Artykuł metodologiczny

Identyfikacja terenowa Matricaria chamomilla za pomocą przenośnego systemu qPCR

DOI:

10.3791/60940

⸱

10 października 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Herbalife NatSource (Hunan) Natural Products Co., Ltd., 2Corporate Quality Laboratory, Herbalife International of America, Inc., 3Corporate Quality, Herbalife International of America, Inc., 4Hyris Ltd, 5Natural Health Product Research Alliance, University of Guelph

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest protokół do terenowej identyfikacji Matricaria chamomilla za pomocą przenośnego systemu qPCR. Ten łatwy do wykonania protokół jest idealny jako metoda potwierdzania tożsamości gatunku botanicznego w miejscach, w których dostęp do sprzętu laboratoryjnego i wiedzy specjalistycznej jest ograniczony, takich jak gospodarstwa rolne i magazyny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kontrola jakości produktów botanicznych zaczyna się od dostarczenia surowców. Tradycyjnie, identyfikacja botaniczna odbywa się za pomocą oceny morfologicznej i chemicznych metod analitycznych. Jednak brak dostępności botaników, zwłaszcza w ostatnich latach, w połączeniu z potrzebą poprawy kontroli jakości w celu zwalczania napięć w łańcuchu dostaw spowodowanych rosnącym popytem konsumenckim i zmianami klimatycznymi, wymaga alternatywnych podejść. Celem tego protokołu jest ułatwienie identyfikacji gatunków botanicznych za pomocą przenośnego systemu qPCR w terenie lub w dowolnym miejscu, w którym dostęp do sprzętu laboratoryjnego i wiedzy specjalistycznej jest ograniczony. Docelowy DNA jest amplifikowany za pomocą qPCR na bazie barwnika, przy czym DNA ekstrahowane z botanicznych materiałów referencyjnych służy jako kontrola pozytywna. Docelowy DNA identyfikuje się na podstawie jego specyficznej amplifikacji i dopasowania piku topnienia do kontroli pozytywnej. Szczegółowy opis kroków i parametrów, od praktycznego pobierania próbek w terenie, po ekstrakcję DNA, amplifikację PCR, a następnie interpretację danych, został dołączony, aby zapewnić, że czytelnicy mogą odtworzyć ten protokół. Uzyskane wyniki są zgodne z tradycyjnymi laboratoryjnymi metodami identyfikacji botanicznej. Protokół jest łatwy do wykonania i opłacalny, umożliwiając testowanie jakości surowców jak najbliżej miejsca pochodzenia łańcucha dostaw.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praktyka używania roślin do utrzymania i poprawy zdrowia sięga tysięcy lat. Ze względu na napięcia w łańcuchu dostaw spowodowane zwiększonym popytem konsumenckim1, niezrównoważonymi praktykami pozyskiwania plonów i zmianami klimatycznymi2, zafałszowania botaniczne stają się coraz większym problemem w branży żywności i suplementów diety3. Obecność niezgłoszonych lub błędnie zidentyfikowanych gatunków botanicznych może prowadzić do zmniejszenia skuteczności, a nawet problemów z bezpieczeństwem. Na przykład pluskwica groniasta (Actaea racemosa), stosowana w leczeniu dyskomfortu przedmiesiączkowego, może być zastąpiona tanim gatunkiem azjatyckim z ograniczonym wsparciem klinicznym dla jego skuteczności4. W poważniejszym przypadku zastąpienie Stephania terandra preparatem Aristolochia fangchi w badaniu klinicznym dotyczącym utraty wagi przy użyciu chińskich ziół doprowadziło do ciężkiej nefrotoksyczności i niewydolności nerek u niektórych uczestników5,6. Te dwa różne gatunki miały wspólną chińską nazwę "Fang Ji". Przypadki te podkreślają potrzebę bardziej rygorystycznej kontroli jakości, począwszy od identyfikacji surowców7, najlepiej jak najbliżej miejsca pochodzenia łańcucha dostaw, aby można było efektywnie alokować zasoby do materiału o prawidłowej tożsamości.

Do identyfikacji botanicznej można użyć wielu ortogonalnych podejść. Tradycyjnie, identyfikacja botaniczna jest przeprowadzana poprzez ocenę morfologiczną8,9 i chemiczne metody analityczne10,11,12,13. Identyfikacja morfologiczna opiera się na różnicach w makroskopowych i mikroskopowych cechach materiałów roślinnych, jeśli istnieją różnice (Rysunek 1). Jednak brak programów szkoleniowych z zakresu botaniki klasycznej w ostatnich latach spowodował niedobór ekspertów14, co czyni to podejście niepraktycznym w rutynowej kontroli jakości. Jego zastosowanie w sproszkowanych materiałach botanicznych jest również ograniczone. Chemiczne metody analityczne są szeroko stosowane w farmakopeach i laboratoriach, ale nie są idealne do badań terenowych ze względu na rozmiar przyrządów, takich jak wysokosprawna chromatografia cienkowarstwowa (HPTLC), wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) (Rysunek 2) oraz wymagania środowiskowe. Ostatnio metody genomiczne pojawiły się jako alternatywna technika uwierzytelniania i wykrywania substytucji gatunków botanicznych, które okazały się skuteczne i precyzyjne. Metody genomiczne wykorzystują wysoką wierność i swoistość informacji genetycznej w materiałach roślinnych15,16,17,18,19. Molekularne narzędzia diagnostyczne są dostępne w postaci urządzeń przenośnych i często obejmują zautomatyzowane narzędzia do interpretacji danych, które obniżają barierę w korzystaniu z technologii, dzięki czemu podejście to jest idealne do identyfikacji w terenie20,21,22,23,24. Po zaprojektowaniu i walidacji metody analizy molekularnej25,26,27, może być ona wykonywana przez dowolny personel z podstawowym przeszkoleniem z zakresu biologii molekularnej. Spośród różnych dostępnych narzędzi przenośnych, PCR w czasie rzeczywistym na sekwencjach DNA jest jednym z opłacalnych wyborów28. Połączenie przenośnego urządzenia z dostosowaną i zwalidowaną analizą molekularną umożliwia weryfikację gatunków botanicznych i składników poza laboratorium, np. w gospodarstwach rolnych i magazynach materiałów botanicznych, redukując czas i koszty związane z tradycyjnymi metodami.

