Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Eliminacja neuronów serotoninergicznych przez stereotaktyczne wstrzyknięcie 5,7-dihydroksytryptaminy do jąder szwu grzbietowego myszy

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60968

⸱

1 maja 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Regenerative Medicine, Shanghai East Hospital, Frontier Science Center for Stem Cell Research, School of Life Sciences and Technology, Tongji University, 2Department of Ophthalmology, Shanghai Tenth People's Hospital Affiliated to Tongji University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje model myszy uszkodzony jądrem szwu grzbietowego (DRN) (>90% przeżywalności u myszy eksperymentalnych) ze stabilną utratą neuronów serotoninergicznych szwu grzbietowego przez stereotaktyczne wstrzyknięcie 5,7-dihydroksytryptaminy do DRN przy użyciu podejścia kątowego, aby zapobiec uszkodzeniu zatoki strzałkowej górnej.

Streszczenie

Stereotaktyczne wstrzykiwanie jest szeroko stosowane do bezpośredniego dostarczania związków lub wirusów do wybranych obszarów mózgu u gryzoni. Bezpośrednie celowanie w neurony serotoninergiczne w jądrze szwu grzbietowego (DRN) może powodować nadmierne krwawienie i śmierć zwierzęcia, ze względu na jego lokalizację poniżej zatoki strzałkowej górnej (SSS). Protokół ten opisuje generowanie mysiego modelu myszy z uszkodzeniem neuronów serotoninergicznych DRN (wskaźnik przeżycia >90%) ze stabilną utratą >70% komórek 5-HT-dodatnich w DRN. Zmiana jest indukowana przez stereotaktyczne wstrzyknięcie selektywnej neurotoksyny serotoninergicznej 5,7-dihydroksytryptaminy (5,7-DHT) do DRN przy użyciu podejścia pod kątem (30° w kierunku przednim/tylnym) w celu uniknięcia uszkodzenia SSS. Myszy z uszkodzeniem neuronów serotoninergicznych DRN wykazują zmiany w zachowaniu związane z lękiem, co pomaga potwierdzić powodzenie operacji uszkodzenia DRN. Metoda ta jest stosowana w przypadku zmian DRN, ale może być również stosowana do innych iniekcji stereotaktycznych, które wymagają iniekcji kątowych, aby uniknąć struktur linii środkowej. Ten mysi model DRN z uszkodzeniem neuronu serotoninergicznego stanowi cenne narzędzie do zrozumienia roli neuronów serotoninergicznych w patogenezie zaburzeń psychicznych, takich jak zespół lęku uogólnionego i duże zaburzenie depresyjne.

Wprowadzenie

Serotonina, czyli 5-hydroksytryptamina (5-HT), jest ważnym neuroprzekaźnikiem wytwarzanym głównie w jelitach i mózgu i wpływa na różne funkcje psychologiczne. W ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) układ serotoninergiczny odgrywa kluczową rolę w regulacji nastroju i zachowań społecznych, snu i czuwania, apetytu, pamięci i pożądania seksualnego. W OUN serotonina jest syntetyzowana przez neurony serotoninergiczne, które można podzielić na następujące dwie grupy: grupę rostralną, która ma wznoszące się projekcje unerwiające praktycznie cały mózg; oraz grupa ogonowa, która głównie rzutuje na rdzeń kręgowy1. Grupa rostralna, która zawiera około 85% neuronów serotoninergicznych w mózgu, składa się z ogonowego jądra liniowego, środkowego jądra szwu i DRN, w którym znajduje się największa populacja neuronów serotoninergicznych w mózgu.

