Wychwytywanie środowiskowego DNA (eDNA) z próbek wody za pomocą flokulacji

Podsumowanie

Środowiskowe DNA (eDNA) jest zazwyczaj pobierane z próbek wody za pomocą wytrącania alkoholu, filtracji lub flokulacji. Przedstawiono tutaj alternatywny protokół, który wykorzystuje chlorek lantanu, aby umożliwić zbieranie rozpuszczonych i związanych z cząstkami kwasów nukleinowych z próbek wody zawierających komórki eukariotyczne, komórki prokariotyczne i wirusa.

Streszczenie

Analiza środowiskowego DNA (eDNA) stała się powszechnie stosowanym podejściem do rozwiązywania problemów w zarządzaniu gatunkami. Wykrywanie gatunków kryptycznych, w tym gatunków inwazyjnych i (lub) zagrożonych, jest celem, zwykle osiąganym poprzez badanie wody i osadów pod kątem obecności charakterystycznych sygnatur DNA. Potrzebne są niezawodne i skuteczne procedury wychwytywania eDNA, zwłaszcza te, które mogą być łatwo wykonane w terenie przez personel o ograniczonym przeszkoleniu i naukowców-amatorów. Wychwytywanie eDNA za pomocą filtracji membranowej jest obecnie szeroko stosowane. Takie podejście wiąże się z nieodłącznymi problemami, które obejmują wybór materiału filtracyjnego i porowatości, zanieczyszczenie filtra oraz czas potrzebny na miejscu do przeprowadzenia procesu. Flokulacja stanowi alternatywę, którą można łatwo wdrożyć i zastosować do systemów pobierania próbek, które mają na celu pokrycie szerokich terytoriów w ograniczonym czasie.

Wprowadzenie

Przed połową 2000 roku, termin "środowiskowe DNA" był powszechnie używany w odniesieniu do DNA uzyskanego z mikrobów wodnych i glebowych, chociaż rozpoczęły się pewne zastosowania do wykrywania ludzkiego i zwierzęcego DNA w celu śledzenia źródeł kału lub wykrywania gatunków obcych^1,2,3. Obecnie środowiskowe DNA jest powszechnie używane do opisywania DNA z komórek złuszczonych z organizmów eukariotycznych, a analiza tego DNA stała się szeroko stosowanym narzędziem zarządzania. Wykrywanie gatunków kryptycznych, w tym tych, które są inwazyjne lub zagrożone, jest celem, zwykle osiąganym poprzez badanie wody lub osadu na obecność charakterystycznych sygnatur DNA gatunku docelowego. Badania mogą koncentrować się na pojedynczym gatunku będącym przedmiotem zainteresowania przy użyciu określonego testu PCR (aktywne pobieranie próbek) lub wiele gatunków może być wykrywanych jednocześnie za pomocą metabarcodingu i masowo równoległego sekwencjonowania.

W ciągu ostatnich dwóch dekad dokonano wielu ulepszeń w zbieraniu próbek, przetwarzaniu próbek i analizie danych związanych z badaniami nad eDNA. We wczesnych badaniach wytrącano alkohol w celu wychwycenia DNA z próbek wody³. Chociaż jest to wypróbowane i prawdziwe, potrzeba analizy dużych objętości wody w celu zwiększenia czułości testu sprawia, że metoda ta jest nieatrakcyjna ze względu na typowe wymaganie dwóch objętości etanolu na każdą objętość próbki wody.

Późniejsze badania zazwyczaj stosowały filtrację membranową, racjonalizując, że eDNA jest obecne w kontinuum stanów od związanego z komórką do swobodnie rozpuszczonego, ale rozpuszczone DNA podlega szybkiej degradacji i dlatego DNA związane z komórką stanowi najbardziej znaczącą frakcję. Materiał filtracyjny i optymalizacja wielkości porów są szeroko dyskutowane i dyskutowane, podobnie jak optymalna metoda (metody) ekstrakcji wychwyconego eDNA z filtra^4,5,6.

Trzecim podejściem do przechwytywania eDNA jest flokulacja, proces używany od wieków do klarowania płynów, w tym wody, piwa i wina. W kilku badaniach wykorzystano flokulację do wychwytywania wirusa z naturalnych lub pitnych źródeł wody^7,8,9,10,11. W badaniach tych zazwyczaj stosowano wstępnie flokulowane mleko odtłuszczone lub chlorek żelaza jako środki wychwytujące. Metody chlorku żelaza zazwyczaj powodują problemy molekularne z dalszą analizą z powodu zahamowania reakcji PCR^12,13. Metody wykorzystujące wstępnie flokulowane mleko odtłuszczone wymagają wcześniejszego przygotowania flokulantu, kontroli pH, a do tej pory były stosowane tylko do wychwytywania wirusa^7,8,9.

