Celem tego protokołu jest analiza podziału komórek w nienaruszonej tkance za pomocą żywej i utrwalonej mikroskopii komórkowej przy użyciu mejocytów Drosophila. Protokół pokazuje, jak wyizolować całe, nienaruszone jądra od larw Drosophila i wczesnych poczwarek oraz jak je przetworzyć i zamontować pod mikroskopem.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie jąder larw i poczwarek Drosophila do analizy podziału komórkowego w żywych, nienaruszonych tkankach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Eksperymentalna analiza komórek dzielących się w żywych, nienaruszonych tkankach i organach jest niezbędna do zrozumienia, jak podział komórek integruje się z rozwojem, homeostazą tkanek i procesami chorobowymi. Spermatocyty Drosophila poddawane mejozie są idealne do tej analizy, ponieważ (1) całe jądra Drosophila zawierające spermatocyty są stosunkowo łatwe do przygotowania do mikroskopii, (2) duży rozmiar spermatocytów sprawia, że dobrze nadają się do obrazowania w wysokiej rozdzielczości, oraz (3) potężne narzędzia genetyczne Drosophila można zintegrować z analizą in vivo. W tym miejscu przedstawiamy łatwo dostępny protokół przygotowania całych jąder z larw trzeciego stadium rozwojowego Drosophila i wczesnych poczwarek. Opisujemy, jak zidentyfikować spermatocyty mejotyczne w przygotowanych całych jądrach i jak zobrazować je na żywo za pomocą mikroskopii poklatkowej. Dostępne są również protokoły utrwalania i barwienia immunologicznego całych jąder. Wykorzystanie jąder larwalnych ma kilka zalet w porównaniu z dostępnymi protokołami, które wykorzystują dorosłe jądra do analizy spermatocytów. Co najważniejsze, jądra larw są mniejsze i mniej zatłoczone komórkami niż jądra dorosłe, co znacznie ułatwia obrazowanie spermatocytów w wysokiej rozdzielczości. Aby zademonstrować te zalety i zastosowania protokołów, przedstawiamy wyniki pokazujące redystrybucję retikulum endoplazmatycznego względem mikrotubul wrzeciona podczas podziału komórki w pojedynczym spermatocycie zobrazowanym za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Protokoły te można łączyć z ekspresją dowolnej liczby znakowanych fluorescencyjnie białek lub markerów organelli, a także mutacjami genów i innymi narzędziami genetycznymi, co czyni to podejście szczególnie skutecznym w analizie mechanizmów podziału komórek w kontekście fizjologicznym całych tkanek i narządów.
Wprowadzenie
Podział komórek jest często badany przy użyciu linii komórkowych hodowanych w kulturze1. Chociaż dzięki tym badaniom uzyskaliśmy bogactwo bezcennych spostrzeżeń i zrozumienia podstawowych mechanizmów2, komórki hodowane w kulturze nie mogą w pełni podsumować fizjologii podziału komórek, ponieważ zachodzi on w nienaruszonej, żywej tkance. Na przykład w nienaruszonych tkankach i narządach komórki muszą dzielić się we właściwym miejscu i czasie, tak aby komórki potomne były prawidłowo usytuowane w tkance, aby mogły przejść odpowiednie programy różnicowania lub funkcjonalne i aby proliferacja komórek była odpowiednio skoordynowana ze wzrostem tkanki lub homeostazą3. Z drugiej strony, w przypadku komórek hodowanych w hodowli, podział komórek jest generalnie regulowany przez czynniki wzrostu w pożywce hodowlanej4, a zatem nie możemy dowiedzieć się od tych komórek, jak czynniki środowiskowe in vivo, takie jak architektura tkanek lub sygnalizacja rozwojowa, wpływają na proces podziału. Ważne jest również, aby zauważyć, że wiele linii komórkowych używanych do badania podziału komórek, takich jak komórki HeLa i U2OS, pochodziło z guzów przerzutowych5. W związku z tym wiele aspektów podstawowej fizjologii tych komórek nowotworowych, takich jak mechanizmy regulacyjne cyklu komórkowego i stabilność chromosomów, zostało prawdopodobnie zmienionych w porównaniu ze zdrowymi komórkami. Pełne zrozumienie fizjologii podziałów komórkowych zależy zatem od naszej zdolności do badania dzielących się komórek w ich natywnym środowisku in vivo, które zachowuje fizjologiczne mechanizmy regulacyjne i architekturę tkanek.
