Artykuł metodologiczny

Stosowanie biopsji chemicznej do oceny jakości przeszczepu

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60946

⸱

17 czerwca 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacodynamics and Molecular Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Nicolaus Copernicus University in Torun, Collegium Medicum in Bydgoszcz, 2Multi Organ Transplant Program, Department of Surgery, Toronto General Hospital, University Health Network, 3Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland, 4Department of Medicine, Toronto General Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Protokół przedstawia wykorzystanie metody biopsji chemicznej, a następnie kompleksową analizę metabolomiczną i lipidomiczną do oceny jakości przeszczepów nerek przeznaczonych do przeszczepu.

Streszczenie

Przeszczep nerki jest terapią ratującą życie dla dużej liczby osób ze schyłkową dysfunkcją nerek na całym świecie. Zabieg wiąże się ze zwiększoną przeżywalnością i wyższą jakością życia pacjenta w porównaniu z konwencjonalną dializą. Niestety, transplantologia cierpi z powodu braku wiarygodnych metod oceny jakości narządów. Standardowe techniki diagnostyczne ograniczają się do makroskopowej kontroli wyglądu lub inwazyjnej biopsji tkanki, które nie dostarczają wyczerpujących informacji o przeszczepie. Proponowany protokół ma na celu wprowadzenie mikroekstrakcji do fazy stałej (SPME) jako idealnej metody analitycznej do kompleksowej analizy metabolomicznej i lipidomicznej wszystkich związków niskocząsteczkowych obecnych w nerkach przeznaczonych do przeszczepienia. Niewielkie rozmiary sondy SPME umożliwiają wykonanie biopsji chemicznej, która umożliwia ekstrakcję metabolitów bezpośrednio z narządu bez konieczności pobierania tkanek. Minimalna inwazyjność metody pozwala na wykonywanie wielu analiz w czasie: bezpośrednio po pobraniu narządu, w trakcie jego konserwacji oraz bezpośrednio po rewaskularyzacji w organizmie biorcy. Przypuszcza się, że połączenie tej nowatorskiej metody pobierania próbek ze spektrometrem mas o wysokiej rozdzielczości pozwoli na rozróżnienie zestawu charakterystycznych związków, które mogą służyć jako biologiczne markery jakości przeszczepu i wskaźniki możliwego rozwoju dysfunkcji narządów.

Wprowadzenie

Według Sieci Pozyskiwania i Transplantacji Narządów w Stanach Zjednoczonych, w 2019 roku w USA było 94 756 pacjentów oczekujących na przeszczep nerki; podczas gdy w Europie w 2018 roku liczba ta wynosiła 10 791. Co dziesięć minut ktoś jest dodawany do krajowej listy oczekujących na przeszczep w Stanach Zjednoczonych i szacuje się, że każdego dnia umiera 20 osób oczekujących na przeszczep1,2. Przeszczep nerki jest leczeniem ratującym życie wielu osób cierpiących na schyłkową niewydolność nerek na całym świecie. Procedura wiąże się ze zwiększonym wskaźnikiem przeżycia i lepszą jakością życia w porównaniu z konwencjonalną dializą.

Jednak transplantacja napotyka wiele poważnych problemów, takich jak niedobór narządów czy brak skutecznych narzędzi do oceny jakości narządów. Standardowe protokoły ograniczają się do makroskopowej kontroli wyglądu lub inwazyjnej biopsji tkanki, które nie dostarczają wyczerpujących informacji na temat jakości przeszczepu. Podczas gdy ocena wizualna pozwala na identyfikację guzów widocznych gołym okiem, nieprawidłowości anatomicznych lub rozległych uszkodzeń przeszczepów, podejście to jest bardzo subiektywne, a jego skuteczność różni się w zależności od doświadczenia obserwatorów. Z drugiej strony biopsja może dostarczyć cennych informacji na temat istniejących wcześniej zaburzeń nerek, a zatem jest uważana za metodę o obiektywnej i udowodnionej wartości w określaniu wyników przeszczepu. Jednak procedura biopsji nie jest wolna od wad; Istnieje ryzyko potencjalnych powikłań, takich jak krwawienie i wymagane jest dodatkowe 4-5 godzin przygotowania próbki, co znacznie wydłuża czas niedokrwienia zimna. W związku z tym, szczególnie w Europie, stosowanie bezpośredniej analizy tkanek jest ograniczone do dawców o rozszerzonych kryteriach (ECD) i dawców po śmierci krążeniowej (DCD)3,4.

Metabolomika i lipidomika zostały ostatnio uznane za obiecujące podejścia do lepszego zrozumienia zmian w szlakach biochemicznych zachodzących podczas konserwacji narządów. Profilowanie metabolomiczne i lipidomiczne umożliwia monitorowanie natychmiastowych reakcji systemu na nagłe zmiany środowiskowe związane z usunięciem narządu z późniejszymi konsekwencjami: niedokrwieniem, stresem oksydacyjnym lub reakcjami zapalnymi5,6,7,8. Nerka jest narządem, który jest w dużej mierze związany z procesami metabolicznymi, dlatego pomiary stężeń metabolitów i lipidów mogą pozwolić na identyfikację potencjalnych biomarkerów jakości narządów i umożliwić lepsze przewidywanie wyników przeszczepu.

