Przedstawiamy protokół wytwarzania hybrydowej błony lipidowej na granicy woda/powietrze poprzez domieszkowanie dwuwarstwy lipidowej cząsteczkami miedzi (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-ftalocyjaniny (CuPc). Powstała hybrydowa błona lipidowa ma strukturę warstwową lipid/CuPc/lipid. Protokół ten może być również stosowany do tworzenia innych funkcjonalnych nanomateriałów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Samoorganizacja hybrydowych błon lipidowych domieszkowanych hydrofobowymi cząsteczkami organicznymi na granicy faz woda/powietrze
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ze względu na ich unikalne właściwości, w tym ultracienką grubość (3-4 nm), ultrawysoką rezystywność, płynność i zdolność do samoorganizacji, dwuwarstwy lipidowe mogą być łatwo funkcjonalizowane i były używane w różnych zastosowaniach, takich jak biosensory i biourządzenia. W tym badaniu wprowadziliśmy płaską cząsteczkę organiczną: 2,9,16,23-tetra-tert-butylo-29H,31H-ftalocyjaninę miedzi (II) do domieszkowania błon lipidowych. Hybrydowa membrana CuPc/lipid tworzy się na granicy faz woda/powietrze w procesie samoorganizacji. W tej błonie hydrofobowe cząsteczki CuPc znajdują się między hydrofobowymi ogonami cząsteczek lipidów, tworząc strukturę warstwową lipid/CuPc/lipid. Co ciekawe, stabilną powietrznie hybrydową dwuwarstwę lipidową można łatwo utworzyć, przenosząc błonę hybrydową na podłoże Si. Przedstawiamy prostą metodę włączania nanomateriałów do dwuwarstwowego systemu lipidowego, która stanowi nową metodologię wytwarzania bioczujników i biourządzeń.
Wprowadzenie
Jako podstawowe struktury błon komórkowych, wnętrze komórek jest oddzielone od zewnętrznej przez dwuwarstwowy system lipidowy. System ten składa się z amfifilowych fosfolipidów, które składają się z hydrofilowych "głów" estrów fosforowych i "ogonów" hydrofobowych kwasów tłuszczowych. Ze względu na niezwykłą płynność i zdolność do samoorganizacji dwuwarstw lipidowych w środowisku wodnym1,2, sztuczne dwuwarstwy lipidowe mogą być tworzone przy użyciu prostych metod3,4. Różne rodzaje białek błonowych, takie jak kanały jonowe, receptory błonowe i enzymy, zostały włączone do sztucznej dwuwarstwy lipidowej w celu naśladowania i badania funkcji błon komórkowych5,6. Niedawno dwuwarstwy lipidowe zostały domieszkowane nanomateriałami (np. nanocząstkami metali, grafenem i nanorurkami węglowymi) w celu utworzenia funkcjonalnych membran hybrydowych7,8,9,10,11,12,13. Szeroko stosowana metoda tworzenia takich błon hybrydowych polega na tworzeniu domieszkowanych pęcherzyków lipidowych, które zawierają materiały hydrofobowe, takie jak zmodyfikowane nanocząstki Au7 lub nanorurki węglowe11, a powstałe pęcherzyki są następnie łączone w płaskie dwuwarstwy lipidowe. Podejście to jest jednak złożone i czasochłonne, co ogranicza potencjalne zastosowania takich membran hybrydowych.
W tej pracy, błony lipidowe zostały domieszkowane cząsteczkami organicznymi, aby wytworzyć hybrydowe błony lipidowe, które powstały na granicy wody i powietrza przez samoorganizację. Protokół ten obejmuje trzy etapy: przygotowanie zmieszanego roztworu, utworzenie membrany hybrydowej na granicy faz woda/powietrze oraz przeniesienie membrany na podłoże Si. W porównaniu z innymi wcześniej opisanymi metodami, opisana tutaj metoda jest prostsza i nie wymaga skomplikowanego oprzyrządowania. Dzięki tej metodzie w krótszym czasie można utworzyć stabilne powietrznie hybrydowe błony lipidowe o większej powierzchni. Nanomateriałem wykorzystanym w tym badaniu jest półprzewodnikowa cząsteczka organiczna, miedź (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-ftalocyjanina (CuPc), która jest szeroko stosowana w wielu zastosowaniach, w tym w ogniwach słonecznych, fotodetektorach, czujnikach gazów i katalizie14,15. CuPc, mała cząsteczka organiczna o płaskiej budowie, ma wysokie powinowactwo do "ogonów" duetu fosfolipidów do swoich właściwości hydrofobowych. Inne grupy donoszą, że cząsteczki CuPc mogą samoorganizować się na powierzchniach monokryształów, tworząc wysoce uporządkowane struktury16,17. Dlatego jest wysoce prawdopodobne, że cząsteczki CuPc mogą zostać włączone do dwuwarstw lipidowych poprzez samoorganizację.