Powszechnie uważa się, że dysregulacja układu serotoninergicznego jest związana z patogenezą dużego zaburzenia depresyjnego (MDD) i zaburzeń lęku uogólnionego ()2. Wynika to z faktu, że selektywne inhibitory wychwytu zwrotnego serotoniny (SSRI) są skutecznym leczeniem farmakologicznym tych zaburzeń psychicznych3,4. Ponadto zgromadzone dowody sugerują, że mania5 i zachowania samobójcze6 mogą być związane z niższym poziomem funkcjonowania serotoniny w DRN. Doniesiono również, że Pet1-Cre; Myszy Lmx1bflox/flox i myszy hTM-DTAiPet1 (genetyczne modele myszy pozbawione większości centralnych neuronów serotoninergicznych z późnego stadium embrionalnego7 i adulthood8, odpowiednio) wykazują wzmocnioną kontekstową pamięć strachu. Jednak pomimo szeroko zakrojonych badań, dokładny udział neuronów serotoninergicznych DRN w tych zaburzeniach psychicznych pozostaje niewyjaśniony.

W celu zbadania mechanizmów, za pomocą których neurony serotoninergiczne DRN regulują patogenezę zaburzeń psychicznych związanych z serotoniną, stworzono modele zwierzęce. Narzędzia optogenetyczne zostały zastosowane do hamowania neuronów serotoninergicznych u szczurów DRN, a zwierzęta te wykazują zwiększone zachowania podobne do lęku9. Optogenetyka ma jednak swoje ograniczenia. Na przykład urządzenie dostarczające światło musi zostać wszczepione w docelowy obszar głęboko w mózgu, a otaczająca tkanka może zostać uszkodzona podczas operacji implantacji lub przez ciepło emitowane przez urządzenie świetlne. Nawet jeśli zmiana temperatury może nie spowodować wykrywalnego uszkodzenia tkanki mózgowej, nadal może wywołać niezwykłe efekty fizjologiczne i behawioralne10.

Manipulacja farmakologiczna może być łatwiejszym podejściem do tworzenia modeli zwierzęcych z uszkodzeniami neuronów serotoninergicznych DRN. Niektóre grupy wygenerowały szczury z uszkodzeniem neuronów serotoninergicznych DRN przez stereotaktyczne mikrowstrzyknięcie neurotoksyny serotoninowej 5,7-DHT do DRN. Jednak te modele szczurów wykazują różne zmiany behawioralne, takie jak zachowanie anksjolityczne11, zwiększone zachowanie podobne do lęku12 i upośledzona pamięć obiektowa13. Pomimo wielu badań na szczurach, przeprowadzono mniej badań nad wpływem 5,7-DHT na myszy. Jedna grupa zgłosiła nadmierną śmiertelność (>50%) i ograniczony niedobór serotoniny u myszy eksperymentalnych, które otrzymały stereotaktyczne mikrozastrzyki 5,7-DHT w klasie DRN14. Inna grupa zgłosiła, że nieprzewidywalny przewlekły łagodny stres (UCMS) może wywołać znaczącą zmianę opóźnienia ataku u myszy z uszkodzeniem DRN wywołanym przez 5,7-DHT. Nie dostarczono jednak żadnych wyników histologicznych, które potwierdziłyby dokładną utratę neuronów serotoninergicznych w klasie DRN15. Stereotaktyczne wstrzyknięcie do DRN przy użyciu standardowych procedur może prowadzić do masywnego krwawienia i wysokiej śmiertelności u myszy, biorąc pod uwagę fakt, że anatomiczna lokalizacja DRN jest poniżej SSS16.

Ten protokół opisuje protokół generowania modelu myszy z uszkodzeniem neuronów serotoninergicznych DRN (>90% przeżywalności myszy eksperymentalnych) ze stabilną utratą neuronów serotoninergicznych DRN przez stereotaktyczne wstrzyknięcie 5,7-DHT. Wtrysk w DRN wykorzystuje podejście kątowe, aby zapobiec uszkodzeniu SSS. Ta operacja konsekwentnie powoduje >70% utratę neuronu serotoninergicznego w DRN myszy i powoduje zmiany w zachowaniu związane z lękiem. Zastosowany tutaj protokół służy do indukowania zmian DRN, ale może być również przydatny dla badaczy, którzy chcą wykonać zastrzyki stereotaktyczne w innych strukturach linii środkowej. Ponadto ten mysi model DRN z uszkodzeniem neuronów serotoninergicznych stanowi cenne narzędzie do zrozumienia roli neuronów serotoninergicznych w zaburzeniach psychicznych (tj. MDD i) oraz oceny potencjalnych środków neuroprotekcyjnych lub strategii terapeutycznych dla tych schorzeń.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie interwencje chirurgiczne i procedury opieki nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Zwierząt Szkoły Nauk Przyrodniczych i Technologii, Uniwersytet Tongji, Szanghaj, Chiny.

