Zewnątrzkomórkowy zapis wielojednostkowy z nerwu węchowego teleostów

Summary

Zewnątrzkomórkowy zapis wielopunktowy z nerwu węchowego jest czułą, solidną i powtarzalną metodą oceny wrażliwości węchowej u ryb morskich. Rejestruje pierwotne bodźce sensoryczne i jest niezależny od zewnętrznego zasolenia.

Abstract

Ostatnie badania wykazały, że zakwaszenie oceanów wpływa na zachowania węchowe ryb. Może to być częściowo spowodowane zmniejszeniem wrażliwości węchowej w wodzie o wysokim pH P_{CO 2} / niskim pH. Aby ocenić skutki zakwaszenia oceanów lub ogólnie wrażliwości węchowej u ryb morskich, proponujemy, aby metodą z wyboru był zewnątrzkomórkowy zapis wielojednostkowy z nerwu węchowego. Chociaż jest inwazyjny, jest czuły, wytrzymały, powtarzalny i niezależny od zewnętrznego zasolenia (w przeciwieństwie na przykład do elektroolfaktogramu [EOG]). Co więcej, rejestruje pierwotne dane sensoryczne do OUN, przed jakimkolwiek centralnym przetwarzaniem. Pokazujemy, że ta metoda może wykazać zmniejszenie wrażliwości węchowej, która jest zarówno tymczasowa, jak i zależna od zapachu, wykorzystując szereg aminokwasów do konstruowania krzywych stężenie-odpowiedź i obliczania progów wykrywania.

Introduction

Ryby polegają głównie na węchu w wielu aspektach swojego życia, w tym między innymi w poszukiwaniu pożywienia, unikaniu drapieżników, ocenie potencjalnych partnerów i migracji^1,2,3. Dlatego ocena wrażliwości węchowej ryb (Co one pachną? Jak bardzo są wrażliwe na te związki?) jest niezbędne do pełnego zrozumienia tych procesów. Co więcej, antropogeniczne skutki dla środowiska, takie jak zakwaszenie i zanieczyszczenie oceanów, mogą mieć głęboki wpływ na układ węchowy, nawet na poziomach subletalnych, ponieważ jest on koniecznie w bliskim kontakcie z otaczającą wodą⁴. Elektrofizjologia in vivo jest eksperymentalnym podejściem z wyboru do oceny wrażliwości węchowej ryb. Dostępne są trzy główne techniki: elektroolfaktogram (EOG), elektroencefalogram (EEG) rejestrowany z opuszki węchowej oraz zapis wielojednostkowy z nerwu węchowego ⁵.

EOG jest najczęściej używanym z tych trzech⁶. Jest to potencjał pola prądu stałego (DC) zarejestrowany powyżej nabłonka węchowego i uważa się, że są to zsumowane potencjały generatora neuronów receptorów węchowych (ORN) reagujących na dany środek zapachowy. Ponieważ jednak amplituda odpowiedzi jest rejestrowana w wodzie, a nie wewnątrz ryby, zależy nie tylko od sygnału generowanego przez rybę, ale także od przewodności otaczającej wody; Im wyższa przewodność (lub im niższa rezystancja), tym niższa będzie amplituda. Może to oznaczać, że EOG jest mniej czułą metodą w wodzie morskiej niż słodkowodne⁷.

EEG rejestrowane z opuszki węchowej jest również szeroko stosowane w badaniach węchu u ryb. Jednak opuszka węchowa jest centrum przetwarzania pierwszego rzędu dla węchowych danych sensorycznych⁸; Jest on wysoce zorganizowany w kłębuszki nerkowe, w związku z czym zarejestrowana odpowiedź zależy w dużym stopniu od położenia elektrod rejestrujących. Na przykład dane wejściowe z ORN wykrywające aminokwasy są przetwarzane przez kłębuszki nerkowe w bocznej części opuszki węchowej, podczas gdy te z substancji chemicznych pochodzących z tego samego gatunku są kierowane do regionu przyśrodkowego^9,10,11,12. Bodźce feromonalne mogą być kierowane do silnie zlokalizowanych kłębuszków nerkowych w obrębie opuszki węchowej. W zależności również od anatomii danego gatunku, idealna pozycja zapisu dla danego środka zapachowego może nie być łatwo dostępna.

Wielopunktowy zapis z nerwu węchowego pozwala obejść główne problemy z EOG i EEG opisane powyżej. Ponieważ rejestruje potencjały czynnościowe przechodzące w dół aksonów ORN z nabłonka do bańki, jest to pierwotny sygnał sensoryczny. A ponieważ jest to rejestrowane wewnątrz ryby, amplituda odpowiedzi jest niezależna od zewnętrznego zasolenia. Niemniej jednak ma to oczywiście pewne wady. Po pierwsze, w zależności od anatomii gatunku, w celu odsłonięcia nerwu węchowego wymagana jest bardziej rozległa operacja niż w przypadku EOG. Po drugie, ponieważ sygnał jest mniejszy niż EOG, wymaga nieco bardziej wyrafinowanego, a co za tym idzie drogiego sprzętu. Ogólny opis innych podejść eksperymentalnych jest podany przez Johna Caprio⁵. Celem tego artykułu jest nakreślenie, w jaki sposób rejestrować zewnątrzkomórkowe wielojednostkowe odpowiedzi nerwu węchowego dorady (Sparus aurata) in vivo na aminokwasowe substancje zapachowe jako przykład tej techniki oraz jak zidentyfikować i przezwyciężyć niektóre z najczęstszych problemów napotykanych w takim eksperymencie.