Biorąc pod uwagę powyższe komplikacje i ograniczenia związane z obecnymi metodami oceny jakości narządów, potrzebne jest mniej inwazyjne rozwiązanie diagnostyczne do szybkiej i złożonej oceny jakości narządów. Mikroekstrakcja do fazy stałej (SPME) spełnia te wymagania jako minimalnie inwazyjna metoda analityczna, która umożliwia pokrycie szerokiego spektrum metabolitów i lipidów. Technika polega na wprowadzeniu na krótki czas do badanego narządu cienkiej (~200 μm), biokompatybilnej sondy ze stopu tytanu i niklu pokrytej selektywną fazą ekstrakcji. Należy podkreślić, że SPME zapobiega ekstrakcji białek, a co za tym idzie umożliwia zahamowanie metabolizmu już na etapie pobierania próbki, co stanowi istotną przewagę nad metodami alternatywnymi. Ponadto miniaturyzacja urządzenia pozwala na wykonywanie powtarzalnych i jednoczesnych analiz kilku struktur organu9,10,11.

Protokół

Wszystkie zwierzęta otrzymały humanitarną opiekę zgodnie z ''Zasadami opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi'' opracowanymi przez National Society for Medical Research oraz ''Przewodnikiem po opiece nad zwierzętami laboratoryjnymi'' wydanym przez National Institute of Health, Ontario, Kanada. Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Instytutu Badawczego w Toronto zatwierdził wszystkie badania. Badania z udziałem ludzi uzyskały zgodę Komisji Bioetycznej Collegium Medicum w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu.

UWAGA: Uzyskaj zgodę od odpowiednich komisji etycznych. Pamiętaj, aby zawsze nosić rękawice ochronne. Nie dotykaj fazy ekstrakcji sond SPME. Do analiz lipidomicznych zaleca się stosowanie fiolek ze szkła dezaktywowanego.

1. Przygotowanie sond

  1. Przygotować sondy ze stopu tytanu i niklu (długość 40 mm; średnica 0,2 mm) pokryte sorbentem mieszanym o średnicy 7 mm. Liczba sond zależy od punktów czasowych docelowych podczas całej procedury oraz liczby powtórzeń (zalecane jest 3 na punkt czasowy).
    UWAGA: Długość i rodzaj fazy ekstrakcji można dostosować w zależności od trybu badania, polarności metabolitów i matrycy próbki.
  2. Przygotować mieszaninę czyszczącą składającą się z chloroformu:metanolu w stosunku 2:1 (v/v). Odmierzyć pipetę po 1,0 ml roztworu do każdej szklanej fiolki o pojemności 2,0 ml i umieścić jedną sondę, uprzednio przebitą przez nakrętkę, w każdej fiolce.
    UWAGA: Przed użyciem wyczyść wszystkie sondy, aby usunąć cząsteczki zanieczyszczeń.
  3. Umieścić fiolki na mieszadle i ustawić prędkość mieszania na 1,200 obr./min. Po 45 minutach zatrzymaj urządzenie i spłucz powłoki wodą klasy LC-MS.
  4. Ponieważ powłoki muszą zostać poddane etapowi kondycjonowania wstępnego w celu ich aktywacji, należy przygotować mieszaninę kondycjonującą wstępnie składającą się z metanolu i wody w stosunku 1:1 (v/v). Odmierzyć pipetę po 1,0 ml roztworu do każdej szklanej fiolki o pojemności 2,0 ml i umieścić w każdej fiolce po jednej sondzie, uprzednio przebitej przez nakrętkę.
  5. Umieścić fiolki na mieszadle wirowym i ustawić prędkość mieszania na 1,200 obr./min.
  6. Po 60 minutach należy zatrzymać mieszadło i spłukać powłoki wodą klasy LC-MS.
  7. Sterylizuj sondy zgodnie ze standardowym protokołem sterylizacji sprzętu chirurgicznego.