Dostarczamy szczegółowy opis procedur używanych do formowania membran i podajemy kilka sugestii, jak płynnie wdrożyć tę procedurę. Ponadto przedstawiono przedstawiono wyniki badań hybrydowych błon lipidowych oraz omówiono potencjalne zastosowania tej metody.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie rozwiązania hybrydowego
- Umyć cztery jednorazowe szklane fiolki o pojemności 4 ml i nakrętki (z uszczelkami pokrytymi PTFE) w kąpieli ultradźwiękowej przez 10 minut w wodzie destylowanej (oczyszczonej za pomocą systemu filtracji), a następnie odpowiednio etanolem i chloroformem. Wysuszyć szklane fiolki i nakrętki w strumieniu gazowego azotu.
- W beztlenowej komorze rękawicowej przygotować roztwór podstawowy CuPc (10 mg/ml) w umytej szklanej fiolce, rozpuszczając sproszkowany CuPc w chloroformie.
- Przefiltrować roztwór CuPc przez membranę z politetrafluoroetylenu (PTFE) o grubości 0,2 μm.
- Przefiltrowany roztwór należy przechowywać w umytej szklanej fiolce wypełnionej azotem i zamknąć fiolkę parafilmem.
- Zakupiony roztwór chloroformu 1,2-difitanoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DPhPC) (25 mg/ml) wyjąć z lodówki w temperaturze -80 °C i pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej.
- Mieszać roztwór DPhPC za pomocą mieszalnika wirowego z prędkością 2300 obr./min przez 10 sekund.
- Opłucz szklaną mikrostrzykawkę chloroformem 5 razy.
- Przenieść 200 μl roztworu chloroformu DPhPC do wstępnie umytej szklanej fiolki za pomocą umytej strzykawki. Odparować rozpuszczalnik znajdujący się w fiolce delikatnym strumieniem azotu.
- Przepłukać szklaną mikrostrzykawkę 5 razy chloroformem.
- Dodać 202,6 μl chloroformu do szklanej fiolki z DPhPC za pomocą oczyszczonej strzykawki.
- Dodać 47,4 μl przefiltrowanego roztworu CuPc o stężeniu 10 mg/ml do roztworu DPhPC. Stosunek molowy DPhPC do CuPc powinien wynosić 10:1.
- Przepłukać szklaną mikrostrzykawkę 5 razy chloroformem.
- Dodać 250 μl heksanu do roztworu za pomocą strzykawki. Końcowe stężenie roztworu powinno wynosić 10 mg/ml.
- Przygotowany roztwór mieszać za pomocą mieszalnika wirowego z prędkością 2300 obr./min przez 10 s.
- Przefiltrować roztwór CuPc przez membranę z politetrafluoroetylenu (PTFE) o grubości 0,2 μm.
- Uszczelnić szklaną fiolkę parafilmem. Umieścić go w szczelnie zamkniętej torbie wypełnionej azotem i umieścić zapieczętowaną torebkę w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
UWAGA: Po kroku 1.13 DPhPC i CuPc rozpuszczono w zmieszanym rozpuszczalniku, który składał się z chloroformu i heksanu (stosunek objętości 1:1). Ponadto stosunek molowy DPhPC do CuPc nie jest ograniczony do 10:1. Przy stałym stężeniu lipidów (10 mg/ml) można stosować różne proporcje molowe. Zgodnie z wcześniejszymi wynikami eksperymentów, do tworzenia wysokiej jakości hybrydowej błony lipidowej preferowany jest zakres od 10:1 do 3:1.
2. Tworzenie hybrydowej membrany na granicy wody i powietrza
- Wytnij podłoża Si (3 cm x 3 cm) z wafla Si.
- Podłoża Si o wymiarach 3 cm x 3 cm należy oczyścić w kąpieli ultradźwiękowej przez 10 minut w oczyszczonej wodzie, a następnie w etanolu, a następnie chloroformie. Podłoże Si należy traktować plazmąO2 przez 5 minut, aby usunąć zaadsorbowane materiały organiczne z powierzchni i poprawić hydrofilowość.
