Artykuł metodologiczny

Zewnątrzkomórkowy zapis wielojednostkowy z nerwu węchowego teleostów

6.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60962

⸱

6 października 2020

 , 
1Centro de Ciências do Mar, 2Universidade do Algarve

W tym artykule

Podsumowanie

Zewnątrzkomórkowy zapis wielopunktowy z nerwu węchowego jest czułą, solidną i powtarzalną metodą oceny wrażliwości węchowej u ryb morskich. Rejestruje pierwotne bodźce sensoryczne i jest niezależny od zewnętrznego zasolenia.

Streszczenie

Ostatnie badania wykazały, że zakwaszenie oceanów wpływa na zachowania węchowe ryb. Może to być częściowo spowodowane zmniejszeniem wrażliwości węchowej w wodzie o wysokim pH PCO 2 / niskim pH. Aby ocenić skutki zakwaszenia oceanów lub ogólnie wrażliwości węchowej u ryb morskich, proponujemy, aby metodą z wyboru był zewnątrzkomórkowy zapis wielojednostkowy z nerwu węchowego. Chociaż jest inwazyjny, jest czuły, wytrzymały, powtarzalny i niezależny od zewnętrznego zasolenia (w przeciwieństwie na przykład do elektroolfaktogramu [EOG]). Co więcej, rejestruje pierwotne dane sensoryczne do OUN, przed jakimkolwiek centralnym przetwarzaniem. Pokazujemy, że ta metoda może wykazać zmniejszenie wrażliwości węchowej, która jest zarówno tymczasowa, jak i zależna od zapachu, wykorzystując szereg aminokwasów do konstruowania krzywych stężenie-odpowiedź i obliczania progów wykrywania.

Wprowadzenie

Ryby polegają głównie na węchu w wielu aspektach swojego życia, w tym między innymi w poszukiwaniu pożywienia, unikaniu drapieżników, ocenie potencjalnych partnerów i migracji1,2,3. Dlatego ocena wrażliwości węchowej ryb (Co one pachną? Jak bardzo są wrażliwe na te związki?) jest niezbędne do pełnego zrozumienia tych procesów. Co więcej, antropogeniczne skutki dla środowiska, takie jak zakwaszenie i zanieczyszczenie oceanów, mogą mieć głęboki wpływ na układ węchowy, nawet na poziomach subletalnych, ponieważ jest on koniecznie w bliskim kontakcie z otaczającą wodą4. Elektrofizjologia in vivo jest eksperymentalnym podejściem z wyboru do oceny wrażliwości węchowej ryb. Dostępne są trzy główne techniki: elektroolfaktogram (EOG), elektroencefalogram (EEG) rejestrowany z opuszki węchowej oraz zapis wielojednostkowy z nerwu węchowego 5.

EOG jest najczęściej używanym z tych trzech6. Jest to potencjał pola prądu stałego (DC) zarejestrowany powyżej nabłonka węchowego i uważa się, że są to zsumowane potencjały generatora neuronów receptorów węchowych (ORN) reagujących na dany środek zapachowy. Ponieważ jednak amplituda odpowiedzi jest rejestrowana w wodzie, a nie wewnątrz ryby, zależy nie tylko od sygnału generowanego przez rybę, ale także od przewodności otaczającej wody; Im wyższa przewodność (lub im niższa rezystancja), tym niższa będzie amplituda. Może to oznaczać, że EOG jest mniej czułą metodą w wodzie morskiej niż słodkowodne7.

EEG rejestrowane z opuszki węchowej jest również szeroko stosowane w badaniach węchu u ryb. Jednak opuszka węchowa jest centrum przetwarzania pierwszego rzędu dla węchowych danych sensorycznych8; Jest on wysoce zorganizowany w kłębuszki nerkowe, w związku z czym zarejestrowana odpowiedź zależy w dużym stopniu od położenia elektrod rejestrujących. Na przykład dane wejściowe z ORN wykrywające aminokwasy są przetwarzane przez kłębuszki nerkowe w bocznej części opuszki węchowej, podczas gdy te z substancji chemicznych pochodzących z tego samego gatunku są kierowane do regionu przyśrodkowego9,10,11,12. Bodźce feromonalne mogą być kierowane do silnie zlokalizowanych kłębuszków nerkowych w obrębie opuszki węchowej. W zależności również od anatomii danego gatunku, idealna pozycja zapisu dla danego środka zapachowego może nie być łatwo dostępna.

Wielopunktowy zapis z nerwu węchowego pozwala obejść główne problemy z EOG i EEG opisane powyżej. Ponieważ rejestruje potencjały czynnościowe przechodzące w dół aksonów ORN z nabłonka do bańki, jest to pierwotny sygnał sensoryczny. A ponieważ jest to rejestrowane wewnątrz ryby, amplituda odpowiedzi jest niezależna od zewnętrznego zasolenia. Niemniej jednak ma to oczywiście pewne wady. Po pierwsze, w zależności od anatomii gatunku, w celu odsłonięcia nerwu węchowego wymagana jest bardziej rozległa operacja niż w przypadku EOG. Po drugie, ponieważ sygnał jest mniejszy niż EOG, wymaga nieco bardziej wyrafinowanego, a co za tym idzie drogiego sprzętu. Ogólny opis innych podejść eksperymentalnych jest podany przez Johna Caprio5. Celem tego artykułu jest nakreślenie, w jaki sposób rejestrować zewnątrzkomórkowe wielojednostkowe odpowiedzi nerwu węchowego dorady (Sparus aurata) in vivo na aminokwasowe substancje zapachowe jako przykład tej techniki oraz jak zidentyfikować i przezwyciężyć niektóre z najczęstszych problemów napotykanych w takim eksperymencie.

Protokół

Hodowla zwierząt i eksperymenty były prowadzone w certyfikowanych obiektach doświadczalnych i były zgodne z portugalskim ustawodawstwem krajowym (DL 113/2013) na podstawie licencji "grupy-1" wydanej przez Generalną Dyrekcję Weterynarii Ministerstwa Rolnictwa, Rozwoju Wsi i Rybołówstwa Portugalii. Ponieważ protokół ten obejmuje postępowanie ze zwierzętami, musi zostać zatwierdzony przez lokalny i/lub krajowy organ, który reguluje dobrostan zwierząt wykorzystywanych w eksperymentach naukowych, ponadto naukowcy muszą mieć odpowiednie przeszkolenie i licencje do przeprowadzania takich procedur.

1. Przygotowanie bodźca

UWAGA: Większość ryb ma bardzo wrażliwy układ węchowy, dlatego należy zachować szczególną ostrożność podczas przygotowywania bodźców węchowych do wykorzystania w eksperymencie. Szkło używane do przygotowania bodźców należy umyć w 5% wybielaczu (podchloryn sodu), dokładnie spłukać wodą z kranu i wysuszyć. Bezpośrednio przed użyciem dokładnie spłucz szklane naczynia wodą morską (tą samą wodą, której użyto do rozcieńczenia bodźca). Uważaj, aby żadna z tych wód nie miała kontaktu z gołą skórą.

