Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

Podsumowanie

Ten protokół demonstruje użycie testu ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ w linii zarodkowej C. elegans.

Streszczenie

Zrozumienie, kiedy i gdzie zachodzą interakcje białko-białko (PPI), jest kluczowe dla zrozumienia funkcji białek w komórce i tego, jak wpływają one na szersze procesy, takie jak rozwój. Linia zarodkowa Caenorhabditis elegans jest doskonałym systemem modelowym do badania IPP, które są związane z regulacją komórek macierzystych, mejozą i rozwojem. Istnieje wiele dobrze opracowanych technik, które pozwalają na znakowanie interesujących białek w celu rozpoznania przez standardowe przeciwciała, co sprawia, że system ten jest korzystny dla reakcji ligacji zbliżeniowej (PLA). W rezultacie, PLA jest w stanie pokazać, gdzie IPP występują w sposób przestrzenny i czasowy w liniach zarodkowych skuteczniej niż alternatywne podejścia. Opisano tutaj protokół zastosowania i kwantyfikacji tej technologii do badania IPP w linii zarodkowej C. elegans.

Wprowadzenie

Szacuje się, że ponad 80% białek wchodzi w interakcje z innymi cząsteczkami¹, co podkreśla, jak ważne są IPP dla realizacji określonych funkcji biologicznych w komórce². Niektóre białka funkcjonują jako węzły ułatwiające tworzenie większych kompleksów, które są niezbędne do przetrwania komórki¹. Centra te pośredniczą w wielu IPP i pomagają organizować białka w sieć, która ułatwia określone funkcje w komórce³. Na tworzenie kompleksów białkowych ma również wpływ kontekst biologiczny, taki jak obecność lub brak określonych oddziałujących partnerów⁴, zdarzenia sygnalizacji komórkowej i etap rozwoju komórki.

C. elegans jest powszechnie używany jako organizm modelowy do różnych badań, w tym do rozwoju. Prosta anatomia tego zwierzęcia składa się z kilku narządów, w tym gonady, jelita i przezroczystego naskórka, co ułatwia analizę rozwoju robaków. Linia zarodkowa znajdująca się w gonadzie jest doskonałym narzędziem do badania, w jaki sposób komórki macierzyste linii zarodkowej dojrzewają do gamet⁵, które rozwijają się w zarodki, a ostatecznie w następne pokolenie potomstwa. Dystalny obszar wierzchołkowy linii zarodkowej zawiera pulę samoodnawiających się komórek macierzystych (ryc. 1). Gdy komórki macierzyste opuszczają niszę, przechodzą do pachytenu mejotycznego i ostatecznie przekształcają się w oocyty w stadium młodego dorosłego (ryc. 1). Ten program rozwoju w linii zarodkowej jest ściśle regulowany przez różne mechanizmy, w tym potranskrypcyjną sieć regulacyjną ułatwioną przez białka wiążące RNA (RBP)⁶. IPP są ważne dla tej działalności regulacyjnej, ponieważ RBP łączą się z innymi kofaktorami, aby pełnić swoje funkcje.

Istnieje kilka podejść, które mogą być wykorzystane do sondowania PPI w robaku, ale każde z nich ma unikalne ograniczenia. Immunoprecypitacja in vivo (IP) może być stosowana do izolowania kompleksów białkowo-białkowych z całych ekstraktów z robaków; Podejście to nie wskazuje jednak, gdzie w robaku występuje PPI. Ponadto kompleksy białkowe, które są przejściowe i tworzą się tylko na określonym etapie rozwoju lub w ograniczonej liczbie komórek, mogą być trudne do odzyskania przez koimmunoprecypitację. Wreszcie, eksperymenty z własnością intelektualną muszą rozwiązać problemy związane z reasortacją kompleksów białkowych po lizie i niespecyficznym zatrzymywaniem białek na matrycy powinowactwa.

Alternatywnymi metodami wykrywania in situ IPP są koimmunostaining, transfer energii rezonansu Förstera (FRET) i dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencyjna (BiFC). Koimmunologiczne barwienie polega na jednoczesnym wykryciu dwóch interesujących białek w utrwalonej tkance robaka i pomiarze stopnia kolokalizacji sygnału. Zastosowanie mikroskopii superrozdzielczej, która oferuje większą szczegółowość niż standardowa mikroskopia⁷, pomaga bardziej rygorystycznie testować kolokalizację białek poza ograniczoną dyfrakcją barierą 200-300 nm⁸. Jednak współbarwienie immunologiczne przy użyciu zarówno mikroskopii konwencjonalnej, jak i superrozdzielczej działa najlepiej w przypadku białek o dobrze zdefiniowanych wzorcach lokalizacji. W przeciwieństwie do tego, staje się znacznie mniej pouczający dla rozproszonych partnerów wchodzących w interakcje. Pomiar kolokalizacji sygnałów na podstawie nakładania się nie dostarcza dokładnych informacji o tym, czy białka są ze sobą złożone^9,10.

Ponadto, koimmunoprecypitacja i ko-barwienie immunologiczne kompleksów białko-białko nie są ilościowe, co utrudnia określenie, czy takie interakcje są znaczące. FRET i BiFC są technikami opartymi na fluorescencji. FRET polega na znakowaniu interesujących białek białkami fluorescencyjnymi (FP), które mają zakładkę spektralną, przy której energia z jednego FP (donora) jest przekazywana do innego FP (akceptora)¹¹. Ten nieradiacyjny transfer energii powoduje fluorescencję akceptora FP, którą można wykryć na odpowiedniej długości fali emisji. BiFC opiera się na rekonstytucji białka fluorescencyjnego in vivo. Polega to na rozszczepieniu GFP na dwa komplementarne fragmenty, takie jak helisy 1-10 i helisa 11¹², które są następnie łączone z dwoma interesującymi białkami. Jeśli te dwa białka wchodzą w interakcje, komplementarne fragmenty GFP zbliżają się do siebie na tyle, aby się fałdować i składać, ponownie tworząc fluorofor GFP. Odtworzona GFP jest następnie bezpośrednio obserwowana jako fluorescencja i wskazuje, gdzie wystąpił PPI.