1. Trzymanie zwierząt

  1. Utrzymuj samce myszy C57BL/6NCrl (10 tygodni, 25 g, n = 21) w standardowych warunkach (temperatura 24 °C; 55% wilgotności) w cyklu 12 godzin/12 godzin światła/ciemności.
  2. Zapewnij jedzenie i wodę ad libitum.
    UWAGA: W tym przypadku trzy myszy są używane do potwierdzania ścieżki igły.

2. Przygotowanie odczynników

UWAGA: Wszystkie etapy przygotowania leku muszą być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia. Wszystkie przygotowane roztwory są przechowywane w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Zaleca się stosowanie jednej porcji na raz, całkowite rozmrożenie, dokładne wymieszanie przed użyciem, wyrzucenie resztek z probówki i unikanie wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.

  1. Rozpuścić 0,25 g chlorowodorku dezypraminy w 100 ml 0,9% soli fizjologicznej, aby otrzymać roztwór o stężeniu 2,5 mg/ml. Wysterylizuj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego z hydrofilową membraną PES o wielkości porów 0,22 μm. Następnie porcję roztworu (1,8 ml/probówkę) rozmieścić w probówkach do mikrowirówek (EP) o pojemności 2 ml. Oznacz etykietą, datuj i natychmiast przechowuj w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Zalecana dawka dla zwierząt wynosi 25 mg/kg.
  2. Rozpuścić 5 mg 5,7-DHT w 1,67 ml 0,9% soli fizjologicznej zawierającej 0,1% kwasu askorbinowego, aby otrzymać roztwór o stężeniu 3 μg/μl. Delikatnie przemieszać, wysterylizować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego (wielkość porów 0,22 μm) i poddzielić roztwór (10 μl/probówkę) do probówek EP o pojemności 0,5 ml. Natychmiast oznaczyć etykietą, datować i zamrażać w temperaturze -80 °C. Zalecana dawka dla zwierząt to 2 μl/mysz.
  3. Rozpuść ketoprofen (środek przeciwbólowy) zgodnie z wcześniej opisaną metodą17. Rozpuść 250 mg ketoprofenu w 15 ml wody i 1 ml 1 M NaOH, dostosuj pH do 7,3 i uzupełnij końcową objętość do 125 ml, co da końcowe stężenie 2 mg / ml. Wysterylizować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm i podzielić roztwór (0,4 ml / probówkę) do probówek EP o pojemności 1,5 ml. Oznaczyć etykietą, datować i zamrażać w temperaturze -80 °C do czasu użycia. Zalecana dawka dla zwierząt wynosi 5 mg/kg.

3. Przygotowanie instrumentów i myszy

  1. Przygotuj pakiet chirurgiczny (zawierający skalpel, parę kleszczyków do tkanek, parę nożyczek, uchwyt na igłę, szwy 3-0, kolczyki i aplikator do kolczyków) uprzednio wysterylizowany w autoklawach wysokotemperaturowych. Umieść 75% etanolu, jodu powidonu, 3% nadtlenku wodoru, roztwór nośnika (0,1% kwasu askorbinowego w 0,9% soli fizjologicznej), bawełniany wacik, maść do oczu ofloksacyny i klatkę regeneracyjną dla myszy na poduszce grzewczej, używając strzykawki Hamilton z igłą 32 G i strzykawką o pojemności 1 cm3.
  2. h przed wstrzyknięciem 5,7-DHT zważyć i zapisać masę ciała myszy, a następnie poddać je dootrzewnowym (i.p.) wstrzyknięciom dezypraminy (2,5 mg / ml, 10 μl / g wagy).
    UWAGA: Celem podania dezypraminy na 1 godzinę przed wstrzyknięciem 5,7-DHT jest zapobieganie utracie komórek katacholaminergicznych18.
  3. Znieczulenie myszy za pomocą znieczulenia wziewnego izofluranem (3% podczas indukcji, 1,5% podczas konserwacji, natężenie przepływu = 2 l/min). Ketoprofen (2 mg/ml, 2,5 μl/g masy) należy podawać we wstrzyknięciu podskórnym (podskórnie). Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia przy braku reakcji na uszczypnięcie ogona.