  1. Przygotować 100 ml 10-2 M L-glutaminy, L-leucyny i L-seryny; przechowywać po 1 ml porcji każdego z nich w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  2. W dniu doświadczenia przygotować z tych podwielokrotności roztwory od 10-3 M do 10-7 M (w krokach rozcieńczania x10) używając zarówno wody kontrolnej, jak i wody morskiej o wysokiej zawartości CO2.
    UWAGA: L-seryna (10-3 M) będzie stosowana jako kontrola pozytywna lub standard. Woda używana do uzupełniania rozcieńczeń bodźców i traktowana dokładnie w taki sam sposób jak bodźce, ale bez dodatku jakiegokolwiek środka zapachowego, będzie używana jako kontrola ujemna lub ślepa próba.

2. Przygotowanie wody o wysokiej zawartości CO2

  1. Przygotuj wodę kontrolną, zbierając 1 l wody morskiej przefiltrowanej węglem drzewnym.
    1. Za pomocą sondy pH sprawdź pH; powinno wynosić około 8,2. Jeśli nie, bąbelkuj powietrzem atmosferycznym, aż do osiągnięcia tego pH.
    2. Za pomocą titratora zasadowego zmierz zasadowość wody.
    3. Zmierz temperaturę i zasolenie wody.
  2. Przygotuj wodę o wysokiej zawartości CO2 , filtrując 1 l wody morskiej, a następnie bąbelkuj CO2 aż do osiągnięcia pożądanego pH.
    1. Za pomocą sondy pH sprawdź pH; powinno wynosić około 7,7.
    2. Za pomocą titratora do zasadowości zmierz zasadowość wody.
    3. Zmierz temperaturę i zasolenie wody.
  3. Określ ciśnienie CO2 zarówno w wodzie kontrolnej, jak i o wysokiej zawartości CO2 za pomocą oprogramowania przeznaczonego do obliczania parametrów CO2 w wodzie (np. Oprogramowanie CO2Calc13).
    1. W oknie wprowadzania dodaj wartości pH wody, temperatury, zasolenia i całkowitej zasadowości (Rysunek 1).
    2. Wybierz stałe, jednostki i skale (zobacz zalecane wartości w Rysunek 2).
    3. Naciśnij przycisk proces, aby określić ciśnienie CO2.
      UWAGA: Rysunek 3 pokazuje przykładowy arkusz wyników.

3. Przygotowanie ryby

UWAGA: W tym protokole użyto dorady o masie 200−400 g.

  1. Znieczulić rybę przez zanurzenie w napowietrzonej naturalnej wodzie morskiej zawierającej MS222 (sól metanosulfonianu etylo-3-aminobenzoesanu). Gdy reakcja na uszczypnięcie ogona ustaje, wstrzyknąć w mięsień boczny bloker nerwowo-mięśniowy trietiodek gallaminy (10 mg·kg-1 w soli fizjologicznej).
    UWAGA: Stężenie stosowanego środka znieczulającego różni się w zależności od gatunku; w przypadku dorady o masie 200−400 g należy użyć 200 mg·L-1 buforowanych 400 mg·L-1 NaHCO3.
  2. Umieść znieczuloną rybę na wyściełanym podporze. Dokładny kształt i rozmiar zależą od gatunku modelu; w przypadku dorady (200−400 g) użyj wyściełanej podpory w kształcie litery V, wykonanej we własnym zakresie.
  3. Umieść silikonową rurkę (średnica = 10 mm) w ustach, podłącz rurkę do pompy głębinowej w zbiorniku zawierającej środek znieczulający, napowietrzoną wodę morską i pompuj wodę przez skrzela o temperaturze ~100 ml · min-1 · kg-1,
    UWAGA: Rozmiar użytej rurki silikonowej będzie zależał od wielkości ryby.
  4. Włóż bolec uziemiający do mięśnia bocznego i podłącz go do stopnia głównego amplifier).
  5. Przykryj rybę wilgotną szmatką (lub ręcznikiem papierowym) z odsłoniętą tylko głową, upewniając się, że pokrycie nie utrudnia wydostawania się wody ze skrzeli.
    UWAGA: Oczy można przykryć kawałkami wilgotnego papieru/szmatki lub czarnego plastiku.
  6. Umieść rurkę systemu dostarczania bodźca, tj. szklaną rurkę podłączoną do źródła wody morskiej w tle, do nozdrza.
    UWAGA: Można stosować rurki mikrohematokrytu (długość = 75 mm, ID = 1,15 mm, OD = 1,55 mm); Można je przeciągnąć do drobniejszego punktu na ściągaczu elektrod do użytku z mniejszymi rybami. Ważne jest, aby upewnić się, że nabłonek węchowy jest mokry podczas operacji (opisanej poniżej).
  7. Odsłoń nerwy węchowe, usuwając skórę i kość czaszki między oczami (nerwy węchowe zwykle biegną razem między oczami) za pomocą wiertła dentystycznego (najlepiej) lub hobbystycznego (np. Dremela) lub polerki jubilerskiej (z wiertłami dentystycznymi) pod mikroskopem preparacyjnym (wewnątrz klatki Faradaya).
    1. U dorady usuń część czaszki bezpośrednio nad oczami za pomocą piły tarczowej, od przodu do oczu do tyłu. Następnie za pomocą wiertła usuń kość między oczami; Nerwy węchowe leżą między oczami.
  8. Po oczyszczeniu wystarczającej ilości kości usuń tłuszcz i tkankę łączną pokrywającą nerwy za pomocą cienkich kleszczy; uważaj, aby nie uszkodzić nerwów ani nie przebić żadnych naczyń krwionośnych.
    UWAGA: Doświadczenie pomoże udoskonalić sekcję; Im mniejsza rozwarstwienie, tym bardziej stabilny będzie preparat. Jednakże musi zostać oczyszczona wystarczająca ilość tkanki; Dla niedoświadczonych, gdy opuszki węchowe są tylko widoczne, wyczyść je nieco bardziej do przodu, aby odsłonić część nerwów, gdy łączą się z opuszkami, aby umożliwić prawidłowe ustawienie elektrod.
  9. Wyczyść elektrody przed użyciem, podłączając je do ujemnego bieguna źródła prądu stałego 3 V (np. dwie baterie AA połączone szeregowo) i umieszczając końcówkę w soli fizjologicznej (lub wodzie morskiej rozcieńczonej 1:3 w słodkiej wodzie) na 20−30 s; z końcówki powinien być widoczny stały strumień małych pęcherzyków.
  10. Po odsłonięciu nerwów węchowych należy umieścić elektrody rejestrujące (trzymane na mikromanipulatorach) w pozycji, która daje maksymalną odpowiedź na wzorzec (np. 10-3 M L-serynę) i minimalną odpowiedź na ślepą próbę. Użyj elektrod wolframowych pokrytych parylenem (tabela materiałów) podłączonych do stopnia głównego przedwzmacniacza prądu przemiennego (AC).
    UWAGA: U dorady najsilniejsze reakcje na aminokwasy obserwuje się zwykle za pomocą elektrod umieszczonych po bocznej stronie nerwu, blisko miejsca, w którym łączy się z opuszką węchową. Może to dotyczyć innych gatunków, ponieważ organizacja kłębuszków nerkowych cebulki jest zasadniczo podobna wśród gatunków. Jednak doświadczenie jest zawsze najlepszym nauczycielem.