W związku z tym, zarówno FRET jak i BiFC zależą od dużych znaczników fluorescencyjnych, które mogą zakłócać funkcję oznaczonego białka. Ponadto FRET i BiFC wymagają obfitej i porównywalnej ekspresji znakowanych białek w celu uzyskania dokładnych danych. FRET może nie być odpowiedni do eksperymentów, w których jeden partner przewyższa drugiego, co może prowadzić do wysokiego tła¹³. Należy również unikać nadekspresji w eksperymentach BiFC, ponieważ może to wywołać niespecyficzne assembly¹⁴, co skutkuje zwiększonym tłem. Obie techniki wymagają optymalizacji warunków ekspresji i obrazowania znakowanych białek, co może wydłużyć czas potrzebny do zakończenia eksperymentów.

Test ligacji zbliżeniowej (PLA) jest alternatywnym podejściem, które może rozwiązać problemy z ograniczeniami wyżej wymienionych technik. PLA wykorzystuje przeciwciała pierwotne, które rozpoznają interesujące białka (lub ich znaczniki). Te pierwszorzędowe przeciwciała są następnie wiązane przez przeciwciała drugorzędowe zawierające sondy oligonukleotydowe, które mogą hybrydyzować ze sobą, gdy znajdują się w odległości 40 nm (lub krótszej)¹⁵. Powstałe zhybrydyzowane DNA jest amplifikowane w reakcji PCR, która jest wykrywana przez sondy uzupełniające DNA. W ten sposób powstają ogniska, które są wizualizowane przez mikroskop. Technologia ta może wykrywać IPP in situ w złożonych tkankach (tj. gonadzie robaka), która jest zorganizowana jako linia montażowa zawierająca komórki na różnych etapach rozwoju i różnicowania. Dzięki PLA IPP mogą być bezpośrednio wizualizowane w stałej gonadzie robaka, co jest korzystne dla zbadania, czy IPP występują na określonym etapie rozwoju. PLA oferuje większą rozdzielczość IPP w przeciwieństwie do testów opartych na kolokalizacji, które są idealne do wykonywania precyzyjnych pomiarów. Jeśli zostanie zastosowana, mikroskopia superrozdzielcza może potencjalnie dostarczyć dokładniejszych szczegółów na temat lokalizacji ognisk PLA w komórce. Kolejną zaletą jest to, że ogniska powstające w reakcjach PLA mogą być zliczane przez proces analizy oparty na ImageJ, co czyni tę technikę ilościową.

Rodzina lekkich łańcuchów dyneinowych LC8 została najpierw opisana jako podjednostka kompleksu motorycznego dynein¹⁶ i przypuszczalnie służyła jako adapter ładunkowy. Od czasu pierwszego odkrycia, LC8 został znaleziony w wielu kompleksach białkowych oprócz kompleksu motorycznego dyneiny^17,18,19,20. Skanowanie w poszukiwaniu sekwencji białek, które zawierają motyw interakcji LC8¹⁹ sugeruje, że LC8 może mieć wiele interakcji z szeroką gamą różnych białek^{17,18,19,20,21,22}. W rezultacie, białka z rodziny LC8 są obecnie uważane za węzły, które pomagają promować tworzenie większych kompleksów białkowych^19,22, takich jak zespoły wewnętrznie nieuporządkowanych białek²¹.

Jedno białko z rodziny LC8 C. elegans, łańcuch lekki dyneiny-1 (DLC-1), ulega szerokiej ekspresji w wielu tkankach i nie jest wzbogacone w specyficzne struktury subkomórkowe^23,24. W związku z tym identyfikacja biologicznie istotnych partnerów in vivo DLC-1 w C. elegans jest trudna z kilku powodów: 1) koimmunoprecypitacja nie wskazuje źródła tkanki, w której zachodzi interakcja; 2) ograniczona ekspresja poszczególnych partnerów lub przejściowe interakcje mogą utrudniać zdolność do wykrycia interakcji za pomocą koimmunoprecypitacji; oraz 3) rozproszona dystrybucja DLC-1 prowadzi do niespecyficznego nakładania się na potencjalne białka partnerskie przez koimmunobarwienie. Opierając się na tych wyzwaniach, PLA jest idealnym podejściem do testowania interakcji in vivo z DLC-1.

Wcześniej doniesiono, że DLC-1 bezpośrednio oddziałuje i służy jako kofaktor dla białek wiążących RNA (RBP) FBF-2²³ i GLD-1²⁵. Nasza praca potwierdza model DLC-1 służącego jako białko piasty i sugeruje, że DLC-1 ułatwia sieć interakcji, która wykracza poza dynein^19,22. Korzystając z testu GST pulldown, zidentyfikowano nowy RBP wchodzący w interakcję z DLC-1 o nazwie OMA-1²⁶. OMA-1 jest ważny dla wzrostu oocytów i dojrzewania mejotycznego²⁷ i działa w połączeniu z wieloma represorami i aktywatorami translacyjnymi²⁸. Podczas gdy FBF-2 i GLD-1 ulegają ekspresji odpowiednio w komórkach macierzystych i mejotycznych regionach pachytenu, OMA-1 ulega dyfuzyjnej ekspresji w linii zarodkowej od pachytenu mejotycznego przez oocyty²⁷ (Figura 1). Sugeruje to, że DLC-1 tworzy kompleksy z RBP w różnych regionach gonady. Stwierdzono również, że bezpośrednia interakcja między DLC-1 i OMA-1 obserwowana in vitro nie jest odzyskiwana przez IP in vivo. PLA został z powodzeniem wykorzystany jako alternatywne podejście do dalszych badań nad tą interakcją w linii zarodkowej C. elegans, a wyniki sugerują, że PLA może być wykorzystany do badania wielu innych IPP w robaku.