Celem tego protokołu jest wprowadzenie metody identyfikacji botanicznej w sytuacjach, gdy dostęp do sprzętu laboratoryjnego i wiedzy specjalistycznej jest ograniczony lub niedostępny, przy użyciu przenośnego systemu qPCR. Metoda została zademonstrowana na polu Matricaria chamomilla (Ryc. 3A), powszechnie znana jako rumianek niemiecki, szeroko stosowana ze względu na swoje właściwości przeciwzapalne i przeciwutleniające29. Można go pomylić z pokrewnymi gatunkami o podobnym wyglądzie lub zapachu, zwłaszcza z rodzajów Chamaemelum, Tanacetum i Chrysanthemum30,31,32. Wśród spokrewnionych gatunków, Chamaemelum nobile, znany również jako rumianek rzymski, jest zauważalny z porównywalnymi poziomami produkcji w handlu (Rysunek 3B). Zaprezentowana metoda została opracowana nie tylko w celu identyfikacji docelowego gatunku botanicznego M. chamomilla, ale także wykrycia jego bliskiego krewnego, C. nobile, w oparciu o specyficzną amplifikację sekwencji DNA.

Ten artykuł wyjaśnia szczegółowo, jak przeprowadzić terenową identyfikację botaniczną M. chamomilla za pomocą interkalacyjnego qPCR opartego na barwniku i analizy krzywej topnienia na urządzeniu przenośnym. Protokół obejmuje pobranie próbek botanicznych z terenu, ekstrakcję DNA na miejscu oraz przygotowanie reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Aby zapewnić prawidłowe wnioski, jako kontrolę pozytywną wykorzystuje się docelowe botaniczne DNA M. chamomilla i niedocelowe botaniczne botaniczne DNA C. nobile, wstępnie wyekstrahowane z certyfikowanych botanicznych materiałów referencyjnych. Swoistość tej metody wykazano poprzez przeprowadzenie testów identyfikacyjnych zarówno M. chamomilla, jak i C. nobile indywidualnie na próbkach i kontrolach. Nieszablonowa kontrola ujemna służy do wykluczenia wyników fałszywie dodatnich spowodowanych zanieczyszczeniem PCR.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pobieranie próbek

  1. Ustaw obszar testowy w terenie z płaską i poziomą powierzchnią.
  2. Zidentyfikuj reprezentatywną roślinę, która odzwierciedla cechy większości roślin na polu kwiatów rumianku (Rysunek 4).
  3. Zbierz główkę kwiatu z reprezentatywnej rośliny za pomocą sterylnych rękawiczek.
  4. Umieścić próbkę w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml.
  5. Powtórz kroki od 1,3 do 1,4 i zbierz ulotkę (o długości około 0,5–0,7 cm) z tej samej rośliny.
    UWAGA: Kwiat i liść M. chamomilla są na tyle małe, że mieszczą się na dnie probówki zbiorczej o pojemności 2,0 ml. W przypadku innych roślin o większej powierzchni można użyć dziurkacza lub nożyczek (przed użyciem wypłukanych w 70% etanolu) do wyizolowania próbek tkanek do testów. Gdy wymagane jest wielokrotne pobieranie próbek, należy opłukać dziurkacz lub nożyczki między kolejnymi czynnościami związanymi z różnymi próbkami.

2. Ekstrakcja DNA

  1. Rozgrzej inkubator w suchej kąpieli do temperatury 95 °C.
  2. Do każdej probówki zbiorczej dodać 100 μl roztworu ekstrakcyjnego z zestawu do ekstrakcji DNA roślin (wymienionego w tabeli materiałów). Aby uzyskać lepszą wydajność ekstrakcji DNA, zmiel próbkę tkanki w roztworze ekstrakcyjnym za pomocą tłuczka do tkanek.
  3. Zamknij rurkę. Upewnij się, że tkanka botaniczna jest pokryta roztworem ekstrakcyjnym przez cały proces ekstrakcji.
  4. Umieścić probówki zbiorcze w nagrzanym inkubatorze w suchej kąpieli i inkubować probówki w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
  5. Po 10 minutach wyjmij probówki z inkubatora do suchej kąpieli.
  6. Dodać 100 μl roztworu rozcieńczającego z tego samego zestawu do ekstrakcji DNA i wymieszać roztwór, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół.
  7. Powtórz ten sam krok w przypadku ekstrakcji ulotki.
  8. Wstrząśnij, aby jeszcze bardziej wymieszać roztwór. Tkanka roślinna zwykle nie wydaje się być zdegradowana po tym zabiegu. Kolor cieczy może ulec zmianie i stać się mętny.
    UWAGA: Rozcieńczony roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej przez noc, jeśli nie nastąpi to natychmiast. Nie jest konieczne usuwanie resztek komórkowych z tkanki roślinnej przed przechowywaniem. Ciecz w probówkach zawiera matryce DNA do dalszej amplifikacji PCR.