4. Zapis elektrofizjologiczny

UWAGA: Podobnie jak w przypadku większości elektrofizjologii, zapis wielu jednostek musi odbywać się w klatce Faradaya. Jednak nagrywanie zewnątrzkomórkowe zwykle nie wymaga stołu antywibracyjnego; Większość ruchu będzie pochodzić od ryby. Niemniej jednak wymagany jest mocny, stabilny stół z metalową powierzchnią do zabezpieczenia podstaw magnetycznych stojaków mikromanipulatorów.

  1. Skonfiguruj system dostarczania bodźców, aby umożliwić szybkie przejście z czystej wody tła na wodę zawierającą bodziec, np. za pomocą zaworu trójdrogowego sterowanego elektromagnesem. Podłączyć wspólny wylot do rurki doprowadzającej wodę do rozety węchowej i umieścić jedną linię w zbiorniku wody morskiej, a drugą w roztworze testowym.
    UWAGA: Gdy zawór jest przełączany (poprzez przepuszczanie prądu stałego), przepływ wody przełącza się z wody tła na wodę zawierającą nawaniacz. Bodziec powinien być podawany wystarczająco długo, aby zobaczyć wyraźny szczyt zintegrowanej odpowiedzi, po którym następuje okres akomodacji; Czas stosowany w obecnym protokole wynosi 4 s, ale w zależności od gatunku może być konieczne wydłużenie czasu.
  2. Podłącz sterownik zaworu do spustu przetwornika analogowo-cyfrowego (np. Digidata); gdy zawór zostanie przełączony z linii tła na linię zawierającą bodziec, rozpocznie to rejestrację danych. Skonfiguruj oprogramowanie tak, aby rozpoczynało nagrywanie w momencie wyzwalania i kontynuowało przez określony czas (np. 10 s).
    UWAGA: Dziesięć sekund powinno wystarczyć, ale można to skrócić lub wydłużyć, w zależności od pytania eksperymentalnego.
  3. Sprawdź stabilność preparatu, testując (rejestrując i mierząc amplitudę zintegrowanej odpowiedzi) wielokrotnie z wzorcem, w tym przypadku 10-3 M L-seryną, i pozwalając, aby między kolejnymi bodźcami upłynęła 1 minuta.
    UWAGA: W zależności od gatunku i substancji zapachowej, reakcje powinny mieć amplitudę w granicach 10% od siebie (z reguły) i powinny mieć szybki początek, wzrosnąć do maksymalnej aktywności i powrócić do stanu wyjściowego po braku bodźca (Rysunek 4).
  4. Zapisz reakcje nerwów węchowych na aminokwasy w kontrolnej wodzie morskiej (od najniższego do najwyższego stężenia) i pozwól, aby między kolejnymi bodźcami upłynęła 1 minuta.
    UWAGA: Możliwe, że w przypadku niektórych gatunków i/lub niektórych substancji zapachowych potrzeba więcej czasu. Ale w przypadku aminokwasów i dorady wystarczy 1 minuta.
  5. Zapisać reakcję na 10-3 M serynę i kontrolny roztwór ślepej próby wodnej.
  6. Zmień wodę tła z kontrolnej wody morskiej na wodę morską o wysokiej zawartości CO2, umieszczając linię tła w butelce z wodą morską o wysokiej zawartości CO2.
    UWAGA: Zaleca się włożenie innej rurki hematokrytu (lub odpowiednika) do końca bodźca i linii tła, aby uniknąć dotykania wody i upewnić się, że koniec rurki pozostaje w wodzie.
  7. Przed przetestowaniem odpowiedzi nerwu węchowego na aminokwasy w wodzie morskiej o wysokiej zawartości CO2 należy kondycjonować nabłonek węchowy wodą o wysokiej zawartości CO2 , podążając za wodą o wysokim CO2 po nabłonku węchowym przez kilka minut.
    UWAGA: Doświadczenie pokazuje, że w przypadku morlesza dorada wystarczy 5 minut.
  8. Rejestruj reakcje nerwów węchowych na aminokwasy w wodzie morskiej o wysokiej zawartości CO2 (od najniższego do najwyższego stężenia).
  9. Zapisać reakcję na roztwór ślepej próby wodnej o wysokim stężeniu CO2 .
  10. Zapisać reakcję na 10-3 M serynę i kontrolny roztwór ślepej próby wodnej.
    UWAGA: Surowy sygnał (aktywność nerwów) należy przefiltrować (dolnoprzepustowy około 2 000−5 000 Hz, górnoprzepustowy 50−300 Hz) i przekazany do przetwornika analogowo-cyfrowego (Tabela materiałów). W celu łatwiejszego ilościowego określenia aktywności nerwów, surowy sygnał można również zintegrować za pomocą nieszczelnego integratora (Tabela materiałów) i przekazać do przetwornika analogowo-cyfrowego, a stamtąd zarówno surowe, jak i zintegrowane sygnały do komputera z odpowiednim oprogramowaniem (np. Axoscope).

5. Analiza danych

  1. Odejmij amplitudę zintegrowanej odpowiedzi na ślepą próbę (w mV) od amplitudy zintegrowanych odpowiedzi na wszystkie bodźce.
  2. Normalizuj reakcje na bodźce, dzieląc amplitudę poprzedniej odpowiedzi na wzorzec (10-3 M seryny); zmniejsza to zmienność między rybami i wewnątrz nich.
  3. Oblicz progi wykrywania przez regresję liniową krzywych stężenie-odpowiedź (na wykresie półlogarytmicznym), zgodnie ze wzorem log(N + 1,5) = log C + B, gdzie C to stężenie molowe, N to znormalizowana amplituda odpowiedzi, a a i b są stałymi7,14.
    UWAGA: Próg wykrywania jest wtedy wartością x, gdzie y = 0,1761 (tj. log 1,5; N = 0); Stężenie, powyżej którego będzie widoczna reakcja (tj. ryba może ją wyczuć). Niektóre substancje zapachowe wywołują sigmoidalne krzywe stężenie-odpowiedź, gdy są wykreślane półlogarytmicznie (np. calcium15,16; w tym przypadku znormalizowane dane można dopasować do trzyparametrowego wykresu Hilla, który da maksymalną amplitudę odpowiedzi i EC50 (tj. [nawaniacz], który daje połowę maksymalnej odpowiedzi; również miarę czułości).
  4. Porównać progi wykrywalności i/lub maksymalną amplitudę odpowiedzi oraz EC50 bodźców badanych w wodzie kontrolnej i badanych w wodzie o wysokiej zawartości CO2 .