Ostatnio badano wychwytywanie bakterii i wirusów metodą flokulacji za pomocą chlorku lantanu (III)^12,13,14,15. Autorzy wykazali, że za pomocą tej metody można zebrać żywe patogeny, ponieważ wiązanie chlorku lantanu było skuteczne przy niskim stężeniu (0,2 mM). Ponadto flokulacja lantanu jest odwracalna poprzez chelatację w łagodnych warunkach, w przeciwieństwie do chlorku żelaza.

Tak więc, flokulacja z użyciem chlorku lantanu do wychwytywania cząstek biologicznych jest atrakcyjna, biorąc pod uwagę, że wymagana jest tylko niewielka ilość dodanego skoncentrowanego środka flokulacyjnego, nie jest potrzebna ścisła kontrola pH, a objętości próbek są skalowalne od mililitrów do galonów. W przypadku wychwytywania eDNA, komórkowe, subkomórkowe (mitochondria i chloroplasty), a także rozpuszczone DNA są łatwo odzyskiwane. Bakterie i wirusy są zbierane jednocześnie, co pozwala na testowanie patogenów i (lub) dodatkowe badania ekologiczne z jednej próbki wody. Przedstawiono protokół flokulacji z wykorzystaniem chlorku lantanu, który umożliwia zbieranie rozpuszczonych i związanych z cząstkami kwasów nukleinowych z próbek wody.

Protokół

1. Dekontaminacja sprzętu i przygotowanie odczynnika flokulacyjnego

1. Dokładnie umyj wszystkie butelki, rurki i inny wcześniej używany sprzęt płynem do mycia naczyń i gorącą wodą.
2. Spryskaj wszystkie butelki, rurki i inny wcześniej używany sprzęt 6% roztworem kwasu cytrynowego, aby usunąć osady mineralne, odstaw na 20 minut i spłucz wodą z kranu.
3. Dodaj roztwór 10-krotnie rozcieńczonego wybielacza domowego (0,5-0,6% końcowego stężenia podchlorynu sodu) do wszystkich butelek (około 10% objętości pojemnika), wstrząśnij, odstaw na co najmniej 1 godzinę, a następnie odcedź i spłucz wodą z kranu, aż nie pozostanie ślad wybielacza. Następnie spłucz raz wodą dejonizowaną.
4. Wysuszyć wszystkie butelki.
5. Umieść wszystkie butelki i nakrętki do zbierania w komorze bezpieczeństwa biologicznego i naświetlaj za pomocą ultrafioletowych lamp bakteriobójczych przez 2 godziny, obracając każdą butelkę i nakrętkę o ćwierć obrotu co pół godziny.
6. Umieść nakrętki na butelkach i luźno dokręć. Zważ każdą butelkę i zapisz jej pustą masę na butelce.
7. Przygotować 100 mM roztwór siedmiowodnego chlorku lantanu (III), rozpuszczając 3,71 g w 100 ml wody dejonizowanej. Aby zminimalizować narażenie substancji chemicznej na działanie powietrza, ponieważ chlorek lantanu jest higroskopijny, należy uszczelnić butelkę taśmą między użyciami.
   UWAGA: Chlorek lantanu jest opatrzony ostrzeżeniem ostrzegawczym zwrotem wskazującym rodzaj zagrożenia. H315 działa drażniąco na skórę. H319 działa drażniąco na oczy. H335 może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Stosować środki ochrony osobistej. Więcej informacji można znaleźć w karcie charakterystyki materiału.
8. Przygotować 1 M roztwór wodorowęglanu sodu, rozpuszczając 84,01 g wodorowęglanu sodu w 1 l wody dejonizowanej. Przefiltruj, wysterylizuj i przechowuj w temperaturze pokojowej.