Protokół

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje szczepy C. elegans, w których oznaczeni są potencjalni partnerzy do interakcji. Zdecydowanie zaleca się stosowanie szczepu kontroli ujemnej, w którym nie oczekuje się, że jedno znakowane białko będzie wchodzić w interakcje z innym oznakowanym potencjalnym partnerem interakcji. W tym przypadku sama GFP została wykorzystana jako kontrola negatywna do oceny tła, ponieważ nie oczekuje się, że DLC-1 będzie wchodzić w interakcje z GFP w robaku. Jako szczep eksperymentalny użyto OMA-1 oznaczonego GFP, ponieważ wstępne dane sugerują interakcję z DLC-1. Szczepy nicieni wykazujące współekspresję białek kontrolnych i testowych z DLC-1 oznaczonym 3xFLAG są określane w tym tekście jako 3xFLAG::D LC-1; GFP oraz 3xFLAG::D LC-1; OMA-1::GFP (szczepy dostępne na życzenie; więcej informacji w Tabeli Materiałów). W tym przypadku używane są znaczniki 3xFLAG i GFP; jednak inne znaczniki mogą być podstawione, o ile ich przeciwciała są kompatybilne z odczynnikami z zestawu PLA.

1. Opieka nad zwierzętami

1. Trzymaj robaki na płytkach pożywki wzrostowej nicieni (NGM), które są wysiane szczepem OP50 E. coli i utrzymuj w temperaturze 24 °C w celu optymalnej ekspresji GFP.
2. Dorosłe robaki przechodzą co 2-3 dni, aby rozmnażać robaki i dobrze je odżywić.

2. Przygotowanie hodowli synchronicznej

1. Zsynchronizuj robaki, wybielając talerz dobrze odżywionych, grawitacyjnych hermafrodytów. Protokół wybielania jest opisany w Porta-de-la-Riva et al.²⁹. Pozostawić zarodki do wylęgu przez noc w probówce wirówkowej o temperaturze 24 °C, obracając się od końca do końca w 10 ml buforu M9 o minimalnej ilości pożywki (M9). W ten sposób powstanie kultura zatrzymanych larw L1.
2. Inkubować probówkę z zatrzymanymi larwami w stadium L1 na lodzie przez 10 minut, a następnie uzupełnić probówkę lodowatym 1x M9.
3. Za pomocą wirówki osadzać larwy w temperaturze 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zassać supernatant tak, aby pozostało tylko 1-2 ml supernatantu.
4. Ponownie zawiesić osad z larw i za pomocą mikropipety przenieść 2 μl zawieszonych kultur larw na szkiełko podstawowe. Policz, ile larw jest obecnych, aby określić gęstość kultury larw, co pomoże pokierować wysiewem robaków w kroku 2.5.
   UWAGA: Gęstość 10-15 larw L1/1 μL dobrze sprawdza się do siewu.
5. Za pomocą mikropipety przenieś objętość kultury larw potrzebną do wysiewu około 100-120 larw w stadium L1 na płytce OP50 o średnicy 60 mm. Na przykład nasiona 10 μl kultury larw o gęstości 10 larw L1/1 μl kultury.
   UWAGA: Nie przekraczaj objętości 40 μl w celu wysiewu larw, w przeciwnym razie nadmiar płynu zakłóci trawnik OP50. Jeśli objętość kultury przekracza 40 μl, powtórz kroki 2.3-2.4, aby jeszcze bardziej zmniejszyć objętość i zwiększyć gęstość hodowli larw.
6. Hoduj robaki w temperaturze 24 °C. Zapisuj czas, w którym L1 są wysiewane na talerzu i okresowo sprawdzaj etap rozwoju, aby określić idealny czas na rozbior.
   UWAGA: Po 52 godzinach od wysiewu L1 robaki hodowane w temperaturze 24 °C są zazwyczaj w stadium młodego dorosłego, które jest idealnym etapem do preparacji PLA ukierunkowanego na gonady. Jednak rzeczywisty czas, w którym zsynchronizowane robaki osiągają stadium młodego dorosłego osobnika, może się różnić w zależności od szczepu i temperatury inkubacji.

3. Sekcja/ekstruzja gonad

UWAGA: Sekcja w celu wytłoczenia gonady jest konieczna, aby PLA ukierunkowane na gonady działało pomyślnie. Takie podejście może również uwalniać zarodki, które również działają przy użyciu tego protokołu dla PLA (zobacz Dyskusję, aby uzyskać więcej informacji). Po rozbiorze zarówno kontrola ujemna, jak i próbki eksperymentalne są równolegle utrwalane i poddawane obróbce pod kątem PLA. Sugeruje się również, aby przygotować dodatkowy zestaw próbek do celów fluorescencyjnego barwienia koimmunologicznego²³ w celu zademonstrowania wzorców ekspresji partnerów białkowych będących przedmiotem zainteresowania.