Protocol

Hodowla zwierząt i eksperymenty były prowadzone w certyfikowanych obiektach doświadczalnych i były zgodne z portugalskim ustawodawstwem krajowym (DL 113/2013) na podstawie licencji "grupy-1" wydanej przez Generalną Dyrekcję Weterynarii Ministerstwa Rolnictwa, Rozwoju Wsi i Rybołówstwa Portugalii. Ponieważ protokół ten obejmuje postępowanie ze zwierzętami, musi zostać zatwierdzony przez lokalny i/lub krajowy organ, który reguluje dobrostan zwierząt wykorzystywanych w eksperymentach naukowych, ponadto naukowcy muszą mieć odpowiednie przeszkolenie i licencje do przeprowadzania takich procedur.

1. Przygotowanie bodźca

UWAGA: Większość ryb ma bardzo wrażliwy układ węchowy, dlatego należy zachować szczególną ostrożność podczas przygotowywania bodźców węchowych do wykorzystania w eksperymencie. Szkło używane do przygotowania bodźców należy umyć w 5% wybielaczu (podchloryn sodu), dokładnie spłukać wodą z kranu i wysuszyć. Bezpośrednio przed użyciem dokładnie spłucz szklane naczynia wodą morską (tą samą wodą, której użyto do rozcieńczenia bodźca). Uważaj, aby żadna z tych wód nie miała kontaktu z gołą skórą.

1. Przygotować 100 ml ^10-2 M L-glutaminy, L-leucyny i L-seryny; przechowywać po 1 ml porcji każdego z nich w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
2. W dniu doświadczenia przygotować z tych podwielokrotności roztwory od ^10-3 M do ^10-7 M (w krokach rozcieńczania x10) używając zarówno wody kontrolnej, jak i wody morskiej o wysokiej zawartości CO₂.
   UWAGA: L-seryna (^10-3 M) będzie stosowana jako kontrola pozytywna lub standard. Woda używana do uzupełniania rozcieńczeń bodźców i traktowana dokładnie w taki sam sposób jak bodźce, ale bez dodatku jakiegokolwiek środka zapachowego, będzie używana jako kontrola ujemna lub ślepa próba.

2. Przygotowanie wody o wysokiej zawartości CO₂

1. Przygotuj wodę kontrolną, zbierając 1 l wody morskiej przefiltrowanej węglem drzewnym.
   1. Za pomocą sondy pH sprawdź pH; powinno wynosić około 8,2. Jeśli nie, bąbelkuj powietrzem atmosferycznym, aż do osiągnięcia tego pH.
   2. Za pomocą titratora zasadowego zmierz zasadowość wody.
   3. Zmierz temperaturę i zasolenie wody.
2. Przygotuj wodę o wysokiej zawartości CO₂ , filtrując 1 l wody morskiej, a następnie bąbelkuj CO₂ aż do osiągnięcia pożądanego pH.
   1. Za pomocą sondy pH sprawdź pH; powinno wynosić około 7,7.
   2. Za pomocą titratora do zasadowości zmierz zasadowość wody.
   3. Zmierz temperaturę i zasolenie wody.
3. Określ ciśnienie CO₂ zarówno w wodzie kontrolnej, jak i o wysokiej zawartości CO₂ za pomocą oprogramowania przeznaczonego do obliczania parametrów CO₂ w wodzie (np. Oprogramowanie CO2Calc¹³).
   1. W oknie wprowadzania dodaj wartości pH wody, temperatury, zasolenia i całkowitej zasadowości (Rysunek 1).
   2. Wybierz stałe, jednostki i skale (zobacz zalecane wartości w Rysunek 2).
   3. Naciśnij przycisk proces, aby określić ciśnienie CO₂.
      UWAGA: Rysunek 3 pokazuje przykładowy arkusz wyników.

3. Przygotowanie ryby

UWAGA: W tym protokole użyto dorady o masie 200−400 g.