2. Ekstrakcja

  1. Otwórz sterylne opakowanie tuż przed pobraniem próbki, aby zapewnić sterylne środowisko.
  2. Włóż dwie sondy bezpośrednio do kory nerkowej na 10 minut w każdym punkcie czasowym. Cała długość powłoki musi być pokryta matrycą tkankową; Nie jest wymagany konkretny kąt, ale zwykle stosuje się ok. 90 stopni.
    UWAGA: Cała procedura medyczna przebiega zgodnie ze standardowymi protokołami w danej placówce. Nie rozważa się żadnych modyfikacji dotyczących pobierania próbek SPME. Procedura obejmuje sześć następujących punktów czasowych pobierania próbek:
    a) przed resekcją nerki, in vivo od dawcy;
    b)-e) po 1 godzinach, 3 godzinach, 5 godzinach, 7 godzinach perfuzji nerkowej, ex vivo w komorze narządowej;
    f) po reperfuzji, in vivo od biorcy.
  3. Wycofaj sondy, wyciągając je z tkanki, a następnie spłucz powłoki wodą klasy LC-MS, aby usunąć pozostałą krew z powierzchni powłoki. Spłukać z miejsca operowanego i natychmiast po wyjęciu sond.

3. Transport i przechowywanie

  1. Umieścić sondy w oddzielnych fiolkach i zamknąć je.
  2. Umieścić fiolki w styropianowym pudełku wypełnionym suchym lodem lub w ciekłym azocie na czas transportu.
  3. Próbki należy przechowywać w zamrażarce (-80 °C) lub natychmiast rozpocząć etap desorpcji.

4. Desorpcja

  1. Przygotować roztwory desorpcyjne składające się z proporcji acetonitryl:woda (v/v) w proporcji 80:20 do analizy metabolomicznej i izopropanolu:metanolu (v/v) w stosunku 1:1 do analizy lipidomicznej.
  2. Odmierzyć pipetą 100 μl roztworu do wkładek umieszczonych w oznaczonych fiolkach o pojemności 2,0 ml i umieścić jedną sondę, uprzednio przebitą przez nakrętkę, w każdej fiolce.
  3. Umieścić fiolki na mieszadle wirowym i ustawić prędkość mieszania na 1 200 obr./min na 120 minut.
  4. Wyjąć sondy z fiolek. Uzyskane ekstrakty są teraz gotowe do analizy instrumentalnej.

5. Analiza LC-MS

  1. Umieścić fiolki z ekstraktami w automatycznym podajniku próbek systemu LC-MS.
    UWAGA: W tym badaniu zastosowano chromatografię cieczową (RP, HILIC) w połączeniu ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości i analizatorem mas orbitrap. Aby zapoznać się z parametrami analizy metabolomicznej, przejdź do kroku 5.2. Aby zapoznać się z parametrami analizy lipidomicznej, przejdź do kroku 5.6.
  2. Użyj kolumny pentafluorofenylowej (PFP) (2.1 mm x 100 mm, 3 μm) do separacji odwróconych faz.
    1. Ustaw natężenie przepływu na 300 μl/min, a temperaturę automatycznego podajnika próbek i kolumny odpowiednio na 4 °C i 25 °C.
    2. Przygotować fazy ruchome w następujących proporcjach: faza ruchoma A: woda: kwas mrówkowy (99,9:0,1, v/v) i faza ruchoma B: acetonitryl: kwas mrówkowy (99,9:0,1, v/v). Ustaw przepływ fazy ruchomej zgodnie z następującymi parametrami: początkowy przepływ fazy ruchomej (0-3 min): 100% A, a następnie gradient liniowy do 10% A (3-25 min), kończący się przepływem izokratycznym 10% A do 34 min, po którym następuje 6 min czasu przywrócenia równowagi kolumny.
  3. Do separacji HILIC należy użyć kolumny HILIC (2,0 mm x 100 mm, 3 μm, 200 A). Ustawić natężenie przepływu na 400 μl/min.
    1. Przygotować fazy ruchome zgodnie z następującymi proporcjami: faza ruchoma A: bufor acetonitryl: octan amonu (9:1, v/v, efektywne stężenie soli 20 mM), faza ruchoma B: bufor acetonitryl: octan amonu (1:1, v/v, efektywne stężenie soli 20 mM).
    2. Ustaw przepływ fazy ruchomej zgodnie z następującymi parametrami: rozpoczęcie przepływu fazy ruchomej (0-3 min) na 100% A, przytrzymaj przez 3,0 min, a następnie zwiększ do 100% B w ciągu 5 minut. Przytrzymaj ze 100% B do 12 min, a następnie 8 min czasu przywrócenia równowagi kolumny.
  4. Ustaw zakres skanowania na 85-1000 m/z. Ustaw parametry źródła jonów HESI w trybie jonizacji dodatniej na: napięcie natrysku 1 500 V, temperaturę kapilary 300 °C, gaz osłonowy 40 a.u., natężenie przepływu gazu pomocniczego 15 a.u., temperaturę grzałki sondy 300 °C, poziom RF soczewki S-Lens 55%.
  5. Przeprowadzaj kontrolę jakości próbek składających się z 10 μl każdej analizowanej próbki (regularnie, co 10-12 próbek) w celu monitorowania wydajności urządzenia.
  6. Do separacji odwróconych faz należy użyć kolumny C18 (2.1 mm x 75 mm, 3.5 μm).
    1. Ustaw natężenie przepływu na 200 μl/min, a temperaturę automatycznego podajnika próbek i kolumny odpowiednio na 4 °C i 55 °C. Przygotować fazy ruchome w następujących proporcjach: faza ruchoma A:H2O:MeOH (60:40, v/v), 10 mM octan amonu i 1 mM kwas octowy; faza ruchoma B: IPA:MeOH (90:10, v/v), 10 mM octan amonu i 1 mM kwas octowy.
    2. Ustaw przepływ fazy ruchomej zgodnie z następującymi parametrami: 0-1 min (20% B), 1-1,5 min (20-50% B), 1,5-7,5 min (50-70% B), 7,5-13 min (70-95% B), 13-17 min (95% B), 17-17,1 min (95-20% B), 17,1-23 min (20%).
  7. Do separacji HILIC należy użyć kolumny HILIC (100 x 2,1 mm, 3 μm).
    1. Ustaw natężenie przepływu na 400 μl/min, a temperaturę automatycznego podajnika próbek i kolumny odpowiednio na 4 °C i 40 °C.
    2. Przygotować fazy ruchome zgodnie z następującymi proporcjami: faza ruchoma A: ACN; faza ruchoma B: 5 mM octanu amonu w wodzie. Ustaw przepływ fazy ruchomej zgodnie z następującymi parametrami: 0-2 min (96% B), 2-15 min (96-80% B), 15-15,1 min (80-96% B), 15,1-21 min (96% B).
  8. Ustaw parametry źródła jonów HESI w trybie jonizacji dodatniej na napięcie natrysku 3 500 V, temperaturę kapilary 275 °C, gaz osłonowy 20 au, natężenie przepływu gazu pomocniczego 10 a.u., temperaturę grzałki sondy 300 °C, poziom RF S-Lens 55%.
  9. Uruchom próbki QC składające się z 10 μl każdej analizowanej próbki (co 10-12 próbek) w celu monitorowania wydajności urządzenia.
  10. Wykonaj akwizycję danych w oprogramowaniu kompatybilnym z urządzeniem.

