Prezentowany tutaj jest protokół do terenowej identyfikacji Matricaria chamomilla za pomocą przenośnego systemu qPCR. Ten łatwy do wykonania protokół jest idealny jako metoda potwierdzania tożsamości gatunku botanicznego w miejscach, w których dostęp do sprzętu laboratoryjnego i wiedzy specjalistycznej jest ograniczony, takich jak gospodarstwa rolne i magazyny.
Artykuł metodologiczny
Identyfikacja terenowa Matricaria chamomilla za pomocą przenośnego systemu qPCR
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kontrola jakości produktów botanicznych zaczyna się od dostarczenia surowców. Tradycyjnie, identyfikacja botaniczna odbywa się za pomocą oceny morfologicznej i chemicznych metod analitycznych. Jednak brak dostępności botaników, zwłaszcza w ostatnich latach, w połączeniu z potrzebą poprawy kontroli jakości w celu zwalczania napięć w łańcuchu dostaw spowodowanych rosnącym popytem konsumenckim i zmianami klimatycznymi, wymaga alternatywnych podejść. Celem tego protokołu jest ułatwienie identyfikacji gatunków botanicznych za pomocą przenośnego systemu qPCR w terenie lub w dowolnym miejscu, w którym dostęp do sprzętu laboratoryjnego i wiedzy specjalistycznej jest ograniczony. Docelowy DNA jest amplifikowany za pomocą qPCR na bazie barwnika, przy czym DNA ekstrahowane z botanicznych materiałów referencyjnych służy jako kontrola pozytywna. Docelowy DNA identyfikuje się na podstawie jego specyficznej amplifikacji i dopasowania piku topnienia do kontroli pozytywnej. Szczegółowy opis kroków i parametrów, od praktycznego pobierania próbek w terenie, po ekstrakcję DNA, amplifikację PCR, a następnie interpretację danych, został dołączony, aby zapewnić, że czytelnicy mogą odtworzyć ten protokół. Uzyskane wyniki są zgodne z tradycyjnymi laboratoryjnymi metodami identyfikacji botanicznej. Protokół jest łatwy do wykonania i opłacalny, umożliwiając testowanie jakości surowców jak najbliżej miejsca pochodzenia łańcucha dostaw.
Wprowadzenie
Praktyka używania roślin do utrzymania i poprawy zdrowia sięga tysięcy lat. Ze względu na napięcia w łańcuchu dostaw spowodowane zwiększonym popytem konsumenckim1, niezrównoważonymi praktykami pozyskiwania plonów i zmianami klimatycznymi2, zafałszowania botaniczne stają się coraz większym problemem w branży żywności i suplementów diety3. Obecność niezgłoszonych lub błędnie zidentyfikowanych gatunków botanicznych może prowadzić do zmniejszenia skuteczności, a nawet problemów z bezpieczeństwem. Na przykład pluskwica groniasta (Actaea racemosa), stosowana w leczeniu dyskomfortu przedmiesiączkowego, może być zastąpiona tanim gatunkiem azjatyckim z ograniczonym wsparciem klinicznym dla jego skuteczności4. W poważniejszym przypadku zastąpienie Stephania terandra preparatem Aristolochia fangchi w badaniu klinicznym dotyczącym utraty wagi przy użyciu chińskich ziół doprowadziło do ciężkiej nefrotoksyczności i niewydolności nerek u niektórych uczestników5,6. Te dwa różne gatunki miały wspólną chińską nazwę "Fang Ji". Przypadki te podkreślają potrzebę bardziej rygorystycznej kontroli jakości, począwszy od identyfikacji surowców7, najlepiej jak najbliżej miejsca pochodzenia łańcucha dostaw, aby można było efektywnie alokować zasoby do materiału o prawidłowej tożsamości.
Do identyfikacji botanicznej można użyć wielu ortogonalnych podejść. Tradycyjnie, identyfikacja botaniczna jest przeprowadzana poprzez ocenę morfologiczną8,9 i chemiczne metody analityczne10,11,12,13. Identyfikacja morfologiczna opiera się na różnicach w makroskopowych i mikroskopowych cechach materiałów roślinnych, jeśli istnieją różnice (Rysunek 1). Jednak brak programów szkoleniowych z zakresu botaniki klasycznej w ostatnich latach spowodował niedobór ekspertów14, co czyni to podejście niepraktycznym w rutynowej kontroli jakości. Jego zastosowanie w sproszkowanych materiałach botanicznych jest również ograniczone. Chemiczne metody analityczne są szeroko stosowane w farmakopeach i laboratoriach, ale nie są idealne do badań terenowych ze względu na rozmiar przyrządów, takich jak wysokosprawna chromatografia cienkowarstwowa (HPTLC), wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) (Rysunek 2) oraz wymagania środowiskowe. Ostatnio metody genomiczne pojawiły się jako alternatywna technika uwierzytelniania i wykrywania substytucji gatunków botanicznych, które okazały się skuteczne i precyzyjne. Metody genomiczne wykorzystują wysoką wierność i swoistość informacji genetycznej w materiałach roślinnych15,16,17,18,19. Molekularne narzędzia diagnostyczne są dostępne w postaci urządzeń przenośnych i często obejmują zautomatyzowane narzędzia do interpretacji danych, które obniżają barierę w korzystaniu z technologii, dzięki czemu podejście to jest idealne do identyfikacji w terenie20,21,22,23,24. Po zaprojektowaniu i walidacji metody analizy molekularnej25,26,27, może być ona wykonywana przez dowolny personel z podstawowym przeszkoleniem z zakresu biologii molekularnej. Spośród różnych dostępnych narzędzi przenośnych, PCR w czasie rzeczywistym na sekwencjach DNA jest jednym z opłacalnych wyborów28. Połączenie przenośnego urządzenia z dostosowaną i zwalidowaną analizą molekularną umożliwia weryfikację gatunków botanicznych i składników poza laboratorium, np. w gospodarstwach rolnych i magazynach materiałów botanicznych, redukując czas i koszty związane z tradycyjnymi metodami.