1. Znieczulić rybę przez zanurzenie w napowietrzonej naturalnej wodzie morskiej zawierającej MS222 (sól metanosulfonianu etylo-3-aminobenzoesanu). Gdy reakcja na uszczypnięcie ogona ustaje, wstrzyknąć w mięsień boczny bloker nerwowo-mięśniowy trietiodek gallaminy (10 mg·^kg-1 w soli fizjologicznej).
   UWAGA: Stężenie stosowanego środka znieczulającego różni się w zależności od gatunku; w przypadku dorady o masie 200−400 g należy użyć 200 mg·^L-1 buforowanych 400 mg·^L-1 NaHCO₃.
2. Umieść znieczuloną rybę na wyściełanym podporze. Dokładny kształt i rozmiar zależą od gatunku modelu; w przypadku dorady (200−400 g) użyj wyściełanej podpory w kształcie litery V, wykonanej we własnym zakresie.
3. Umieść silikonową rurkę (średnica = 10 mm) w ustach, podłącz rurkę do pompy głębinowej w zbiorniku zawierającej środek znieczulający, napowietrzoną wodę morską i pompuj wodę przez skrzela o temperaturze ~100 ml · ^min-1 · ^kg-1,
   UWAGA: Rozmiar użytej rurki silikonowej będzie zależał od wielkości ryby.
4. Włóż bolec uziemiający do mięśnia bocznego i podłącz go do stopnia głównego amplifier).
5. Przykryj rybę wilgotną szmatką (lub ręcznikiem papierowym) z odsłoniętą tylko głową, upewniając się, że pokrycie nie utrudnia wydostawania się wody ze skrzeli.
   UWAGA: Oczy można przykryć kawałkami wilgotnego papieru/szmatki lub czarnego plastiku.
6. Umieść rurkę systemu dostarczania bodźca, tj. szklaną rurkę podłączoną do źródła wody morskiej w tle, do nozdrza.
   UWAGA: Można stosować rurki mikrohematokrytu (długość = 75 mm, ID = 1,15 mm, OD = 1,55 mm); Można je przeciągnąć do drobniejszego punktu na ściągaczu elektrod do użytku z mniejszymi rybami. Ważne jest, aby upewnić się, że nabłonek węchowy jest mokry podczas operacji (opisanej poniżej).
7. Odsłoń nerwy węchowe, usuwając skórę i kość czaszki między oczami (nerwy węchowe zwykle biegną razem między oczami) za pomocą wiertła dentystycznego (najlepiej) lub hobbystycznego (np. Dremela) lub polerki jubilerskiej (z wiertłami dentystycznymi) pod mikroskopem preparacyjnym (wewnątrz klatki Faradaya).
   1. U dorady usuń część czaszki bezpośrednio nad oczami za pomocą piły tarczowej, od przodu do oczu do tyłu. Następnie za pomocą wiertła usuń kość między oczami; Nerwy węchowe leżą między oczami.
8. Po oczyszczeniu wystarczającej ilości kości usuń tłuszcz i tkankę łączną pokrywającą nerwy za pomocą cienkich kleszczy; uważaj, aby nie uszkodzić nerwów ani nie przebić żadnych naczyń krwionośnych.
   UWAGA: Doświadczenie pomoże udoskonalić sekcję; Im mniejsza rozwarstwienie, tym bardziej stabilny będzie preparat. Jednakże musi zostać oczyszczona wystarczająca ilość tkanki; Dla niedoświadczonych, gdy opuszki węchowe są tylko widoczne, wyczyść je nieco bardziej do przodu, aby odsłonić część nerwów, gdy łączą się z opuszkami, aby umożliwić prawidłowe ustawienie elektrod.
9. Wyczyść elektrody przed użyciem, podłączając je do ujemnego bieguna źródła prądu stałego 3 V (np. dwie baterie AA połączone szeregowo) i umieszczając końcówkę w soli fizjologicznej (lub wodzie morskiej rozcieńczonej 1:3 w słodkiej wodzie) na 20−30 s; z końcówki powinien być widoczny stały strumień małych pęcherzyków.
10. Po odsłonięciu nerwów węchowych należy umieścić elektrody rejestrujące (trzymane na mikromanipulatorach) w pozycji, która daje maksymalną odpowiedź na wzorzec (np. ^10-3 M L-serynę) i minimalną odpowiedź na ślepą próbę. Użyj elektrod wolframowych pokrytych parylenem (tabela materiałów) podłączonych do stopnia głównego przedwzmacniacza prądu przemiennego (AC).
    UWAGA: U dorady najsilniejsze reakcje na aminokwasy obserwuje się zwykle za pomocą elektrod umieszczonych po bocznej stronie nerwu, blisko miejsca, w którym łączy się z opuszką węchową. Może to dotyczyć innych gatunków, ponieważ organizacja kłębuszków nerkowych cebulki jest zasadniczo podobna wśród gatunków. Jednak doświadczenie jest zawsze najlepszym nauczycielem.

4. Zapis elektrofizjologiczny

UWAGA: Podobnie jak w przypadku większości elektrofizjologii, zapis wielu jednostek musi odbywać się w klatce Faradaya. Jednak nagrywanie zewnątrzkomórkowe zwykle nie wymaga stołu antywibracyjnego; Większość ruchu będzie pochodzić od ryby. Niemniej jednak wymagany jest mocny, stabilny stół z metalową powierzchnią do zabezpieczenia podstaw magnetycznych stojaków mikromanipulatorów.