1. Zbierz 30-40 młodych dorosłych robaków do szklanego naczynia zawierającego 500 μL 1x M9 + lewamizol (końcowe stężenie 2,5 mM). Po zebraniu robaków ostrożnie usuń i wyrzuć większość pożywki, aby usunąć bakterie, które są przenoszone wraz z robakami.
2. Dodaj świeże 500 μL 1x M9 + lewamizol i za pomocą pipety delikatnie nabierz i dozuj pożywkę do wypłukania robaków. Ostrożnie usuń i wyrzuć większość pożywki, aby usunąć bakterie, które są przenoszone wraz z robakami.
   1. Powtórz ten krok 2x-3x, aż wszystkie bakterie zostaną usunięte. Po zakończeniu prania pozostaw robaki w około 100 μl podłoża, aby utrzymać nawodnienie.
      UWAGA: Nie pozwól, aby robaki przebywały w pożywce dłużej niż 7 minut, ponieważ zakłóci to wytłaczanie gonad podczas sekcji. Wykonuj mycie pod pomocą mikroskopu preparacyjnego, aby monitorować usuwanie pożywki, aby robaki nie zostały utracone.
3. Za pomocą pipety szklanej lub polietylenowej przenieś ślimaki na szkiełko mikroskopowe o wymiarach 25 mm x 75 mm pokryte 0,001% poli-L-lizyną (szkiełka używane w tej procedurze mają obwód pokryty żywicą epoksydową, pozostawiając trzy obszary robocze o wymiarach 14 mm x 14 mm każde). Usuń nadmiar pożywki tak, aby pozostało około 10-15 μl pożywki.
4. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego i dwóch igieł o rozmiarze 261/2 umieść jedną igłę na drugiej, tak aby końce utworzyły nożyczki. Używając igieł zorientowanych w ten sposób, odetnij robaki za gardłem, aby uwolnić linie zarodkowe. Wytnij wszystkie robaki w ciągu 5 minut.
   UWAGA: Więcej szczegółów na temat wykonywania sekcji można znaleźć w poprzedniej publikacji Gervaise'a i Arur³⁰.
5. Po wypreparowaniu wszystkich robaków delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 40 mm na szkiełku tak, aby było prostopadłe do szkiełka. Końce szkiełka nakrywkowego powinny zwisać ze szkiełka.
6. Zamrozić szkiełka na wstępnie schłodzonym bloku aluminiowym utrzymywanym na suchym lodzie przez co najmniej 20 minut. Delikatnie umieść schłodzony ołówek na wierzchu szkiełka nakrywkowego, aby zapobiec poluzowaniu się szkiełka nakrywkowego z powodu rozszerzania się lodu.

4. Fiksacja/blokowanie

1. Gdy szkiełko nakrywkowe jest gotowe do utrwalenia, strzepnąć je ołówkiem lub innym narzędziem o krawędziach i natychmiast zanurzyć szkiełko w słoiku zawierającym świeży, lodowaty metanol (schłodzony do temperatury -20 °C) na 1 minutę.
2. Delikatnie przetrzyj krawędzie szkiełka otaczające próbkę, tak aby następny odczynnik był utrzymywany przez napięcie powierzchniowe wokół próbki. Stosować 150 μl utrwalacza (2% formaldehydu w 100 mM KH₂PO_4, pH = 7,2) przez 5 minut w temperaturze RT.
   UWAGA: Przetestowaliśmy również procedurę wiązania metanolu/acetonu^{31,32 i stwierdziliśmy}, że jest ona zgodna z reakcją PLA.
3. Przyłóż szkiełko do ręcznika papierowego pod prostopadłym kątem 90°, aby utrwalacz spłynął ze szkiełka i wchłonął się w ręcznik papierowy. Szkiełka blokowe 2x przez 15 minut w RT w słoiku Coplin z 50 ml 1x PBS/1% albuminy surowicy bydlęcej Triton X-100/1% (PBT/BSA).
   UWAGA: Słoiki z kopeliny lub inne rodzaje słoików do barwienia są zalecane do tego etapu blokowania i poniższych etapów mycia w sekcjach 6-9. Zapewniają one wystarczające objętości do efektywnej wymiany buforu blokującego lub przemłukującego z próbką.
4. Szkiełka blokowe z roztworem PBT/BSA zawierającym 10% normalnej surowicy koziej. Delikatnie przetrzyj krawędzie otaczające szkiełko i nałóż 100 μl roztworu na szkiełko. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.
   UWAGA: Ten etap jest wysoce zalecany w przypadku barwienia przeciwciałem pierwszorzędowym αFLAG. Wilgotna komora jest skonstruowana poprzez zabezpieczenie szklanych pipet taśmą w tacy, aby szkiełka mogły się na nich położyć podczas inkubacji. Zwilżone chusteczki zadaniowe (tabela materiałów) są umieszczane w tacy, aby podnieść wewnętrzną wilgotność tacy, aby zapobiec parowaniu. Pokrywka i taca są pokryte folią, aby chronić próbki przed światłem podczas etapów wrażliwych na światło.
5. Umieść szkiełko na ręczniku papierowym, aby roztwór PBT/BSA/10%NGS spłynął ze szkiełka i delikatnie przetrzyj krawędzie szkiełka. Użyj odczynnika blokującego (Tabela materiałów), aby zablokować szkiełka. Nałóż jedną kroplę na przestrzeń o wymiarach 14 mm x 14 mm. Inkubować szkiełka podstawowe przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze.

5. Inkubacja przeciwciał pierwotnych

UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki PLA i minimalne tło, współczynnik rozcieńczenia pierwszorzędowych przeciwciał może wymagać optymalizacji (zobacz Dyskusję po więcej szczegółów). Dodatkowo przeciwciała pierwszorzędowe powinny być hodowane w różnych gospodarzach, które odpowiadają specyficzności przeciwciał drugorzędowych stosowanych w PLA.