6. Analiza danych

  1. Przetwarzanie danych, przypuszczalna identyfikacja i analiza statystyczna za pomocą oprogramowania dedykowanego do nieukierunkowanej analizy metabolomicznej i lipidomicznej.
    UWAGA: W celu wizualizacji struktury danych można uzyskać analizę głównych składowych (PCA) i wykresy pudełkowych.

Wyniki

Pobieranie próbek przeprowadzono zgodnie z opisaną powyżej metodą SPME, wykorzystując sondy powlekane 7 mm mieszaną fazą ekstrakcyjną. Próbki pobierano bezpośrednio z tkanki przeszczepu (in vivo przed transplantacją), ex vivo z komory nerkowej po 1 h, 3 h, 5 h i 7 h perfuzji oraz in vivo po rewaskularyzacji u biorcy. Nieselektywne analizy metabolomiczne i lipidomiczne wykonano przy użyciu chromatografii cieczowej (RP, HILIC) sprzężonej z wysokorozdzielczą spektrometrią mas, z analizatorem masy ustawionym w trybie jonizacji pozytywnej. W celu oceny jakości danych i uzyskania ogólnego wglądu w wyniki, dane poddano analizie głównych składowych (PCA). Jak pokazano na Rysunku 1, próbki QC utworzyły ciasny klaster, co potwierdza jakość analiz. Badane grupy wykazują stosunkowo dobrą separację, co pozwala na wizualizację różnic w profilach metabolicznych i lipidomicznych przed i po transplantacji, a także podczas perfuzji narządu (Rysunek 2). Pobieranie próbek metodą SPME umożliwia profilowanie metaboliczne narządu w czasie. Wykresy pudełkowe wybranych metabolitów służą do zilustrowania zmian w poziomach metabolitów w trakcie eksperymentu (Rysunek 3). Szerokie spektrum wyekstrahowanych cech rozdzielonych na kolumnach RP i HILIC przedstawiono na Rysunku 4.