1. Skonfiguruj system dostarczania bodźców, aby umożliwić szybkie przejście z czystej wody tła na wodę zawierającą bodziec, np. za pomocą zaworu trójdrogowego sterowanego elektromagnesem. Podłączyć wspólny wylot do rurki doprowadzającej wodę do rozety węchowej i umieścić jedną linię w zbiorniku wody morskiej, a drugą w roztworze testowym.
   UWAGA: Gdy zawór jest przełączany (poprzez przepuszczanie prądu stałego), przepływ wody przełącza się z wody tła na wodę zawierającą nawaniacz. Bodziec powinien być podawany wystarczająco długo, aby zobaczyć wyraźny szczyt zintegrowanej odpowiedzi, po którym następuje okres akomodacji; Czas stosowany w obecnym protokole wynosi 4 s, ale w zależności od gatunku może być konieczne wydłużenie czasu.
2. Podłącz sterownik zaworu do spustu przetwornika analogowo-cyfrowego (np. Digidata); gdy zawór zostanie przełączony z linii tła na linię zawierającą bodziec, rozpocznie to rejestrację danych. Skonfiguruj oprogramowanie tak, aby rozpoczynało nagrywanie w momencie wyzwalania i kontynuowało przez określony czas (np. 10 s).
   UWAGA: Dziesięć sekund powinno wystarczyć, ale można to skrócić lub wydłużyć, w zależności od pytania eksperymentalnego.
3. Sprawdź stabilność preparatu, testując (rejestrując i mierząc amplitudę zintegrowanej odpowiedzi) wielokrotnie z wzorcem, w tym przypadku ^10-3 M L-seryną, i pozwalając, aby między kolejnymi bodźcami upłynęła 1 minuta.
   UWAGA: W zależności od gatunku i substancji zapachowej, reakcje powinny mieć amplitudę w granicach 10% od siebie (z reguły) i powinny mieć szybki początek, wzrosnąć do maksymalnej aktywności i powrócić do stanu wyjściowego po braku bodźca (Rysunek 4).
4. Zapisz reakcje nerwów węchowych na aminokwasy w kontrolnej wodzie morskiej (od najniższego do najwyższego stężenia) i pozwól, aby między kolejnymi bodźcami upłynęła 1 minuta.
   UWAGA: Możliwe, że w przypadku niektórych gatunków i/lub niektórych substancji zapachowych potrzeba więcej czasu. Ale w przypadku aminokwasów i dorady wystarczy 1 minuta.
5. Zapisać reakcję na ^10-3 M serynę i kontrolny roztwór ślepej próby wodnej.
6. Zmień wodę tła z kontrolnej wody morskiej na wodę morską o wysokiej zawartości CO₂, umieszczając linię tła w butelce z wodą morską o wysokiej zawartości CO₂.
   UWAGA: Zaleca się włożenie innej rurki hematokrytu (lub odpowiednika) do końca bodźca i linii tła, aby uniknąć dotykania wody i upewnić się, że koniec rurki pozostaje w wodzie.
7. Przed przetestowaniem odpowiedzi nerwu węchowego na aminokwasy w wodzie morskiej o wysokiej zawartości CO₂ należy kondycjonować nabłonek węchowy wodą o wysokiej zawartości CO₂ , podążając za wodą o wysokim CO₂ po nabłonku węchowym przez kilka minut.
   UWAGA: Doświadczenie pokazuje, że w przypadku morlesza dorada wystarczy 5 minut.
8. Rejestruj reakcje nerwów węchowych na aminokwasy w wodzie morskiej o wysokiej zawartości CO₂ (od najniższego do najwyższego stężenia).
9. Zapisać reakcję na roztwór ślepej próby wodnej o wysokim stężeniu CO₂ .
10. Zapisać reakcję na ^10-3 M serynę i kontrolny roztwór ślepej próby wodnej.
    UWAGA: Surowy sygnał (aktywność nerwów) należy przefiltrować (dolnoprzepustowy około 2 000−5 000 Hz, górnoprzepustowy 50−300 Hz) i przekazany do przetwornika analogowo-cyfrowego (Tabela materiałów). W celu łatwiejszego ilościowego określenia aktywności nerwów, surowy sygnał można również zintegrować za pomocą nieszczelnego integratora (Tabela materiałów) i przekazać do przetwornika analogowo-cyfrowego, a stamtąd zarówno surowe, jak i zintegrowane sygnały do komputera z odpowiednim oprogramowaniem (np. Axoscope).

5. Analiza danych

1. Odejmij amplitudę zintegrowanej odpowiedzi na ślepą próbę (w mV) od amplitudy zintegrowanych odpowiedzi na wszystkie bodźce.
2. Normalizuj reakcje na bodźce, dzieląc amplitudę poprzedniej odpowiedzi na wzorzec (^10-3 M seryny); zmniejsza to zmienność między rybami i wewnątrz nich.
3. Oblicz progi wykrywania przez regresję liniową krzywych stężenie-odpowiedź (na wykresie półlogarytmicznym), zgodnie ze wzorem log(N + 1,5) = log C + B, gdzie C to stężenie molowe, N to znormalizowana amplituda odpowiedzi, a a i b są stałymi^7,14.
   UWAGA: Próg wykrywania jest wtedy wartością x, gdzie y = 0,1761 (tj. log 1,5; N = 0); Stężenie, powyżej którego będzie widoczna reakcja (tj. ryba może ją wyczuć). Niektóre substancje zapachowe wywołują sigmoidalne krzywe stężenie-odpowiedź, gdy są wykreślane półlogarytmicznie (np. calcium^15,16; w tym przypadku znormalizowane dane można dopasować do trzyparametrowego wykresu Hilla, który da maksymalną amplitudę odpowiedzi i EC₅₀ (tj. [nawaniacz], który daje połowę maksymalnej odpowiedzi; również miarę czułości).
4. Porównać progi wykrywalności i/lub maksymalną amplitudę odpowiedzi oraz EC₅₀ bodźców badanych w wodzie kontrolnej i badanych w wodzie o wysokiej zawartości CO₂ .