1. Umieść szkiełko na ręczniku papierowym, aby odczynnik blokujący spłynął ze szkiełka i delikatnie wytrzyj krawędzie. Użyj rozcieńczalnika przeciwciał (tabela materiałów), aby rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe. Nałożyć 40 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na przestrzeń 14 mm x 14 mm.
2. Szkiełka inkubować w wilgotnej komorze przez noc w temperaturze 4 °C.

6. Inkubacja sondy PLA (przeciwciało wtórne)

UWAGA: Dla kroków 6-9 użyj myjących A i B w RT. Jeśli są przechowywane w temperaturze 4 °C, przed użyciem pozwól im ogrzać się do temperatury pokojowej.

1. Myj szkiełka 2x przez 5 minut z 50 ml 1x buforu do płukania A (tabela materiałów) w temperaturze pokojowej w słoiku Coplin. Ustaw słoik Coplin na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 60 obr./min.
2. Umieść szkiełko na ręczniku papierowym, aby bufor do mycia spłynął ze szkiełka i delikatnie wytrzyj krawędzie. Przygotować 40 μl roztworu zawierającego sondy PLUS i MINUS (rozcieńczonego w stosunku 1:5 rozcieńczalnikiem przeciwciał). Nanieść roztwór na każdą przestrzeń o wymiarach 14 mm x 14 mm.
3. Szkiełka inkubować w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.

7. Podwiązanie

1. Myj szkiełka 2x przez 5 minut z 50 ml 1x buforu do płukania A w RT w słoiku Coplin. Ustaw słoik Coplin na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 60 obr./min.
2. Rozcieńczyć bufor do ligacji (tabela materiałów) w stosunku 1:5 ultraczystą wodą. Użyć tego buforu do rozcieńczenia ligazy (tabela materiałów) w stosunku 1:40 w celu przygotowania roboczego roztworu do ligacji.
   1. Umieść szkiełko na ręczniku papierowym, aby bufor do mycia spłynął ze szkiełka i delikatnie wytrzyj krawędzie. Nanieść 40 μl roztworu do ligacji na każdą przestrzeń o wymiarach 14 mm x 14 mm.
3. Inkubować szkiełka podstawowe w wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze 37 °C.

8. Wzmocnienie

UWAGA: Użycie odczynników detekcyjnych z czerwonymi fluoroforami (Tabela materiałów) skutkuje najmniejszą ilością tła w tkance C. elegans.

1. Myj szkiełka 2x przez 5 minut z 50 ml 1x buforu do płukania A w RT w słoiku Coplin. Ustaw słoik Coplin na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 60 obr./min.
2. Rozcieńczyć czerwony bufor wzmacniający (tabela materiałów) w stosunku 1:5 ultraczystą wodą. Użyj tego buforu do rozcieńczenia polimerazy (tabela materiałów) w stosunku 1:80, aby przygotować zapas roboczy roztworu wzmacniającego i chronić przed światłem.
   1. Umieść szkiełko na ręczniku papierowym, aby bufor do mycia spłynął ze szkiełka i delikatnie wytrzyj krawędzie. Nanieść 40 μl roztworu wzmacniającego na każdą przestrzeń o wymiarach 14 mm x 14 mm.
3. Szkiełka inkubować w wilgotnej komorze przez 1 godzinę i 40 minut w temperaturze 37 °C. Upewnij się, że wilgotna komora jest przykryta folią w celu ochrony próbek przed światłem.

9. Końcowe pranie

1. Myj szkiełka 2x przez 10 minut z 50 ml 1x buforu do płukania B (tabela materiałów) w temperaturze RT w słoiku Coplin. Ustaw słoik Coplin na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 60 obr./min.
2. Myj szkiełka 1x przez 1 minutę z 50 ml 0,01x buforu do płukania B w temperaturze RT w słoiku Coplin. Ustaw słoik Coplin na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 60 obr./min. Bufor ten przygotowuje się przez rozcieńczenie buforu B do przemywania ultraczystą wodą.

10. Montaż szkiełek nakrywkowych

1. Pozwól, aby nadmiar buforu do płukania spłynął ze szkiełka na ręcznik papierowy i zetrzyj wszelkie pozostałości buforu pozostające na obwodzie szkiełka pokrytym żywicą epoksydową.
2. Dodać 10 μl podłoża wzorcowego (tabela materiałów) do próbki i delikatnie położyć szkiełko nakrywkowe na wierzchu, pozwalając na rozprowadzenie podłoża mocującego.
3. Pomaluj krawędź szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe i szkiełko. Delikatnie nakładaj lakier do paznokci, aby uniknąć przesuwania szkiełka nakrywkowego, co spowoduje uszkodzenie linii zarodkowych. Pozwól lakierowi do paznokci stwardnieć przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej, podczas gdy szkiełka są chronione przed światłem, przed obejrzeniem go pod mikroskopem.
4. Przechowuj szkiełka w ciemnym pojemniku lub uchwycie na szkiełka, ponieważ próbki oznaczone PLA są wrażliwe na światło. Producent sugeruje, że szkiełka mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C w przypadku długotrwałego przechowywania lub w temperaturze 4 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania. Preparaty przygotowane przy użyciu tego protokołu wytrzymają co najmniej 2 miesiące przy przechowywaniu w temperaturze 20 °C.