4. Stereotaktyczne wstrzykiwanie

  1. Umieść znieczuloną mysz na platformie stereotaktycznej, a następnie przymocuj jej głowę do nauszników i siekaczy aparatu stereotaktycznego.
  2. Ogol głowę myszy, a następnie oczyść odsłoniętą skórę głowy jednym peelingiem z 75% etanolu, a następnie jednym peelingiem z jodowidonu.
  3. Nałóż maść z lidokainą na skórę głowy za pomocą bawełnianego wacika, aby zapewnić miejscowe działanie przeciwbólowe. Nałóż maść do oczu z ofloksacyną na oczy, aby chronić rogówkę.
  4. Wykonaj nacięcie na skórze głowy wzdłuż linii środkowej za pomocą skalpela od 1 mm z tyłu do oczu do linii międzyusznej.
  5. Użyj wacika nasączonego 3% wodą utlenioną, aby usunąć okostną, a następnie osusz czaszkę i odsłoń szwy czaszkowe. Zaznacz położenie bregmy i lambdy.
  6. Wyreguluj pozycję głowy za pomocą siekacza, aż bregma i lambda będą leżeć w tej samej płaszczyźnie poziomej. Wyreguluj końcówkę igły, aby dotykała bregmy lub lambdy, zapisz współrzędne przyśrodkowe / boczne (ML) i grzbietowe / brzuszne (DV) i wyreguluj siekacz tak, aby współrzędne DV i ML bregmy i lambdy były odpowiednio równe.
  7. Odblokuj przycisk pozycjonowania prostopadłego i blokującą, a następnie ustaw ramię manipulatora (oś z) na 30° w kierunku przednim/tylnym (AP), jak pokazano na Rysunek 1A,B. Zablokuj przycisk.
  8. Zamocować strzykawkę Hamilton wypełnioną 2 μl 5,7-DHT (3 μg/μL) na uchwycie (w przypadku grupy pozorowanej myszom wstrzykuje się 0,9% soli fizjologicznej zawierającej 0,1% kwasu askorbinowego). Wyreguluj końcówkę igły, aby dotknąć punktu orientacyjnego bregma, a następnie wyzeruj wartości ML, AP i DV za pomocą modułu wyświetlacza cyfrowego.
    UWAGA: Roztwór 5,7-DHT jest płynem o brązowym zabarwieniu, co ułatwia określenie, czy strzykawka Hamilton jest prawidłowo napełniona. Jeśli nie ma dostępu do modułu wyświetlacza cyfrowego, zapisz liczbę wyświetlaną na trzech osiach, gdy końcówka igły dotyka bregmy, a końcowe współrzędne reprezentują "zarejestrowaną liczbę plus współrzędną podaną w tym protokole". Na przykład, jeśli zapisany numer na ramieniu manipulatora osi y (kierunek A/P) to "a", to końcowa współrzędna w kierunku A/P powinna wynosić "a - 6,27".
  9. Przesuń ramię manipulatora, aby ustawić końcówkę igły w pozycji wtrysku (APa = -6,27, ML = 0; wzór na obliczenie końcowych współrzędnych jest podany w Rysunek 1B). Zaznacz pozycję docelową za pomocą markera.
  10. Wywierć otwór na zadziory za pomocą przenośnej wiertarki szybkoobrotowej z mikrosilnikiem, a następnie przesuń ramię manipulatora, aby opuścić końcówkę igły do celu (DVa = -4,04). Powoli wstrzyknąć 2 μl roztworu do mózgu (0,5 μl/3 min), trzymając igłę na miejscu przez dodatkowe 5 minut, aby zapobiec wyciekowi roztworu. Po wstrzyknięciu należy delikatnie usunąć igłę.
  11. Zakładać szwy przerywane na nacięcie za pomocą szwów 3-0. Owiń zszyte nacięcie bawełnianym wacikiem nasączonym jodonem, aby uniknąć infekcji.
  12. Wyczyść prawe ucho wacikiem z jodonu i jasnotem, a następnie przyłóż wysterylizowany kolczyk do podstawy ucha w celu identyfikacji.
  13. Usuń myszy eksperymentalne z aparatu stereotaktycznego i umieść je w klatce odzyskiwania myszy na poduszce grzewczej, aż do momentu pełnego wyzdrowienia ze znieczulenia.