Results

Typowa reakcja na kontrolę pozytywną (^10-3 M L-seryna; Rysunek 4A) i kontrola negatywna (puste; Rysunek 4B) nagrane z nerwu węchowego dorady jest pokazane w Rysunek 4. W obecności bodźca (poziomy pasek; w jamie węchowej, w kontakcie z nabłonkiem węchowym), zwróć uwagę na szybki wzrost aktywności (odzwierciedlony w odchyleniu zintegrowanego sygnału w górę) do szczytu w ciągu około jednej sekundy od wystąpienia bodźca, po którym następuje okres akomodacji (gdy bodziec jest nadal obecny), oraz powrót do aktywności wyjściowej po zakończeniu bodźca. Bezwzględna amplituda odpowiedzi jest w dużym stopniu zależna od położenia elektrody; Jeśli zarejestrowana zostanie odpowiedź o niskiej amplitudzie, spróbuj zmienić pozycje elektrod. Wolniejszy wzrost szczytowej aktywności może być spowodowany umieszczeniem rurki przenoszącej wodę zawierającą bodziec do nabłonka węchowego zbyt daleko od nabłonka; Spróbuj przesunąć rurkę nosową bliżej (ale nie dotykając) nabłonka. Zauważ, że w przeciwieństwie do tego, blank wywołuje niewielką reakcję lub nie wywołuje jej wcale. Znacząca pozytywna reakcja (tj. wzrost aktywności) na ślepą próbę może wskazywać na zanieczyszczenie wody używanej do rozcieńczania bodźców; Świeże rozcieńczenia czystą wodą (i szklanymi naczyniami) powinny rozwiązać ten problem. W przeciwnym razie może być konieczne dokładniejsze wyczyszczenie instalacji wodnej (w tym filtrów z węglem aktywnym). Negatywna reakcja (tj. spadek aktywności) może wskazywać na niewielką zmianę natężenia przepływu, gdy zawór jest przełączany z powodu, na przykład, zablokowania zaworu.

Typowa krzywa stężenie-odpowiedź (wykreślona półlogarytmicznie), w tym przypadku dla L-leucyny (^10-7 M do ^10-3 M), jest pokazana w Rysunek 5A. Należy zauważyć, że rosnące stężenia środka zapachowego wywołują coraz większe wzrosty aktywności, a tym samym amplitudy zintegrowanych odpowiedzi. Wykres znormalizowanych danych i odpowiadającej im regresji liniowej pokazano na rysunku Rysunek 5B. Szacowany próg wykrywalności można obliczyć na podstawie wartości x, gdy y = 0,1761 (tj. log1,5; gdzie N = 0). W tym przypadku wartość ta wynosi -7,48; oznacza to, że obliczony próg L-leucyny w tej rybie wynosi ^10-7,48 M. Wykładnik α można podobnie oszacować na podstawie regresji liniowej znormalizowanych danych na wykresie logarytmicznym; logN = αlog[nawaniacz] + stała. Współczynnik γ następnie podaje wzrost stężenia nawaniacza wymagany do zwiększenia amplitudy odpowiedzi o jedną jednostkę logarytmiczną; Oznacza to, że jest to oszacowanie nachylenia krzywej stężenie-odpowiedź17. W tym przykładzie α = 0,277 i γ = 3,61; Dlatego, aby zwiększyć amplitudę odpowiedzi dziesięciokrotnie (tj. jedną jednostkę logarytmiczną; log10 = 1), stężenie bodźca należy zwiększyć 10^3,61-krotnie (4,074-krotnie).

Typowa sigmoidalna krzywa stężenie-odpowiedź (Rysunek 6A) po półlogarytmicznym wykreśleniu, w tym przypadku do L-glutaminy, jest pokazana w Rysunek 6B. Obserwuje się podobny zależny od stężenia wzrost amplitudy odpowiedzi; jednak przy wyższych stężeniach wzrost ten staje się mniejszy, tak że amplituda odpowiedzi osiąga maksimum (N_max). Pozwala to na dopasowanie danych do trzyparametrowego równania Hilla:

W ten sposób można obliczyć EC₅₀ (stężenie nawaniacza, przy którym wywoływana jest 50% maksymalna reakcja) oraz współczynnik Hilla (miara nachylenia nachylenia liniowej części krzywej sigmoidalnej).