11. Akwizycja obrazu

1. W celu oceny ilościowej należy użyć mikroskopu konfokalnego, aby uchwycić obrazy wytłaczanych linii zarodkowych, które są wyraźnie widoczne, nieuszkodzone i niezakłócone. Przechwyć stos z linii zarodkowej, która obejmuje całą linię zarodkową w płaszczyźnie z i wygeneruj maksymalny obraz rzutowania do wykorzystania do oceny ilościowej.
   UWAGA: Mikroskopia konfokalna jest idealna do uzyskiwania i ilościowego oznaczania obrazów PLA z mniejszym tłem w porównaniu z obrazami uzyskanymi przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego.
   1. Jeśli linia zarodkowa nie mieści się w jednym polu widzenia, należy uchwycić nakładające się pola widzenia, jeśli jest to konieczne, aby zobrazować całą linię zarodkową. Maksymalne projekcje tych obrazów można zszyć ze sobą na FIDŻI.
2. Należy upewnić się, że warunki obrazowania między próbkami kontrolnymi i eksperymentalnymi są takie same, aby ustalić sprawiedliwy i właściwy próg identyfikacji ognisk podczas analizy obrazu.
   UWAGA: Zapisać co najmniej 8-10 linii zarodkowych z każdej próbki na kontrpróbę, aby ułatwić analizę statystyczną kwantyfikacji PLA. Dla PLA zaleca się co najmniej trzy powtórzenia biologiczne w celu uzyskania wiarygodnych i spójnych wyników ilościowych.

12. Analiza obrazu i kwantyfikacja za pomocą FIJI/ImageJ

UWAGA: Poniższy przepływ pracy opiera się na obrazach uzyskanych za pomocą obiektywu 40x na mikroskopie konfokalnym, w którym obrazy są zapisywane w formacie .czi. Te obrazy .czi i towarzyszące im metadane, w tym wymiary, mogą być dostępne i otwierane w FIJI/ImageJ w celu dalszej analizy. Należy sprawdzić, czy FIJI akceptuje format plików konfokalnych z konfokalnego dostępnego dla konkretnego użytkownika. Jeśli nie, obrazy w formacie .tiff mogą być alternatywnie używane do analizy, ale użytkownik będzie musiał ręcznie ustawić skalę obrazu w FIJI/ImageJ (Analyze | Ustaw skalę). Zaleca się, aby wszystkie obrazy kontroli ujemnej były najpierw analizowane razem w celu ustalenia poziomu tła.