5. Opieka pooperacyjna nad myszami

  1. Poddaj myszy wstrzyknięciom ketoprofenu 1x/dobę do 2 dni po zabiegu.
  2. Sprawdzaj myszy codziennie do 7 dni po zabiegu.

6. Test labiryntu z podwyższonym poziomem litery T

UWAGA: Wykonaj test zgodnie z wcześniejszym opisem19,20.

  1. Upewnij się, że test podwyższonego labiryntu T (ETM) składa się z dwóch otwartych ramion (30 cm x 5 cm x 0.5 cm) prostopadłych do dwóch zamkniętych ramion (30 cm x 5 cm x 16 cm x 0.5 cm) z platformą środkową (5.0 cm x 5.0 cm x 0.5 cm). Jedno z zamkniętych ramion jest blokowane przez nieprzezroczystą folię z tworzywa sztucznego, tworząc kształt litery T (Rysunek 2A).
  2. Trzy dni przed badaniem ETM należy przyzwyczaić zwierzęta do codziennej pracy przez 5 minut.
  3. W 30 dobie po zabiegu należy wykonać test ETM.
  4. W dniu testów behawioralnych wystawiaj myszy na działanie jednego z otwartych ramion przez 10 minut.
  5. W celu przeprowadzenia testów unikania hamowania, umieść każdą mysz w dystalnym końcu zamkniętego ramienia i zapisz czas potrzebny do opuszczenia tego ramienia czterema łapami w trzech próbach. Pierwsze badanie to unikanie linii bazowej, drugie badanie to unikanie 1, a trzecie badanie to unikanie 2.
  6. Trzymaj myszy w klatkach przez 30 s między szlakami i ustal czas graniczny (tutaj 300 s jest używane dla każdej próby).