3. Konfiguracja reakcji PCR

  1. Skonfiguruj warunki termocyklingu instrumentu qPCR zgodnie ze specyfikacją producenta. Zastosować profil termocyklingu PCR wymieniony w (Tabela 1), który rozpoczyna się od stałego kroku temperatury dla początkowej denaturacji, po którym następuje 25 cykli amplifikacji, a kończy się wzrostem temperatury w celu uzyskania krzywej topnienia o wysokiej rozdzielczości.
  2. Przed użyciem rozmrozić qPCR Master Mix i startery (Tabela 2) w temperaturze pokojowej.
  3. Zaplanuj reakcję, która zostanie załadowana do każdej studzienki: studzienki zawierające kontrolę pozytywną z gatunkami docelowymi, kontrolę pozytywną z gatunkami niedocelowymi, próbki i kontrolę ujemną (Rysunek 5).
    1. W tym przykładzie użyto dziesięciu studzienek – pięciu do niemieckiego testu identyfikacyjnego rumianku, a pozostałe pięć do testu identyfikacji rumianku rzymskiego. W przypadku każdego rodzaju badania identyfikacji gatunku jedna studzienka zawiera kontrolę pozytywną z DNA wyekstrahowanym z materiału referencyjnego gatunków docelowych, jedna studzienka zawiera kontrolę pozytywną z DNA wyekstrahowanym z materiału referencyjnego gatunków niedocelowych, dwie studzienki wypełnia się próbkami DNA kwiatów i liści pobranymi z pola, a jedna studzienka jest przeznaczona do kontroli ujemnej. Tabela 3 opisuje każdy typ studni.
  4. Przygotować wzorcową mieszankę reakcji zgodnie z instrukcją dla każdego badania identyfikacji gatunku botanicznego. Typowa mieszanka wzorcowa reakcji zawiera uniwersalną mieszankę mistrzowską qPCR (2x), startery specyficzne dla gatunku do przodu i do tyłu oraz wodę wolną od nukleaz. W tabeli 4 przedstawiono skład układu reakcyjnego.
    UWAGA: Jeśli nie zużyć od razu, przechowuj główną mieszankę reakcji qPCR w temperaturze od +2 °C do +8 °C w chłodziarce lub minilodówce.
  5. Przed użyciem dokładnie wymieszać mieszankę wzorcową reakcji, pipetując.
  6. Umieść wkład qPCR stroną zadrukowaną do góry na płaskiej i stabilnej powierzchni.
  7. Załadować 18 μl wzorcowej mieszanki reakcyjnej skonfigurowanej w kroku 3.4 do studzienek z wkładami zgodnie z dołkami zdefiniowanymi w kroku 3.3. W tej demonstracji dodaj niemiecką mieszankę wzorcową reakcji testu identyfikacji rumianku do studzienek oznaczonych do testu GC (GCT w dołkach 1, 3, 5, 7, 9) i mieszankę wzorcową testu identyfikacji rumianku rzymskiego do studzienek oznaczonych do testu RC (RCT w studzienkach 2, 4, 6, 8, 10) (patrz Rysunek 5).
  8. Przenieść 2 μl próbki DNA z supernatantu probówek do ekstrakcji DNA i wstępnie wyekstrahowanych dodatnich kontroli DNA do studzienek z wkładami wstępnie załadowanymi mieszanką wzorcową qPCR. Po dodaniu każdej matrycy DNA do głównej mieszanki qPCR, delikatnie wymieszać roztwór, pipetując.
    UWAGA: Unikaj unoszących się na wodzie resztek komórkowych podczas przenoszenia DNA z probówki do ekstrakcji DNA. W razie potrzeby użyj miniwirówki, aby oddzielić supernatant i resztki komórkowe.
  9. Ostrożnie uszczelnij wkład folią samoprzylepną. Załaduj wkład do komory termocyklingowej i zamknij ją.
  10. Ustaw urządzenie qPCR tak, aby działało.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 1, botaniczne DNA z główki kwiatu i liścia zostało wyekstrahowane do supernatantu po inkubacji termicznej probówki zbiorczej w temperaturze 95 °C przez 10 minut. W obecnym badaniu supernatant wykazywał żółty i zielonkawy kolor zarówno dla kwiatów, jak i liści, co wskazuje, że różne naturalne związki zostały uwolnione do supernatantu z botanicznym DNA (Ryc. 6). Chociaż wiarygodną amplifikację PCR uzyskano później w trzech egzemplarzach dla wszystkich matryc DNA wyekstrahowanych w terenie, ocenę jakości DNA przeprowadzono w laboratorium jako odniesienie. Stężenie ekstraktu DNA z główki kwiatu, oznaczone za pomocą fluorometrii, mieściło się w zakresie 3,69–5,36 ng/μl, podczas gdy stężenie ekstraktu DNA z liści mieściło się w zakresie 6,42–9,29 ng/μl. Współczynniki absorbancji A260/A280 i A260/A230 ekstraktów DNA z kwiatów i liści mierzono za pomocą spektrofotometrii. Jednak ze względu na nakładanie się widma absorpcji DNA i fitochemicznej absorpcji UV, nie można było zmierzyć tych proporcji wiarygodnie (dane nie pokazane).