Wyniki

Na Rysunku 4 przedstawiono typową odpowiedź na kontrolę pozytywną (10-3 M L-seryny; Rysunek 4A) oraz kontrolę negatywną (próba ślepa; Rysunek 4B) zarejestrowaną z nerwu węchowego leszcza morskiego. W obecności bodźca (czarny poziomy pasek; w jamie węchowej, w kontakcie z nabłonkiem węchowym) zauważalny jest szybki wzrost aktywności (odzwierciedlony w wychyleniu sygnału zintegrowanego w górę) do szczytu w ciągu około jednej sekundy od rozpoczęcia bodźca, po którym następuje okres akomodacji (podczas gdy bodziec jest nadal obecny) i powrót do aktywności bazowej po zakończeniu bodźca. Bezwzględna amplituda odpowiedzi jest silnie zależna od położenia elektrody; jeśli zarejestrowana amplituda odpowiedzi jest niska, należy spróbować zmienić położenie elektrod. Wolniejszy wzrost do szczytowej aktywności może wynikać z faktu, że rurka doprowadzająca wodę z bodźcem do nabłonka węchowego została umieszczona zbyt daleko od nabłonka; należy spróbować przesunąć rurkę nosową bliżej nabłonka (ale bez dotykania go). Należy zauważyć, że w przeciwieństwie do tego, próba ślepa wywołuje niewielką odpowiedź lub nie wywołuje jej wcale. Znacząca odpowiedź pozytywna (tj. wzrost aktywności) na próbę ślepą może wskazywać na zanieczyszczenie wody użytej do przygotowania rozcieńczeń bodźców; przygotowanie świeżych rozcieńczeń w czystej wodzie (i czystym szkle laboratoryjnym) powinno rozwiązać ten problem. Jeśli nie, konieczne może być dokładniejsze oczyszczenie systemu wodnego (w tym filtrów z węglem aktywnym). Odpowiedź negatywna (tj. spadek aktywności) może wskazywać na niewielką zmianę natężenia przepływu podczas przełączania zaworu, spowodowaną np. zablokowaniem zaworu.

Typowa krzywa koncentracja-odpowiedź (przedstawiona w skali półlogarytmicznej), w tym przypadku dla L-leucyny (od 10-7 M do 10-3 M), jest pokazana na Rysunku 5A. Należy zauważyć, że zwiększające się stężenia substancji zapachowej wywołują coraz większe wzrosty aktywności, a tym samym wzrost amplitudy odpowiedzi zintegrowanych. Wykres znormalizowanych danych oraz odpowiadająca im regresja liniowa są przedstawione na Rysunku 5B. Szacowany próg detekcji można obliczyć z wartości x, gdy y = 0,1761 (tj. log1,5; gdzie N = 0). W tym przypadku wartość ta wynosi -7,48; oznacza to, że obliczony próg dla L-leucyny u tej ryby wynosi 10-7.48 M. Wykładnik α można w podobny sposób oszacować z regresji liniowej znormalizowanych danych na wykresie log-log; logN = αlog[substancja zapachowa] + stała. Współczynnik γ określa zatem wzrost stężenia substancji zapachowej wymagany do zwiększenia amplitudy odpowiedzi o jedną jednostkę logarytmiczną; jest to zatem szacunek nachylenia krzywej koncentracja-odpowiedź17. W tym przykładzie α = 0,277 i γ = 3,61; zatem, aby dziesięciokrotnie zwiększyć amplitudę odpowiedzi (tj. o jedną jednostkę logarytmiczną; log10 = 1), stężenie bodźca musi zostać zwiększone 103.61 razy (4074-krotnie).

Typową sigmoidalną krzywą zależności odpowiedzi od stężenia (Rysunek 6A) przedstawioną w skali półlogarytmicznej, w tym przypadku dla L-glutaminy, pokazano na Rysunku 6B>. Widoczny jest podobny zależny od stężenia wzrost amplitudy odpowiedzi; jednak przy wyższych stężeniach wzrost ten słabnie, aż amplituda odpowiedzi osiągnie wartość maksymalną (Nmax). Pozwala to na dopasowanie danych do trójparametrowego równania Hilla:
Równanie krzywej wiązania ligandu; N/Nmax=[odorant]^n/(EC50n+[odorant]^n); schemat wzoru.

W ten sposób można obliczyć EC50 (stężenie substancji zapachowej, przy którym wywołuje się 50% maksymalnej odpowiedzi) oraz współczynnik Hilla (miara nachylenia stoku liniowej części krzywej sigmoidalnej).

