Szczurzy model przeciążenia ciśnieniem wywołał umiarkowaną przebudowę i dysfunkcję skurczową, w przeciwieństwie do jawnej skurczowej niewydolności serca

Podsumowanie

Opisujemy tworzenie szczurzego modelu umiarkowanego przemodelowania wywołanego przeciążeniem ciśnieniem i wczesnej dysfunkcji skurczowej, gdzie aktywowane są szlaki transdukcji sygnału zaangażowane w inicjację procesu przebudowy. Ten model zwierzęcy pomoże w identyfikacji celów molekularnych do zastosowania wczesnych strategii terapeutycznych zapobiegających przebudowie niewydolności serca.

Streszczenie

W odpowiedzi na uraz, taki jak zawał mięśnia sercowego, przedłużające się nadciśnienie lub czynnik kardiotoksyczny, serce początkowo dostosowuje się poprzez aktywację szlaków transdukcji sygnału, aby przeciwdziałać, w krótkim okresie, utracie miocytów serca i/lub wzrostowi stresu w ścianie. Jednak przedłużona aktywacja tych szlaków staje się szkodliwa, prowadząc do inicjacji i propagacji przebudowy serca, co prowadzi do zmian w geometrii lewej komory i zwiększenia objętości lewej komory; fenotyp obserwowany u pacjentów ze skurczową niewydolnością serca (HF). W tym miejscu opisujemy stworzenie szczurzego modelu umiarkowanej przebudowy wywołanej przeciążeniem ciśnieniowym i wczesnej dysfunkcji skurczowej (MOD) poprzez wstępujące pasmo aorty (AAB) za pomocą klipsa naczyniowego o powierzchni wewnętrznej 2^mm2. Zabieg wykonywany jest na szczurach rasy Sprague-Dawley o wadze 200 g. Fenotyp MOD HF rozwija się po 8-12 tygodniach od AAB i jest charakteryzowany nieinwazyjnie za pomocą echokardiografii. Wcześniejsze prace sugerują aktywację szlaków transdukcji sygnału i zmienioną ekspresję genów oraz modyfikację potranslacyjną białek w fenotypie MOD HF, które naśladują te obserwowane w ludzkim skurczowym HF; w związku z tym, dzięki czemu fenotyp MOD HF jest odpowiednim modelem do badań translacyjnych w celu identyfikacji i testowania potencjalnych terapeutycznych celów przeciw przebudowie w HF. Zaletą fenotypu MOD HF w porównaniu z jawnym skurczowym fenotypem HF jest to, że pozwala on na identyfikację celów molekularnych zaangażowanych we wczesny proces przebudowy i wczesne zastosowanie interwencji terapeutycznych. Ograniczeniem fenotypu MOD HF jest to, że może on nie naśladować spektrum chorób prowadzących do skurczowej niewydolności serca u człowieka. Co więcej, jest to fenotyp trudny do stworzenia, ponieważ operacja AAB wiąże się z wysoką śmiertelnością i wskaźnikami niepowodzeń, a tylko 20% operowanych szczurów rozwija pożądany fenotyp HF.

Wprowadzenie

Niewydolność serca (HF) jest powszechną chorobą i wiąże się z wysoką zachorowalnością i śmiertelnością¹. Modele przeciążenia ciśnieniowego (PO) HF u gryzoni, wytwarzane przez wstępujące lub poprzeczne pasmo aorty, są powszechnie stosowane do badania mechanizmów molekularnych prowadzących do niewydolności serca i testowania potencjalnych nowych celów terapeutycznych w HF. Naśladują również zmiany obserwowane w ludzkiej niewydolności serca wtórne do przedłużającego się nadciśnienia układowego lub ciężkiego zwężenia zastawki aortalnej. Po PO ściana lewej komory (LV) stopniowo zwiększa swoją grubość, w procesie znanym jako koncentryczny przerost lewej komory (LVH), aby skompensować i dostosować się do wzrostu naprężenia ściany lewej komory. Jest to jednak związane z aktywacją wielu nieprzystosowawczych szlaków sygnałowych, które prowadzą do zaburzeń w obiegu wapnia i homeostazie, przebudowy metabolicznej i macierzy zewnątrzkomórkowej oraz zmian w ekspresji genów, a także zwiększonej apoptozy i autofagii^2,3,4,5,6. Te zmiany molekularne stanowią wyzwalacz inicjacji i propagacji przebudowy mięśnia sercowego i przejścia do zdekompensowanego fenotypu HF.