Interkalacyjny barwnik fluorescencyjny został użyty do monitorowania wzmocnienia docelowych fragmentów w czasie rzeczywistym. Ponieważ zarówno specyficzne startery M. chamomilla, jak i C. nobile celują w region wewnętrznej transkrybowanej przestrzeni dystansowej 2 (ITS2), który ma dziesiątki do setek kopii w genomie rośliny, 25 cykli amplifikacji PCR jest wystarczających do wygenerowania wystarczającej liczby amplikonów do identyfikacji gatunków rumianku. W Rysunek 7, wartość Ct dla pozytywnej kontroli M. chamomilla w teście identyfikacji M. chamomilla była mniejsza niż 25 (GCP_GCT), podczas gdy po 25 cyklach amplifikacji fluorescencja tej samej kontroli w teście identyfikacji C. nobile była poniżej progu wykrywania (GCP_RCT). Z drugiej strony, po 25 cyklach fluorescencja dla kontroli pozytywnej C. nobile w teście identyfikacyjnym M. chamomilla była poniżej progu wykrywalności (RCP_GCT), podczas gdy wartość Ct dla tej samej kontroli w teście identyfikacji C. nobile była mniejsza niż 25 (RCP_RCT). Amplifikacja docelowych i niedocelowych kontroli dodatnich w ich odpowiednich testach wykazuje swoistość testu identyfikacji M. chamomilla. W przypadku próbki DNA, ekstrakt DNA z główki kwiatu polnego i liścia dał wartości Ct wynoszące odpowiednio 15,18 i 19,41 w teście identyfikacyjnym M. chamomilla (próbka1 (FLOWER_GCT) i próbka 2 (LIŚĆ) _GCT). Obie te próbki nie zostały amplifikowane w teście identyfikacji C. nobile (Próbka1(FLOWER)_RCT i Próbka2(LIŚĆ)_RCT). Wzorce amplifikacji obu próbek odpowiadały wzorcowi amplifikacji kontroli pozytywnej M. chamomilla. Kontrole ujemne nie zostały wzmocnione zarówno w testach identyfikacyjnych M. chamomilla, jak i C. nobile (NC_GCT i NC_RCT), co wyklucza możliwość wyników fałszywie dodatnich spowodowanych zanieczyszczeniem PCR. Aby dodatkowo potwierdzić specyficzną amplifikację w kontrolach pozytywnych i próbkach, frakcje produktu końcowego PCR z każdej studzienki przeprowadzono na 2% żelu agarozowym w laboratorium (Rysunek 8). W przypadku testu identyfikacyjnego M. chamomilla obie próbki terenowe dały amplikony biegnące w tej samej pozycji co kontrola pozytywna M. chamomilla o szacowanej wielkości nieco powyżej 100 pz (wielkość teoretyczna 102 pz). W przypadku testu identyfikacji C. nobile kontrola pozytywna gatunku niebędącego przedmiotem zwalczania C. nobile wykazała pasmo między 50 a 100 pz, co odpowiada teoretycznej wielkości 65 pz. Pozostałe tory nie wykazały żadnego konkretnego produktu wzmacniającego, co zgadzało się z brakiem sygnału fluorescencyjnego dla tych studni, co zaobserwowano w testach terenowych.

Po amplifikacji PCR, przeprowadzono analizę krzywej topnienia, aby ocenić charakterystykę dysocjacji dwuniciowego DNA (dsDNA) podczas ogrzewania. Gdy temperatura wzrosła podczas ostatniego cyklu analizy krzywej topnienia, wzrost temperatury spowodował dysocjację dwuniciowych amplikonów. Interkalacyjny barwnik fluorescencyjny był stopniowo uwalniany do roztworu, zmniejszając intensywność fluorescencji (Rysunek 9A). Punkt przegięcia pierwszej krzywej pochodnej wykorzystano do wyznaczenia temperatury topnienia (Tm) (Rysunek 9B), która zależy głównie od długości fragmentu DNA i zawartości GC. Połączenie wartości Ct z temperaturą topnienia może zwiększyć specyficzność analizy qPCR. W niniejszym badaniu pik temperatury topnienia amplikonu PCR kontroli pozytywnej M. chamomilla wystąpił w temperaturze 85,6 °C (GCP_GCT) i różnił się od piku temperatury topnienia amplikonu PCR z kontrolą dodatnią C. nobile w temperaturze 79,1 °C (RCP_RCT). Amplikon PCR z główki kwiatu polnego i liścia spowodował skoki temperatury topnienia odpowiednio w temperaturze 85,2 °C i 84,8 °C (próbka1 (FLOWER_GCT) i próbka 2 (LEAF) _GCT). Aby ocenić zmiany temperatury topnienia mierzone za pomocą przenośnego systemu qPCR, zebrano dodatkowe punkty danych, aby potwierdzić, że temperatury topnienia próbki były zawsze zbliżone do temperatury topnienia uzyskanej z kontroli pozytywnej M. chamomilla (w granicach 2 °C) i były dalekie od temperatury topnienia amplikonu kontroli dodatniej C. nobile (Rysunek 10). Szczyty temperatur topnienia odnotowywano niekiedy w innych odwiertach. Jednak ich wartości Ct były nie mniejsze niż 25, a szczyty temperatury topnienia nie były bliskie kontroli dodatniej M. chamomilla lub C. nobile (oddalone od siebie o więcej niż 2 °C).

Podsumowując, test identyfikacyjny M. chamomilla może być interpretowany na podstawie reguł decyzyjnych podsumowanych w Tabeli 5. Ponieważ wszystkie kontrole pozytywne dały wynik pozytywny dla domniemanego gatunku botanicznego, negatywny dla innych gatunków, a kontrole ujemne dały wynik negatywny, obie próbki terenowe zostały uznane za zawierające M. chamomilla, ale nie C. nobile. Ponadto, aby dostosować wyniki testów terenowych do innych technik analitycznych, wnioski terenowe zostały dodatkowo potwierdzone za pomocą wcześniej zwalidowanej metody kodowania kreskowego DNA25 (dane nie pokazane).

figure-results-1
Ryc. 1: Identyfikacja morfologiczna materiału botanicznego. (A) Kwiaty hibiscus rosa-sinensis, korzenie Curcuma longa, liście Malva Sylvestris, liście Rosmarinus officinalis, nasiona Coriandrum sativum, korzenie Zingiber officinale. (B) Płatki Petroselinum crispum i Apium graveolens są trudne do odróżnienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Identyfikacja chemiczna materiałów botanicznych. (A) Przyrząd do HPTLC i reprezentatywny chromatogram HPTLC. (B) Przyrząd do HPLC i reprezentatywny chromatogram HPLC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Ryc. 3: Matricaria chamomilla i Chamaemelum nobile w terenie. (A) Matricaria chamomilla, zaczerpnięte z Wikipedii na licencji CC BY-SA 3.0, https://en.wikipedia.org/wiki/Matricaria_chamomilla#/media/File:Matricaria_February_2008-1.jpg. (B) Chamaemelum nobile, zaczerpnięte z Wikipedii pod numerem CC BY-SA 3.0, https://en.wikipedia.org/wiki/Chamomile#/media/File:Chamaemelum_nobile_001.JPG. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Ryc. 4: Zbieranie części roślin M. chamomilla z pola. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Rozmieszczenie studzienek testowych w demonstracji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Ekstrakt DNA z pola w probówkach zbiorczych. Tkanka botaniczna pozostaje w oryginalnej probówce i jest pokryta żółtawym ekstraktem DNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Wykres fluorescencyjny przedstawiający akumulację produktów PCR w ciągu 25 cykli termocyklingu. Kontrola pozytywna M. chamomilla i kontrola pozytywna C. nobile wykazują wartości Ct mniejsze niż 25 odpowiednio w testach identyfikacyjnych M. chamomilla i C. nobile. Próbki kwiatów i liści polnych amplifikowano za pomocą testu identyfikacyjnego M. chamomilla o wartościach Ct 15,18 i 19,41. Reszta studni nie była wzmocniona. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Elektroforeza żelowa produktów amplifikacji PCR w terenie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 9: Analiza temperatury topnienia. (A) Sygnał fluorescencji w każdym studzience zmniejsza się wraz ze wzrostem temperatury. (B) Tożsamość produktów PCR została potwierdzona przez pik temperatury topnienia w analizie krzywej topnienia. W próbkach kwiatów i liści polnych szczyty temperatury osiągają temperatury 85,2 °C i 84,8 °C. Są one bliskie szczytowi wytwarzanemu przez kontrolę pozytywną M. chamomilla. Kontrola dodatnia C. nobile wytworzyła pik w temperaturze 79,1 °C, który różni się od pozostałych trzech próbek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rysunek 10: Skokowa zmienność temperatury topnienia między kontrolą dodatnią a próbkami terenowymi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