- Zlewkę teflonową o średnicy wewnętrznej 7,5 cm myć płynącą oczyszczoną wodą przez 3 minuty.
- Oczyszczone podłoże Si umieścić w umytej zlewce z PTFE. Podłoże jest nachylone pod kątem 30° do poziomu.
- Wlej odpowiednią ilość oczyszczonej wody do zlewki teflonowej, aż całe podłoże Si zostanie zanurzone.
- Wyjmij przygotowany roztwór hybrydowy z zamrażarki i pozwól mu ogrzać się do temperatury pokojowej.
- Mieszaj roztwór hybrydowy za pomocą mieszalnika wirowego z prędkością 2300 obr./min przez 15 sekund.
- Przepłukać szklaną mikrostrzykawkę (50 μl) 5 razy chloroformem.
- Upuść 3-5 μl roztworu hybrydowego na powierzchnię wody za pomocą strzykawki, aby utworzyć pływającą hybrydową błonę lipidową.
UWAGA: Po upuszczeniu roztworu ważne jest, aby trzymać kroplę blisko (mniej niż 1 cm) powierzchni wody. Należy również zauważyć, że jednowarstwowa membrana hybrydowa nie jest widoczna gołym okiem, ale wielowarstwowa membrana hybrydowa wygląda jak cienka, niebieska folia. W celu przeniesienia wielowarstwowej membrany hybrydowej na podłoże Si, ważne jest, aby upuścić zmieszany roztwór jak najbliżej podłoża Si.
3. Przenoszenie membrany na podłoże Si
- Po odparowaniu rozpuszczalnika organicznego (zajmie to mniej niż 2 sekundy) należy obniżyć poziom wody z prędkością 3 mm/min, wypompowując wodę przez gumową rurkę, która jest napędzana pompą perystaltyczną, aby przenieść pływającą membranę hybrydową na podłoże Si.
- Po zakończeniu procesu przenoszenia (około 5 minut) umieść podłoże Si na wycieraczce do pomieszczeń czystych i poczekaj, aż cała pozostała woda odparuje.
UWAGA: Obniżenie poziomu wody przy tak niskim tempie służy zminimalizowaniu turbulencji wody i ochronie membrany.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Nowo utworzona membrana ma jednolity jasno niebieski kolor ze względu na obecność cząsteczek CuPc. Obszar zabarwionej membrany wynosi zazwyczaj kilka centymetrów kwadratowych. Na Rysunku 1A oraz Rysunku 1B przedstawiono obraz mikroskopowy oraz obraz z mikroskopu sił atomowych (AFM) (wraz z profilem wysokości) hybrydowej membrany lipidowej na podłożu Si. Na obrazie AFM membrana w górnym lewym rogu jest gruba, o grubości 79,4 nm, natomiast ta w dolnym prawym rogu ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W roztworze prekursorowym membrany hybrydowej do rozpuszczania lipidów i CuPc stosuje się mieszany rozpuszczalnik organiczny (chloroform i heksan), a nie czysty chloroform. W przypadku użycia czystego chloroformu gęstość roztworu prekursora byłaby wyższa niż wody. Dlatego jest wysoce prawdopodobne, że roztwór opadnie na dno wody, a nie rozprzestrzeni się na powierzchni wody. Dodanie heksanu, rozpuszczalnika o niskiej gęstości, do roztworu prekursora zapewnia, że roztwór będzie unosił się na powierzchni wody i utworzył je...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez program CREST Japońskiej Agencji Nauki i Technologii (JPMJCR14F3) oraz Grant in-Aids od Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (19H00846 i 18K14120). Prace te zostały częściowo przeprowadzone w Laboratorium Nanoelektroniki i Spintroniki Instytutu Badawczego Komunikacji Elektrycznej Uniwersytetu Tohoku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Chloroform | Wako Chemikalia | 033-08631 | |
| CuPc | Sigma-Aldrich | 423165 | |
| DPhPc | Avanti Polar Lipids | 850356C | |
| Fiolki szklane z nakrętką | Nichiden-Rike Glass Co., Ltd | 6-29801 | |
| Hexane | Wako Chemikalia | 084-03421 | |
| Filtry membranowe | Merck Millipore Ltd. | ||
| Mikrostrzykawka | Hamilton | 80530 | |
| Pompa perystaltyczna | Tokyo Rikakikai Co., Ltd. | ||
| Mieszalnik Vortex | Scientific Industries, Inc. | SI-0286 |
Bibliografia
- Israelachvili, J. N., Mitchell, D. J., Ninham, B. W. Theory of self-assembly of lipid bilayers and vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 470 (2), 185-201 (1977).