2. Pobieranie próbek i flokulacja

1. Pobrać próbki z każdego miejsca oraz jedną ślepą próbę polową (próbkę zawierającą wodę pitną, napełnioną na miejscu w celu kontroli zanieczyszczenia), napełniając butelki o odpowiedniej wielkości. Dostosuj liczbę pobieranych próbek zgodnie z planem doświadczenia i zamierzonym celem. Nie należy przepełniać butelek poza krawędź butelki, aby umożliwić rozszerzanie się, jeśli próbki mają zostać zamrożone.
2. Rejestruj odpowiednie metadane, w tym datę, godzinę i lokalizację GPS. Oznacz pojemniki na próbki.
3. Dodać 1 M roztwór wodorowęglanu sodu do każdej próbki i ślepej próby polowej. Dodać 10 ml na 500 ml próbki.
4. Zakręć butelki i wymieszaj.
5. Dodać 100 mM chlorku lantanu do każdej próbki i pójść ślepą próbą. Dodać 1 ml na 500 ml próbki.
6. Zakręć i dokładnie wymieszaj. Użyj taśmy elektrycznej, aby zabezpieczyć nasadkę.
7. Przechowywać na lodzie do czasu powrotu do laboratorium polowego, następnie próbki mogą być przechowywane przez noc w lodówce i w pozycji pionowej, aby kłaczki mogły osiąść na dnie pojemnika, lub zamrożone w temperaturze -20 °C w celu wysyłki do drugiego laboratorium w celu dalszego przetwarzania. Próbki muszą być zamrażane w pozycji pionowej, aby umożliwić rozszerzanie się cieczy i zapobiec pęknięciu pojemnika.

3. Przetwarzanie kłaczków

1. Zamrożone próbki należy rozmrozić w temperaturze pokojowej w chłodziarce lub przenieść próbki, które nie zostały zamrożone, do odpowiedniego obszaru stołu warsztatowego, który obejmuje pompę perystatyczną i rurki do aspiracji supernatantów próbki. Upewnij się, że rurka biegnąca przez pompę perystaltyczną odprowadza się do dużego wiadra na podłodze. Ujęcie powinno być wyposażone w czystą, plastikową słomkę do picia w celu kontrolowania poboru.
2. Użyj pompy perystaltycznej, aby usunąć supernatant, używając słomki do picia, aby skierować ssanie najpierw tuż pod powierzchnię cieczy i przesuwając wlot słomki w dół wraz z poziomem cieczy. Usunąć resztki supernatantu, ostrożnie przesuwając wlot tak, aby spoczął na pontylu (wypukłe wgłębienie w dnie butelki). Pozwala to na maksymalne usunięcie cieczy, podczas gdy kłaczki gromadzą się na obrzeżach (patrz Rysunek 1).

Rysunek 1: Zbiór kłaczków osadzonych przy jednostkowym ciężarze ciężkości. Floki zawierające materiał komórkowy i eDNA osadza się na dnie butelki z próbką i są one gotowe do odzyskania po usunięciu supernatantu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Dołączyć czystą słomkę do picia i powtórzyć usuwanie sklarowanego osadu dla każdej próbki.
4. Użyj czystej pipety o pojemności 20 ml i kontrolera pipet, aby całkowicie przenieść zawiesinę kłaczków do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Używaj płukanek wodą dejonizowaną o małej objętości (około 5 ml), aby upewnić się, że wszelkie resztki kłaczków zostały odzyskane z butelki na próbkę.
5. Ustawić wszystkie probówki o pojemności 50 ml do równych objętości wodą dejonizowaną i zebrać kłaczki przez odwirowanie przy 2 500 x g przez 20 minut.
6. Odlej sklarowany osad i ustaw probówki odwrócone na czystym ręczniku papierowym, aby odsączyć.
7. Zawiesić kłaczki w 1 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 przez mieszanie wirowe, a następnie dodać 4 ml 1x roztwór TE o pH 8,0 i ponownie wymieszać. Przenieść zawieszone kłaczki do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, dodać 50 μl 10% liniowego poliakrylamidu i odwirować. Dodaj 5 ml 100% izopropanolu, wymieszaj i odstaw na lód na 20 minut.
8. Wirować przy 6 000 x g przez 20 minut w celu zebrania DNA i cząstek komórkowych. Odlej supernatanty i pozostaw do odwrócenia na czystych ręcznikach papierowych do odsączenia. Pozostawić do lekkiego wyschnięcia, ale nie przesuszać.
9. Rozpocznij proces ekstrakcji DNA kłaczków za pomocą komercyjnego zestawu, który wykorzystuje ubijanie kulek i wiązanie kolumny wirowej o pojemności 25 μg.
   1. Najpierw ponownie zawiesić kłaczki w 800 μl buforu do lizy dostarczonego z zestawem i całkowicie przenieść zawiesinę do rurki do ubijania kulek. Koralik pokonał zawieszenie kłaczków w krótkim czasie z chłodzeniem pomiędzy. Homogenaty mogą być przechowywane w tym momencie w stanie zamrożonym lub zgodnie z protokołem zestawu.
   2. Najpierw wyeluować DNA z kolumny wirowej za pomocą 100 μl, a następnie poddać recyklingowi eluat przez rurkę wirową.
   3. Na koniec wymyć resztki DNA z kolumny za pomocą dodatkowych 100 μl podwielokrotności buforu elucyjnego, aby uzyskać całkowitą objętość 200 μl. To maksymalizuje regenerację.
10. Zbierz, przygotuj i przeanalizuj eDNA, aby zademonstrować skuteczność tego protokołu i jego wydajność w stosunku do powszechnie stosowanej metody filtracji.
    1. Przygotuj reakcje, które zawierają 1x qPCR master mix, 25 μg/ml trombiny bydlęcej ^14,16, 0,4 μM starterów do przodu i do tyłu oraz 2 μL matrycy (1% odzyskanego próbki DNA). Skonstruować krzywe wzorcowe przy użyciu seryjnych rozcieńczeń oczyszczonych i ilościowo oczyszczonych amplikonów PCR wygenerowanych przy użyciu vouchera DNA. Alternatywnie, cele mogą być syntetyzowane komercyjnie.
    2. Należy zastosować porównawczą metodę kwantyfikacji, jeśli nie jest dostępna żadna norma. W tym przykładzie należy przeprowadzić cykl termiczny w warunkach reakcji 95 °C przez 10 minut, a następnie 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 10 s, 57 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s, chociaż warunki te należy dostosować do innych testów. Analizuj dane za pomocą oprogramowania producenta.