Celem tego protokołu jest wprowadzenie metody identyfikacji botanicznej w sytuacjach, gdy dostęp do sprzętu laboratoryjnego i wiedzy specjalistycznej jest ograniczony lub niedostępny, przy użyciu przenośnego systemu qPCR. Metoda została zademonstrowana na polu Matricaria chamomilla (Ryc. 3A), powszechnie znana jako rumianek niemiecki, szeroko stosowana ze względu na swoje właściwości przeciwzapalne i przeciwutleniające29. Można go pomylić z pokrewnymi gatunkami o podobnym wyglądzie lub zapachu, zwłaszcza z rodzajów Chamaemelum, Tanacetum i Chrysanthemum30,31,32. Wśród spokrewnionych gatunków, Chamaemelum nobile, znany również jako rumianek rzymski, jest zauważalny z porównywalnymi poziomami produkcji w handlu (Rysunek 3B). Zaprezentowana metoda została opracowana nie tylko w celu identyfikacji docelowego gatunku botanicznego M. chamomilla, ale także wykrycia jego bliskiego krewnego, C. nobile, w oparciu o specyficzną amplifikację sekwencji DNA.
Ten artykuł wyjaśnia szczegółowo, jak przeprowadzić terenową identyfikację botaniczną M. chamomilla za pomocą interkalacyjnego qPCR opartego na barwniku i analizy krzywej topnienia na urządzeniu przenośnym. Protokół obejmuje pobranie próbek botanicznych z terenu, ekstrakcję DNA na miejscu oraz przygotowanie reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Aby zapewnić prawidłowe wnioski, jako kontrolę pozytywną wykorzystuje się docelowe botaniczne DNA M. chamomilla i niedocelowe botaniczne botaniczne DNA C. nobile, wstępnie wyekstrahowane z certyfikowanych botanicznych materiałów referencyjnych. Swoistość tej metody wykazano poprzez przeprowadzenie testów identyfikacyjnych zarówno M. chamomilla, jak i C. nobile indywidualnie na próbkach i kontrolach. Nieszablonowa kontrola ujemna służy do wykluczenia wyników fałszywie dodatnich spowodowanych zanieczyszczeniem PCR.
Protokół
1. Pobieranie próbek
- Ustaw obszar testowy w terenie z płaską i poziomą powierzchnią.
- Zidentyfikuj reprezentatywną roślinę, która odzwierciedla cechy większości roślin na polu kwiatów rumianku (Rysunek 4).
- Zbierz główkę kwiatu z reprezentatywnej rośliny za pomocą sterylnych rękawiczek.
- Umieścić próbkę w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml.
- Powtórz kroki od 1,3 do 1,4 i zbierz ulotkę (o długości około 0,5–0,7 cm) z tej samej rośliny.
UWAGA: Kwiat i liść M. chamomilla są na tyle małe, że mieszczą się na dnie probówki zbiorczej o pojemności 2,0 ml. W przypadku innych roślin o większej powierzchni można użyć dziurkacza lub nożyczek (przed użyciem wypłukanych w 70% etanolu) do wyizolowania próbek tkanek do testów. Gdy wymagane jest wielokrotne pobieranie próbek, należy opłukać dziurkacz lub nożyczki między kolejnymi czynnościami związanymi z różnymi próbkami.
2. Ekstrakcja DNA
- Rozgrzej inkubator w suchej kąpieli do temperatury 95 °C.
- Do każdej probówki zbiorczej dodać 100 μl roztworu ekstrakcyjnego z zestawu do ekstrakcji DNA roślin (wymienionego w tabeli materiałów). Aby uzyskać lepszą wydajność ekstrakcji DNA, zmiel próbkę tkanki w roztworze ekstrakcyjnym za pomocą tłuczka do tkanek.
- Zamknij rurkę. Upewnij się, że tkanka botaniczna jest pokryta roztworem ekstrakcyjnym przez cały proces ekstrakcji.
- Umieścić probówki zbiorcze w nagrzanym inkubatorze w suchej kąpieli i inkubować probówki w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
- Po 10 minutach wyjmij probówki z inkubatora do suchej kąpieli.
- Dodać 100 μl roztworu rozcieńczającego z tego samego zestawu do ekstrakcji DNA i wymieszać roztwór, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół.
- Powtórz ten sam krok w przypadku ekstrakcji ulotki.
- Wstrząśnij, aby jeszcze bardziej wymieszać roztwór. Tkanka roślinna zwykle nie wydaje się być zdegradowana po tym zabiegu. Kolor cieczy może ulec zmianie i stać się mętny.
UWAGA: Rozcieńczony roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej przez noc, jeśli nie nastąpi to natychmiast. Nie jest konieczne usuwanie resztek komórkowych z tkanki roślinnej przed przechowywaniem. Ciecz w probówkach zawiera matryce DNA do dalszej amplifikacji PCR.
3. Konfiguracja reakcji PCR
- Skonfiguruj warunki termocyklingu instrumentu qPCR zgodnie ze specyfikacją producenta. Zastosować profil termocyklingu PCR wymieniony w (Tabela 1), który rozpoczyna się od stałego kroku temperatury dla początkowej denaturacji, po którym następuje 25 cykli amplifikacji, a kończy się wzrostem temperatury w celu uzyskania krzywej topnienia o wysokiej rozdzielczości.
- Przed użyciem rozmrozić qPCR Master Mix i startery (Tabela 2) w temperaturze pokojowej.
- Zaplanuj reakcję, która zostanie załadowana do każdej studzienki: studzienki zawierające kontrolę pozytywną z gatunkami docelowymi, kontrolę pozytywną z gatunkami niedocelowymi, próbki i kontrolę ujemną (Rysunek 5).