- Venable, R. M., Zhang, Y., Hardy, B. J., Pastor, R. W. Molecular dynamics simulations of a lipid bilayer and of hexadecane: an investigation of membrane fluidity. Science. 262 (5131), 223-226 (1993).
- Ide, T., Ichikawa, T. A novel method for artificial lipid-bilayer formation. Biosensors and Bioelectronics. 21 (4), 672-677 (2005).
- Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
- Kongsuphol, P., Fang, K. B., Ding, Z. Lipid bilayer technologies in ion channel recordings and their potential in drug screening assay. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 530-542 (2013).
- Demarche, S., Sugihara, K., Zambelli, T., Tiefenauer, L., Voros, J. Techniques for recording reconstituted ion channels. Analyst. 136 (6), 1077-1089 (2011).
- Sakaguchi, N., Kimura, Y., Hirano-Iwata, A., Ogino, T. Fabrication of Au-nanoparticle-embedded lipid bilayer membranes supported on solid substrates. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (17), 4474-4481 (2017).
- Schulz, M., Olubummo, A., Binder, W. H. Beyond the lipid bilayer: interaction of polymers and nanoparticles with membranes. Soft Matter. 8 (18), 4849-4864 (2012).
- Wang, J., Wei, Y., Shi, X., Gao, H. Cellular entry of graphene nanosheets: the role of thickness, oxidation and surface adsorption. RSC Advances. 3 (36), 15776-15782 (2013).
- Vögele, M., Köfinger, J., Hummer, G. Molecular dynamics simulations of carbon nanotube porins in lipid bilayers. Faraday Discussions. 209, 341-358 (2018).
- Kanomata, K., Deguchi, T., Ma, T., Haseyama, T., Miura, M., Yamaura, D., Tadaki, D., Niwano, M., Hirano-Iwata, A., Hirose, F. Photomodulation of electrical conductivity of a PCBM-doped free-standing lipid bilayer in buffer solution. Journal of Electroanalytical Chemistry. 832, 55-58 (2019).
- Barnoud, J., Rossi, G., Monticelli, L. Lipid Membranes as Solvents for Carbon Nanoparticles. Physical Review Letters. 112, 068102(2014).
- Dichello, G. A., et al. Preparation of liposomes containing small gold nanoparticles using electrostatic interactions. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 105, 55-63 (2017).
- Sullivan, P., Heutz, S., Schultes, S. M., Jones, T. S. Influence of codeposition on the performance of CuPc−C60 heterojunction photovoltaic devices. Applied Physics Letters. 84 (7), 1210-1212 (2004).
- Miyata, T., Kawaguchi, S., Ishii, M., Minami, T. High sensitivity chlorine gas sensors using Cu−phthalocyanine thin films. Thin Solid Films. 425 (1-2), 255-259 (2003).
- Barrena, E., de Oteyza, D. G., Dosch, H., Wakayama, Y. 2D supramolecular self-assembly of binary organic monolayers. ChemPhysChem. 8 (13), 1915-1918 (2007).
- Xiao, K., et al. Surface-induced orientation control of CuPc molecules for the epitaxial growth of highly ordered organic crystals on graphene. Journal of the American Chemical Society. 135 (9), 3680-3687 (2013).
- Feng, X., Ma, T., Yamaura, D., Tadaki, D., Hirano-Iwata, A. Formation and characterization of air-stable lipid bilayer membranes incorporated with phthalocyanine molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6515-6520 (2019).
- Wu, Y., He, K., Ludtke, S. J., Huang, H. W. X-ray diffraction study of lipid bilayer membranes interacting with amphiphilic helical peptides: diphytanoyl phosphatidylcholine with alamethicin at low concentrations. Biophysical Journal. 68 (6), 2361-2369 (1995).
- Zaitseva, S. V., Bettini, S., Valli, L., Kolker, A. M., Borovkov, N. Y. Atypical film-forming behavior of soluble tetra-3-nitro-substituted copper phthalocyanine. ChemPhysChem. 20 (3), 422-428 (2019).
- Ghani, F., Gojzewski, H., Riegler, H. Nucleation and growth of copper phthalocyanine aggregates deposited from solution on planar surfaces. Applied Surface Science. 351, 969-976 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