Wyniki

Osiem próbek wody o pojemności 500 ml (po 450 ml każda) pobranych z akwarium, w którym znajdują się dwa żółwie malowane ze Wschodu (Chrysemys picta picta) zostało użytych do przygotowania eDNA przy użyciu opisanego protokołu. Kolejne osiem próbek wody o pojemności 500 ml przefiltrowano przez 47-milimetrowe filtry z włókna szklanego o porowatości 1,5 μm, bez spoiwa, a eDNA wyekstrahowano przy użyciu tej samej metody ekstrakcji, która została użyta w protokole flokulacji. DNA przygotowane przy użyciu obu metod ana...

Dyskusja

Chociaż ta technika jest prosta, niektóre kroki mają kluczowe znaczenie dla sukcesu. Pobieranie i przenoszenie kłaczków musi być wykonane w całości, aby nie doszło do utraty DNA. Resztki materiału należy zebrać za pomocą płukania strategicznego. Opisany protokół wykorzystuje komercyjny zestaw do ekstrakcji DNA do końcowego przetwarzania flokulowanego materiału. Inne metody ekstrakcji mogą działać podobnie lub mogą być lepsze pod względem wydajności, ale modyfikacje tej części protokołu nie zostały wyczerpująco przetestow...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,5 M EDTA, pH 8,0	Dostępne z kilku źródeł
1 x bufor TE, pH 8,0	Dostępne z kilku źródeł
15 ml stożkowe probówki wirówkowe	Jednorazowe
	z czyszczeniem i odkażaniem
38/400 Polipropylenowa nakrętka z czułością na nacisk Wkładka	Pozostaw nakrętki luźno przymocowane do czasu użycia. Zakryj szczelnie, aby uszczelnić wkładkę wrażliwą na nacisk.
Stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml Jednorazowe
zastosowanie 6% roztworu kwasu cytrynowego Służy	do usuwania osadów mineralnych z butelek wielokrotnego użytku na próbki.
Zestaw do usuwania mikroorganizmów kałowych/glebowych	Użyj żywicy lub kolumny
Chlorek lantanu (III) siedmiowodny	100 mM Roztwór
Perystaltyczna pompa prądu stałego	Każda pompa perystaltyczna zrobi to lub może być syfonowana
Nośnik poliakrylowy	10% liniowy poliakrylamid
Wodorowęglan	sodu1 M, filtr sterylizowany i przechowywany w temperaturze

komercyjnychkomercyjnych 16 uncji Przezroczyste kwadratowe butelki PET wielokrotnego użytku do usuwania inhibitorówpodstawowy pokojowej