Rysunek 1: Zrzut ekranu oprogramowania przedstawiający okno wprowadzania danych z programu CO2Calc. Wyróżnione (czerwone pola) to pola wymagane do obliczenia parametru węglanu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zrzut ekranu oprogramowania przedstawiający okno wprowadzania dla odpowiednich stałych, jednostek i skal. Podane wartości są zalecane dla warunków, w których przeprowadzono opisane doświadczenia; Mogą ulec zmianie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Zrzut ekranu oprogramowania przedstawiający okno wyników. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Typowe odpowiedzi wielojednostkowe rejestrowane zewnątrzkomórkowo z nerwu węchowego dorady in vivo w odpowiedzi na ^10-3 M L-serynę (A) i ślepą próbę (B). Górne ścieżki pokazują zintegrowane reakcje, a dolne ścieżki pokazują surowy (nerwowy) sygnał. Bodźce przykładano do nabłonka węchowego (poziome paski). Należy zwrócić uwagę na szybki wzrost aktywności w ciągu 1 s ekspozycji, szczyt aktywności, po którym następuje okres akomodacji (gdy środek zapachowy był nadal dostarczany do nabłonka) i powrót do poziomów wyjściowych po zaprzestaniu dostarczania środka zapachowego. Niewielki lub żaden wzrost aktywności nie jest obserwowany po stymulacji wodą traktowaną w taki sam sposób, jak rozcieńczenia środka zapachowego, z wyjątkiem dodania dowolnego środka zapachowego (ślepa próba). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Typowa krzywa stężenie-odpowiedź dla L-leucyny zarejestrowana zewnątrzkomórkowo z nerwu węchowego in vivo. (A) Wraz ze wzrostem stężenia L-leucyny przyłożonej do nabłonka węchowego (poziomych prętów) z ^10-7 M do ^10-3 M, obserwuje się jednoczesny wzrost aktywności nerwu. Górne ścieżki pokazują zintegrowane reakcje, a dolne ścieżki pokazują surowy (nerwowy) sygnał. (B) Regresja liniowa (R² = 0,97) znormalizowanych danych wykreślonych półlogarytmicznie w celu obliczenia progu wykrywania jako wartości log[L-leucyny], gdy log(N + 1,5) = 0,1761 (tj. gdzie N = 0). W tym przykładzie ta wartość wynosi -7,48; szacowany próg wykrywalności L-leucyny u tej ryby wynosi zatem ^10-7,48 M. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Typowa krzywa stężenie-odpowiedź dla L-glutaminy rejestrowanej zewnątrzkomórkowo z nerwu węchowego in vivo. (A) Wraz ze wzrostem stężenia L-glutaminy nałożonej na nabłonek węchowy (poziome pręty) z ^10-7 M do ^10-3 M, obserwuje się jednoczesny wzrost aktywności w nerwie. Górne ścieżki pokazują zintegrowane reakcje, a dolne ścieżki pokazują surowy (nerwowy) sygnał. (B) Półlogarytmiczny wykres znormalizowanych danych dopasowany do trzyparametrowego równania Hilla (R² = 0,99). W tym przykładzie obliczono EC₅₀ = 3,11 μM, a współczynnik Hilla = 0,565). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

W niniejszym badaniu opisano zastosowanie wielojednostkowego (zewnątrzkomórkowego) zapisu z nerwu węchowego dorady (S. aurata), morskiego sparida o dużym znaczeniu w akwakulturze. Jednak to eksperymentalne podejście może być szeroko stosowane do innych ryb; Operacja i dokładne rozmieszczenie elektrod będzie wyraźnie zależało od anatomii układu węchowego, a wybór i stężenie środka znieczulającego może zależeć od badanego gatunku. Na przykład nerw węchowy złotej rybki (Carassius auratus) jest krótki; w takim przypadku rejestracja EEG z opuszki węchowej byłaby łatwiejsza. Wybór środka zapachowego może również w pewnym stopniu zależeć od gatunku. W obecnym badaniu wykorzystano aminokwasy. O ile wiadomo autorom, wszystkie badane do tej pory gatunki ryb mają wrażliwość węchową^na aminokwasy ^1,18. Wrażliwość ta została związana z różnymi procesami, takimi jak lokalizacja żywności, komunikacja chemiczna i rozpoznawanie wód urodzeniowych 19,20,21,22,23. Jednak wrażliwość różnych gatunków jest, ogólnie rzecz biorąc, dość podobna i nie zależy od stylu życia ani siedliska. Są to również dobrze zdefiniowane cząsteczki, które są tanie i łatwo dostępne. Te powody sprawiają, że są one idealnymi bodźcami testowymi do badań nad węchem u ryb, zwłaszcza tych badających skutki zakłóceń antropogenicznych (np. zakwaszenie lub zanieczyszczenie), gdzie wyniki można łatwo porównać między gatunkami²⁴.