Postępy w zrozumieniu, jak działa podział komórek w nienaruszonych tkankach i organach, są utrudnione przez trudności związane z analizą in vivo lub ex vivo. Po pierwsze, dostęp do dzielących się komórek do analizy mikroskopowej w dużych narządach lub grubych tkankach może być trudny lub niemożliwy. Po drugie, często trudno jest przewidzieć, kiedy poszczególne komórki będą się dzielić in vivo. Po trzecie, fizjologia tkanek może ulec gwałtownemu pogorszeniu podczas hodowli ex vivo. W tym protokole opisujemy łatwo dostępne metody żywej i stałej analizy spermatocytów Drosophila melanogaster podczas przechodzenia mejotycznych podziałów komórkowych w całkowicie nienaruszonych jądrach. Komórki te są idealne do analizy ex vivo na żywo, ponieważ są łatwo dostępne za pomocą standardowych metod optycznych, takich jak mikroskopia konfokalna, dzielą się w przewidywalnych czasach i miejscach, a nienaruszone jądra można utrzymywać w hodowli ex vivo przez okres do około 24 godzin. Ponadto spermatocyty Drosophila to duże okrągłe komórki (o średnicy około 20–30 μm), które nie zmieniają kształtu podczas podziału, co czyni je idealnymi do obrazowania poklatkowego o wysokiej rozdzielczości składników komórkowych, takich jak aparat wrzecionowy i organelle cytoplazmatyczne. Chociaż komórki te przechodzą mejozę, a nie mitozę, wiele podstawowych procesów podziału komórek jest bardzo podobnych między tymi dwoma mechanizmami podziału komórek6. Te zalety, w połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi Drosophila, sprawiły, że spermatocyty Drosophila stały się szeroko stosowanym modelem do analizy ex vivo podstawowych procesów podziału komórek, w tym tworzenia i regulacji wrzeciona, cytokinezy oraz przebudowy i podziału organelli7,8,9,10,11.
Spermatocyty to komórki, które są na mejotycznym etapie spermatogenezy. U Drosophila spermatogeneza rozpoczyna się od grupy komórek macierzystych linii zarodkowej, które znajdują się w małym regionie lub "centrum" na jednym biegunie jądra12,13. Komórki te dzielą się przez asymetryczną mitozę, dając początek pojedynczemu zróżnicowanemu spermatogonium. Spermatogonia przechodzi następnie cztery synchroniczne mitozy, aby wytworzyć grupę 16 komórek, które pozostają ściśle związane w jednej torbieli. Na tym etapie komórki przechodzą z cyklu komórkowego mitotycznego do mejotycznego i są określane jako spermatocyty. Spermatocyty spędzają około dwóch do trzech dni w przedłużonym etapie G2 cyklu komórkowego, podczas którego gwałtownie rosną i przechodzą zmiany cytologiczne w ramach przygotowań do dwóch podziałów mejotycznych i następującej po nich spermiogenezy13,14. Cała grupa 16 spermatocytów w obrębie jednej torbieli wchodzi następnie w tym samym czasie do pierwszego podziału mejotycznego. W ten sposób kilka spermatocytów mejotycznych może być obrazowanych jednocześnie, gdy przechodzą przez podział komórki. Pierwszy podział mejotyczny trwa około 1,5 godziny, po czym prawie natychmiast następuje drugi podział mejotyczny, w wyniku którego powstają łącznie 64 plemniki, które następnie różnicują się w dojrzałe plemniki.
