploidalności i zarodkowania w populacji kardiomiocytów
Myszy CD-1Charles River22Służy do obrazowania, oceny ploidalności i zarodkowania w populacji kardiomiocytów
Kolagenaza 2WorthingtonLS004177Dla celów tego protokołu różnice między partiami są minimalne i nie wpływają na ogólną wydajność i jakość izolacji
Siarczan miedzi (II) pentahydratSigma-Aldrich203165-10GDo barwienia edu
Cy5 Picolyl AzideClick Chemistry Tools1177-25Azydek stosowany do barwienia edu
Cytacja3BioTek-Używanydo automatycznego obrazowania do analizy DNA
DAPILife TechnologiesD3571DAPI służy do barwienia DNA. Zapasy rozpuszczono w wodzie destylowanej.
osioł anty-mysz IgG-Alexa568Life TechnologiesA10037Przeciwciało wtórne stosowane do wykrywania barwienia alfa aktyniną w kardiomiocytach
KleszczeROBOZRS-5137Używamy tych zakrzywionych, kleszczy, chociaż można również użyć kleszczy prostych
Kwas solnyFisher ScientificA144212Aby ustawić pH buforu Tris-HCl na pH 8,5
ImageJimagej.net/Fiji/Downloads-Używany do analizy obrazów
Kwas L-askorbinowySigma-Aldrich255564-100GDo barwienia edu
Igła do infuzjiTERUMOSV*23BLKUżywamy skrzydełek w zestawach infuzyjnych w całym protokole, ponieważ łatwo jest manipulować pozycją igły za pomocą tych zestawów podczas iniekcji
Nikon A1R HD25Nikon-Służydo wykonywania konfokalnych obrazów barwienia alfa aktyniną
Siatka nylonowa 200 mikronówElko filtrująca03-200/54Siatka używana do filtrowania zwykłych kardiomiocytów (nie przerośniętych)
Siatka nylonowa 400 mikronówElko filtrująca06-400/38Siatka używana do filtrowania przerośniętych dorosłych kardiomiocytów
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1X)Corning21-040-CVMożna to również przygotować w laboratorium. Chociaż sterylność jest ważna w tym eksperymencie, uważamy, że wystarczy przygotować PBS i przefiltrować go
Chlorek potasu, granulowanyMallinckrodt6858Granulowany chlorek potasu był przez nas preferowany, ponieważ tworzy mniej agregatów, gdy jest przechowywany w temperaturze pokojowej
Rr-project.org-Służy do analizy danych pomiarów uzyskanych z obrazów
Tris BaseFisher ScientificBP152-5Służy do buforowania reakcji barwienia EdU

Bibliografia

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135 (10), e146(2017).
  2. Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the future of cardiovascular disease in the United States: a policy statement from the American Heart Association. Circulation. 123 (8), 933-944 (2011).
  3. Eschenhagen, T., et al. Cardiomyocyte Regeneration: A Consensus Statement. Circulation. 136 (7), 680-686 (2017).
  4. Tzahor, E., Poss, K. D. Cardiac regeneration strategies: Staying young at heart. Science. 356 (6342), 1035-1039 (2017).
  5. Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).
  6. Richardson, G. D. Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
  7. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  8. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  9. Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
  10. Bergmann, O., et al. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Experimental Cell Research. 317 (2), 188-194 (2011).
  11. O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
  12. Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  13. Shaklee, J., et al. Development of a Click-Chemistry Reagent Compatible with Mass Cytometry. Scientific Reports. 8 (1), 6657(2018).
  14. Mollova, M., et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1446-1451 (2013).
  15. Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157 (4), 795-807 (2014).
  16. Roukos, V., Pegoraro, G., Voss, T. C., Misteli, T. Cell cycle staging of individual cells by fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10 (2), 334-348 (2015).
  17. Patterson, M., et al. Frequency of mononuclear diploid cardiomyocytes underlies natural variation in heart regeneration. Nature Genetics. 49 (9), 1346-1353 (2017).
  18. Gomes, C. J., Harman, M. W., Centuori, S. M., Wolgemuth, C. W., Martinez, J. D. Measuring DNA content in live cells by fluorescence microscopy. Cell Division. 13, 6(2018).
  19. Woo, L. A., et al. High-content phenotypic assay for proliferation of human iPSC-derived cardiomyocytes identifies L-type calcium channels as targets. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 127, 204-214 (2018).
  20. Morikawa, Y., Heallen, T., Leach, J., Xiao, Y., Martin, J. F. Dystrophin-glycoprotein complex sequesters Yap to inhibit cardiomyocyte proliferation. Nature. 547 (7662), 227-231 (2017).
  21. Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja kardiomiocyt wutrwalona tkanka sercatrawienie kolagenazwirowanie r nicowebarwienie troponin Tbarwienie alfa aktyninbarwienie j der DAPIplatforma analizy obrazuokre lanie ploidalno ciocena nukleacji

Powiązane artykuły