W zależności od danego gatunku, przygotowania do rejestracji wielojednostkowej mogą pozostać stabilne przez kilka godzin; amplituda odpowiedzi na wzorzec wewnętrzny (^10-3 M L-seryna w obecnym badaniu) nie powinna różnić się o więcej niż 10% pomiędzy kolejnymi testami. Jakiekolwiek znaczące odchylenie od tej zasady może być spowodowane: (i) ruchem ryby, a tym samym przemieszczeniem elektrod i/lub rurki nosowej; (ii) zanieczyszczenie wody, na przykład poprzez kontakt z rękami eksperymentatora (zwłaszcza jeśli niższe stężenia danego środka zapachowego dają większe reakcje niż wyższe stężenia); lub (iii) pogorszenie stanu zdrowia preparatu). W przypadku i) ryba powinna zostać sprawdzona pod kątem przemieszczenia; Jeśli tak, zmień jego położenie i dodaj więcej środka znieczulającego do wody i/lub podaj kolejną dawkę trietiodku galaminy. Odczekaj 5 minut i ponownie przetestuj standard. Jeśli odpowiedź jest nadal mniejsza, należy zmienić położenie elektrod i/lub rurki nosowej, aż zostanie zarejestrowana wystarczająco duża odpowiedź. W przypadku (ii) po prostu należy ponownie przygotować serię świeżych rozcieńczeń środka zapachowego, używając czystego szkła i wody. W przypadku (iii) należy sprawdzić, czy przepływ wody przez skrzela ryby jest odpowiedni, czy woda przepływa przez skrzela (tj. wypływa przez wieczko, a nie przez otwór gębowy) oraz czy woda jest dobrze napowietrzona. Różne gatunki ryb mają bardzo różne preferencje temperaturowe; zapewnić, aby laboratorium) (i temperatura wody mającej kontakt z rybami) była jak najbardziej zbliżona do temperatury, w której ryby są trzymane. Upewnij się również, że ryby nie są zestresowane i unikaj przenoszenia ich (nawet z jednego zbiornika do drugiego) przez co najmniej tydzień przed nagraniem. Szum elektryczny jest oczywiście zmorą życia elektrofizjologa; Jednak obecny artykuł nie jest odpowiednim medium do dyskusji o tym, jak to przezwyciężyć/zredukować. Niemniej jednak "The Axon Guide" (dostępny bezpłatnie w formacie PDF do pobrania ze strony producenta) jest źródłem praktycznych porad dotyczących minimalizacji hałasu. Gdy standardowa stymulacja wywoła dużą, stabilną odpowiedź, a szereg stężeń da zależny od stężenia wzrost amplitudy, przy minimalnej odpowiedzi na ślepą próbę, można rozpocząć rejestrowanie odpowiedzi na bodźce testowe. Niektórzy autorzy podają ten sam bodziec trzy razy i obliczają średnią arytmetyczną do późniejszej analizy danych. Są to jednak repliki techniczne, a takie podejście wydłuży czas sesji nagraniowej trzykrotnie. Obecni autorzy wolą testować dany środek zapachowy raz, ale zawsze w ramach krzywej stężenie-odpowiedź. Pozwala to nie tylko na obliczenie progu wykrywalności lub EC₅₀ (zgodnie z opisem), ale także zapewnia badanie stężeń bliskich stężeniom, których ryby doświadczyłyby w swoim naturalnym środowisku (nie zawsze jest to znane). Co więcej, wszelkie reakcje odstające, na przykład spowodowane zanieczyszczeniem, są łatwiejsze do wykrycia; W razie potrzeby można je następnie powtórzyć przy użyciu świeżo pobranej próbki.

Wielojednostkowy zapis z nerwu węchowego może być inwazyjny, ale jest bardziej czuły niż EOG, gdy jest rejestrowany w wodzie morskiej⁷, ponieważ jest niezależny od zewnętrznego zasolenia. Można go zatem wykorzystać do oceny wrażliwości węchowej na substancje zapachowe, takie jak wapń i sód, których zmiany stężeń również wpłynęłyby na przewodność, a w konsekwencji na zarejestrowane napięcia¹⁵. Jako oszacowanie liczby ORN reagujących na dany zapach (tj. potencjały czynnościowe przemieszczające się wzdłuż aksonów ORN od nabłonka węchowego do bańki), reprezentuje on surowy, nieprzetworzony sygnał (wstępne przetwarzanie bodźca węchowego rozpoczyna się w opuszkach). W związku z tym lepszym parametrem do oceny bezpośredniego wpływu zanieczyszczeń, takich jak metale ciężkie, oraz zmian środowiskowych, takich jak pH, na układ węchowy niż EOG czy EEG^24,25. Na zapis z opuszki węchowej w wodzie morskiej o wysokim pHCO₂ (a zatem o niskim pH) może mieć wpływ centralny wpływ pH na przetwarzanie nerwowe; "Teoria_receptora GABA A" zakwaszenia oceanów²⁶, w której obniżenie pH wody powoduje redystrybucję jonów Cl^- i HCO₃^- w płynie mózgowo-rdzeniowym, a w konsekwencji przesunięcie aktywacji GABA-ergicznej z hamującej (hiperpolaryzującej) na pobudzającą (depolaryzującą). Ponadto w takich badaniach ważne jest, aby ocenić skutki zakwaszenia lub zanieczyszczeń przy użyciu stężeń nawaniaczy podobnych do tych, z którymi ryby mogą się zetknąć w swoim naturalnym środowisku. W przypadku aminokwasów jest to zakres od nano do mikromolowych 27,28,29; blisko progu wykrywalności tych związków w rybach ^1,18. Oszacowanie progu wykrywalności danego środka zapachowego może dać pewne wyobrażenie o znaczeniu i/lub biologicznej roli wrażliwości węchowej. Na przykład minóg morski (Petromyzon marinus) ma wysoką wrażliwość węchową na określone kwasy żółciowe uwalniane przez larwy do progu ^10-13 M³⁰; Ta czułość pozwala dorosłym osobnikom zlokalizować i zidentyfikować odpowiednie tarliska, a tym samym działać jako feromon wędrowny na duże odległości. Podobnie dojrzałe samice minoga morskiego mają wysoką wrażliwość węchową na sperminę (próg ^10-14 M), poliaminę uwalnianą w mleczu przez samce, która następnie przyciąga je do gniazd plemników samców³¹. Inne ryby również wykazują wrażliwość węchową na poliaminy 32,33,34,35, ale nie z wystarczająco niskimi progami wykrywalności, aby wspierać podobną rolę feromonową; Zamiast tego sugeruje się unikanie rozkładających się ryb. Niemniej jednak, przy tak wysokiej wrażliwości węchowej, można sobie wyobrazić, że niewielkie zmniejszenie wrażliwości (tj. wzrost progu), nawet jeśli amplituda odpowiedzi nie jest dramatycznie zmniejszona, może spowodować poważne problemy dla ryb²⁴.