scenacykltemperaturaGodzina
Stała temperatura195 °CLata 60.
Wzmocnienie2595 °CLata 30.
60 °CLata 30.
Krzywa topnienia160 °CRampa 0.05 °C/s
95 °C

Tabela 1: warunki termocyklingu qPCR dla testów identyfikacyjnych M. chamomilla i C. nobile.

TestNazwa podkładuSekwencja 5'-3'pozycjaregionRozmiar amplikonu
Matricaria recutita3 ZŁTCGTCGGTCGCAAGGATAAGnaprzódITS2102 pz
ZŁ 4TAAACTCAGCGGGTAGTCCCrewers
Chamaemelum nobile11 ZŁTGTCGCACGTTGCTAGGAAGCAnaprzódITS265 pz
12 ZŁTCGAAGCGTCATCCTAAGACAACrewers

Tabela 2: Pary starterów do testów identyfikacyjnych M. chamomilla i C. nobile.

Dobra pozycjaDobra nazwaOpis
1GC_PosCtrl_GC_TestDodatnia kontrola rumianku niemieckiego w teście GC
cyfra arabskaGC_PosCtrl_RC_TestPozytywna kontrola rumianku niemieckiego w teście RC
3RC_PosCtrl_GC_TestPozytywna kontrola rumianku rzymskiego w teście GC
4RC_PosCtrl_RC_TestPozytywna kontrola rumianku rzymskiego w teście RC
5Field_Sample_GC_TestPróbka tkanki liścia poddana testowi GC
6Field_Sample_RC_TestPróbka tkanki liścia poddana testowi RC
7Field_Sample_GC_TestPróbka tkanki kwiatowej w teście GC
8Field_Sample_RC_TestPróbka tkanki kwiatowej w teście RC
9NegCtrl_GC_TestPróbka kontroli ujemnej w teście GC
10NegCtrl_RC_TestPróbka kontroli ujemnej w teście RC

Tabela 3: Typy studni i opisy do testów identyfikacyjnych M. chamomilla i C. nobile.

OdczynnikGC_TestRC_Test
Uniwersalna mieszanka qPCR*10 μL10 μL
Podkład ZL3 (10 μM)0,4 μlnie
Podkład ZL4 (10 μM)0,4 μlnie
Podkład ZL11 (10 μM)nie0,4 μl
Podkład ZL12 (10 μM)nie0,4 μl
H2O(bez nukleaz)7,2 μl7,2 μl
* zawiera polimerazę DNA Hot Start Taq

Tabela 4: Kompozycja Master-mix do testów identyfikacyjnych M. chamomilla i C. nobile.

Nazwa studniOczekiwany wynikKryteria pozytywnego wynikuKryteria wyniku negatywnego
Wykryte / ObecneNie wykryto / Brak
GC_PosCtrl_GC_TestWykryteCt < 25 i 84 < = Tm <= 86-
GC_PosCtrl_RC_TestNie wykryto-Brak wartości Ct w ciągu 25 cykli
RC_PosCtrl_GC_TestNie wykryto-Brak wartości Ct w ciągu 25 cykli
RC_PosCtrl_RC_TestWykryteCt < 25 i 79 < = Tm <= 81-
Field_Sample_Leaf_GC_TestprezentowaćCt < 25 i 84 < = Tm <= 86Brak wartości Ct w ciągu 25 cykli
Field_Sample_Leaf_RC_Testnieobecny-Brak wartości Ct w ciągu 25 cykli
Field_Sample_Flower_GC_TestprezentowaćCt < 25 i 84 < = Tm <= 86Brak wartości Ct w ciągu 25 cykli
Field_Sample_Flower_RC_Testnieobecny-Brak wartości Ct w ciągu 25 cykli
NegCtrl_GC_TestNie wykryto-Brak wartości Ct w ciągu 25 cykli
NegCtrl_RC_TestNie wykryto-Brak wartości Ct w ciągu 25 cykli

Tabela 5: Zasady interpretacji wyników qPCR.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projektowanie starterów i wybór matryc są kluczowymi krokami w uzyskaniu wydajnej i specyficznej amplifikacji qPCR. Po zidentyfikowaniu odpowiedniego szablonu, zwykle stosuje się oprogramowanie do projektowania podkładów, aby pomóc w doborze podkładów na podstawie zmiennych projektowych, takich jak długość podkładu, temperatura topnienia i zawartość GC33,34. Optymalizację i walidację można przeprowadzić w oczekiwanych warunkach eksperymentalnych testu, aby zapewnić swoistość, czułość i solidność reakcji PCR35. Nieoptymalna konstrukcja startera może prowadzić do tworzenia się starter-dimer, w którym interakcje starterów wytwarzają produkty niespecyficzne36.