- W tym przykładzie użyto dziesięciu studzienek – pięciu do niemieckiego testu identyfikacyjnego rumianku, a pozostałe pięć do testu identyfikacji rumianku rzymskiego. W przypadku każdego rodzaju badania identyfikacji gatunku jedna studzienka zawiera kontrolę pozytywną z DNA wyekstrahowanym z materiału referencyjnego gatunków docelowych, jedna studzienka zawiera kontrolę pozytywną z DNA wyekstrahowanym z materiału referencyjnego gatunków niedocelowych, dwie studzienki wypełnia się próbkami DNA kwiatów i liści pobranymi z pola, a jedna studzienka jest przeznaczona do kontroli ujemnej. Tabela 3 opisuje każdy typ studni.
- Przygotować wzorcową mieszankę reakcji zgodnie z instrukcją dla każdego badania identyfikacji gatunku botanicznego. Typowa mieszanka wzorcowa reakcji zawiera uniwersalną mieszankę mistrzowską qPCR (2x), startery specyficzne dla gatunku do przodu i do tyłu oraz wodę wolną od nukleaz. W tabeli 4 przedstawiono skład układu reakcyjnego.
UWAGA: Jeśli nie zużyć od razu, przechowuj główną mieszankę reakcji qPCR w temperaturze od +2 °C do +8 °C w chłodziarce lub minilodówce. - Przed użyciem dokładnie wymieszać mieszankę wzorcową reakcji, pipetując.
- Umieść wkład qPCR stroną zadrukowaną do góry na płaskiej i stabilnej powierzchni.
- Załadować 18 μl wzorcowej mieszanki reakcyjnej skonfigurowanej w kroku 3.4 do studzienek z wkładami zgodnie z dołkami zdefiniowanymi w kroku 3.3. W tej demonstracji dodaj niemiecką mieszankę wzorcową reakcji testu identyfikacji rumianku do studzienek oznaczonych do testu GC (GCT w dołkach 1, 3, 5, 7, 9) i mieszankę wzorcową testu identyfikacji rumianku rzymskiego do studzienek oznaczonych do testu RC (RCT w studzienkach 2, 4, 6, 8, 10) (patrz Rysunek 5).
- Przenieść 2 μl próbki DNA z supernatantu probówek do ekstrakcji DNA i wstępnie wyekstrahowanych dodatnich kontroli DNA do studzienek z wkładami wstępnie załadowanymi mieszanką wzorcową qPCR. Po dodaniu każdej matrycy DNA do głównej mieszanki qPCR, delikatnie wymieszać roztwór, pipetując.
UWAGA: Unikaj unoszących się na wodzie resztek komórkowych podczas przenoszenia DNA z probówki do ekstrakcji DNA. W razie potrzeby użyj miniwirówki, aby oddzielić supernatant i resztki komórkowe. - Ostrożnie uszczelnij wkład folią samoprzylepną. Załaduj wkład do komory termocyklingowej i zamknij ją.
- Ustaw urządzenie qPCR tak, aby działało.
Wyniki
Zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 1, botaniczne DNA z kwiatostanu i liścia zostało wyekstrahowane do nadsączu po inkubacji termicznej probówki z materiałem w temperaturze 95 °C przez 10 min. W niniejszym badaniu nadsącz z kwiatu i liścia wykazywał kolor żółty i zielonkawy, co wskazuje, że wraz z botanicznym DNA do nadsączu uwolniła się różnorodna grupa związków naturalnych (Rycina 6). Chociaż w dalszej kolejności uzyskano wiarygodną amplifikację PCR w trzech powtórzeniach dla wszystkich matryc DNA wyekstrahowanego w terenie, w laboratorium przeprowadzono referencyjną ocenę jakości DNA. Stężenie ekstraktu DNA z kwiatostanu, określone metodą fluorometrii, wynosiło od 3,69–5,36 ng/µL, natomiast stężenie ekstraktu DNA z liścia wynosiło od 6,42–9,29 ng/µL. Stosunki absorbancji A260/A280 oraz A260/A230 ekstraktów DNA z kwiatu i liścia zmierzono spektrofotometrycznie. Jednak ze względu na nakładanie się widm absorpcji UV DNA i fitochemicznej, stosunki te nie mogły zostać wiarygodnie zmierzone (dane nie pokazano).
Do monitorowania amplifikacji fragmentów docelowych w czasie rzeczywistym zastosowano fluorescencyjny barwnik interkalujący. Ponieważ specyficzne primery dla M. chamomilla oraz C. nobile są skierowane przeciwko regionowi wewnętrznego odstępnika transkrybowanego 2 (ITS2), który występuje w genomie rośliny w dziesiątkach lub setkach kopii, 25 cykli amplifikacji PCR jest wystarczających do wytworzenia liczby amplikonów umożliwiającej identyfikację gatunków rumianku. Na Rysunku 7 wartość Ct dla kontroli dodatniej M. chamomilla w teście identyfikacji M. chamomilla była mniejsza niż 25 (GCP_GCT), natomiast po 25 cyklach amplifikacji fluorescencja tej samej kontroli w teście identyfikacji C. nobile znajdowała się poniżej progu detekcji (GCP_RCT). Z drugiej strony, po 25 cyklach fluorescencja dla kontroli dodatniej C. nobile w teście identyfikacji M. chamomilla była poniżej progu detekcji (RCP_GCT), podczas gdy wartość Ct dla tej samej kontroli w teście identyfikacji C. nobile była mniejsza niż 25 (RCP_RCT). Amplifikacja kontroli dodatnich docelowych i niedocelowych w ich odpowiednich testach potwierdza specyficzność testu identyfikacji M. chamomilla. W przypadku DNA z próbek, ekstrakty DNA z koszyczków kwiatowych i liści pobranych w terenie wykazały w teście identyfikacji M. chamomilla wartości Ct odpowiednio 15,18 i 19,41 (Sample1(FLOWER)_GCT oraz Sample2(LEAF)_GCT). Żadna z tych próbek nie uległa amplifikacji w teście identyfikacji C. nobile (Sample1(FLOWER)_RCT oraz Sample2(LEAF)_RCT). Wzorce amplifikacji obu próbek były zgodne ze wzorcem amplifikacji kontroli dodatniej M. chamomilla. Kontrole ujemne nie uległy amplifikacji ani w teście identyfikacji M. chamomilla, ani w teście C. nobile (NC_GCT oraz NC_RCT), co wyklucza możliwość wystąpienia wyników fałszywie dodatnich spowodowanych kontaminacją PCR. Aby dodatkowo potwierdzić specyficzną amplifikację w kontrolach dodatnich i próbkach, frakcje produktu końcowego PCR z każdej studzienki poddano elektroforezie na 2% żelu agarozowym w laboratorium (Rysunek 8). W teście identyfikacji M. chamomilla obie próbki terenowe dały amplikony w tej samej pozycji co kontrola dodatnia M. chamomilla, o szacowanej wielkości nieco powyżej 100 bp (wielkość teoretyczna 102 bp). W teście identyfikacji C. nobile kontrola dodatnia gatunku niedocelowego C. nobile dała prążek między 50 a 100 bp, co odpowiada teoretycznej wielkości 65 bp. Pozostałe ścieżki nie wykazały specyficznego produktu amplifikacji, co było zgodne z brakiem sygnału fluorescencji w tych studzienkach zaobserwowanym podczas testów terenowych.