Wykresy rozrzutu analizy głównych składowych (PCA); schemat porównujący rozkłady grupy QC i grup próbek.
Rycina 1: Analiza głównych składowych wykazująca grupowanie próbek kontroli jakości dla analiz metabolomicznych w układzie odwróconym (A), HILIC (B) oraz lipidomicznych w układzie odwróconym (C) i HILIC (D). Kontrola jakości jest niezbędna w analizie nietargetowanej w celu monitorowania wszelkich możliwych zmian wywołanych niestabilnością aparatury. Ścisłe grupowanie się próbek QC zapewnia, że wszystkie zaobserwowane zmiany mają pochodzenie biologiczne. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Wykresy analizy głównych składowych (PCA) porównujące stany perfuzji oraz próbki od dawcy i biorcy.
Rysunek 2: Analiza głównych składowych przedstawiająca różnice metabolomiczne (A) i lipidomiczne (B) pomiędzy poszczególnymi punktami poboru próbek. Niekierowane profilowanie nerek z wykorzystaniem SPME-LC-HRMS umożliwia zaobserwowanie różnic biochemicznych w organach na kolejnych etapach ich konserwacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza farmakokinetyczna; wykresy pudełkowe zależności dawka-odpowiedź; wskaźniki wchłaniania i stężenia; wykres danych.
Rysunek 3: Wykresy pudełkowe wybranych związków pokazujące zmiany w metabolitach (A, B) i lipidach (C, D) w okresie okołoprzeszczepiennym. Po wyselekcjonowaniu i zidentyfikowaniu związków różnicujących, wykresy pudełkowe pozwalają na monitorowanie zmian w poziomach tych związków na kolejnych etapach protokołu oraz porównanie poziomów metabolitów w organach poddanych różnym protokołom konserwacji lub pobranych od różnych dawców, np. dawców z bijącym sercem lub dawców po zgonie krążeniowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Chromatogramy spektrometrii masowej, m/z względem RT, wykres przedstawiający wyniki analizy rozdziału związków.
Rycina 4: Mapa jonów (m/z w funkcji czasu retencji) cech uzyskanych w analizie LC-MS z zastosowaniem rozdziału (A) w odwróconej fazie oraz (B) metodą HILIC. Wykres umożliwia oszacowanie całkowitej liczby cech uzyskanych przy zastosowaniu proponowanego protokołu (od ekstrakcji po detekcję) oraz ocenę zakresu pokrycia analitów w zależności od polarności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Ocena jakości narządów pozostaje dużym wyzwaniem dla lekarzy, którzy muszą podejmować szybkie, świadome decyzje dotyczące tego, czy dany narząd nadaje się do przeszczepu, czy też należy go wyrzucić. Wiele czynników, takich jak wiek dawcy, czas trwania niedokrwienia oraz infekcje i procesy zapalne, może wpływać na długoterminowy wynik przeszczepu. Chociaż do tej pory opracowano różne metody diagnozowania funkcji alloprzeszczepu nerki, badanie histopatologiczne pozostaje złotym standardem w tej materii 3,4,12. Chociaż procedura biopsji może dostarczyć istotnych informacji na temat istniejącej wcześniej choroby dawcy i zmian naczyniowych, nie jest wolna od wad. Typowe problemy w tym zakresie utrzymują błędy w pobieraniu próbek związane ze zmiennością między obserwatorami oraz pobieranie próbek niewystarczającej ilości kłębuszków nerkowych w celu uzyskania wyczerpujących informacji na temat funkcji narządów. Ponadto przygotowanie próbki wiąże się z pewnymi problemami, takimi jak niepełna ocena przeszczepu w przypadku zamrożonych skrawków oraz wydłużenie czasu zabiegu cięcia parafinowego. Jednak zwiększone ryzyko krwotoku, który może objawiać się ostrym lub dużym krwiomoczem, jest głównym zagrażającym życiu powikłaniem związanym z procedurą biopsji. Z tego powodu liczba dopuszczalnych biopsji w procedurach transplantacyjnych jest ściśle ograniczona, co utrudnia uchwycenie zmian dynamicznych i analiz szeregów czasowych za pomocą tej metody 12,13,14. Korzyści płynące z analizy histologicznej należy porównać z ryzykiem związanym z tą metodologią. Wartość wyników histologicznych jest niepodważalna, ale nie wyjaśniają one molekularnych mechanizmów aberracji.

Metabolomika i lipidomika to najmłodsze dziedziny naukowej rodziny "-omicznej". Kompletny zestaw niskocząsteczkowych (<1200 Da) ludzkich metabolitów i lipidów połączonych w sieć metaboliczną definiuje się jako metabolom ludzki. Genom pozostaje względnie stały przez całe życie, z niewielkimi modyfikacjami spowodowanymi rzadkimi mutacjami. Metabolom jest produktem ekspresji genów, który jest bardzo wrażliwy na zmiany we wszystkich procesach biologicznych, a także czynniki środowiskowe. Dynamiczna natura metabolitów i lipidów sprawia, że są one doskonałymi wskaźnikami aktualnego stanu narządów 7,8,15,16. Zaproponowana w ww. protokole metoda SPME umożliwia wykrycie zmian zachodzących w narządzie w trakcie jego konserwacji, począwszy od pobrania narządu z organizmu dawcy, aż do rewaskularyzacji u biorcy. Mała średnica sondy (~200 μm) zapewnia minimalną inwazyjność i pozwala na pobranie kilku próbek z tego samego narządu bez powodowania uszkodzeń tkanki. Prowadzenie badań z wykorzystaniem nerki, jako najczęściej przeszczepianego narządu, pozwala na lepsze zrozumienie i dalszą charakterystykę szlaków metabolicznych odpowiedzialnych za spadek jakości i funkcji przeszczepów. Możliwość monitorowania modyfikacji w czasie z pewnością jest ważną zaletą tej techniki w porównaniu z konwencjonalnymi metodami inwazyjnymi, takimi jak biopsja. W prezentowanej analizie zidentyfikowano zmienione stężenia różnych grup lipidów i metabolitów, zwłaszcza aminokwasów egzogennych, puryn, nukleozydów purynowych i glicerofosfolipidów. Wyniki te są zgodne z poprzednimi raportami z analizy tkanek 5,6,17,18,19,20. Do tej pory większość doniesień naukowych wykorzystujących metabolomikę lub lipidomikę do wyjaśnienia procesów wywołujących powikłania po przeszczepie lub zjawiska uszkodzenia niedokrwiennego/reperfuzyjnego (IRI) ograniczała się do analizy płynów biologicznych 21,22,23.