Interfejs CO2Calc, pola ręcznego wprowadzania danych do obliczeń systemu węglanowego, w tym wartości pH i TA.
Rycina 1: Zrzut ekranu oprogramowania przedstawiający okno wprowadzania danych z programu CO2Calc. Wyróżnione (czerwone ramki) są pola wymagane do obliczenia parametrów węglanowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Interfejs preferencji obliczeń CO2 z parametrami: stała, skala pH, bor, strumień powietrze-morze.
Rysunek 2: Zrzut ekranu oprogramowania przedstawiający okno wprowadzania odpowiednich stałych, jednostek i skal. Przedstawione wartości są zalecane dla warunków, w których przeprowadzono opisane eksperymenty; mogą one ulec zmianie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Tabela wejść i wyjść chemii oceanicznej; zasolenie, poziomy węglanów, strumień CO2, analiza temperatury.
Rysunek 3: Zrzut ekranu oprogramowania przedstawiający okno wyników. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Schemat analizy sygnału nerwowego: zintegrowana odpowiedź na 10^-3 M L-serynę w porównaniu z kontrolą pustą.
Rycina 4: Typowe odpowiedzi wielkojednostkowe zarejestrowane zewnątrzkomórkowo z nerwu węchowego dorady in vivo w odpowiedzi na 10-3 M L-serynę (A) oraz próbę pustą (B). Górne ślady przedstawiają odpowiedzi zintegrowane, a dolne ślady przedstawiają surowy sygnał (nerwowy). Bodźce aplikowano do nabłonka węchowego (paski poziome). Zauważalny jest gwałtowny wzrost aktywności podczas 1 s ekspozycji, szczyt aktywności, a następnie okres akomodacji (podczas gdy substancja zapachowa była nadal dostarczana do nabłonka) i powrót do poziomu bazowego po ustaniu dostarczania substancji zapachowej. Mały lub żaden wzrost aktywności jest widoczny po stymulacji wodą traktowaną w ten sam sposób co rozcieńczenia substancji zapachowej, z wyjątkiem dodania jakiejkolwiek substancji zapachowej (próba pusta). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Odpowiedź nerwu na stężenia L-leucyny; zawiera wykresy sygnałów nerwowych (A) i analizę logarytmiczną (B).
Rycina 5: Typowa krzywa zależności odpowiedzi od stężenia L-leucyny zarejestrowana zewnątrzkomórkowo z nerwu węchowego in vivo. (A) Wraz ze wzrostem stężenia L-leucyny aplikowanej do nabłonka węchowego (poziome paski) od 10-7 M do 10-3 M, obserwuje się towarzyszący wzrost aktywności nerwu. Górne ślady przedstawiają odpowiedzi zintegrowane, a dolne ślady surowy sygnał (nerwowy). (B) Regresja liniowa (R2 = 0,97) znormalizowanych danych przedstawionych w skali półlogarytmicznej w celu obliczenia progu detekcji jako wartości dla log[L-leucyna], gdy log(N + 1,5) = 0,1761 (tj. gdzie N = 0). W tym przykładzie wartość ta wynosi -7,48; szacowany próg detekcji dla L-leucyny u tej ryby wynosi zatem 10-7,48 M. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Zależność dawka-odpowiedź dla L-glutaminy; sygnał nerwowy względem stężenia; sygnał zintegrowany, EC₅₀, analiza wykresu.
Rycina 6: Typowa krzywa zależności odpowiedź-stężenie dla L-glutaminy zarejestrowana zewnątrzkomórkowo z nerwu węchowego in vivo. (A) Wraz ze wzrostem stężenia L-glutaminy aplikowanej do nabłonka węchowego (poziome paski) od 10-7 M do 10-3 M, obserwuje się towarzyszący wzrost aktywności nerwu. Górne ślady przedstawiają odpowiedzi zintegrowane, a dolne ślady przedstawiają surowy sygnał (nerwowy). (B) Wykres półlogarytmiczny znormalizowanych danych dopasowany do trójparametrowego równania Hilla (R2 = 0,99). W tym przykładzie obliczone EC50 = 3,11 µM, a współczynnik Hilla = 0,565). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

W niniejszym badaniu opisano zastosowanie wielojednostkowego (zewnątrzkomórkowego) zapisu z nerwu węchowego dorady (S. aurata), morskiego sparida o dużym znaczeniu w akwakulturze. Jednak to eksperymentalne podejście może być szeroko stosowane do innych ryb; Operacja i dokładne rozmieszczenie elektrod będzie wyraźnie zależało od anatomii układu węchowego, a wybór i stężenie środka znieczulającego może zależeć od badanego gatunku. Na przykład nerw węchowy złotej rybki (Carassius auratus) jest krótki; w takim przypadku rejestracja EEG z opuszki węchowej byłaby łatwiejsza. Wybór środka zapachowego może również w pewnym stopniu zależeć od gatunku. W obecnym badaniu wykorzystano aminokwasy. O ile wiadomo autorom, wszystkie badane do tej pory gatunki ryb mają wrażliwość węchowąna aminokwasy 1,18. Wrażliwość ta została związana z różnymi procesami, takimi jak lokalizacja żywności, komunikacja chemiczna i rozpoznawanie wód urodzeniowych 19,20,21,22,23. Jednak wrażliwość różnych gatunków jest, ogólnie rzecz biorąc, dość podobna i nie zależy od stylu życia ani siedliska. Są to również dobrze zdefiniowane cząsteczki, które są tanie i łatwo dostępne. Te powody sprawiają, że są one idealnymi bodźcami testowymi do badań nad węchem u ryb, zwłaszcza tych badających skutki zakłóceń antropogenicznych (np. zakwaszenie lub zanieczyszczenie), gdzie wyniki można łatwo porównać między gatunkami24.

W zależności od danego gatunku, przygotowania do rejestracji wielojednostkowej mogą pozostać stabilne przez kilka godzin; amplituda odpowiedzi na wzorzec wewnętrzny (10-3 M L-seryna w obecnym badaniu) nie powinna różnić się o więcej niż 10% pomiędzy kolejnymi testami. Jakiekolwiek znaczące odchylenie od tej zasady może być spowodowane: (i) ruchem ryby, a tym samym przemieszczeniem elektrod i/lub rurki nosowej; (ii) zanieczyszczenie wody, na przykład poprzez kontakt z rękami eksperymentatora (zwłaszcza jeśli niższe stężenia danego środka zapachowego dają większe reakcje niż wyższe stężenia); lub (iii) pogorszenie stanu zdrowia preparatu). W przypadku i) ryba powinna zostać sprawdzona pod kątem przemieszczenia; Jeśli tak, zmień jego położenie i dodaj więcej środka znieczulającego do wody i/lub podaj kolejną dawkę trietiodku galaminy. Odczekaj 5 minut i ponownie przetestuj standard. Jeśli odpowiedź jest nadal mniejsza, należy zmienić położenie elektrod i/lub rurki nosowej, aż zostanie zarejestrowana wystarczająco duża odpowiedź. W przypadku (ii) po prostu należy ponownie przygotować serię świeżych rozcieńczeń środka zapachowego, używając czystego szkła i wody. W przypadku (iii) należy sprawdzić, czy przepływ wody przez skrzela ryby jest odpowiedni, czy woda przepływa przez skrzela (tj. wypływa przez wieczko, a nie przez otwór gębowy) oraz czy woda jest dobrze napowietrzona. Różne gatunki ryb mają bardzo różne preferencje temperaturowe; zapewnić, aby laboratorium) (i temperatura wody mającej kontakt z rybami) była jak najbardziej zbliżona do temperatury, w której ryby są trzymane. Upewnij się również, że ryby nie są zestresowane i unikaj przenoszenia ich (nawet z jednego zbiornika do drugiego) przez co najmniej tydzień przed nagraniem. Szum elektryczny jest oczywiście zmorą życia elektrofizjologa; Jednak obecny artykuł nie jest odpowiednim medium do dyskusji o tym, jak to przezwyciężyć/zredukować. Niemniej jednak "The Axon Guide" (dostępny bezpłatnie w formacie PDF do pobrania ze strony producenta) jest źródłem praktycznych porad dotyczących minimalizacji hałasu. Gdy standardowa stymulacja wywoła dużą, stabilną odpowiedź, a szereg stężeń da zależny od stężenia wzrost amplitudy, przy minimalnej odpowiedzi na ślepą próbę, można rozpocząć rejestrowanie odpowiedzi na bodźce testowe. Niektórzy autorzy podają ten sam bodziec trzy razy i obliczają średnią arytmetyczną do późniejszej analizy danych. Są to jednak repliki techniczne, a takie podejście wydłuży czas sesji nagraniowej trzykrotnie. Obecni autorzy wolą testować dany środek zapachowy raz, ale zawsze w ramach krzywej stężenie-odpowiedź. Pozwala to nie tylko na obliczenie progu wykrywalności lub EC50 (zgodnie z opisem), ale także zapewnia badanie stężeń bliskich stężeniom, których ryby doświadczyłyby w swoim naturalnym środowisku (nie zawsze jest to znane). Co więcej, wszelkie reakcje odstające, na przykład spowodowane zanieczyszczeniem, są łatwiejsze do wykrycia; W razie potrzeby można je następnie powtórzyć przy użyciu świeżo pobranej próbki.