Po amplifikacji PCR przeprowadzono analizę krzywej topnienia, aby ocenić charakterystykę dysocjacji dwuniciowego DNA (dsDNA) podczas ogrzewania. W miarę wzrostu temperatury podczas końcowego cyklu analizy krzywej topnienia, wzrost temperatury powodował dysocjację dwuniciowych amplikonów. Interkalujący barwnik fluorescencyjny był stopniowo uwalniany do roztworu, co prowadziło do spadku intensywności fluorescencji (Rycina 9A). Punkt przegięcia krzywej pierwszej pochodnej wykorzystano do wyznaczenia temperatury topnienia (Tm) (Rycina 9B), która zależy głównie od długości fragmentu DNA oraz zawartości GC. Połączenie wartości Ct z temperaturą topnienia może zwiększyć swoistość analizy qPCR. W niniejszym badaniu szczyt temperatury topnienia amplikonu PCR kontroli pozytywnej M. chamomilla wystąpił przy 85.6 °C (GCP_GCT), co odróżniało go od szczytu temperatury topnienia amplikonu PCR kontroli pozytywnej C. nobile przy 79.1 °C (RCP_RCT). Amplikony PCR z kwiatostanów i liści pobranych w terenie wykazały szczyty temperatury topnienia odpowiednio przy 85.2 °C i 84.8 °C (Sample1(FLOWER)_GCT oraz Sample2(LEAF)_GCT). Aby ocenić wariacje temperatury topnienia mierzone za pomocą przenośnego systemu qPCR, zebrano dodatkowe punkty danych, aby potwierdzić, że temperatury topnienia próbek były zawsze zbliżone do temperatury topnienia uzyskanej dla kontroli pozytywnej M. chamomilla (w granicach 2 °C) i oddalone od temperatury topnienia amplikonu kontroli pozytywnej C. nobile (Rycina 10). Szczyty temperatury topnienia odnotowano czasami w innych studzienkach. Jednak ich wartości Ct nie były niższe niż 25, a szczyty temperatury topnienia nie znajdowały się blisko kontroli pozytywnej M. chamomilla ani C. nobile (różnica powyżej 2 °C).
Podsumowując, wynik testu identyfikacyjnego M. chamomilla w terenie można zinterpretować w oparciu o reguły decyzyjne przedstawione w Tabeli 5. Biorąc pod uwagę, że wszystkie kontrole dodatnie dały wynik dodatni dla domniemanego gatunku botanicznego i wynik ujemny dla pozostałych gatunków, a kontrole ujemne dały wynik ujemny, ustalono, że obie próbki terenowe zawierają M. chamomilla, ale nie C. nobile. Ponadto, aby uzgodnić wyniki testów terenowych z innymi technikami analitycznymi, wnioski z badań terenowych zostały dodatkowo potwierdzone za pomocą wcześniej zwalidowanej metody kodowania DNA (DNA barcoding)25 (dane nie przedstawiono).
Rycina 1: Identyfikacja morfologiczna materiałów botanicznych.(A) kwiaty Hibiscus rosa-sinensis, korzenie Curcuma longa, liście Malva Sylvestris, liście Rosmarinus officinalis, nasiona Coriandrum sativum, korzenie Zingiber officinale. (B) Płatki Petroselinum crispum i Apium graveolens są trudne do odróżnienia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Identyfikacja chemiczna materiałów botanicznych. (A) Aparatura HPTLC oraz reprezentatywny chromatogram HPTLC. (B) Aparatura HPLC oraz reprezentatywny chromatogram HPLC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Matricaria chamomilla oraz Chamaemelum nobile w terenie. (A) Matricaria chamomilla, zaadaptowano z Wikipedii na licencji CC BY-SA 3.0, https://en.wikipedia.org/wiki/Matricaria_chamomilla#/media/File:Matricaria_February_2008-1.jpg. (B) Chamaemelum nobile, zaadaptowano z Wikipedii na licencji CC BY-SA 3.0, https://en.wikipedia.org/wiki/Chamomile#/media/File:Chamaemelum_nobile_001.JPG. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4: Zbieranie części roślin M. chamomilla w terenie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5: Układ studni testowych w demonstracji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 6: Ekstrakt DNA z terenu w probówkach zbiorczych. Tkanka botaniczna pozostaje w oryginalnej probówce i jest pokryta żółtawym ekstraktem DNA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 7: Wykres fluorescencji pokazujący akumulację produktów PCR w ciągu 25 cykli termocyklingu. Kontrola pozytywna M. chamomilla oraz kontrola pozytywna C. nobile wykazują wartości Ct mniejsze niż 25 odpowiednio w testach identyfikacji M. chamomilla i C. nobile. Próbki kwiatów i liści pobrane z pola zostały amplifikowane w teście identyfikacji M. chamomilla z wartościami Ct wynoszącymi 15,18 i 19,41. Pozostałe studzienki nie uległy amplifikacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 8: Elektroforeza żelowa produktów amplifikacji PCR wykonanej w terenie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 9: Analiza temperatury topnienia. (A) Sygnał fluorescencji w każdej studience maleje wraz ze wzrostem temperatury. (B) Tożsamość produktów PCR została potwierdzona poprzez szczyt temperatury topnienia w analizie krzywej topnienia. Próbki kwiatów i liści z terenu wykazują szczyty przy 85.2 °C i 84.8 °C. Są one zbliżone do szczytu uzyskanego dla kontroli pozytywnej M. chamomilla. Kontrola pozytywna C. nobile wygenerowała szczyt przy 79.1 °C, który różni się od wyników trzech pozostałych próbek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 10: Zmienność piku temperatury topnienia między kontrolą pozytywną a próbkami terenowymi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Etap | Cykl | Temperatura | Czas |
| Stała temperatura | 1 | 95 °C | 60 s |
| Amplifikacja | 25 | 95 °C | 30 s |
| 60 °C | 30 s | ||
| Krzywa topnienia | 1 | 60 °C | Rampa 0.05 °C/s |
| 95 °C |
Tabela 1: Warunki cykli termicznych qPCR dla testów identyfikacji M. chamomilla i C. nobile.