Unikalną zaletą używania spermatocytów do badania podziału komórek w żywych, nienaruszonych tkankach jest to, że grupy lub torbiele komórek nieustannie przechodzą przez różne etapy spermatogenezy, a komórki na wszystkich etapach spermatogenezy mogą być zazwyczaj zidentyfikowane w dowolnym jądrze (patrz Rysunek 3A). Dlatego stosunkowo łatwo jest znaleźć komórki mejotyczne w całych jądrach. Generalnie skupiamy się na pierwszej, a nie na drugiej mejozie, ponieważ komórki te są znacznie większe i bardziej podatne na obrazowanie w wysokiej rozdzielczości, ale cały proces obejmujący oba podziały mejotyczne można z powodzeniem zobrazować. Należy również zauważyć, że ogólny protokół przygotowania i hodowli jąder może być również wykorzystany do analizy innych procesów spermatogenezy, takich jak wcześniejsze mitotyczne podziały komórek macierzystych lub spermatogoniów lub zmiany cytologiczne, które zachodzą, gdy plemniki dojrzewają do plemników15. Wiele z tych aspektów spermatogenezy jest wysoce konserwatywnych między Drosophila a ludźmi16.
Spermatocyty Drosophila zaczynają wchodzić w fazę mejozy spermatogenezy podczas trzeciego stadium larwalnego rozwoju Drosophila13. Dlatego jądra wyizolowane z etapów cyklu życiowego, począwszy od larw trzeciego stadium rozwojowego, a kończąc na poczwarkach i osobnikach dorosłych, mogą być wykorzystywane do analizy dzielących się spermatocytów. Dostępnych jest kilka doskonałych protokołów ekstrakcji jąder od dorosłych samców much do żywej i ustalonej analizy spermatogenezy17,18,19. Protokoły te mogą być preferowane do badania późnych etapów spermatogenezy lub jeśli konieczne jest zastosowanie markerów genetycznych, które są widoczne tylko u dorosłych. Protokół koncentruje się zamiast tego na przygotowaniu jąder z larw i wczesnych poczwarek, ponieważ jądra na tych etapach mają kilka zalet, które są szczególnie istotne dla analizy podziału komórek za pomocą mikroskopii poklatkowej o wysokiej rozdzielczości. Po pierwsze, jądra larw i poczwarek są mniejsze niż te od dorosłych, a komórki w narządzie są mniej stłoczone. Z tego powodu dzielące się spermatocyty można często obrazować w pobliżu zewnętrznej powierzchni jąder larw, bez konieczności przenikania przez wiele warstw tkanki rozpraszającej światło. Po drugie, dorosłe jądra poruszają się rytmicznie z powodu skurczów przyczepionych narządów dodatkowych, a ruchy te utrudniają obrazowanie poklatkowe poszczególnych komórek. I po trzecie, jądra larw są korzystne podczas badania mutacji genów, które powodują śmiertelność poczwarki lub dorosłego osobnika. Nasze metody są zoptymalizowane pod kątem długotrwałej hodowli jąder na etapie mikroskopu, co pozwala na obrazowanie wielu rund podziału komórek lub progresji poszczególnych komórek przez wiele etapów spermatogenezy w tym samym preparacie. Opisujemy również protokół utrwalania i barwienia immunologicznego całych jąder. Ogólnie rzecz biorąc, nasze protokoły są szczególnie przydatne dla osób zainteresowanych badaniem podziału komórek w nienaruszonej tkance, a możliwość połączenia analizy spermatocytów z wysoce wykonalnymi narzędziami genetycznymi Drosophila sprawia, że jest to szczególnie skuteczne podejście.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotuj zwierzęta, narzędzia i media do sekcji
- Krzyżuj muchy męskie i żeńskie, aby uzyskać potomstwo o pożądanym genotypie. Przydatne markery transgeniczne do identyfikacji i oceny stopnia zaawansowania spermatocytów mejotycznych obejmują GFP-tubulinę do oznaczania wrzeciona mejotycznego i RFP-histon 2A do oznaczania chromsomów8. Użyć od pięciu do dziesięciu samic na krzyżówkę i utrzymywać krzyżówki na standardowym pokarmie dla much w fiolkach w inkubatorze w temperaturze 25 °C do momentu, gdy larwy trzeciego stadium zaczną pełzać po bokach fiolki (4-5 dni). Wczesne białe poczwarki zaczną się formować dzień później.
- Zaopatrz się w dwie pary prostych kleszczy z cienkimi końcówkami. Upewnij się, że końcówki są ostre, równej długości i proste (Rysunek 1A). Używaj tych kleszczyków tylko do sekcji i zakryj końcówkami do pipet o pojemności 10 μl, gdy nie są używane.
- Przygotuj narzędzie do skalpela.