Pomimo użycia szczepów wsobnych gryzoni i standaryzacji rozmiaru klipsa oraz techniki chirurgicznej, istnieje ogromna zmienność fenotypowa w strukturze i funkcji komory LV w modelach pasm aortalnych^7,8,9. Zmienność fenotypowa napotkana po PO u szczura, szczepu Sprague-Dawley, jest opisana w innym miejscu^10,11. Spośród nich występują dwa fenotypy HF, które wskazują na przebudowę mięśnia sercowego i aktywację szlaków transdukcji sygnału prowadzących do stanu podwyższonego stresu oksydacyjnego. Jest to związane z przebudową metaboliczną, zmienioną ekspresją genów i zmianami w potranslacyjnej modyfikacji białek, co razem odgrywa rolę w procesie przebudowy^10,12. Pierwszy to fenotyp umiarkowanej przebudowy i wczesnej dysfunkcji skurczowej (MOD), a drugi to fenotyp jawnej skurczowej HF (HFrEF).

Model PO HF jest korzystniejszy niż model HF z zawałem mięśnia sercowego (MI), ponieważ wywołane przez PO naprężenia ściany obwodowej i południkowej są równomiernie rozłożone na wszystkie segmenty mięśnia sercowego. Jednak oba modele cierpią z powodu zmienności nasilenia PO^10,11 i w rozmiarze zawału^13,14 wraz z intensywnym stanem zapalnym i bliznowaceniem w miejscu zawału¹⁵, a także przyleganiem do ściany klatki piersiowej i otaczających tkanek, które obserwuje się w modelu MI HF. Co więcej, model HF indukowany przez PO u szczurów jest trudny do stworzenia, ponieważ wiąże się z wysoką śmiertelnością i wskaźnikami niepowodzeń¹⁰, przy czym tylko 20% operowanych szczurów rozwija fenotyp MOD HF¹⁰.

MOD jest atrakcyjnym fenotypem HF i stanowi ewolucję tradycyjnie tworzonego fenotypu HFrEF, ponieważ pozwala na wczesne ukierunkowanie szlaków transdukcji sygnału, które odgrywają rolę w przebudowie mięśnia sercowego, zwłaszcza gdy dotyczy to zaburzeń w dynamice i funkcji mitochondriów, metabolizmie mięśnia sercowego, obiegu wapnia i przebudowie macierzy zewnątrzkomórkowej. Te procesy patofizjologiczne są wysoce widoczne w fenotypie MOD HF¹¹. W tym manuskrypcie opisujemy, jak stworzyć fenotypy MOD i HFrEF oraz rozwiązujemy pułapki podczas wykonywania procedury pasma aorty wstępującej (AAB). Wyjaśniamy również, jak najlepiej scharakteryzować za pomocą echokardiografii dwa fenotypy HF, MOD i HFrEF, oraz jak odróżnić je od innych fenotypów, które nie rozwijają ciężkiego PO lub u których rozwija się ciężkie PO i koncentryczna przebudowa, ale bez znaczącej przebudowy ekscentrycznej.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody i procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Szkoły Medycznej Uniwersytetu Tulane.