| Analiza | Nazwa startera | Sekwencja 5'-3' | Położenie | Region | Wielkość amplikonu | |
| Matricaria recutita | ZL3 | TCGTCGGTCGCAAGGATAAG | Wstęp | ITS2 | 102 bp | |
| ZL4 | TAAACTCAGCGGGTAGTCCC | Odwrócenie | ||||
| Chamaemelum nobile | ZL11 | TGTCGCACGTTGCTAGGAAGCA | Wstęp | ITS2 | 65 bp | |
| ZL12 | TCGAAGCGTCATCCTAAGACAAC | Odwrócenie | ||||
Tabela 2: Pary starterów do testów identyfikacyjnych M. chamomilla i C. nobile.
| Położenie dołka | Nazwa studzienki | Opis | |
| 1 | GC_KontrolaDodatnia_Test_GC | Kontrola pozytywna z rumianku niemieckiego w teście GC | |
| 2 | GC_KontrolaPozytywna_RC_Test | Kontrola pozytywna z rumianku niemieckiego w teście RC | |
| 3 | RC_PosCtrl_GC_Test | Kontrola dodatnia rumianku rzymskiego w badaniu GC | |
| 4 | RC_KontrPos_RC_Test | Kontrola pozytywna z rumianku rzymskiego w teście RC | |
| 5 | Badanie_prób_terenowych_GC | Próbka tkanki liściowej w teście GC | |
| 6 | Test_RC_Próbki_Polowej | Próbka tkanki liścia poddana testowi RC | |
| 7 | Test_GC_próbek_terenowych | Próbka tkanki kwiatowej w teście GC | |
| 8 | Test_RC_Próbki_Polowej | Próbka tkanki kwiatowej w teście RC | |
| 9 | Test_KontrolaNeg_GC | Próbka kontroli negatywnej w teście GC | |
| 10 | Test_RC_NegCtrl | Próbka kontrolna negatywna w teście RC | |
Tabela 3: Typy studzienek i opisy dla testów identyfikacyjnych M. chamomilla oraz C. nobile.
| Odczynnik | Test_GC | Test_RC |
| Uniwersalna mieszanina do qPCR* | 10 µL | 10 µL |
| starter ZL3 (10 µM) | 0.4 µL | Brak danych |
| starter ZL4 (10 µM) | 0.4 µL | Nie dotyczy |
| starter ZL11 (10 µM) | ND | 0.4 µL |
| starter ZL12 (10 µM) | ND | 0.4 µL |
| H2O (wolna od nukleaz) | 7.2 µL | 7.2 µL |
| * zawiera polimerazę Taq DNA typu Hot Start | ||
Tabela 4: Skład master-mixu do testów identyfikacyjnych M. chamomilla i C. nobile.
| Nazwa otworu | Oczekiwany wynik | Kryteria wyniku dodatniego | Kryteria wyniku negatywnego |
| Wykryto / Obecny | Nie wykryto / Brak | ||
| GC_KontrolaPozytywna_Test_GC | Wykryto | Ct < 25 i 84 <= Tm <= 86 | - |
| GC_KontrolaPozytywna_RC_Test | Nie wykryto | - | Brak wartości Ct w ciągu 25 cykli |
| RC_PosCtrl_GC_Test | Nie wykryto | - | Brak wartości Ct w ciągu 25 cykli |
| RC_KontrolaPozytywna_RC_Test | Wykryto | Ct < 25 i 79 <= Tm <= 81 | - |
| Test_GC_liści_z_prób_terenowych | Przedstawić | Ct < 25 i 84 <= Tm <= 86 | Brak wartości Ct w ciągu 25 cykli |
| Test_RC_Liścia_z_Próbki_Polowej | Nieobecny | - | Brak wartości Ct w ciągu 25 cykli |
| Test_GC_próbki_kwiatu_z_terenu | Prezentuj | Ct < 25 i 84 <= Tm <= 86 | Brak wartości Ct w ciągu 25 cykli |
| Test_RC_Próbki_Kwiatów_z_Terenu | Nieobecny | - | Brak wartości Ct w ciągu 25 cykli |
| Test_KontrolnaNegatywna_GC | Nie wykryto | - | Brak wartości Ct w ciągu 25 cykli |
| Test_KontroliNegatywnej_RC | Nie wykryto | - | Brak wartości Ct w ciągu 25 cykli |
Tabela 5: Zasady interpretacji wyników qPCR.
Dyskusja
Projektowanie starterów i wybór matryc są kluczowymi krokami w uzyskaniu wydajnej i specyficznej amplifikacji qPCR. Po zidentyfikowaniu odpowiedniego szablonu, zwykle stosuje się oprogramowanie do projektowania podkładów, aby pomóc w doborze podkładów na podstawie zmiennych projektowych, takich jak długość podkładu, temperatura topnienia i zawartość GC33,34. Optymalizację i walidację można przeprowadzić w oczekiwanych warunkach eksperymentalnych testu, aby zapewnić swoistość, czułość i solidność reakcji PCR35. Nieoptymalna konstrukcja startera może prowadzić do tworzenia się starter-dimer, w którym interakcje starterów wytwarzają produkty niespecyficzne36.