- Włóż koniec szpilki przeciw owadom ze stali anodowanej na czarno do uchwytu na szpilki i przekręć uchwytu, aby zamocować szpilkę na miejscu. Używając kleszczy i pod mikroskopem preparacyjnym, chwyć szpilkę do owadów pośrodku i zegnij ją, aby utworzyć wewnętrzny kąt 135° (Rysunek 1B). Ostra końcówka służy do cięcia tkanki, podczas gdy krawędź służy do przenoszenia jąder między kroplami pożywki.
- Nasadka z końcówką do pipety o pojemności 1 000 μl, gdy nie jest używana.
- Pracując w kapturze do hodowli tkankowych, przygotować 5 ml porcji pożywki Schneidera i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia sekcji, podgrzej jedną porcję pożywki o pojemności 5 ml do temperatury pokojowej. Następnie przenieś podgrzaną pożywkę preparacyjną do strzykawki o pojemności 10 ml i podłącz filtr strzykawkowy 0,22 μm.
2. Sekcja jąder od larw i wczesnych poczwarek
- Za pomocą strzykawki z filtrem wypełnionym pożywką usunąć trzy krople pożywki (po 50 μl każda) z górnej, środkowej i dolnej części szkiełka podstawowego.
- Użyj sondy preparucyjnej, aby przenieść od pięciu do dziesięciu larw trzeciego stadium rozwojowego lub wczesnych poczwarek (poczwarki, które są nadal białe lub żółte) do górnej kropli. Delikatnie porusz larwy i poczwarki w pożywce za pomocą sondy preparucyjnej, aby usunąć wszelkie jedzenie lub zanieczyszczenia.
- Pod mikroskopem preparacyjnym obróć pojedynczą larwę lub poczwarkę na bok za pomocą sondy preparucyjnej, aby zidentyfikować dwa obustronne jądra, jeśli są obecne, które pojawiają się jako owalne półprzezroczyste struktury w tylnej trzeciej części ciała (Rysunek 2A, B). Zwierzęta, które nie mają jąder, są samicami i należy je wyrzucić.
- Kiedy zostanie znaleziona larwa lub poczwarka samca i jest czysta, przenieś ją do drugiej kropli pożywki. Powtarzać tę czynność do momentu, gdy 3 lub 4 larwy i/lub poczwarki płci męskiej zostaną przeniesione do drugiej kropli pożywki.
- Pracując w drugiej kropli pożywki, chwyć pojedynczą męską larwę lub poczwarkę parą kleszczy w jej środkowej części, tuż przed jądrami. Użyj drugiej pary kleszczy, aby delikatnie rozerwać zwierzę na pół.
- Przytrzymaj tylny koniec larwy lub poczwarki na szklanym szkiełku za pomocą kleszczy. Zaczynając tuż obok kleszczy, dociśnij naskórek za pomocą krawędzi skalpela i przesuń skalpel w kierunku odciętego końca zwierzęcia. Spowoduje to wydalenie narządów wewnętrznych zwierzęcia, w tym jelit, ciał tłuszczowych i jąder.
- Delikatnie oddziel jądra od reszty narządów. Jądra są przezroczystymi, owalnymi narządami osadzonymi we wstęgach ciała tłuszczowego (Ryc. 2C).
- Przenieś jądra pojedynczo do trzeciej kropli pożywki. Aby to osiągnąć, włóż krawędź skalpela pod ciało tłuszczowe, wyjmij tkankę z podłoża i szybko przenieś ją do trzeciej kropli.
- Alternatywnie, jeśli nie ma wystarczającej ilości ciała tłuszczowego nadal przyczepionego do jąder, aby skutecznie podnieść tkankę, delikatnie przenieś tkankę za pomocą szklanej pipety Pasteura, która została wstępnie zwilżona środkiem preparacyjnym .
- Użyj ostrego końca narzędzia skalpela, aby delikatnie odciąć nadmiar tłuszczu z jąder, pozostawiając tylko małą obwódkę tłuszczu wokół krawędzi (Rysunek 2C). Nie jest konieczne, aby usunąć całe ciało tłuszczowe, a próba tego spowoduje prawdopodobnie uszkodzenie lub pęknięcie jąder.