Każde zastosowanie kliniczne wymaga optymalizacji protokołu pobierania próbek, aby zapewnić, że działanie metody analitycznej spełnia oczekiwane kryteria. W związku z tym korzyścią płynącą z wykorzystania SPME jest możliwość dostosowania warunków do różnych projektów eksperymentalnych. Różnorodność dostępnych faz ekstrakcji zapewnia szerokie spektrum ekstrahowanych metabolitów o zróżnicowanej polarności. Jednocześnie można to uznać za ograniczenie metody ze względu na fakt, że każdy sorbent zapewnia selektywność w stosunku do określonych cech i nie ekstrahuje wszystkich związków obecnych w matrycy próbki. Należy zauważyć, że powłoki SPME ekstrahują tylko za pomocą wolnych cząsteczek i po prostu nie wchodzą w interakcje ze związaną frakcją analitu. Biokompatybilność powłok nie wprowadza toksyczności do tkanki, jednocześnie ograniczając ekstrakcję dużych cząsteczek, takich jak białka; W konsekwencji procesy enzymatyczne zostają zahamowane już na etapie pobierania próbki, a obecność artefaktów jest zminimalizowana, co stanowi ogromną przewagę nad alternatywnymi metodami pobierania próbek. Długość powłoki wpływa na efektywność ekstrakcji (tj. długość powłoki wyznacza pole powierzchni i objętość fazy ekstrakcji); W związku z tym dłuższe powłoki zapewniają wyższy odzysk. Z drugiej strony, krótsze powłoki umożliwiają wyższą rozdzielczość przestrzenną. Aby uzyskać wiarygodne wyniki, ważne jest, aby zanurzyć sondę dokładnie na tej samej głębokości kory nerkowej. Zbyt głębokie wprowadzenie powoduje ryzyko przedostania się do rdzenia nerkowego. Czas ekstrakcji jest również proporcjonalny do wydajności ekstrakcji. Dlatego wybór optymalnego czasu ekstrakcji jest jednym z najbardziej krytycznych etapów w rozwoju metody SPME. Dokładność pomiaru czasu zapewnia najwyższą powtarzalność. W zastosowaniach biologicznych, takich jak ta omówiona, zawsze istnieje kompromis między czułością i powtarzalnością protokołu analitycznego a ograniczeniami procedury medycznej. Podczas gdy ekstrakcja równowagowa zapewnia najwyższą czułość, ze względów bezpieczeństwa w takich zastosowaniach często stosuje się warunki wstępnej równowagi, ponieważ czas ekstrakcji nie powinien wpływać na całkowity czas trwania operacji. Skuteczność desorpcji zależy od czasu trwania procesu i składu rozpuszczalnika desorpcyjnego, który powinien być zgodny z fazą ruchomą używaną do rozdzielaniachromatograficznego 9,10,11.

Jednym z głównych wymagań dotyczących oprzyrządowania diagnostycznego stosowanego do oceny śródoperacyjnej jest czas analizy. Obecnie podejmowane są próby opracowania szybkiego narzędzia do ekstrakcji SPME in vivo sprzężonego bezpośrednio ze spektrometrem masowym za pomocą otwartego interfejsu mikroprzepływowego (MOI)24 lub natryskiwania z powlekanym ostrzem (CBS)25. Takie podejścia pozwoliłyby na ujawnianie wyników analiz w czasie rzeczywistym lub zbliżonym do czasu rzeczywistego. Zastosowanie takich metod do przedinterwencyjnych analiz profili metabolicznych i lipidomicznych może usprawnić proces podejmowania decyzji podczas procedur transplantacyjnych, umożliwiając najlepsze możliwe spersonalizowane podejście i szybką reakcję w przypadku niewydolności narządów.