Wielojednostkowy zapis z nerwu węchowego może być inwazyjny, ale jest bardziej czuły niż EOG, gdy jest rejestrowany w wodzie morskiej7, ponieważ jest niezależny od zewnętrznego zasolenia. Można go zatem wykorzystać do oceny wrażliwości węchowej na substancje zapachowe, takie jak wapń i sód, których zmiany stężeń również wpłynęłyby na przewodność, a w konsekwencji na zarejestrowane napięcia15. Jako oszacowanie liczby ORN reagujących na dany zapach (tj. potencjały czynnościowe przemieszczające się wzdłuż aksonów ORN od nabłonka węchowego do bańki), reprezentuje on surowy, nieprzetworzony sygnał (wstępne przetwarzanie bodźca węchowego rozpoczyna się w opuszkach). W związku z tym lepszym parametrem do oceny bezpośredniego wpływu zanieczyszczeń, takich jak metale ciężkie, oraz zmian środowiskowych, takich jak pH, na układ węchowy niż EOG czy EEG24,25. Na zapis z opuszki węchowej w wodzie morskiej o wysokim pHCO2 (a zatem o niskim pH) może mieć wpływ centralny wpływ pH na przetwarzanie nerwowe; "Teoriareceptora GABA A" zakwaszenia oceanów26, w której obniżenie pH wody powoduje redystrybucję jonów Cl- i HCO3- w płynie mózgowo-rdzeniowym, a w konsekwencji przesunięcie aktywacji GABA-ergicznej z hamującej (hiperpolaryzującej) na pobudzającą (depolaryzującą). Ponadto w takich badaniach ważne jest, aby ocenić skutki zakwaszenia lub zanieczyszczeń przy użyciu stężeń nawaniaczy podobnych do tych, z którymi ryby mogą się zetknąć w swoim naturalnym środowisku. W przypadku aminokwasów jest to zakres od nano do mikromolowych 27,28,29; blisko progu wykrywalności tych związków w rybach 1,18. Oszacowanie progu wykrywalności danego środka zapachowego może dać pewne wyobrażenie o znaczeniu i/lub biologicznej roli wrażliwości węchowej. Na przykład minóg morski (Petromyzon marinus) ma wysoką wrażliwość węchową na określone kwasy żółciowe uwalniane przez larwy do progu 10-13 M30; Ta czułość pozwala dorosłym osobnikom zlokalizować i zidentyfikować odpowiednie tarliska, a tym samym działać jako feromon wędrowny na duże odległości. Podobnie dojrzałe samice minoga morskiego mają wysoką wrażliwość węchową na sperminę (próg 10-14 M), poliaminę uwalnianą w mleczu przez samce, która następnie przyciąga je do gniazd plemników samców31. Inne ryby również wykazują wrażliwość węchową na poliaminy 32,33,34,35, ale nie z wystarczająco niskimi progami wykrywalności, aby wspierać podobną rolę feromonową; Zamiast tego sugeruje się unikanie rozkładających się ryb. Niemniej jednak, przy tak wysokiej wrażliwości węchowej, można sobie wyobrazić, że niewielkie zmniejszenie wrażliwości (tj. wzrost progu), nawet jeśli amplituda odpowiedzi nie jest dramatycznie zmniejszona, może spowodować poważne problemy dla ryb24.

Przy wykreślaniu półlogarytmicznym krzywe stężenie-odpowiedź na substancje zapachowe mogą być wykładnicze, liniowe lub sigmoidalne18. W przypadku aminokwasów takie półlogarytmiczne krzywe stężenie-odpowiedź są albo liniowe (tj. logarytmiczne), sigmoidalne lub funkcje potęgowe7. To, że nie obserwuje się nasycenia odpowiedzi (tj. brak plateau na krzywej stężenie-odpowiedź, nawet przy stężeniach ponadśrodowiskowych) jest prawdopodobnie spowodowane wiązaniem się kilku receptorów z poszczególnymi aminokwasami, w zależności od ich stężenia, a nie wiązaniem się każdego aminokwasu z określonym receptorem; Wraz ze wzrostem stężenia danego aminokwasu, więcej receptorów jest w stanie go związać i tym samym zareagować. Niemniej jednak ryby potrafią rozróżniać mieszaniny aminokwasów 36,37,38,39; Jest to prawdopodobnie spowodowane kombinatorycznymi wzorcami aktywności wywoływanymi w opuszkach węchowych 12,40; aksony wszystkich ORN wyrażających to samo białko receptorowe kończą się na tych samych kłębuszkach w opuszkach węchowych 41,42, a jeden aminokwas może aktywować więcej niż jeden kłębuszek nerkowy.