- Powtórz powyższe kroki dla wszystkich męskich larw na szkiełku podstawowym.
- Przejdź do kroku 3 lub 5.
3. Montaż jąder do obrazowania mikroskopowego na żywo
UWAGA: Ta procedura montażu została zaadaptowana z niedawno opublikowanego protokołu obrazowania neuroblastów mózgu larw Drosophila20. Dodatkowe informacje można znaleźć w tym odwołaniu.
- Za pomocą strzykawki filtrującej umieść pojedynczą kroplę pożywki Schneidera (około 30 μl) na środku naczynia hodowlanego o średnicy 50 mm.
- Użyj wstępnie zwilżonej pipety Pasteura, aby przenieść przygotowane jądra do kropli na naczyniu przepuszczającym gaz. Jądra na ogół unoszą się na powierzchni kropli.
- Użyj skalpela, aby delikatnie docisnąć jądra do membrany przepuszczającej gazy. Uważaj, aby nie rozerwać membrany przepuszczającej gaz ostrym końcem skalpela. Wypchnij wszystkie jądra do środka kropli.
- Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej olejem halowęglowym przygotuj cztery krople oleju, po około 30 μl każda, na membranę przepuszczającą gaz. Wokół kropli pożywki zawierającej jądra należy rozmieścić krople oleju tak, aby odpowiadały czterem rogom szkiełka nakrywkowego o średnicy 22 mm.
- Wyrównaj rogi szkiełka nakrywkowego o średnicy 22 mm z czterema kroplami oleju halowęglowego i delikatnie opuść szkiełko nakrywkowe na podłoże i olej. Pozwolić, aby szkiełko nakrywkowe osiadło i aby pożywka zawierająca jądra rozprzestrzeniła się między kroplami oleju.
- Usunąć nadmiar podłoża, aby szkiełko nakrywkowe mogło osiąść na powierzchni jąder. Obserwując jądra pod mikroskopem preparacyjnym, włóż róg delikatnej chusteczki do pożywki pod szkiełkiem nakrywkowym, aby usunąć niewielką ilość płynu. Odetnij wystarczającą ilość pożywki, aż szklane szkiełko nakrywkowe zetknie się z powierzchnią największego jądra. Bardzo ważne jest, aby nie usuwać zbyt dużej ilości podłoża i nie opuszczać szkiełka nakrywkowego zbyt mocno, ponieważ będzie to wywierać nacisk na jądra i spowodować ich pęknięcie (patrz Rysunek 5).
4. Obrazowanie na żywo spermatocytów mejotycznych
UWAGA: Spermatocyty mogą być obrazowane za pomocą skaningu laserowego lub mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem. System musi charakteryzować się odpowiednią szybkością i czułością, aby uniknąć fotowybielania białek fluorescencyjnych lub fotouszkodzenia tkanki.
- Umieść kroplę olejku immersyjnego na szklanym szkiełku nakrywkowym tuż nad jądrami. Odwróć naczynie i umieść je na stoliku mikroskopu i przesuń obiektyw mikroskopu (40x lub 60x) w oleju, aż znajdzie się tuż poniżej jąder. Użyj światła przechodzącego, aby znaleźć pojedyncze jądro i ustawić na nim ostrość.
- Robiąc szybkie obrazy za pomocą konfokalu, poruszaj jądrami, aby zbadać organizację komórek. Na jednym końcu jądra będzie miało wiele małych, gęsto upakowanych komórek. Ten koniec zawiera komórki macierzyste linii rozrodczej i spermatogonię. Poruszając się w kierunku drugiego końca narządu, zidentyfikuj stopniowo większe komórki zorganizowane w dyskretne skupiska lub torbiele. Te duże komórki to spermatocyty (Rysunek 3A).
- W przypadku obrazowania tubuliny GFP zidentyfikuj spermatocyty, które rozpoczną mejozę w ciągu 30-60 minut, dzięki obecności dwóch jasnych astry mikrotubul (tj. centrosomów) znajdujących się w korze komórki (Figura 3B, C).
- Po zidentyfikowaniu torbieli spermatocytów mejotycznych ustaw parametry akwizycji, aby uchwycić z-stosy obrazów w czasie. Zazwyczaj uzyskanie 15-20 obrazów oddalonych od siebie o 1,5 μm w wymiarze z jest wystarczające do uchwycenia pełnej objętości kilku spermatocytów w tej samej torbieli.