Przy wykreślaniu półlogarytmicznym krzywe stężenie-odpowiedź na substancje zapachowe mogą być wykładnicze, liniowe lub sigmoidalne¹⁸. W przypadku aminokwasów takie półlogarytmiczne krzywe stężenie-odpowiedź są albo liniowe (tj. logarytmiczne), sigmoidalne lub funkcje potęgowe⁷. To, że nie obserwuje się nasycenia odpowiedzi (tj. brak plateau na krzywej stężenie-odpowiedź, nawet przy stężeniach ponadśrodowiskowych) jest prawdopodobnie spowodowane wiązaniem się kilku receptorów z poszczególnymi aminokwasami, w zależności od ich stężenia, a nie wiązaniem się każdego aminokwasu z określonym receptorem; Wraz ze wzrostem stężenia danego aminokwasu, więcej receptorów jest w stanie go związać i tym samym zareagować. Niemniej jednak ryby potrafią rozróżniać mieszaniny aminokwasów 36,37,38,39; Jest to prawdopodobnie spowodowane kombinatorycznymi wzorcami aktywności wywoływanymi w opuszkach węchowych ^12,40; aksony wszystkich ORN wyrażających to samo białko receptorowe kończą się na tych samych kłębuszkach w opuszkach węchowych ^41,42, a jeden aminokwas może aktywować więcej niż jeden kłębuszek nerkowy.

Jednak wysoce specyficzne substancje zapachowe, takie jak feromony, mogą wywoływać sigmoidalne lub quasi-sigmoidalne krzywe stężenie-odpowiedź^43,44. Wniosek, choć nie przetestowany empirycznie, jest taki, że te reakcje węchowe są spowodowane wysoce specyficznymi receptorami, które wiążą cząsteczkę feromonu i niewiele więcej. W związku z tym powyżej danego stężenia wszystkie receptory są zajęte, a dalsze wzrosty nie będą wywoływać dalszych odpowiedzi w innych ORN. W związku z tym dane te można dopasować do trzyparametrowego wykresu Hilla, a maksymalną odpowiedź, EC₅₀ i współczynnik Hilla można obliczyć 15,45,46. Może to dostarczyć cennych informacji, takich jak pozorne powinowactwo i pozorna liczba receptorów, których nie mogą dostarczyć liniowe lub wykładnicze krzywe stężenie-odpowiedź.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Przedwzmacniacz prądu przemiennego	Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, Wielka Brytania)	NL104	Przedwzmacniacz Neurolog specjalnie zaprojektowany do tego typu nagrań.
Digidata	Molecular Devices, LLC. (San Jose, CA, USA)	1440A	Przetwornik analogowo-cyfrowy.
EMG Integrator	Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, Wielka Brytania)	NL703	Nieszczelny integrator elektryczny do integracji surowej aktywności nerwu.
Klatka Faradaya	Wykonana we własnym zakresie		W celu zmniejszenia hałasu elektrycznego.
Filter	Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, Wielka Brytania)	NL125/6	Moduł filtrujący do zapisu elektrofizjologicznego.
Trietiodek galaminy	Sigma-Aldrich (Portugalia)	G8134	Bloker nerwowo-mięśniowy
L-glutamina	Sigma-Aldrich (Portugalia)	G3126	Aminokwas stosowany jako środek zapachowy
L-leucyna	Sigma-Aldrich (Portugalia)	L80000	Aminokwas stosowany jako środek zapachowy
L-seryna	Sigma-Aldrich (Portugalia)	S4500	Aminokwas stosowany jako środek zapachowy
Metaliczny płyta bazowa	Dowolna		Stanowi podstawę dla mikromanipulatorów.
Rurki mikrohematokrytu	Dowolna		Do umiejscowienia dopływu wody do nabłonka węchowego
Mikromanipulatory	Narishige International Ltd (Londyn, Wielka Brytania)	M-152	Elektrody pozycyjne
MS222 (sól metanosulfonianu etylo-3-aminobenzoesanu)	Sigma-Aldrich (Portugalia)	E10505	Anestezjologiczna
sonda pH	Instrumenty Hanna (Pó voa de Varzim, Portugalia)	HI12302	Sonda do pomiaru pH wody.
Refraktometr	Hanna instrumenty (Pó voa de Varzim, Portugalia)	HI96822	Refraktometr do pomiaru zasolenia wody
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich (Portugalia)	746398	Do roztworu soli
Zawory elektromagnetyczne	The Lee Co. (Essex, CT, USA)	LFAA1201618H	Do przełączania między wodą tła a roztworami stymulacyjnymi (już niedostępnymi)
Mikroskop stereoskopowy	Zeiss, Leica, Olympus	Każdy odpowiedni model.	Do preparowania i umieszczania elektrod.
Titrator	Hanna (Pó voa de Varzim, Portugalia)	HI84531	Titrator do pomiaru zasadowości wody, pH i temperatury.
Mikroelektrody wolframowe 0,1 MΩ	World Precision Instruments (Hitchin, Wielka Brytania)	TM31A10	Elektrody zewnątrzkomórkowe.
Sterownik zaworu	Wykonane we własnym		źródle 12 V DC do obsługi zaworów elektromagnetycznych.
Pompa wodna (zatapialna)	Dowolna		Do dostarczania wody zawierającej środek znieczulający do skrzeli ryb.