1. Narzędzia i instrumenty do tworzenia modeli AAB

1. Zaopatrz się w środki dezynfekujące, takie jak 70% alkohol izopropylowy i powidon-jod.
2. Zaopatrz się w ketaminę i ksylazynę do znieczulenia oraz buprenorfinę do znieczulenia.
3. Zaopatrz się w poduszkę grzewczą i jednorazową podkładkę o dużej chłonności o wymiarach 18 cali x 30 cali.
4. Zaopatrz się w rolkę ze 100% bawełnianego sznurka, taśmę i maszynkę do strzyżenia włosów.
5. Zaopatrz się w plastikową deskę o wymiarach 20 cm x 25 cm, grubości od 3 do 5 mm.
6. Zaopatrz się w oświetlacz światłowodowy Z-LITE.
7. Zaopatrz się w wentylator mechaniczny dla małych zwierząt (np. SAR-830/AP).
8. Zaopatrz się w szwy stożkowe Vicryl 2-0 i 3-0 oraz nylonowy szew monofilamentowy 3-0, sterylne gaziki i sterylne bardzo duże bawełniane końcówki oraz sterylne rękawiczki.
9. Uzyskać 16 G angiocath do intubacji.
10. Kup następujące narzędzia chirurgiczne.
    1. Zaopatrz się w podwiązanie Hemoclip ze stali nierdzewnej Weck i klipsy do podwiązywania ze stali nierdzewnej.
    2. Zdobądź utwardzone nożyczki do cienkiej tęczówki.
    3. Zaopatrz się w kleszcze Adson.
    4. Zaopatrz się w dwa zakrzywione kleszcze Graefe.
    5. Zaopatrz się w kleszcze proste Halsted-Mosquito Hemostats.
    6. Zaopatrz się w uchwyt na igły Mayo-Hegar.
    7. Zdobądź retraktor klatki piersiowej Alm z zębami.
11. Wykorzystaj i zdobądź autoklaw i sterylizator perełkowy.