7. Perfuzja, fiksacja, barwienie immunohistochemiczne i kwantyfikacja

  1. Pod koniec badania (35 dni po operacji, po teście behawioralnym) wykonaj perfuzję i fiksację całego ciała, gdy mysz jest w znieczuleniu ogólnym.
    1. Znieczulij mysz zgodnie z opisem w kroku 3.3. Umieść głęboko znieczuloną mysz w pozycji leżącej grzbietowej.
    2. Zwilż sierść 75% alkoholem na całej powierzchni brzusznej.
    3. Wykonaj cięcie poniżej mostka, a następnie nacięcie w kształcie litery V w klatce piersiowej. Chwyć klatkę piersiową za pomocą zacisku, aby odsłonić serce.
    4. Wprowadzić igłę do infuzji żylnej do lewej komory, a następnie natychmiast przeciąć wyrostek przedsionka nożyczkami, aby umożliwić odpływ krwi.
    5. Włącz pompę perystaltyczną, aby wprowadzić sól fizjologiczną do całego ciała przez układ krążenia. Zamień sól fizjologiczną na 4% paraformaldehyd (PFA), gdy płyn wychodzący z prawego przedsionka stanie się przezroczysty i gdy wątroba zmieni kolor z czerwonego na bladoczerwony. Wykonaj kolejne 5 ml 4% PFA, gdy ogon myszy porusza się, a ciało jest sztywne.
      UWAGA: Kołysanie ogona myszy jest oznaką odpowiedniej perfuzji.
  2. Izolacja mózgu po perfuzji wewnątrzsercowej z 4% PFA
    1. Odetnij głowę myszy dużymi nożyczkami, a następnie przetnij skórę, aby odsłonić czaszkę.
    2. Wykonaj dwa nacięcia u podstawy czaszki (połączone z szyją), wykonaj jedno cięcie wzdłuż linii łączącej oczy, a następnie przetnij czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego. Chwyć i oderwij czaszkę każdej półkuli na zewnątrz, aby odsłonić mózg za pomocą kleszczy.
      UWAGA: Przecięcie czaszki wzdłuż szwu strzałkowego należy wykonać ostrożnie, w przeciwnym razie mózg może zostać uszkodzony i podzielony na części.
    3. Usuń mózg i umieść go w 4% PFA w temperaturze 4 °C na noc w celu późniejszego utrwalenia, a następnie przenieś mózg do 30% sacharozy, aż opadnie na dno.
      UWAGA: Odwodnienie przy użyciu 30% sacharozy nie jest konieczne, jeśli skrawki są cięte wibratomem.
  3. Wchłoń nadmiar płynu wokół chusteczki za pomocą ręcznika papierowego przed osadzeniem. Osadź tkankę mózgową w OCT z twarzą rostralną na uchwycie.
    UWAGA: Orientacja próbki jest ważna. Rostralna powierzchnia mózgu musi być przymocowana do uchwytu, aby upewnić się, że krawędź tnąca jest częścią ogonową.
  4. Wyciąć przekrój koronalny DRN (4,0–4,8 mm z tyłu od bregmy) o grubości 30 μm (odstępy czteroczęściowe) za pomocą kriostatu i zebrać skrawki w PBS. Przechowywać w roztworze do kriokonserwacji sekcji mózgu (SCS) w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Identyfikacja DRN jest bardzo ważna. Kolejne struktury anatomiczne są pokazane jako Rysunek 3A–H. Charakterystyczne struktury są następujące: boczne zagłębienie czwartej komory (LR4V, czerwona linia przerywana w Rysunek 3A,E), czwarta komora (4V, czerwony trójkąt kreskowy w Rysunek 3B,F), drugi płat móżdżku (2Cb, czerwona kreska w kształcie rombu w Rysunek 3C/G) i akwedukt (Aq, czerwona kreska w Rysunek 3D,H). Rozpocznij zbieranie tkanek, gdy obserwuje się struktury, jak pokazano na Rysunek 3D,H, a następnie tnij na odcinki o grubości 30 μm (odstępy czteroczęściowe), aby uzyskać łącznie 24 przekroje koronalne. Barwienie H&E przekrojów pokazano w (Rysunek 3E–H). Czwarta sekcja każdej z czterech sekcji zostanie wybrana do wykonania barwienia immunofluorescencyjnego. Pozostałe sekcje są przechowywane w SCS. W przypadku trudności z rozpoznaniem konstrukcji pomocny jest montaż jednej sztuki sekcji na zjeżdżalni.
  5. Wykonaj test immunohistochemiczny zgodnie z wcześniejszym opisem21,22.
  6. Policz komórki 5-HT-dodatnie na różnych poziomach sekcji w całym DRN za pomocą ImageJ.