Kontrola bez matrycy (NTC) zastosowana w tym badaniu sprawdza zarówno zanieczyszczenie DNA, jak i obecność dimerów starterów, które mogą wpływać na test. Wyniki nie wykazały amplifikacji, co jest dobrą wskazówką, że zarówno zanieczyszczenie DNA, jak i dimery starterów nie stanowią problemu. Zanieczyszczenie DNA i dimery starterów objawiają się w krzywych topnienia bez kontroli matrycowych oraz jako dodatkowe piki w krzywych topnienia kontroli pozytywnych. Zazwyczaj oczekuje się, że krzywa topnienia kontroli dodatniej będzie zawierać pojedynczy pik, chyba że poddomeny bogate w AT w matrycy powodują nierównomierne topnienie. Podwójne piki można przewidzieć, symulując testy topnienia za pomocą oprogramowania uMELT37. W tym badaniu zastosowano złoty standard uruchamiania produktu PCR na żelu agarozowym, aby potwierdzić obecność docelowego produktu PCR oraz brak zanieczyszczeń i dimerów starterów.
Sporym wyzwaniem w analizie molekularnej materiału botanicznego jest uzyskanie dobrej jakości DNA w wyniku procesu ekstrakcji DNA botanicznego. Materiały botaniczne są sprzedawane i spożywane ze względu na aktywne związki chemiczne, które są związane z korzyściami zdrowotnymi. W procesie ekstrakcji DNA te związki chemiczne będą również uwalniane do roztworu do ekstrakcji DNA, potencjalnie powodując zahamowanie PCR, powodując w ten sposób niepowodzenia amplifikacji PCR. Opracowano różne zestawy do oczyszczania DNA roślin przy użyciu rozpuszczalników organicznych i kolumn w celu usunięcia związków chemicznych pochodzących z roślin38. Jednak dygestorium i wirówka szybkoobrotowa wymagane do obsługi tych zestawów nie są dostępne w terenie.
W obecnym protokole uproszczona metoda ekstrakcji DNA wykorzystuje komercyjny zestaw do ekstrakcji DNA roślin (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów ). Miał zdolność neutralizowania powszechnych substancji hamujących w celu uzyskania powtarzalnych wyników i dawał spójne wyniki dla M. chamomilla i C. nobile. Zarówno główki i liście kwiatowe M. chamomilla , jak i C. nobile dawały amplikony PCR o określonych pikach topnienia, co wskazuje, że obecność inhibitorów PCR nie stanowiła problemu. W przypadku innych roślin z wyższymi poziomami inhibitorów PCR amplifikacja DNA w ich pierwotnej ekstrakcji może być mniej wydajna. Aby zmniejszyć inhibicję i poprawić wydajność amplifikacji, mając dostęp do całej rośliny, do celów identyfikacji można również wykorzystać inne części rośliny o niższej zawartości polisacharydów i polifenoli. Jeśli dostęp do różnych części rośliny jest ograniczony, młodsze liście lub płatki wycięte z główek kwiatowych, które zazwyczaj mają niższą zawartość fenolu39, mogą mieć większe szanse na sukces. Ponieważ sekwencje DNA są spójne w całej roślinie, każda część rośliny może być wykorzystana do potwierdzenia tożsamości gatunku. Jeśli amplifikacja PCR jest nadal nieoptymalna, oryginalny ekstrakt DNA można dodatkowo rozcieńczyć przed PCR lub zastosować bardziej wyrafinowane protokoły oczyszczania laboratoryjnego.
Kolejnym wyzwaniem dla analizy PCR są fałszywie dodatnie wyniki spowodowane zanieczyszczeniem DNA, które może negatywnie wpłynąć na interpretację danych. Zazwyczaj jest on kontrolowany przez aktywne sprzątanie, korzystanie z dedykowanego sprzętu i ograniczanie pracy do wyznaczonych obszarów. Za pomocą qPCR wszystkie analizy PCR można przeprowadzić w zamkniętym systemie, co znacznie zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia amplikonem PCR w środowisku, które nie jest dobrze kontrolowane. Poza tym środowiskowe DNA nie powinno również wykazywać fałszywie dodatniego wyniku ze względu na specyficzność testu, zgodnie z poprzednim badaniem walidacyjnym40.
Jest miejsce na poprawę. W przedstawionym tutaj protokole zastosowano barwnik interkalacyjny, aby pokazać amplifikację fragmentu docelowego w czasie rzeczywistym. Specyfikę metody potwierdza ponadto charakterystyczna temperatura topnienia, która jest odmienna między amplikonami M. chamomilla i C. nobile . Dlatego interkalacyjny PCR na bazie barwnika może skutecznie odpowiedzieć na pytanie "Co to za gatunek rośliny?" w terenie. Jednak oprócz konieczności przeprowadzenia identyfikacji botanicznej na pojedynczej roślinie odizolowanej z pola, w wielu przypadkach proszki lub ekstrakty roślinne w magazynie również skorzystają z szybkiej oceny tożsamości na miejscu. W przypadku tego typu materiałów może być konieczne udzielenie odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak: "Co znajduje się w tym materiale?", "Czy zawiera gatunki botaniczne, których szukam?", "Czy zawiera domieszki, których chcę uniknąć?" i "Czy jest całkowicie lub częściowo zastąpiony innymi gatunkami botanicznymi, które są szkodliwe?". Zamiast stosowania barwnika interkalacyjnego, można zaprojektować różne sondy qPCR do celowania w amplikony z różnych składników botanicznych w jednym systemie reakcyjnym, przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej specyficzności i wydajności testu. Opracowanie qPCR opartego na sondzie i wykorzystanie przenośnego systemu qPCR, który oferuje detekcję wielokanałową, może jeszcze bardziej rozszerzyć zastosowanie testów terenowych jako testu dopasowanego do celu na szersze środowisko, takie jak magazyny materiałów botanicznych i centra dystrybucji, aby odpowiedzieć na bardziej skomplikowane pytania. Ponadto użycie wielu sond pozwala również użytkownikowi na włączenie wewnętrznej amplifikacji do każdego układu reakcyjnego, dzięki czemu więcej informacji będzie dostępnych w przypadku podejrzenia zahamowania PCR.