Kontrola bez matrycy (NTC) zastosowana w tym badaniu sprawdza zarówno zanieczyszczenie DNA, jak i obecność dimerów starterów, które mogą wpływać na test. Wyniki nie wykazały amplifikacji, co jest dobrą wskazówką, że zarówno zanieczyszczenie DNA, jak i dimery starterów nie stanowią problemu. Zanieczyszczenie DNA i dimery starterów objawiają się w krzywych topnienia bez kontroli matrycowych oraz jako dodatkowe piki w krzywych topnienia kontroli pozytywnych. Zazwyczaj oczekuje się, że krzywa topnienia kontroli dodatniej będzie zawierać pojedynczy pik, chyba że poddomeny bogate w AT w matrycy powodują nierównomierne topnienie. Podwójne piki można przewidzieć, symulując testy topnienia za pomocą oprogramowania uMELT37. W tym badaniu zastosowano złoty standard uruchamiania produktu PCR na żelu agarozowym, aby potwierdzić obecność docelowego produktu PCR oraz brak zanieczyszczeń i dimerów starterów.

Sporym wyzwaniem w analizie molekularnej materiału botanicznego jest uzyskanie dobrej jakości DNA w wyniku procesu ekstrakcji DNA botanicznego. Materiały botaniczne są sprzedawane i spożywane ze względu na aktywne związki chemiczne, które są związane z korzyściami zdrowotnymi. W procesie ekstrakcji DNA te związki chemiczne będą również uwalniane do roztworu do ekstrakcji DNA, potencjalnie powodując zahamowanie PCR, powodując w ten sposób niepowodzenia amplifikacji PCR. Opracowano różne zestawy do oczyszczania DNA roślin przy użyciu rozpuszczalników organicznych i kolumn w celu usunięcia związków chemicznych pochodzących z roślin38. Jednak dygestorium i wirówka szybkoobrotowa wymagane do obsługi tych zestawów nie są dostępne w terenie.

W obecnym protokole uproszczona metoda ekstrakcji DNA wykorzystuje komercyjny zestaw do ekstrakcji DNA roślin (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów ). Miał zdolność neutralizowania powszechnych substancji hamujących w celu uzyskania powtarzalnych wyników i dawał spójne wyniki dla M. chamomilla i C. nobile. Zarówno główki i liście kwiatowe M. chamomilla , jak i C. nobile dawały amplikony PCR o określonych pikach topnienia, co wskazuje, że obecność inhibitorów PCR nie stanowiła problemu. W przypadku innych roślin z wyższymi poziomami inhibitorów PCR amplifikacja DNA w ich pierwotnej ekstrakcji może być mniej wydajna. Aby zmniejszyć inhibicję i poprawić wydajność amplifikacji, mając dostęp do całej rośliny, do celów identyfikacji można również wykorzystać inne części rośliny o niższej zawartości polisacharydów i polifenoli. Jeśli dostęp do różnych części rośliny jest ograniczony, młodsze liście lub płatki wycięte z główek kwiatowych, które zazwyczaj mają niższą zawartość fenolu39, mogą mieć większe szanse na sukces. Ponieważ sekwencje DNA są spójne w całej roślinie, każda część rośliny może być wykorzystana do potwierdzenia tożsamości gatunku. Jeśli amplifikacja PCR jest nadal nieoptymalna, oryginalny ekstrakt DNA można dodatkowo rozcieńczyć przed PCR lub zastosować bardziej wyrafinowane protokoły oczyszczania laboratoryjnego.

Kolejnym wyzwaniem dla analizy PCR są fałszywie dodatnie wyniki spowodowane zanieczyszczeniem DNA, które może negatywnie wpłynąć na interpretację danych. Zazwyczaj jest on kontrolowany przez aktywne sprzątanie, korzystanie z dedykowanego sprzętu i ograniczanie pracy do wyznaczonych obszarów. Za pomocą qPCR wszystkie analizy PCR można przeprowadzić w zamkniętym systemie, co znacznie zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia amplikonem PCR w środowisku, które nie jest dobrze kontrolowane. Poza tym środowiskowe DNA nie powinno również wykazywać fałszywie dodatniego wyniku ze względu na specyficzność testu, zgodnie z poprzednim badaniem walidacyjnym40.

Jest miejsce na poprawę. W przedstawionym tutaj protokole zastosowano barwnik interkalacyjny, aby pokazać amplifikację fragmentu docelowego w czasie rzeczywistym. Specyfikę metody potwierdza ponadto charakterystyczna temperatura topnienia, która jest odmienna między amplikonami M. chamomilla i C. nobile . Dlatego interkalacyjny PCR na bazie barwnika może skutecznie odpowiedzieć na pytanie "Co to za gatunek rośliny?" w terenie. Jednak oprócz konieczności przeprowadzenia identyfikacji botanicznej na pojedynczej roślinie odizolowanej z pola, w wielu przypadkach proszki lub ekstrakty roślinne w magazynie również skorzystają z szybkiej oceny tożsamości na miejscu. W przypadku tego typu materiałów może być konieczne udzielenie odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak: "Co znajduje się w tym materiale?", "Czy zawiera gatunki botaniczne, których szukam?", "Czy zawiera domieszki, których chcę uniknąć?" i "Czy jest całkowicie lub częściowo zastąpiony innymi gatunkami botanicznymi, które są szkodliwe?". Zamiast stosowania barwnika interkalacyjnego, można zaprojektować różne sondy qPCR do celowania w amplikony z różnych składników botanicznych w jednym systemie reakcyjnym, przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej specyficzności i wydajności testu. Opracowanie qPCR opartego na sondzie i wykorzystanie przenośnego systemu qPCR, który oferuje detekcję wielokanałową, może jeszcze bardziej rozszerzyć zastosowanie testów terenowych jako testu dopasowanego do celu na szersze środowisko, takie jak magazyny materiałów botanicznych i centra dystrybucji, aby odpowiedzieć na bardziej skomplikowane pytania. Ponadto użycie wielu sond pozwala również użytkownikowi na włączenie wewnętrznej amplifikacji do każdego układu reakcyjnego, dzięki czemu więcej informacji będzie dostępnych w przypadku podejrzenia zahamowania PCR.