- Uzyskuj pełne stosy z co 2 minuty, jeśli obrazujesz cały pierwszy podział mejotyczny, co zajmuje około 1,5 godziny. Możliwe jest zastosowanie szybszych wskaźników akwizycji, szczególnie jeśli ma być analizowane tylko określone zdarzenie mejozy. Należy jednak uważać, aby nie spowodować fotowybielania lub fotouszkodzeń z powodu wielokrotnego wystawiania próbki na wzbudzenie laserowe.
- Użyj ciągłego, automatycznego systemu kontroli ostrości, aby zapobiec dryfowaniu ogniskowej w długim czasie akwizycji. Kontrola temperatury próbki na stoliku mikroskopu na ogół nie jest konieczna, zakładając temperaturę pokojową około 22–23 °C. Jeśli dostępna jest regulacja temperatury, utrzymuj próbkę w temperaturze 25 °C na stoliku mikroskopu.
- Jeśli spermatocyty mejotyczne nie zostaną znalezione, należy przechowywać próbkę przez kilka godzin lub przez noc w inkubatorze o temperaturze 25 °C i ponownie wykonać obraz.
5. Utrwalenie i barwienie immunologiczne
- Z kroku 2.10 powyżej, użyj szklanej pipety Pasteura, aby przenieść jądra do dołka w 9-dołkowym szklanym naczyniu preparacyjnym zawierającym 0,5 ml 8% paraformaldehydu w PBSTx (sól fizjologiczna buforowana fosforanami z 0,3% Triton X-100). Upewnij się, że jądra leżą na dnie naczynia.
nuta: Paraformaldehyd jest toksyczny i należy obchodzić się z nim w rękawiczkach pod wyciągiem. - Utrwal jądra na 20 minut w temperaturze pokojowej.
- Przenieść jądra do studzienki zawierającej 0,5 ml PBSTx. Myć przez 5 minut z delikatnym mieszaniem. Powtórz etap mycia w nowych studzienkach ze świeżym PBSTx jeszcze dwa razy.
- Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe do pożądanego stężenia w 0,5 ml PBSTx zawierającym 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Przenieść jądra z 9-dołkowego szklanego naczynia rozpoznawczego do probówki z rozcieńczonym przeciwciałem pierwszorzędowym i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z delikatnym kołysaniem lub nutacją.
- Myć jądra w 0,5 ml PBSTx przez 5 minut w studzience 9-dołkowego szklanego naczynia preparacyjnego. Powtórz krok prania ze świeżym PBSTx jeszcze dwa razy.
- Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w 250 μl PBSTx zawierającego 5% BSA i dozować do czystej studzienki 9-dołkowego szklanego naczynia preparacyjnego. W razie potrzeby dodaj DAPI, aby wybarwić DNA. Przenieść jądra do studzienki zawierającej przeciwciało drugorzędowe, przykryć folią i inkubować w ciemności z delikatnym mieszaniem przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
- Przenieś jądra do czystej studzienki wypełnionej 0,5 ml PBSTx. Przemyj świeżym PBSTx dwa razy przez 5 minut i trzeci raz przez 30 minut.
6. Montaż Stałych Testów
- Przenieś jądra z ostatniego płukania na szklane szkiełko mikroskopowe za pomocą pipety Pasteura. W razie potrzeby użyj krawędzi skalpela, aby docisnąć jądra do powierzchni szkiełka.
- Użyj rogu delikatnej chusteczki do zadań, aby usunąć nadmiar płynu z jąder. Usuń jak najwięcej płynu.
- Nałóż 30–50 μl kropli pożywki do mikroskopii na jądra.
- Umieścić szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 mm na kropli podłoża montażowego i pozwolić, aby szkiełko nakrywkowe osiadło, a podłoże montażowe rozprowadziło się pod szkiełkiem nakrywkowym. W razie potrzeby delikatnie docisnąć szkiełko nakrywkowe, aby wycisnąć nadmiar podłoża mocującego i pozwolić szkiełku nakrywkowemu oprzeć się na powierzchni jąder.
- Użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po prawidłowym wykonaniu tego protokołu jądra pozostaną w pełni nienaruszone, co umożliwi obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej lub innych metod mikroskopii fluorescencyjnej. Jak pokazano na Rysunku 3A, organizacja komórkowa jąder jest zachowana, a widoczna jest progresja różnicowania komórek z jednego końca jądra na drugi, obejmująca spermatogonia, spermatocyty i haploidalne spermatydy. GFP-tubulina jest przydatnym markerem do identyfikacji dzielących się spermatocytów oraz do obraz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisaliśmy protokół przygotowania jąder larwalnych lub wczesnych poczwarek Drosophila , zoptymalizowany pod kątem długotrwałego, żywego obrazowania podziału komórek spermatocytów. Jest to potężna metoda analizy podziału komórek w kontekście fizjologicznym nienaruszonej tkanki. Moc tej metody jest jeszcze bardziej rozszerzona w połączeniu z narzędziami genetycznymi Drosophila , takimi jak specyficzne mutacje genów, specyficzna tkankowo supresja RNAi oraz znakowane fluorescencyjnie markery białek i organe...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez fundusze startowe Departamentu Obrony dla J.T.S.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 5-calowa sonda preparcyjna | Fisher | 08-965-A | |
| szklana pipeta Pasteura | Fisher | 13-678-20A Albumina | |
| surowicy bydlęcej (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Dumont #5 | Kleszcze Fine Science Tools | 11252-20 | Proste forcepty z cienkimi |
| końcówkami Matowe szkiełka mikroskopowe | Fisher | 12-544-2 | Szkiełka do mocowania stałej tkanki, z matową powierzchnią do pisania, |
| olej halowęglowy 700 | Sigma | H8898-100 mL | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | SAR946077410 | Przepuszczalne dla gazów naczynie do hodowli tkankowych |
| Szklana osłona mikroskopu | Fisher | 12-541-B | 22 mm x 22 mm, #1,5 szklane szkiełko nakrywkowe Szpilki |
| Minutien Fine | Science Tools | 26002-15 | Szpilki do owadów używane do produkcji narzędzie do skalpela |
| Niklowany uchwyt na szpilki | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| 32% roztwór paraformaldehydu, | mikroskopia elektronowa klasy EM Sciences | 15714 | |
| Szkiełka mikroskopowe z fazowaną krawędzią planu | Fisher | 12-549-5 | Szkiełka używane do preparacji |
| Płytki punktowe PYREX | Fisher | 13-748B | 9-dołkowe szklane naczynie |
| preparacyjneSchneider's Drosophila medium | Fisher | 21720-024 | |
| Filtr strzykawkowy, 0,22 i mikro; m | EMD Millipore | SLGS033SB | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Podłoże montażowe do mikroskopii |
Bibliografia
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38 (1), San Diego, Calif. 2-16 (2006).
- Ong, J. Y., Torres, J. Z. Dissecting the mechanisms of cell division. The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).
- Levine, E. M. Cell cycling through development. Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).
- Gross, S. M., Rotwein, P. Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).
- Mittelman, D., Wilson, J. H. The fractured genome of HeLa cells. Genome Biology. 14 (4), 111(2013).
- Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development. Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).
- Giansanti, M. G., Fuller, M. T. What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis. Cytoskeleton. 69 (11), Hoboken, N.J. 869-881 (2012).
- Karabasheva, D., Smyth, J. T. A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 12456(2019).
- Polevoy, G., et al. Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis. Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).
- Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biology. 2 (1), 8(2004).
- Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules. Open Biology. 5 (8), (2015).
- Demarco, R. S., Eikenes, ÅH., Haglund, K., Jones, D. L. Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), San Diego, Calif. 218-227 (2014).
- Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. 71-147 (1993).
- Dunleavy, E. M., et al. The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C. PLOS Biology. 10 (12), 1001460(2012).
- Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).
- Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. Sperm competition and the evolution of spermatogenesis. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).
- Savoian, M. S. Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).
- Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes. Journal of Visualized Experiments. (83), e51058(2014).
- Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
- Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).
- Harel, A., et al. Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos. Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).
- Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
- Tates, A. D. Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. , (1971).
- Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment. Journal of Visualized Experiments. (91), 51868(2014).
- Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).
- Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules. Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