Jednak wysoce specyficzne substancje zapachowe, takie jak feromony, mogą wywoływać sigmoidalne lub quasi-sigmoidalne krzywe stężenie-odpowiedź43,44. Wniosek, choć nie przetestowany empirycznie, jest taki, że te reakcje węchowe są spowodowane wysoce specyficznymi receptorami, które wiążą cząsteczkę feromonu i niewiele więcej. W związku z tym powyżej danego stężenia wszystkie receptory są zajęte, a dalsze wzrosty nie będą wywoływać dalszych odpowiedzi w innych ORN. W związku z tym dane te można dopasować do trzyparametrowego wykresu Hilla, a maksymalną odpowiedź, EC50 i współczynnik Hilla można obliczyć 15,45,46. Może to dostarczyć cennych informacji, takich jak pozorne powinowactwo i pozorna liczba receptorów, których nie mogą dostarczyć liniowe lub wykładnicze krzywe stężenie-odpowiedź.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez fundusze FEDER poprzez Regionalny Program Operacyjny Algarve - CRESC Algarve 2020 oraz przez Fundusze Krajowe za pośrednictwem FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia w ramach projektu ALG-01-0145-FEDER-30262 oraz projekty FCT PTDC/BIA-BMA/30262/2017, UID/Multi/04326/2019 i DL57/2016/CP1361/CT0041 (przyznane ZV).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przedwzmacniacz prądu przemiennegoDigitimer Ltd (Welwyn Garden City, Wielka Brytania)NL104Przedwzmacniacz Neurolog specjalnie zaprojektowany do tego typu nagrań.
DigidataMolecular Devices, LLC. (San Jose, CA, USA)1440APrzetwornik analogowo-cyfrowy.
EMG IntegratorDigitimer Ltd (Welwyn Garden City, Wielka Brytania)NL703Nieszczelny integrator elektryczny do integracji surowej aktywności nerwu.
Klatka FaradayaWykonana we własnym zakresieW celu zmniejszenia hałasu elektrycznego.
FilterDigitimer Ltd (Welwyn Garden City, Wielka Brytania)NL125/6Moduł filtrujący do zapisu elektrofizjologicznego.
Trietiodek galaminySigma-Aldrich (Portugalia)G8134Bloker nerwowo-mięśniowy
L-glutaminaSigma-Aldrich (Portugalia)G3126Aminokwas stosowany jako środek zapachowy
L-leucynaSigma-Aldrich (Portugalia)L80000Aminokwas stosowany jako środek zapachowy
L-serynaSigma-Aldrich (Portugalia)S4500Aminokwas stosowany jako środek zapachowy
Metaliczny płyta bazowaDowolnaStanowi podstawę dla mikromanipulatorów.
Rurki mikrohematokrytuDowolnaDo umiejscowienia dopływu wody do nabłonka węchowego
MikromanipulatoryNarishige International Ltd (Londyn, Wielka Brytania)M-152Elektrody pozycyjne
MS222 (sól metanosulfonianu etylo-3-aminobenzoesanu)Sigma-Aldrich (Portugalia)E10505Anestezjologiczna
sonda pHInstrumenty Hanna (Pó voa de Varzim, Portugalia)HI12302Sonda do pomiaru pH wody.
RefraktometrHanna instrumenty (Pó voa de Varzim, Portugalia)HI96822Refraktometr do pomiaru zasolenia wody
Chlorek soduSigma-Aldrich (Portugalia)746398Do roztworu soli
Zawory elektromagnetyczneThe Lee Co. (Essex, CT, USA)LFAA1201618HDo przełączania między wodą tła a roztworami stymulacyjnymi (już niedostępnymi)
Mikroskop stereoskopowyZeiss, Leica, OlympusKażdy odpowiedni model.Do preparowania i umieszczania elektrod.
TitratorHanna (Pó voa de Varzim, Portugalia)HI84531Titrator do pomiaru zasadowości wody, pH i temperatury.
Mikroelektrody wolframowe 0,1 MΩWorld Precision Instruments (Hitchin, Wielka Brytania)TM31A10Elektrody zewnątrzkomórkowe.
Sterownik zaworuWykonane we własnymźródle 12 V DC do obsługi zaworów elektromagnetycznych.
Pompa wodna (zatapialna)DowolnaDo dostarczania wody zawierającej środek znieczulający do skrzeli ryb.