Podsumowując, postawiono hipotezę, że proponowany protokół umożliwi uzyskanie pełnych profili metabolicznych i lipidomicznych przeszczepów nerkowych, co z kolei zapewniłoby kompleksową ocenę jakości narządów i charakterystykę procesów odpowiedzialnych za uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne. Nowatorstwem projektu jest wykorzystanie mikroekstrakcji do fazy stałej (SPME), oferującej niskoinwazyjne pobieranie próbek żywych organizmów, w połączeniu z jedną z najbardziej innowacyjnych dostępnych technologii analizy metabolomicznej i lipidomicznej (np. spektrometr masowy wysokiej rozdzielczości Orbitrap). SPME łączy w sobie pobieranie próbek, ekstrakcję i wygaszanie metabolitów w jednym kroku, dzięki czemu jest idealnym narzędziem do szybkiej analizy. Oczekuje się, że protokół ten pomoże odpowiedzieć na pytania związane z tym, jakie warunki nerki przed przeszczepieniem są odpowiedzialne za opóźnione funkcjonowanie narządu lub jego dysfunkcje po przeszczepie, a także jak protokół zachowania przeszczepu wpływa na biochemię narządu. Taka wiedza nie tylko miałaby znaczący wpływ na zapobieganie ewentualnym powikłaniom związanym z przeszczepem, ale może pomóc w ulepszeniu obecnych protokołów konserwacji przeszczepów, minimalizując utratę żywej tkanki po przeszczepie, a także utratę życia. Proponowane rozwiązanie otworzy drzwi do dalszych badań w tej dziedzinie, w tym walidacji określonych potencjalnych biomarkerów i poprawy wyników terapeutycznych w transplantologii.

Oświadczenia

Autorzy pragną podziękować firmie MilliporeSigma (Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy) za dostarczenie urządzeń SPME oraz firmie Thermo Fisher Scientific za dostęp do spektrometru mas Q-Exactive Focus Orbitrap.

Podziękowania

Badanie było wspierane przez grant Opus UMO-2017/27/B/NZ5/01013 z Narodowego Centrum Nauki. Autorzy pragną podziękować firmie MilliporeSigma, należącej do Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy, za dostarczenie urządzeń SPME. Dział nauk przyrodniczych firmy Merck działa w Stanach Zjednoczonych i Kanadzie pod nazwą MilliporeSigma. Autorzy pragną również podziękować firmie Thermo Fisher Scientific za dostęp do spektrometru mas orbitrap Q-Exactive Focus. Autorzy serdecznie dziękują dr Aleksandrze Woderskiej-Jasińskiej oraz personelowi Kliniki Transplantologii i Chirurgii Ogólnej w Bydgoszczy za życzliwą pomoc w realizacji projektu. BB pragnie podziękować prof. Januszowi Pawliszynowi za możliwość pobrania próbek w Toronto General Hospital podczas jej pobytu na University of Waterloo.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowyMerck5330010050Dodatek do fazy mobilnej
AcetonitrylAlchem696-34967-4X2,5LRozpuszczalnik HPLC
Octan amonuMerck5330040050Dodatek do fazy mobilnej
BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXERBenchmark ScientificBV1010Mieszalnik wirowy
CzapkiPerlan Technologies5183-2076Niebieski scrw tp, wstępnie nacięty PTFE/Si spta, 100PK
ChloroformMerck1024441000
Discovery HS F5 Supelguard Cartridge, 3 μ m, L i czasy; Średnica wewnętrzna 2 cm i razy; Kolumna ochronna 2,1 mmMerck567570-UHPLC
Discovery HS F5, 2,1 mm x 100 mm, 3 μ mKolumna HPLCMerck567502-U
Kwas mrówkowyAlchem497-94318-50MLDodatek do fazy ruchomej
Fiolki szklanePerlan Technologies5182-0714
HILIC Luna 3 i mu; m, 200A, 100 x 2.0 mmShim-PolPHX-00D-4449-B0Kolumna HPLC
HILIC SecurityGuard Kartridż, 3 μ m, 4 x 2,0 mmShim-PolPHX-AJ0-8328Kolumna ochronna HPLC
IsopropanolAlchem231-AL03262500Rozpuszczalnik HPLC
MetanolAlchem696-34966-4X2,5LRozpuszczalnik HPLC
Nano-czysta wodaMerck1037281002Rozpuszczalnik HPLC
Q Exactive Focus hybrydowy kwadrupol-Orbitrap MSThermo ScientificQ Exactive FocusMass Spektrometr
SeQuant ZIC-cHILIC 3µ m,100Å 100 x 2,1 mmKolumna HPLCMerck1506570001
Zestaw osłon SeQuant ZIC-HILIC 20 x 2,1 mmKolumna ochronnaMerck1504360001
Sondy światłowodowe SPME LC, tryb mieszanyprototypoweSupelco
Systemy HPLC UltiMate 3000 System HPLCThermo ScientificUltiMate 3000Wkładki
do fiolek (dezaktywowane)Perlan Technologies5181-8872
XSelect CSH C18 3.5μ m 2,1x75mmWoda186005644Kolumna HPLC
XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge 3,5μ m, 2.1x5mmWoda186007811kolumna ochronna HPLC
HPLC Włókna