Przedstawiony tutaj protokół ma następujące zalety w porównaniu z istniejącymi technologiami wykorzystywanymi w tym samym celu. Po pierwsze, w przypadku tradycyjnych metod identyfikacji morfologicznej i chemicznej, procedura i jej wyniki muszą zostać przeprowadzone i zinterpretowane przez ekspertów. Testy identyfikacyjne oparte na qPCR mogą być przeprowadzane przez osoby z podstawowym wykształceniem z zakresu biologii molekularnej i interpretowane w bardziej ustandaryzowany sposób. Po drugie, w porównaniu z identyfikacją i różnicowaniem gatunków opartym na qPCR, zwykle przeprowadzanym w laboratorium, protokół identyfikacji terenowej przy użyciu przenośnego przyrządu nie wymaga instrumentów o dużej powierzchni, takich jak wirówka o dużej prędkości, sprzęt do oceny jakości DNA, termocykler z detektorem fluorescencji oraz komputer ze specjalnym oprogramowaniem. W ten sposób identyfikacja gatunków na podstawie DNA może być przeprowadzona w dowolnym miejscu bez opóźnień. Po trzecie, poszukiwanie materiałów botanicznych jest zadaniem, które wymaga globalnej operacji. Dzięki postępom w usługach w chmurze i sztucznej inteligencji urządzenie przenośne może potencjalnie otrzymywać metody opracowane i zatwierdzone przez ekspertów w laboratorium, być obsługiwane przez osoby niebędące ekspertami w odległych obszarach i uzyskiwać obiektywne certyfikaty od stron trzecich. Dlatego ta opcja jest bardziej atrakcyjna niż kiedykolwiek, a praca zdalna staje się trendem.
Podsumowując, w niniejszym protokole zademonstrowano identyfikację terenową M. chamomilla za pomocą przenośnego systemu qPCR. Pomyślne zastosowanie tej techniki pozwoli uzyskać bardzo dokładne wyniki identyfikacji botanicznej i pomoże producentom i dostawcom botanicznym kwalifikować materiały botaniczne w sposób terminowy i opłacalny.
Oświadczenia
Zaświadczamy, że Zhengxiu Yang, Zheng Quan, Tiffany Chua, Leo Li, Yanjun Zhang, Silva Babajanian, Tricia Chua, Peter Chang, Gary Swanson, Zhengfei Lu są pracownikami Herbalife International of America, Inc. Zaświadczamy, że Francesco Buongiorno, Isabella Della Noce i Lorenzo Colombo są pracownikami firmy Hyris Ltd., która produkuje przenośny przyrząd qPCR używany w tym artykule.
Podziękowania
Dziękujemy Jamesowi Shanowi za jego wysiłki w nagrywaniu filmów terenowych. Dziękujemy Jonowi Byronowi i Matthew Semerau za ich pracę przy montażu wideo. Dziękujemy Ansenowi Luo, Harry'emu Du i Frankowi Dengowi za ich wsparcie w zlokalizowaniu pola testowego. Dziękujemy Marii Rubinsky za cenne uwagi do całego rękopisu. Wszystkie wyróżnione osoby są pracownikami Herbalife International of America, Inc.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Bateria | TNE | 78000mAh | Zapewnij zasilanie polowe |
| bCUBE | HYRIS | bCUBE 2.0 | do przyrządów qPCR |
| (16 dołków) | HYRIS | NA | Materiały eksploatacyjne do |
| pipety elektrycznej | Eppendorf | NA | Obsługa płynu |
| Extract-N-AmpTM zestaw do PCR roślin | SIGMA | XNAP2-1KT | Zestaw do ekstrakcji DNA roślin |
| Rumianek niemiecki (Matricaria chamomilla L) botaniczny materiał referencyjny | AHP | 2264 | Stosowany jako kontrola pozytywna |
| Mini sucha kąpiel | Yooning | MiniH-100L | Do ekstrakcji DNA |
| Woda wolna od nukleaz | AMBION | AM9937 | qPCR |
| reaction Primer | Thermo Fisher Scientific | NA | qPCR reakcja |
| Rumianek rzymski (Chamaemelum nobile) kwiat botancyjne materiały referencyjne | ChromaDex | ASB-00030806-005 | Stosowany jako kontrola pozytywna |
| Luna universal qPCR master mix | NEB | M3003L | qPCR reakcja |
Bibliografia
- Smith, T., Gillespie, M., Eckl, V., Knepper, J., Reynolds, C. Herbal supplement sales in US increase by 9.4% in 2018. HerbalGram. 123, 62-73 (2019).
- Israelsen, L. D. The challenge of regulation, globalization and climate change on botanicals and traditional medicines: respecting tradition while embracing change. Planta Medica. 74 (3), 36(2008).
- Cardellina, J. H. Challenges and opportunities confronting the botanical dietary supplement industry. Journal of Natural Products. 65 (7), 1073-1084 (2002).
- Foster, S. Exploring the peripatetic maze of black cohosh adulteration: a review of the nomenclature, distribution, chemistry, market status, analytical methods and safety. HerbalGram. 98, 32-51 (2013).
- Vanherweghem, J. L. Misuse of herbal remedies: The case of an outbreak of terminal renal failure in Belgium (Chinese herbs nephropathy). The Journal of Alternative and Complementary Medicine. 4 (1), 9-13 (1998).
- Vanherweghem, J. L., et al. Rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming regimen including Chinese herbs. The Lancet. 341 (8842), 387-391 (1993).