8. Analiza statystyczna

  1. Korzystaj z oprogramowania statystycznego do analizy danych. Wyraź wyniki jako środki ± SEM.
  2. Przetwarzaj wartości do analizy statystycznej za pomocą dwuczynnikowego testu ANOVA lub niesparowanego testu t i rozważ różnice istotne przy **p < 0,01.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W sekcji koronalnej, lokalizacja DRN znajduje się tuż poniżej SSS i akweduktu (Rysunek 1B,C); więc celowanie w DRN przy użyciu standardowych procedur może prowadzić do masywnego krwawienia i wysokiej śmiertelności u myszy16. W związku z tym iniekcje stereotaktyczne zostały tutaj wykonane przy użyciu podejścia kątowego zamiast standardowego podejścia pionowego, aby uniknąć uszkodzenia SSS (Rysunek 1A,B). Aby potwierdzić lokal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten z powodzeniem opisuje produkcję niezawodnego mysiego modelu DRN z uszkodzeniem neuronów serotoninergicznych o wysokiej odtwarzalności zmian i niskim wskaźniku śmiertelności. Namierzenie DRN jest złożonym zadaniem, ponieważ może uszkodzić SSS znajdujący się tuż nad DRN16 i doprowadzić do nadmiernego krwawienia, a nawet śmierci14. W związku z tym zastrzyki stereotaktyczne wykonano poprzez ustawienie ramienia manipulacyjnego pod kątem 30° w kierunku AP, aby unikną...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin [Numery grantów 2017YFA0104100]; Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych [Granty o numerach 31771644, 81801331 i 31930068]; oraz Fundusze Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtr strzykawkowy 0,22 mikronaMilliporeSLGPRB
3% nadtlenek wodoruCaoshanhu Co., Ltd, Jiangxi, Chiny
5,7-DihydroksytryptaminaSigma-AldrichSML20583ug / ul, 2ul
Kompaktowy aparat do znieczulenia małych zwierzątRWD Life Science Co., LtdR500
Leica Biosystems, Wetzlar, NiemcyCM1950
Cy 3 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch705-165-0031:2,000
dapiSigma-AldrichD8417
chlorowodorek dezypraminySigma-AldrichPHR172325 mg / kg
Probówka EppendorfaQuality Scientific Plastics509-GRD-Q
kozie przeciwciało anty-5-HTAbcamab660471:800
GraphPad PrismGraphpad Software Inc, CA, US
Hamilton Strzykawka mikrolitrowaHamilton87943
KetoprofenSigma-AldrichK1751-1G5mg/kg
Kwas L-askorbinowyBBI Life SciencesA610021-05000,10%
maść z lidokainąTsinghua Tongfang Pharmaceutical Co. LtdH20063466
maść do oczu ofloksacynyShenyang Xingqi Pharmaceutical Co.Ltd, ChinyH10940177
pompa perystaltycznaHuxi Analytical Instrument Factory Co., Ltd, Szanghaj, ChinyHL-1D
RWD Life Science Co., Ltd68018
zamrażarka ultraniskotemperaturowaHaierDW-86L388
Dzwonek VortexKylin-BellVORTEX-5
Kriostat serii Aparat stereotaktyczny