1. Rozpocznij proces analizy, analizując najpierw wszystkie obrazy kontroli ujemnej, a następnie przejdź do próbek eksperymentalnych. Otwórz obraz projekcji maksymalnej w FIJI/ImageJ, aby przeanalizować (Rysunek 2A). W przypadku korzystania z pliku .czi zostanie wyświetlony monit o wyświetlenie opcji importu formatów biologicznych.
   1. Dołącz następujące opcje, aby otworzyć obraz: widok stosu za pomocą przeglądarki danych; tryb koloru = Kolorowany. Okno z obrazem powinno się teraz otworzyć z suwakiem, aby przełączać się między różnymi kanałami przechwytywanymi przez konfokalne (np. DAPI lub PLA).
   2. Jeśli obrazy muszą zostać zszyte, utwórz duplikaty każdego kanału z każdego obrazu, zaznaczając obraz prawym przyciskiem myszy i wybierając Duplikuj, aby otworzyć okno Duplikat. Określ tylko numer kanału (c), który odpowiada kanałowi PLA lub DAPI (np. 2) i odznacz pole Duplicate Hyperstack.
   3. Gdy oba obrazy mają zostać zszyte, wybierz Wtyczki | Szwy | Przestarzałe | Szwy 2D. Otworzy się okno Łączenie obrazów 2D. Wybierz obrazy, które będą używane do łączenia, i użyj domyślnych parametrów, które są wstępnie ustawione w oknie, a następnie wybierz przycisk OK. Wynikowy obraz będzie złożonym obrazem w skali szarości.
      UWAGA: Jeśli obrazy podrzędne nie są idealnie wyrównane, dostosowanie parametrów (np. zwiększenie liczby pików do sprawdzenia z 5 do 500 lub zmiana metody fuzji z mieszania liniowego na maksymalną intensywność) może pomóc w uzyskaniu pożądanego obrazu. Chociaż dostępne są inne narzędzia do łączenia, takie podejście zachowuje wymiarowość obrazu, co jest ważne dla kwantyfikacji.
2. Otwórz menedżera ROI (Region of Interest), naciskając T na klawiaturze. Otworzy się nowe okno o nazwie ROI Manager.
3. Wybierz narzędzie wielokąta z pola Zestaw narzędzi FIDŻI. Upuść punkty wokół linii zarodkowej, aby ją obrysować i wygenerować ROI ( Rysunek 2B). Połącz ostatnią kropkę z pierwszą, aby wygenerować pełny zwrot z inwestycji.
   UWAGA: W przypadku ciemniejszych obrazów pomocne jest dostosowanie kontrastu w celu poprawy widoczności linii zarodkowej (która jest odwracalna), aby można było ją dokładniej obrysować.
   1. Natychmiast po zakończeniu ROI przejdź do menedżera ROI i wybierz Dodaj [t], aby zapisać ROI. Konieczne jest, aby wszelkie zmiany w ROI, w tym dodawanie/usuwanie punktów lub przesuwanie ROI i punktów, zostały zaktualizowane (wybierz Aktualizuj z menedżera ROI) przed przejściem do następnego kroku, w przeciwnym razie zostaną utracone. Więcej informacji na temat manipulacji zwrotami z inwestycji i ich punktami można znaleźć w Podręczniku użytkownika FIJI/ImageJ.
4. Po ustawieniu orientacji ROI można ją zapisać do późniejszego wykorzystania, wybierając nazwę ROI w menedżerze ROI, a następnie Więcej | Zapisz | (nazwij plik i określ miejsce docelowe, w którym chcesz zapisać). Zapisane ROI można otworzyć w menedżerze ROI, wybierając Więcej | Otwórz | (wybierz plik).
5. Zmierz obszar wewnątrz ROI, wybierając nazwę ROI w menedżerze ROI, a następnie wybierając przycisk Zmierz w menedżerze ROI. Otworzy się okno wyników z informacjami o ROI, w tym o obszarze, który obejmuje na obrazie (μM²) (wstawka Rysunek 2B). Zapisz te informacje w arkuszu kalkulacyjnym do kolejnych obliczeń.
   UWAGA: Upewnij się, że skala obrazu została ustawiona prawidłowo, aby zebrane zostały prawidłowe wymiary ROI. Typy pomiarów zgłaszanych w polu Wyniki można modyfikować, przechodząc do punktu menu Analiza | Ustaw wymiary....
6. Otwórz zduplikowany obraz tylko kanału PLA, zaznaczając obraz PLA prawym przyciskiem myszy i wybierając Duplikuj (Rysunek 2C). Otworzy się okno Duplikat. Określ tylko numer kanału (c), który odpowiada kanałowi PLA (np. 2) i odznacz pole Duplicate Hyperstack. Zaleca się zduplikowanie tego obrazu, aby oryginalny obraz nie został zmodyfikowany.
   UWAGA: Te opcje pojawią się tylko podczas przeglądania obrazów zawierających wiele kanałów na FIJI/ImageJ. Alternatywnym podejściem jest podzielenie kanałów Obraz | Kolor | Podziel kanały, ale spowoduje to modyfikację oryginalnego pliku obrazu.
7. Mając wybrany tylko obraz kanału PLA, przejdź do Obraz | Dostosuj | Próg. Otworzy się okno Próg dla obrazu. Wybierz opcję Domyślne jako metodę progową, Czerwony jako kolor i zaznacz pole Ciemne tło. Korzystając z górnej ścieżki w oknie, przesuń pasek w prawo, aż wszystkie ogniska PLA zostaną wyraźnie podświetlone na obrazie.
   1. Zapisz wartość w polu po prawej stronie górnej ścieżki i zanotuj, jaka wartość została użyta do ustawienia progu. Wybierz opcję Zastosuj w oknie Próg, aby sfinalizować próg, a obraz zostanie przekonwertowany na białe tło z tylko ogniskami progowymi widocznymi jako czarne kropki (Rysunek 2D). Zbadać próg na kilku obrazach kontroli ujemnej, aby upewnić się, że jest on odpowiedni do uchwycenia wszystkich ognisk PLA z obrazu na obraz przed oceną ilościową.
      UWAGA: Aby wyświetlić ogniska progowe jako czarne kropki na białym tle, przejdź do menu Process | Binarny | Opcje... i odznacz pole Czarne tło. Wartość progowa między 30-40 jest dobrym punktem wyjścia do identyfikacji PLA w linii zarodkowej; Jednak idealna wartość może się różnić w zależności od tła.
8. Aby określić ilościowo ogniska PLA, zastosuj ROI wygenerowany w krokach 12.3-12.3.1 do obrazu progowego, wybierając nazwę ROI w oknie menedżera ROI. Kontur ROI powinien pojawić się na obrazie w tym samym miejscu, w którym był na obrazie źródłowym (Rysunek 2E).
   1. Przejdź do punktu Analiza | Analizuj cząstki. Otworzy się okno Analizuj cząstki i wybierz następujące parametry: rozmiar (mikron^2) = 0-nieskończoność, okrągłość = 0,00-1,00, show = Nic. Zaznacz pole Podsumuj.
   2. Wybierz przycisk OK, a pojawi się tabela podsumowania z informacjami o ROI (tj. całkowita liczba ognisk PLA, całkowity obszar zajmowany przez ogniska PLA wewnątrz w ROI, średni rozmiar ognisk PLA i procent obszaru zajmowanego przez ogniska PLA w stosunku do rozmiaru ROI) (wstawka Rysunek 2E). Zapisz te pomiary w arkuszu kalkulacyjnym.
9. Powtórz kroki 12.1–12.8 dla kilku obrazów kontroli ujemnej przy użyciu tego samego progu.
   1. Po przeanalizowaniu wszystkich obrazów kontroli ujemnej powtórz kroki 12.1-12.8 dla wszystkich próbek eksperymentalnych, stosując ten sam próg, który został określony przez kontrolę ujemną w celu identyfikacji i ilościowego określenia ognisk PLA.

Wyniki

Współimmunologiczne barwienie obu 3xFLAG::D LC-1; GFP oraz 3xFLAG::D LC-1; OMA-1::Linie zarodkowe GFP z przeciwciałami FLAG i GFP ujawniły swoje wzorce ekspresji w linii zarodkowej (Rysunek 3Aii-iii,3Bii-iii). Podczas gdy GFP był wyrażany w całej linii zarodkowej (Rysunek 3Aiii), OMA-1::Ekspresja GFP była ograniczona do późnego pachytenu i oocytów (Rysunek 3Biii)