2. Zabieg chirurgiczny z opaską aorty wstępującej

1. Znieczulić zwierzę wstrzyknięciem dootrzewnowym mieszaniny 75-100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny.
   UWAGA: Odczekaj kilka minut, aż zwierzę będzie całkowicie uspokojone i wiotkie. Jeśli dawka środka znieczulającego jest niewystarczająca, a zwierzę nadal porusza się w klatce, należy ponownie wstrzyknąć zwierzęciu tę samą dawkę środka znieczulającego po odczekaniu wystarczającej ilości czasu, około 5-10 minut między kolejnymi wstrzyknięciami. Większość zwierząt wymaga 1-2 zastrzyków, aby uzyskać głęboką sedację i znieczulenie.
2. Ogol włosy w miejscu operacyjnym znajdującym się po prawej stronie bocznej klatki piersiowej pod prawą pachą.
3. Ustabilizuj zwierzę, delikatnie przyklejając wszystkie cztery kończyny do plastikowej deski. Następnie wykonaj intubację dotchawiczą za pomocą angiokatu 16 G. Po pomyślnej intubacji zwierzęcia należy rozpocząć wentylację mechaniczną o objętości oddechowej 2 ml przy 50 cyklach/min i FiO₂ przy 21%. Szukaj symetrycznego wzrostu ściany klatki piersiowej z każdym oddechem.
4. Obróć zwierzę powoli, aby leżało na lewym boku, a następnie zegnij ogon w kształcie litery U i ustabilizuj go, delikatnie przyklejając go taśmą do plastikowej deski. Następnie śmiało zdezynfekuj ogolony obszar za pomocą miejscowego stosowania jodu powidonu.
5. Naciekać skórę w miejscu nacięcia mieszanką 50/50 objętości 1-2% lidokainy/0,25-0,5% bupiwakainy jako środek przeciwbólowy zapobiegawczy przed wykonaniem nacięcia.
6. Wykonaj prawe poziome nacięcie skóry o długości 1-2 centymetrów w prawej okolicy pachowej 1 cm poniżej prawej pachy. Następnie rozetnij warstwę mięśniową klatki piersiowej, aż dotrze do klatki piersiowej. Wykonaj torakotomię 1 cm między 2^{. a 3}. klatką^piersiową.
   1. Podczas preparowania warstwy mięśniowej klatki piersiowej należy zachować ostrożność i unikać uszkodzenia prawej tętnicy pachowej, która biegnie pod prawą pachą.
      UWAGA: Torakotomia wykonywana między^{1 a 2 żebrem} niesie ze sobą ryzyko opaski prawej tętnicy ramienno-głowowej zamiast aorty wstępującej. Torakotomia między 3^{. a czwartym} żebrem utrudnia wizualizację i opaskę aorty wstępującej, ponieważ operator będzie patrzył na prawy przedsionek.
      UWAGA: Unikaj rozciągania torakotomii zbyt przyśrodkowo w kierunku mostka, aby uniknąć wypreparowania i uszkodzenia prawej tętnicy sutkowej wewnętrznej.
7. Delikatnie rozetnij dwa płaty grasicy i rozsuń je z boku. Następnie zidentyfikuj aortę wstępującą i odizoluj ją od żyły głównej górnej przez rozwarstwienie za pomocą zakrzywionych kleszczy Graefe.
   UWAGA: Znaczna manipulacja grasicą spowoduje jej obrzęk i utrudni wizualizację aorty wstępującej.
   1. Wypreparuj żyłę główną górną z aorty ze szczególną ostrożnością, aby uniknąć urazu lub pęknięcia żyły głównej górnej, co jest śmiertelne. Może to być najtrudniejsza część procedury i oczekuje się, że będzie się zdarzać od czasu do czasu nawet w najbardziej doświadczonych rękach, ale często u początkujących i uczących się.
8. Delikatnie podnieś wznoszącą się aortę za pomocą zakrzywionych kleszczy Graefe i umieść klips naczyniowy wokół aorty wstępującej.
   1. Wyreguluj narzędzie do podwiązywania krwionośnych naczyń krwionośnych za pomocą plastikowego, wstępnie przyciętego 7-calowego elementu, aby uzyskać klips naczyniowy o żądanym obszarze wewnętrznym 1.5 mm² lub 2 mm², w zależności od pożądanego modelu HF.
9. Zszyj klatkę piersiową za pomocą szwu monofilamentowego Vicryl 2-0. Następnie zszyj warstwę mięśniową klatki piersiowej za pomocą szwu stożkowego 3-0 Vicryl. Następnie zszyj nacięcie skóry za pomocą nylonowego szwu monofilamentowego 3-0.
10. Po zakończeniu operacji należy podawać kombinację następujących leków, które mają służyć jako środek przeciwbólowy w okresie pooperacyjnym: 1) Buprenorfina 0,01-0,05 mg/kg podskórnie co 8-12 godzin, 2) Meloksykam 2 mg/kg podskórnie co 12 godzin i 3) Morfina 2,5 mg/kg podskórnie co 2-4 godziny w razie potrzeby w przypadku silnego bólu><. UWAGA: Pozostaw zwierzę do rekonwalescencji na poduszce grzewczej pod regularnym nadzorem. Gdy zwierzę wykazuje oznaki powrotu do zdrowia po znieczuleniu (jest w stanie oddychać spontanicznie - bez oznak sapania lub używania mięśni dodatkowych przez ponad dwie minuty - i ma dobry refleks, czerwone i ciepłe kończyny), ekstubuj zwierzę i zwróć je do klatki.