Bibliografia

  1. Goridis, C., Rohrer, H. Specification of catecholaminergic and serotonergic neurons. Nature Review Neurosciences. 3 (7), 531-541 (2002).
  2. Zmudzka, E., Salaciak, K., Sapa, J., Pytka, K. Serotonin receptors in depression and anxiety: Insights from animal studies. Life Science. 210, 106-124 (2018).
  3. Sanchez, C., Asin, K. E., Artigas, F. Vortioxetine, a novel antidepressant with multimodal activity: review of preclinical and clinical data. Pharmacology and Therapeutics. 145, 43-57 (2015).
  4. Pae, C. U., et al. Vortioxetine, a multimodal antidepressant for generalized anxiety disorder: a systematic review and meta-analysis. Journal of Psychiatric Research. 64, 88-98 (2015).
  5. Howerton, A. R., Roland, A. V., Bale, T. L. Dorsal raphe neuroinflammation promotes dramatic behavioral stress dysregulation. Journal of Neuroscience. 34 (21), 7113-7123 (2014).
  6. Matthews, P. R., Harrison, P. J. A morphometric, immunohistochemical, and in situ hybridization study of the dorsal raphe nucleus in major depression, bipolar disorder, schizophrenia, and suicide. Journal of Affective Disorders. 137 (1-3), 125-134 (2012).
  7. Dai, J. X., et al. Enhanced contextual fear memory in central serotonin-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (33), 11981-11986 (2008).
  8. Song, N. N., et al. Reducing central serotonin in adulthood promotes hippocampal neurogenesis. Science Reports. 6, 20338(2016).
  9. Nishitani, N., et al. Manipulation of dorsal raphe serotonergic neurons modulates active coping to inescapable stress and anxiety-related behaviors in mice and rats. Neuropsychopharmacology. 44 (4), 721-732 (2019).
  10. Long, M. A., Fee, M. S. Using temperature to analyse temporal dynamics in the songbird motor pathway. Nature. 456 (7219), 189-194 (2008).
  11. Sena, L. M., et al. The dorsal raphe nucleus exerts opposed control on generalized anxiety and panic-related defensive responses in rats. Behavioral Brain Research. 142 (1-2), 125-133 (2003).
  12. Hall, F. S., Devries, A. C., Fong, G. W., Huang, S., Pert, A. Effects of 5,7-dihydroxytryptamine depletion of tissue serotonin levels on extracellular serotonin in the striatum assessed with in vivo microdialysis: relationship to behavior. Synapse. 33 (1), 16-25 (1999).
  13. Lieben, C. K., Steinbusch, H. W., Blokland, A. 5,7-DHT lesion of the dorsal raphe nuclei impairs object recognition but not affective behavior and corticosterone response to stressor in the rat. Behavioral Brain Research. 168 (2), 197-207 (2006).
  14. Martin, S., van den Buuse, M. Phencyclidine-induced locomotor hyperactivity is enhanced in mice after stereotaxic brain serotonin depletion. Behavioral Brain Research. 191 (2), 289-293 (2008).
  15. Yalcin, I., Coubard, S., Bodard, S., Chalon, S., Belzung, C. Effects of 5,7-dihydroxytryptamine lesion of the dorsal raphe nucleus on the antidepressant-like action of tramadol in the unpredictable chronic mild stress in mice. Psychopharmacology (Berlin). 200 (4), 497-507 (2008).
  16. Xiong, B., et al. Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128(2017).
  17. Spofford, C. M., et al. Ketoprofen produces modality-specific inhibition of pain behaviors in rats after plantar incision. Anesthesia and Analgesia. 109 (6), 1992-1999 (2009).
  18. Baumgarten, H. G., Klemm, H. P., Sievers, J., Schlossberger, H. G. Dihydroxytryptamines as tools to study the neurobiology of serotonin. Brain Research Bulletin. 9 (1-6), 131-150 (1982).
  19. Graeff, F. G., Netto, C. F., Zangrossi, H. The elevated T-maze as an experimental model of anxiety. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 23 (2), 237-246 (1998).
  20. Lister, R. G. The use of a plus-maze to measure anxiety in the mouse. Psychopharmacology (Berlin). 92 (2), 180-185 (1987).
  21. Lu, J., et al. Generation of integration-free and region-specific neural progenitors from primate fibroblasts. Cell Reports. 3 (5), 1580-1591 (2013).
  22. Cao, L., et al. Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Human Serotonergic Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 131(2017).
  23. Sinhababu, A. K., Borchardt, R. T. Molecular mechanism of biological action of the serotonergic neurotoxin 5,7-dihydroxytryptamine. Neurochemistry International. 12 (3), 273-284 (1988).
  24. Jia, Y. F., et al. Abnormal anxiety- and depression-like behaviors in mice lacking both central serotonergic neurons and pancreatic islet cells. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 325(2014).
  25. Marcinkiewcz, C. A., et al. Serotonin engages an anxiety and fear-promoting circuit in the extended amygdala. Nature. 537 (7618), 97-101 (2016).
  26. Ohmura, Y., Tanaka, K. F., Tsunematsu, T., Yamanaka, A., Yoshioka, M. Optogenetic activation of serotonergic neurons enhances anxiety-like behaviour in mice. International Journal of Neuropsychopharmacology. 17 (11), 1777-1783 (2014).
  27. Correia, P. A., et al. Transient inhibition and long-term facilitation of locomotion by phasic optogenetic activation of serotonin neurons. eLife. 6, (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

j dro szwu grzbietowegopodej cie pod k temmodel mysizachowanie l kowewstrzykni cie do m zgulekcja neurotoksycznazaburzenia psychiatryczne
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.