Przedstawiony tutaj protokół ma następujące zalety w porównaniu z istniejącymi technologiami wykorzystywanymi w tym samym celu. Po pierwsze, w przypadku tradycyjnych metod identyfikacji morfologicznej i chemicznej, procedura i jej wyniki muszą zostać przeprowadzone i zinterpretowane przez ekspertów. Testy identyfikacyjne oparte na qPCR mogą być przeprowadzane przez osoby z podstawowym wykształceniem z zakresu biologii molekularnej i interpretowane w bardziej ustandaryzowany sposób. Po drugie, w porównaniu z identyfikacją i różnicowaniem gatunków opartym na qPCR, zwykle przeprowadzanym w laboratorium, protokół identyfikacji terenowej przy użyciu przenośnego przyrządu nie wymaga instrumentów o dużej powierzchni, takich jak wirówka o dużej prędkości, sprzęt do oceny jakości DNA, termocykler z detektorem fluorescencji oraz komputer ze specjalnym oprogramowaniem. W ten sposób identyfikacja gatunków na podstawie DNA może być przeprowadzona w dowolnym miejscu bez opóźnień. Po trzecie, poszukiwanie materiałów botanicznych jest zadaniem, które wymaga globalnej operacji. Dzięki postępom w usługach w chmurze i sztucznej inteligencji urządzenie przenośne może potencjalnie otrzymywać metody opracowane i zatwierdzone przez ekspertów w laboratorium, być obsługiwane przez osoby niebędące ekspertami w odległych obszarach i uzyskiwać obiektywne certyfikaty od stron trzecich. Dlatego ta opcja jest bardziej atrakcyjna niż kiedykolwiek, a praca zdalna staje się trendem.

Podsumowując, w niniejszym protokole zademonstrowano identyfikację terenową M. chamomilla za pomocą przenośnego systemu qPCR. Pomyślne zastosowanie tej techniki pozwoli uzyskać bardzo dokładne wyniki identyfikacji botanicznej i pomoże producentom i dostawcom botanicznym kwalifikować materiały botaniczne w sposób terminowy i opłacalny.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaświadczamy, że Zhengxiu Yang, Zheng Quan, Tiffany Chua, Leo Li, Yanjun Zhang, Silva Babajanian, Tricia Chua, Peter Chang, Gary Swanson, Zhengfei Lu są pracownikami Herbalife International of America, Inc. Zaświadczamy, że Francesco Buongiorno, Isabella Della Noce i Lorenzo Colombo są pracownikami firmy Hyris Ltd., która produkuje przenośny przyrząd qPCR używany w tym artykule.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Jamesowi Shanowi za jego wysiłki w nagrywaniu filmów terenowych. Dziękujemy Jonowi Byronowi i Matthew Semerau za ich pracę przy montażu wideo. Dziękujemy Ansenowi Luo, Harry'emu Du i Frankowi Dengowi za ich wsparcie w zlokalizowaniu pola testowego. Dziękujemy Marii Rubinsky za cenne uwagi do całego rękopisu. Wszystkie wyróżnione osoby są pracownikami Herbalife International of America, Inc.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BateriaTNE78000mAhZapewnij zasilanie polowe
bCUBEHYRISbCUBE 2.0do przyrządów qPCR
(16 dołków)HYRISNAMateriały eksploatacyjne do
pipety elektrycznejEppendorfNAObsługa płynu
Extract-N-AmpTM zestaw do PCR roślinSIGMAXNAP2-1KTZestaw do ekstrakcji DNA roślin
Rumianek niemiecki (Matricaria chamomilla L) botaniczny materiał referencyjnyAHP2264Stosowany jako kontrola pozytywna
Mini sucha kąpielYooningMiniH-100LDo ekstrakcji DNA
Woda wolna od nukleazAMBIONAM9937qPCR
reaction PrimerThermo Fisher ScientificNAqPCR reakcja
Rumianek rzymski (Chamaemelum nobile) kwiat botancyjne materiały referencyjneChromaDexASB-00030806-005Stosowany jako kontrola pozytywna
Luna universal qPCR master mixNEBM3003LqPCR reakcja
Przenośne kartridże bCUBE