Dyskusja

Podczas badania IPP w linii zarodkowej C. elegans , wyższa rozdzielczość oferowana przez PLA w porównaniu z barwieniem koimmunologicznym umożliwia wizualizację i kwantyfikację miejsc, w których zachodzą interakcje w linii zarodkowej. Wcześniej informowano, że DLC-1 bezpośrednio oddziałuje z OMA-1 za pomocą testu ściągającego GST in vitro ²⁶; Jednak ta interakcja nie została odzyskana przez ekstrakcję in vivo. Fluorescencyjne barwienie koimmunologiczne 3xFLAG::D LC-1; Linie zarodk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
16% roztwór paraformaldehydu	Usługi mikroskopii elektronowej	15710	używany do wytwarzania 4% roztworu roboczego
1M KH2PO4	Sigma	P0662	Przygotuj zapas roboczy 1M
1x M9	różne		różne przygotowane jako 10x zapas używany przy 1x; patrz wormbook.org dla protokołu
1x PBS	różne	różne	zobacz wormbook.org do protokołu
26.5 Igła o rozmiarze 26.5	Exel International	26402	Igły używane do preparacji
BSA	Lampire	7500802
Probówki wirówkowe	Thermo Scientific	05-529C	50ml Dębowa rurka wirówkowa grzbietowa używana do synchronizacji
Mikroskop konfokalny	Zeiss	880
Coplin Jar	PolyLab	62101
Szkiełko nakrywkowe do zamrażania próbek	Globe Scientific	1411-10	22x40mm, nr 1
Szkiełko nakrywkowe do uszczelniania szkiełek	Globe	Scientific 1404-15	22x22mm, nr 1.5
DAPI Podłoże montażowe do immunofluorescencji	wektor	H-1200
Ligaza	Sigma-Aldrich		DUO82029 Duolink 1x Ligase, Wchodzi w skład zestawu odczynników do wykrywania in situ Duolink Czerwony DUO92008
Czerwony bufor wzmacniający	Sigma-Aldrich	DUO82011	Duolink 5x Amplification Red buffer, Jest częścią odczynników do wykrywania in situ Duolink Czerwony zestaw buforu
ligacyjnego	DUO92008 Aldrich DUO82009		Duolink 5x bufor ligacyjny, jest częścią zestawu odczynników do wykrywania in situ Duolink Red DUO92008
Rozcieńczalnik przeciwciał	Sigma-Aldrich	DUO82008	Rozcieńczalnik przeciwciał Duolink, w zestawie z DUO92004 i DUO92002, Uwaga: 1x roztwór PBS / 1% BSA może być również użyty jako substytut do rozcieńczenia przeciwciała.
Rozwiązanie blokujące	Sigma-Aldrich	DUO82007	rozwiązanie blokujące Duolink, w zestawie DUO92004 i DUO92002
medium montażowe do PLA Medium montażowe	Sigma-Aldrich	DUO82040	Duolink In Situ z sondą DAPI
MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004	Duolink In Situ Anti-Mouse Sonda MINUS
PLUS	Sonda Sigma-Aldrich	DUO92002	Duolink In Situ Anti-Rabbit PLUS
Bufor do płukania A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink In Situ wash Buffer A
Wash Buffer B	Sigma-Aldrich		DUO82048 Duolink In Situ wash Buffer B
Polimeraza	Sigma-Aldrich	DUO82030	Duolink Polymerase, Wchodzi w skład odczynników do wykrywania Duolink In Situ Czerwony zestaw DUO92008
Mikroskop epifluorescencyjny	Leica		DFC300G kamera, mikroskop DM5500B
Koza anty-mysz Alexa 594	JacksonImmuno	115-585-146	Użyj w 1:500
Koza anty-królik Alexa 488	JacksonImmuno	111-545-144	Użyj w 1:200
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu	Adobe		Adobe Photoshop + Illsutrator CS3
Szklana pipeta	Corning	7095B-5X
Lewamizol	ACROS Organics	187870100	Przygotuj zapas roboczy o pojemności 250 mM
Metanol Fisher	Scientific	A454
Mysz anty-FLAG	Sigma	F1804	Stosować w skali 1:1000 do immunofluorescencji i PLA, zalecany wstępny blok z normalną kozią surowicą Lakier
paznokci	L.A. kolory	CNP195
Pożywka do wzrostu nicieni (NGM)	różne		Zobacz wormbook.org dla protokół
Normalna surowica kozia	JacksonImmuno	005-000-121
Polietylenowa pipeta Pasteura	Globe Scientific	135030
Poli-L-Lizyna	Sigma-Aldrich	P1524	Przygotowany jako 0,1% roztwór podstawowy w wodzie, przechowywany w temperaturze -20C i rozcieńczony w stosunku 1:100 w wodzie do powlekania szkiełek
Szalki Petriego	Tritech	PD7060	średnica 60 mm
Królik anty-GFP	Thermo Fisher	G10362	Stosować w skali 1:200 dla immunofluorescencji, 1:4000 dla prowadnic PLA
	Thermo Fisher	30-2066A-Brown	Trzykwadratowe autoklawowalne prowadnice 14x14mm z prętami są zamawiane na zamówienie przez Fisher Scientific. Poli-L-lizyna dodawana do szkiełek w laboratorium
Roztwór podchlorynu sodu	Fisher Scientific	SS290-1
	Kimtech	34120	Chusteczki robocze 4,4x8,4 cala
Tace (242x241x20mm)	Thermo Fisher	240845	Służy do produkcji komory wilgotnej
Triton X-100	ACROS Organics	327372500
Woda ultraczysta	Milli-Q		Ultraczysta woda uzyskana z Milli-Q Integral Water Purification System
Watchglass	Carolina Biological	742300-20
° C zamrażarka-80
° C zamrażarka
Folia aluminiowa Szczep
OP50 E. coli
Orbital Shaker
Tape
Szczepy nicieni użyte w tym badaniu (oba dostępne na życzenie)
mntSi13[pME4.1] II; UNC-119(ED3) III; teIs1 [pRL475]		UMT 376	dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Kod źródłowy 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III	UMT 422		dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Odniesienie: to badanie