Bibliografia

  1. Kasumyan, A. O. The olfactory system in fish: structure, function, and role in behaviour. Journal of Ichthyology. 44 (Suppl 2), S180-S223 (2004).
  2. Michel, W. C. Chemoreception. The Physiology of Fishes. Evans, D. H., Claiborne, J. B. , CRC Press. Boca Raton, FL. 471-497 (2006).
  3. Wisenden, B. D. Chemical cues that indicate risk of predation. Fish Pheromones and Related Cues. Sorensen, P. W., Wisenden, B. D. , John Wiley & Sons Inc. Ames, IA. 131-148 (2015).
  4. Tierney, K. B., et al. Olfactory toxicity in fishes. Aquatic Toxicology. 96 (1), 2-26 (2010).
  5. Caprio, J. In vivo olfactory and taste recordings in fish. Experimental Cell Biology of Taste and Olfaction. Current Techniques and Protocols. Spielman, A. I., Brand, J. G. , CRC Press. Boca Raton, FL. 251-261 (1995).
  6. Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. The electoolfactogram: a review of its history and uses. Microscopy Research and Technique. 58, 152-160 (2002).
  7. Hubbard, P. C., Barata, E. N., Ozório, R. O. A., Valente, L. M. P., Canário, A. V. M. Olfactory sensitivity to amino acids in the blackspot seabream (Pagellus bogaraveo): a comparison between olfactory receptor recording techniques in seawater. Journal of Comparative Physiology A. 197 (8), 839-849 (2011).
  8. Hamdani, E. H., Døving, K. B. The functional organization of the fish olfactory system. Progress in Neurobiology. 82 (2), 80-86 (2007).
  9. Hara, T. J., Zhang, C. Topographic bulbar projections and dual neural pathways of the primary olfactory neurons in salmonid fishes. Neuroscience. 82 (1), 301-313 (1998).
  10. Thommesen, G. The spatial distribution of odour induced potentials in the olfactory bulb of the char and trout (Salmonidae). Acta Physiologica Scandinavica. 102, 205-217 (1978).
  11. Nikonov, A. A., Caprio, J. Electrophysiological evidence for a chemotopy of biologically relevant odors in the olfactory bulb of the channel catfish. Journal of Neurophysiology. 86 (4), 1869-1876 (2001).
  12. Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Chemotopic, combinatorial, and noncombinatorial odorant representations in the olfactory bulb revealed using a voltage-sensitive axon tracer. Journal of Neuroscience. 18 (23), 9977-9988 (1998).
  13. Pierrot, D. E., Lewis, E., Wallace, D. W. R. MS Excel programme developed for CO2 system calculations. ORNL/CDIAC-105a, Carbon Dioxide Information Analysis Center. , Oak Ridge National Laboratory, US Department of Energy, Oak Ridge, TN. (2006).
  14. Hubbard, P. C., Barata, E. N., Canário, A. V. M. Olfactory sensitivity to catecholamines and their metabolites in the goldfish. Chemical Senses. 28 (3), 207-218 (2003).
  15. Hubbard, P. C., Barata, E. N., Canário, A. V. M. Olfactory sensitivity to changes in environmental [Ca2+] in the marine teleost Sparus aurata. Journal of Experimental Biology. 203 (24), 3821-3829 (2000).
  16. Hubbard, P. C., Ingleton, P. M., Bendell, L. A., Barata, E. N., Canário, A. V. M. Olfactory sensitivity to changes in environmental [Ca2+] in the freshwater teleost Carassius auratus: an olfactory role for the Ca2+-sensing receptor? Journal of Experimental Biology. 205, 2755-2764 (2002).
  17. Byrd, R. P. Jr, Caprio, J. Comparison of olfactory receptor (EOG) and bulbar (EEG) responses to amino acids in the catfish, Ictalurus punctatus. Brain Research. 249 (1), 73-80 (1982).
  18. Hara, T. J. The diversity of chemical stimulation in fish olfaction and gustation. Reviews in Fish Biology and Fisheries. 4 (1), 1-35 (1994).
  19. Kawabata, K. Induction of sexual behavior in male fish (Rhodeus ocellatus ocellatus) by amino acids. Amino Acids. 5 (3), 323-327 (1993).
  20. Shoji, T., Yamamoto, Y., Nishikawa, D., Kurihara, K., Ueda, H. Amino acids in stream water are essential for salmon homing migration. Fish Physiology and Biochemistry. 28 (1-4), 249-251 (2003).
  21. Yamamoto, Y., Hino, H., Ueda, H. Olfactory imprinting of amino acids in lacustrine sockeye salmon. PLoS ONE. 5 (1), e8633(2010).
  22. Kutsyna, O., Velez, Z., Canário, A. V. M., Keller-Costa, T., Hubbard, P. C. Variation in urinary amino acids in the Mozambique tilapia: a signal of dominance or individuality?. Chemical Signals in Vertebrates 13. Schulte, B., Goodwin, T., Ferkin, M. , Springer. Cham, Switzerland. 189-204 (2016).
  23. Velez, Z., Hubbard, P. C., Hardege, J. D., Barata, E. N., Canário, A. V. M. The contribution of amino acids to the odour of a prey species in the Senegalese sole (Solea senegalensis). Aquaculture. 265, 336-342 (2007).
  24. Porteus, C. S., et al. Near-future CO2 levels impair the olfactory system of a marine fish. Nature Climate Change. 8 (8), 737-743 (2018).
  25. Velez, Z., Roggatz, C. C., Benoit, D. M., Hardege, J. D., Hubbard, P. C. Short- and medium-term exposure to ocean acidification reduces olfactory sensitivity in gilthead seabream. Frontiers in Physiology. 10, 731(2019).
  26. Nilsson, G. E., et al. Near-future carbon dioxide levels alter fish behaviour by interfering with neurotransmitter function. Nature Climate Change. 2 (3), 201-204 (2012).
  27. Fuhrman, J. A., Ferguson, R. L. Nanomolar concentrations and rapid turnover of dissolved free amino acids in seawater: agreement between chemical and microbiological measurements. Marine Ecology - Progress Series. 33 (3), 237-242 (1986).
  28. Pomeroy, L. R., Macko, S. A., Ostrom, P. H., Dunphy, J. The microbial food web in Arctic seawater: concentration of dissolved free amino acids and bacterial abaundance and activity in the Arctic Ocean and in Resolute Passage. Marine Ecology - Progress Series. 61 (1-2), 31-40 (1990).
  29. Poulet, S. A., Williams, R., Conway, D. V. P., Videau, C. Co-occurrence of copepods and dissolved free amino acids in shelf sea waters. Marine Biology. 108 (3), 373-385 (1991).
  30. Sorensen, P. W., et al. Mixture of new sulfated steroids functions as a migratory pheromone in the sea lamprey. Nature Chemical Biology. 1 (6), 324-328 (2005).
  31. Scott, A. M., et al. Spermine in semen of male sea lamprey acts as a sex pheromone. PLoS Biology. 17 (7), e3000332(2019).
  32. Da Silva, J. P., et al. Synthetic versus natural receptors: supramolecular control of chemical sensing in fish. ACS Chemical Biology. 9 (7), 1432-1436 (2014).
  33. Hussain, A., et al. High-affinity olfactory receptor for the death-associated odor cadaverine. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 19579-19584 (2013).
  34. Michel, W. C., Sanderson, M. J., Olson, J. K., Lipschitz, D. L. Evidence of a novel transduction pathway mediating detection of polyamines by the zebrafish olfactory system. Journal of Experimental Biology. 206 (10), 1697-1706 (2003).
  35. Rolen, S. H., Sorensen, P. W., Mattson, D., Caprio, J. Polyamines as olfactory stimuli in the goldfish Carassius auratus. Journal of Experimental Biology. 206 (10), 1683-1696 (2003).
  36. Kang, J., Caprio, J. Electro-olfactogram and multiunit olfactory receptor responses to complex mixtures of amino acids in the channel catfish, Ictalurus punctatus. Journal of General Physiology. 98 (4), 699-721 (1991).
  37. Kang, J., Caprio, J. Electrophysiological responses of single olfactory bulb neurons to binary mixtures of amino acids in the channel catfish, Ictalurus punctatus. Journal of Neurophysiology. 74 (4), 1435-1443 (1995).
  38. Valentincic, T., Kralj, J., Stenovec, M., Koce, A., Caprio, J. The behavioral detection of binary mixtures of amino acids and their individual components by catfish. Journal of Experimental Biology. 203, 3307-3317 (2000).
  39. Valentincic, T., Wegert, S., Caprio, J. Learned olfactory discrimination versus innate taste responses to amino acids in channel catfish (Ictalurus punctatus). Physiology and Behavior. 55 (5), 865-873 (1994).
  40. Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
  41. Vassar, R., et al. Topographic organization of sensory projections to the olfactory bulb. Cell. 79 (6), 981-991 (1994).
  42. Mombaerts, P., et al. Visualizing an olfactory sensory map. Cell. 87 (4), 675-686 (1996).
  43. Keller-Costa, T., et al. Identity of a tilapia pheromone released by dominant males that primes females for reproduction. Current Biology. 24 (18), 2130-2135 (2014).
  44. Sorensen, P. W., Hara, T. J., Stacey, N. E. Extreme olfactory sensitivity of mature and gonadally-regressed goldfish to a potent steroidal pheromone, 17a,20b-dihydroxy-4-pregnen-3-one. Journal of Comparative Physiology A. 160 (3), 305-313 (1987).
  45. Keller-Costa, T., Canário, A. V. M., Hubbard, P. C. Olfactory sensitivity to steroid glucuronates in Mozambique tilapia suggests two distinct and specific receptors for pheromone detection. Journal of Experimental Biology. 217 (23), 4203-4212 (2014).
  46. Hubbard, P. C., Mota, V., Keller-Costa, T., da Silva, J. P., Canário, A. V. M. Chemical communication in tilapia: a comparison of Oreochromis mossambicus with O. niloticus. General and Comparative Endocrinology. 207, 13-20 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rejestracja nerwu w chowegoOcena wra liwo ci w chowejEfekty zakwaszenia ocean wOdpowied na st enie aminokwas wTechnika rejestracji elektrofizjologicznejSystem dostarczania bod c wMetoda pozycjonowania elektrodPrzygotowanie wody z dwutlenkiem w glaSystem w chowy ryb
Zewnątrzkomórkowy zapis wielojednostkowy z nerwu węchowego teleostów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.