3. Echokardiografia

1. Uspokoić zwierzę wstrzyknięciem dootrzewnowym 80-100 mg/kg ketaminy. Zapewnij odpowiednią sedację, aby prawidłowo uzyskać dobrej jakości obrazy echa.
   UWAGA: Stosowanie izofluranu jako środka znieczulającego jest odradzane ze względu na jego działanie kardiodepresyjne, szczególnie w przypadku silnego przeciążenia ciśnieniem i może dawać fałszywe wrażenie rozszerzenia LV i dysfunkcji skurczowej, która ustępuje po odstawieniu znieczulenia zwierzęcia.
   1. Zachowaj ostrożność i podawaj połowę lub nawet jedną trzecią dawki ketaminy zwierzętom, które wyglądają na duszne i tachypneiczne z podejrzeniem, że rozwinął się fenotyp HFrEF.
2. Ogolić włosy na klatce piersiowej, z przodu, u zwierzęcia całkowicie uspokojonego.
3. Połóż zwierzę na plecach i ustabilizuj je na plastikowej desce.
4. Uzyskuj klipy widoku 2D przymostkowej długiej osi i 2D przymostkowej krótkiej osi na poziomie mięśnia brodawkowatego. Uzyskaj również obrazy w trybie M z widoku krótkiej osi przymostkowej na poziomie mięśnia brodawkowatego, aby zmierzyć grubość przegrody lewej komory i ściany tylnej w rozkurczu, a także średnicę końcoworozkurczową i końcowoskurczową LV.
   1. Rejestruj obrazy lub klipy z tętnem 370 - 420 uderzeń na minutę, aby zapewnić prawidłową ocenę rozmiaru i funkcji LV. Akwizycja obrazów przy niższym tętnie prowadzi do fałszywego wrażenia obniżonej funkcji lewej komory i rozszerzenia lewej komory.
      UWAGA: Akwizycja skróconych obrazów/klipów widoku 2D z długą osią przymostkową prowadzi do fałszywych pomiarów. W celu kontroli jakości upewnij się, że wierzchołek lewej wysokości i kąt aortalno-mitralny są wizualizowane w tym samym cięciu płaskim.
   2. Uzyskuj obrazy/klipy 2D z krótkiej osi przymostkowej na poziomie mięśnia środkowego brodawkowatego. Będzie to służyć jako punkt odniesienia do uzyskania wiarygodnych seryjnych i późniejszych pomiarów LV podczas śledzenia zwierząt w czasie przez cały okres badania.
5. Uzyskaj obrazy w trybie M w widoku długiej osi przymostkowej na poziomie zastawki aortalnej, aby ocenić względną średnicę aorty do lewego przedsionka (LA) przy skurczu końcowym.
   UWAGA: Zwierzęta z fenotypami MOD i HFrEF powinny wykazywać oznaki dylatacji LA ze stosunkiem LA/Ao wynoszącym ≥1,25 i <1,5 w fenotypie MOD HF i ≥1,5 w fenotypie HFrEF¹⁰.

Wyniki

Charakterystykę fenotypów HF, które rozwijają się 8-12 tygodni po AAB, można łatwo przeprowadzić za pomocą echokardiografii. Reprezentatywne obrazy w trybie M dla grupy Sham, 3. tygodnia po AAB oraz fenotypów MOD i HFrEF przedstawiono na Rysunku 1A. Rysunek 1B oraz Rysunek 1C przedstawiają odpowiednio rozmiar klipsa naczyniowego wykorzystanego do wytworzenia feno...

Dyskusja

Po PO związanym z AAB u szczura, LV ulega koncentrycznej przebudowie poprzez zwiększenie grubości ścianki LV, znanej jako koncentryczny LVH, jako mechanizm kompensacyjny przeciwdziałający wzrostowi naprężeń ścian LV. Wzrost grubości ścianki lewej komory staje się zauważalny w pierwszym tygodniu po AAB i osiąga maksymalną grubość po 2-3 tygodniach od AAB. W tym okresie aktywacja nieprzystosowanych szlaków transdukcji sygnału prowadzi do postępującego powiększania lewej komory wraz ze wzrostem objętości lewej komory, proce...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kleszcze Adson	F.S.T.	11019-12	narzędzie chirurgiczne
Zwijacz klatki piersiowej Alm z zębami	ROBOZ	RS-6510	narzędzie chirurgiczne
Kleszcze Graefe, zakrzywione	FST	11152-10	narzędzie chirurgiczne
Halsted-Mosquito Hemostats, proste	FST	13010-12	narzędzie chirurgiczne
Hartowane nożyczki do drobnych tęczówek, proste	Fine Science Tools FST	14090-11	narzędzie chirurgiczne
hemoclip tradycyjne klipsy do podwiązywania ze stali nierdzewnej	Narzędzie chirurgiczne	Weck	523735
igły Mayo-Hegar	FST	12004-18	narzędzie chirurgiczne
wentylator mechaniczny	CWE inc	SAR-830 / AP	wentylator mechaniczny dla małych zwierząt
Weck ze stali nierdzewnej Podwiązanie hemolipów	Weck	533140	narzędzie chirurgiczne

uchwyt