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, T., Gillespie, M., Eckl, V., Knepper, J., Reynolds, C. Herbal supplement sales in US increase by 9.4% in 2018. HerbalGram. 123, 62-73 (2019).
  2. Israelsen, L. D. The challenge of regulation, globalization and climate change on botanicals and traditional medicines: respecting tradition while embracing change. Planta Medica. 74 (3), 36(2008).
  3. Cardellina, J. H. Challenges and opportunities confronting the botanical dietary supplement industry. Journal of Natural Products. 65 (7), 1073-1084 (2002).
  4. Foster, S. Exploring the peripatetic maze of black cohosh adulteration: a review of the nomenclature, distribution, chemistry, market status, analytical methods and safety. HerbalGram. 98, 32-51 (2013).
  5. Vanherweghem, J. L. Misuse of herbal remedies: The case of an outbreak of terminal renal failure in Belgium (Chinese herbs nephropathy). The Journal of Alternative and Complementary Medicine. 4 (1), 9-13 (1998).
  6. Vanherweghem, J. L., et al. Rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming regimen including Chinese herbs. The Lancet. 341 (8842), 387-391 (1993).
  7. Khan, I. A., Smillie, T. Implementing a "quality by design" approach to assure the safety and integrity of botanical dietary supplements. Journal of Natural Products. 75 (9), 1665-1673 (2012).
  8. Applequist, W. The Identification of Medicinal Plants: A Handbook of the Morphology of Botanicals in Commerce. , Missouri Botanical Garden Press. (2006).
  9. Upton, R., Graff, A., Jolliffe, G., Länger, R., Williamson, E. American Herbal Pharmacopoeia: Botanical Pharmacognosy - Microscopic Characterization of Botanical Medicines. , CRC Press. (2016).
  10. Frommenwiler, D. A., et al. Comprehensive HPTLC fingerprinting for quality control of an herbal drug - the case of angelica gigas root. Planta Medica. 84 (6-7), 465-474 (2018).
  11. Heyman, H. M., Meyer, J. J. M. NMR-based metabolomics as a quality control tool for herbal products. South African Journal of Botany. 82, 21-32 (2012).
  12. Lazarowych, N. J., Pekos, P. Use of fingerprinting and marker compounds for identification and standardization of botanical drugs: strategies for applying pharmaceutical HPLC analysis to herbal products. Drug Information Journal. 32 (2), 497-512 (1998).
  13. Tankeu, S., et al. Hyperspectral imaging and support vector machine: a powerful combination to differentiate black cohosh (actaea racemosa) from other cohosh species. Planta Medica. 84 (6-7), 407-419 (2018).
  14. Rodman, J. E., Cody, J. H. The taxonomic impediment overcome: NSF's Partnerships for Enhancing Expertise in Taxonomy (PEET) as a model. Systematic Biology. 52 (3), 428-435 (2003).
  15. Chen, S., et al. A renaissance in herbal medicine identification: from morphology to DNA. Biotechnology Advances. 32 (7), 1237-1244 (2014).
  16. Li, X., et al. Plant DNA barcoding: from gene to genome. Biological Reviews. 90 (1), 157-166 (2015).
  17. Madesis, P., Ganopoulos, I., Sakaridis, I., Argiriou, A., Tsaftaris, A. Advances of DNA-based methods for tracing the botanical origin of food products. Food Research International. 60, 163-172 (2014).
  18. Newmaster, S. G., Ragupathy, S., Janovec, J. A botanical renaissance: state-of-the-art DNA bar coding facilitates an automated identification technology system for plants. International Journal of Computer Applications in Technology. 35 (1), 50-60 (2009).
  19. Parveen, I., Gafner, S., Techen, N., Murch, S. J., Khan, I. A. DNA barcoding for the identification of botanicals in herbal medicine and dietary supplements: strengths and limitations. Planta Medica. 82 (14), 1225-1235 (2016).
  20. Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. A pocket-sized convective PCR thermocycler. Angewandte Chemie International Edition. 46 (23), 4316-4319 (2007).
  21. Almassian, D. R., Cockrell, L. M., Nelson, W. M. Portable nucleic acid thermocyclers. Chemical Society Reviews. 42 (22), 8769-8798 (2013).
  22. Benítez-Páez, A., Portune, K. J., Sanz, Y. Species-level resolution of 16S rRNA gene amplicons sequenced through the MinION portable nanopore sequencer. Gigascience. 5 (1), 4(2016).
  23. Emanuel, P. A., et al. Detection of Francisella tularensis within infected mouse tissues by using a hand-held PCR thermocycler. Journal of Clinical Microbiology. 41 (2), 689-693 (2003).
  24. Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228(2016).
  25. Lu, Z., et al. Single-laboratory validation of a two-tiered DNA barcoding method for raw botanical identification. Journal of AOAC International. 102 (5), 1435-1447 (2019).
  26. Sgamma, T., et al. DNA barcoding for industrial quality assurance. Planta Medica. 83 (14-15), 1117-1129 (2017).
  27. Wallinger, C., et al. Rapid plant identification using species-and group-specific primers targeting chloroplast DNA. PLoS One. 7 (1), 29473(2012).
  28. Newmaster, S. G., et al. Recommendations for validation of real-time PCR methods for molecular diagnostic identification of botanicals. Journal of AOAC International. , (2019).
  29. Singh, O., Khanam, Z., Misra, N., Srivastava, M. K. Chamomile (Matricaria chamomilla L.): an overview. Pharmacognosy Reviews. 5 (9), 82(2011).
  30. Mills, S. Y., Bone, K. The Essential Guide to Herbal Safety. Elsevier Health Sciences. , 325(2004).
  31. Avula, B., et al. Quantitative determination of phenolic compounds by UHPLC-UV-MS and use of partial least-square discriminant analysis to differentiate chemo-types of Chamomile/Chrysanthemum flower heads. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 278-288 (2014).
  32. Guzelmeric, E., Vovk, I., Yesilada, E. Development and validation of an HPTLC method for apigenin 7-O-glucoside in chamomile flowers and its application for fingerprint discrimination of chamomile-like materials. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 108-118 (2015).
  33. Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. Genome Research. 3 (3), 30-37 (1993).
  34. Untergasser, A., et al. Primer3Plus, an enhanced web interface to Primer3. Nucleic Acids Research. 35, Web Server issue 71-74 (2007).
  35. Bustin, S., Huggett, J. qPCR primer design revisited. Biomolecular Detection and Quantification. 14, 19-28 (2017).
  36. Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3235-3241 (1997).
  37. Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), Oxford, England. 1019-1020 (2011).
  38. Heikrujam, J., Kishor, R., Mazumder, P. B. The chemistry behind plant DNA isolation protocols. Biochemical Analysis Tools - Methods for Bio-Molecules Studies. , (2020).
  39. Blum-Silva, C. H., Chaves, V. C., Schenkel, E. P., Coelho, G. C., Reginatto, F. H. The influence of leaf age on methylxanthines, total phenolic content, and free radical scavenging capacity of Ilex paraguariensis aqueous extracts. Revista Brasileira de Farmacognosia. 25 (1), 1-6 (2015).
  40. Lu, Z., et al. Validation of a targeted PCR method for raw and processed botanical material identification: an example using matricaria chamomilla (chamomile). Journal of AOAC International. 102 (6), 1787-1797 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Identyfikacja botanicznaekstrakcja DNAanaliza krzywej topnieniarumianek pospolityrumianek rzymskitesty terenoweamplifikacja qPCRbotaniczna kontrola jako ci

Powiązane artykuły