Bibliografia

  1. U.S. Department of Health & Human Services. Organ Procurement and Transplantation Network. , Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov (2019).
  2. Branger, P., Undine, S. Annual Report 2018/Eurotransplant International Foundation. , Eurotransplant Foundation. Leiden. (2018).
  3. Dare, A. J., Pettigrew, G. J., Saeb-Parsy, K. Preoperative assessment of the deceased-donor kidney: From macroscopic appearance to molecular biomarkers. Transplantation. 97, 797-807 (2014).
  4. Mueller, T. F., Solez, K., Mas, V. Assessment of kidney organ quality and prediction of outcome at time of transplantation. Seminars in Immunopathology. 33, 185-199 (2011).
  5. Xu, J., et al. Lipidomics comparing DCD and DBD liver allografts uncovers lysophospholipids elevated in recipients undergoing early allograft dysfunction. Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).
  6. Rao, S., et al. Early lipid changes in acute kidney injury using SWATH lipidomics coupled with MALDI tissue imaging. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 310, 1136-1147 (2016).
  7. Wishart, D. S. Metabolomics: The principles and potential applications to transplantation. American Journal of Transplantation. 5, 2814-2820 (2005).
  8. Kim, S. J., Kim, S. H., Kim, J. H., Hwang, S., Yoo, H. J. Understanding metabolomics in biomedical research. Endocrinology and Metabolism. 31, 7-16 (2016).
  9. Bojko, B., et al. Solid phase microextraction fills the gap in tissue sampling protocols. Analytica Chimica Acta. 803, 75-81 (2013).
  10. Filipiak, W., Bojko, B. SPME in clinical, pharmaceutical, and biotechnological research - How far are we from daily practice. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. , 115-213 (2019).
  11. Bojko, B., et al. Low invasive in vivo tissue sampling for monitoring biomarkers and drugs during surgery. Laboratory Investigation. 94, 586-594 (2014).
  12. Ahmad, I. Biopsy of the transplanted kidney. Seminars in Interventional Radiology. 21, 275-281 (2004).
  13. Plattner, B. W., et al. Complications and adequacy of transplant kidney biopsies: A comparison of techniques. Journal of Vascular Access. 19, 291-296 (2018).
  14. Tapia-Canelas, C., et al. Complications associated with renal graft biopsy in transplant patients. Nefrologia. 34, 115-119 (2014).
  15. Afshinnia, F., et al. Lipidomics and Biomarker Discovery in Kidney Disease. Seminars in Nephrology. 38, 127-141 (2018).
  16. Zhao, Y. Y., Vaziri, N. D., Lin, R. C. Lipidomics: New insight into kidney disease. Advances in Clinical Chemistry. 68, 153-175 (2015).
  17. Kaminski, J., et al. Oxygen Consumption by Warm Ischemia-Injured Porcine Kidneys in Hypothermic Static and Machine Preservation. Journal of Surgical Research. 242, 78-86 (2019).
  18. Wijermars, L. G. M., et al. Defective postreperfusion metabolic recovery directly associates with incident delayed graft function. Kidney International. 90, 181-191 (2016).
  19. Huang, H., et al. Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion. Scientific Reports. 8, 1-12 (2018).
  20. Solati, Z., Edel, A. L., Shang, Y., Karmin, O., Ravandi, A. Oxidized phosphatidylcholines are produced in renal ischemia reperfusion injury. PLoS One. 13, 1-24 (2018).
  21. Wishart, D. S. Metabolomics in monitoring kidney transplants. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 15, 637-642 (2006).
  22. Abbiss, H., Maker, G. L., Trengove, R. D. Metabolomics approaches for the diagnosis and understanding of kidney diseases. Metabolites. 9, (2019).
  23. Zhang, Z. H., et al. Metabolomics insights into chronic kidney disease and modulatory effect of rhubarb against tubulointerstitial fibrosis. Scientific Reports. 5, 1-17 (2015).
  24. Looby, N. T., et al. Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry: Via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring. Analyst. 144, 3721-3728 (2019).
  25. Gómez-Ríos, G. A., Tascon, M., Pawliszyn, J. Coated blade spray: Shifting the paradigm of direct sample introduction to MS. Bioanalysis. 10, 257-271 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment
Posted by JoVE Editors on 8/28/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment. One of the affiliations was updated.

The third affiliation was updated from:

Department of Transplantation and General Surgery, University Hospital, University of Nicolaus Copernicus Torun"

to:

Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland

Tagi

Mikroekstrakcja w fazie sta ejtransplantacja narz d wanaliza metabolomicznaanaliza lipidomicznaspektrometria mas o wysokiej rozdzielczo cianaliza g wnych sk adowychanaliza LC MSsonda SPME
Stosowanie biopsji chemicznej do oceny jakości przeszczepu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.