- Khan, I. A., Smillie, T. Implementing a "quality by design" approach to assure the safety and integrity of botanical dietary supplements. Journal of Natural Products. 75 (9), 1665-1673 (2012).
- Applequist, W. The Identification of Medicinal Plants: A Handbook of the Morphology of Botanicals in Commerce. , Missouri Botanical Garden Press. (2006).
- Upton, R., Graff, A., Jolliffe, G., Länger, R., Williamson, E. American Herbal Pharmacopoeia: Botanical Pharmacognosy - Microscopic Characterization of Botanical Medicines. , CRC Press. (2016).
- Frommenwiler, D. A., et al. Comprehensive HPTLC fingerprinting for quality control of an herbal drug - the case of angelica gigas root. Planta Medica. 84 (6-7), 465-474 (2018).
- Heyman, H. M., Meyer, J. J. M. NMR-based metabolomics as a quality control tool for herbal products. South African Journal of Botany. 82, 21-32 (2012).
- Lazarowych, N. J., Pekos, P. Use of fingerprinting and marker compounds for identification and standardization of botanical drugs: strategies for applying pharmaceutical HPLC analysis to herbal products. Drug Information Journal. 32 (2), 497-512 (1998).
- Tankeu, S., et al. Hyperspectral imaging and support vector machine: a powerful combination to differentiate black cohosh (actaea racemosa) from other cohosh species. Planta Medica. 84 (6-7), 407-419 (2018).
- Rodman, J. E., Cody, J. H. The taxonomic impediment overcome: NSF's Partnerships for Enhancing Expertise in Taxonomy (PEET) as a model. Systematic Biology. 52 (3), 428-435 (2003).
- Chen, S., et al. A renaissance in herbal medicine identification: from morphology to DNA. Biotechnology Advances. 32 (7), 1237-1244 (2014).
- Li, X., et al. Plant DNA barcoding: from gene to genome. Biological Reviews. 90 (1), 157-166 (2015).
- Madesis, P., Ganopoulos, I., Sakaridis, I., Argiriou, A., Tsaftaris, A. Advances of DNA-based methods for tracing the botanical origin of food products. Food Research International. 60, 163-172 (2014).
- Newmaster, S. G., Ragupathy, S., Janovec, J. A botanical renaissance: state-of-the-art DNA bar coding facilitates an automated identification technology system for plants. International Journal of Computer Applications in Technology. 35 (1), 50-60 (2009).
- Parveen, I., Gafner, S., Techen, N., Murch, S. J., Khan, I. A. DNA barcoding for the identification of botanicals in herbal medicine and dietary supplements: strengths and limitations. Planta Medica. 82 (14), 1225-1235 (2016).
- Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. A pocket-sized convective PCR thermocycler. Angewandte Chemie International Edition. 46 (23), 4316-4319 (2007).
- Almassian, D. R., Cockrell, L. M., Nelson, W. M. Portable nucleic acid thermocyclers. Chemical Society Reviews. 42 (22), 8769-8798 (2013).
- Benítez-Páez, A., Portune, K. J., Sanz, Y. Species-level resolution of 16S rRNA gene amplicons sequenced through the MinION portable nanopore sequencer. Gigascience. 5 (1), 4(2016).
- Emanuel, P. A., et al. Detection of Francisella tularensis within infected mouse tissues by using a hand-held PCR thermocycler. Journal of Clinical Microbiology. 41 (2), 689-693 (2003).
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228(2016).
- Lu, Z., et al. Single-laboratory validation of a two-tiered DNA barcoding method for raw botanical identification. Journal of AOAC International. 102 (5), 1435-1447 (2019).
- Sgamma, T., et al. DNA barcoding for industrial quality assurance. Planta Medica. 83 (14-15), 1117-1129 (2017).
- Wallinger, C., et al. Rapid plant identification using species-and group-specific primers targeting chloroplast DNA. PLoS One. 7 (1), 29473(2012).
- Newmaster, S. G., et al. Recommendations for validation of real-time PCR methods for molecular diagnostic identification of botanicals. Journal of AOAC International. , (2019).
- Singh, O., Khanam, Z., Misra, N., Srivastava, M. K. Chamomile (Matricaria chamomilla L.): an overview. Pharmacognosy Reviews. 5 (9), 82(2011).
- Mills, S. Y., Bone, K. The Essential Guide to Herbal Safety. Elsevier Health Sciences. , 325(2004).
- Avula, B., et al. Quantitative determination of phenolic compounds by UHPLC-UV-MS and use of partial least-square discriminant analysis to differentiate chemo-types of Chamomile/Chrysanthemum flower heads. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 278-288 (2014).
- Guzelmeric, E., Vovk, I., Yesilada, E. Development and validation of an HPTLC method for apigenin 7-O-glucoside in chamomile flowers and its application for fingerprint discrimination of chamomile-like materials. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 108-118 (2015).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. Genome Research. 3 (3), 30-37 (1993).
- Untergasser, A., et al. Primer3Plus, an enhanced web interface to Primer3. Nucleic Acids Research. 35, Web Server issue 71-74 (2007).
- Bustin, S., Huggett, J. qPCR primer design revisited. Biomolecular Detection and Quantification. 14, 19-28 (2017).
- Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3235-3241 (1997).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), Oxford, England. 1019-1020 (2011).
- Heikrujam, J., Kishor, R., Mazumder, P. B. The chemistry behind plant DNA isolation protocols. Biochemical Analysis Tools - Methods for Bio-Molecules Studies. , (2020).
- Blum-Silva, C. H., Chaves, V. C., Schenkel, E. P., Coelho, G. C., Reginatto, F. H. The influence of leaf age on methylxanthines, total phenolic content, and free radical scavenging capacity of Ilex paraguariensis aqueous extracts. Revista Brasileira de Farmacognosia. 25 (1), 1-6 (2015).
- Lu, Z., et al. Validation of a targeted PCR method for raw and processed botanical material identification: an example using matricaria chamomilla (chamomile). Journal of AOAC International. 102 (6), 1787-1797 (2019).
Przedruki i uprawnienia
