Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

Podsumowanie

Ten protokół demonstruje użycie testu ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ w linii zarodkowej C. elegans.

Streszczenie

Zrozumienie, kiedy i gdzie zachodzą interakcje białko-białko (PPI), jest kluczowe dla zrozumienia funkcji białek w komórce i tego, jak wpływają one na szersze procesy, takie jak rozwój. Linia zarodkowa Caenorhabditis elegans jest doskonałym systemem modelowym do badania IPP, które są związane z regulacją komórek macierzystych, mejozą i rozwojem. Istnieje wiele dobrze opracowanych technik, które pozwalają na znakowanie interesujących białek w celu rozpoznania przez standardowe przeciwciała, co sprawia, że system ten jest korzystny dla reakcji ligacji zbliżeniowej (PLA). W rezultacie, PLA jest w stanie pokazać, gdzie IPP występują w sposób przestrzenny i czasowy w liniach zarodkowych skuteczniej niż alternatywne podejścia. Opisano tutaj protokół zastosowania i kwantyfikacji tej technologii do badania IPP w linii zarodkowej C. elegans.

Wprowadzenie

Szacuje się, że ponad 80% białek wchodzi w interakcje z innymi cząsteczkami¹, co podkreśla, jak ważne są IPP dla realizacji określonych funkcji biologicznych w komórce². Niektóre białka funkcjonują jako węzły ułatwiające tworzenie większych kompleksów, które są niezbędne do przetrwania komórki¹. Centra te pośredniczą w wielu IPP i pomagają organizować białka w sieć, która ułatwia określone funkcje w komórce³. Na tworzenie kompleksów białkowych ma również wpływ kontekst biologiczny, taki jak obecność lub brak określonych oddziałujących partnerów⁴, zda....

Protokół

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje szczepy C. elegans, w których oznaczeni są potencjalni partnerzy do interakcji. Zdecydowanie zaleca się stosowanie szczepu kontroli ujemnej, w którym nie oczekuje się, że jedno znakowane białko będzie wchodzić w interakcje z innym oznakowanym potencjalnym partnerem interakcji. W tym przypadku sama GFP została wykorzystana jako kontrola negatywna do oceny tła, ponieważ nie oczekuje się, że DLC-1 będzie wchodzić w interakcje z GFP w robaku. Jako szczep eksperymentalny użyto OMA-1 oznaczonego GFP, ponieważ wstępne dane sugerują interakcję z DLC-1. Szczepy nicieni wykazujące współekspresję białek kontrolnych i testowych z DLC-1 oz....

Wyniki

Współimmunologiczne barwienie obu 3xFLAG::D LC-1; GFP oraz 3xFLAG::D LC-1; OMA-1::Linie zarodkowe GFP z przeciwciałami FLAG i GFP ujawniły swoje wzorce ekspresji w linii zarodkowej (Rysunek 3Aii-iii,3Bii-iii). Podczas gdy GFP był wyrażany w całej linii zarodkowej (Rysunek 3Aiii), OMA-1::Ekspresja GFP była ograniczona do późnego pachytenu i oocytów (Rysunek 3Biii)

Dyskusja

Podczas badania IPP w linii zarodkowej C. elegans , wyższa rozdzielczość oferowana przez PLA w porównaniu z barwieniem koimmunologicznym umożliwia wizualizację i kwantyfikację miejsc, w których zachodzą interakcje w linii zarodkowej. Wcześniej informowano, że DLC-1 bezpośrednio oddziałuje z OMA-1 za pomocą testu ściągającego GST in vitro ²⁶; Jednak ta interakcja nie została odzyskana przez ekstrakcję in vivo. Fluorescencyjne barwienie koimmunologiczne 3xFLAG::D LC-1; Linie zarodk.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
16% roztwór paraformaldehydu	Usługi mikroskopii elektronowej	15710	używany do wytwarzania 4% roztworu roboczego
1M KH2PO4	Sigma	P0662	Przygotuj zapas roboczy 1M
1x M9	różne		różne przygotowane jako 10x zapas używany przy 1x; patrz wormbook.org dla protokołu
1x PBS	różne	różne	zobacz wormbook.org do protokołu
26.5 Igła o rozmiarze 26.5	Exel International	26402	Igły używane do preparacji
BSA	Lampire	7500802
Probówki wirówkowe	Thermo Scientific	05-529C	50ml Dębowa rurka wirówkowa grzbietowa używana do synchronizacji
Mikroskop konfokalny	Zeiss	880
Coplin Jar	PolyLab	62101
Szkiełko nakrywkowe do zamrażania próbek	Globe Scientific	1411-10	22x40mm, nr 1
Szkiełko nakrywkowe do uszczelniania szkiełek	Globe	Scientific 1404-15	22x22mm, nr 1.5
DAPI Podłoże montażowe do immunofluorescencji	wektor	H-1200
Ligaza	Sigma-Aldrich		DUO82029 Duolink 1x Ligase, Wchodzi w skład zestawu odczynników do wykrywania in situ Duolink Czerwony DUO92008
Czerwony bufor wzmacniający	Sigma-Aldrich	DUO82011	Duolink 5x Amplification Red buffer, Jest częścią odczynników do wykrywania in situ Duolink Czerwony zestaw buforu
ligacyjnego	DUO92008 Aldrich DUO82009		Duolink 5x bufor ligacyjny, jest częścią zestawu odczynników do wykrywania in situ Duolink Red DUO92008
Rozcieńczalnik przeciwciał	Sigma-Aldrich	DUO82008	Rozcieńczalnik przeciwciał Duolink, w zestawie z DUO92004 i DUO92002, Uwaga: 1x roztwór PBS / 1% BSA może być również użyty jako substytut do rozcieńczenia przeciwciała.
Rozwiązanie blokujące	Sigma-Aldrich	DUO82007	rozwiązanie blokujące Duolink, w zestawie DUO92004 i DUO92002
medium montażowe do PLA Medium montażowe	Sigma-Aldrich	DUO82040	Duolink In Situ z sondą DAPI
MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004	Duolink In Situ Anti-Mouse Sonda MINUS
PLUS	Sonda Sigma-Aldrich	DUO92002	Duolink In Situ Anti-Rabbit PLUS
Bufor do płukania A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink In Situ wash Buffer A
Wash Buffer B	Sigma-Aldrich		DUO82048 Duolink In Situ wash Buffer B
Polimeraza	Sigma-Aldrich	DUO82030	Duolink Polymerase, Wchodzi w skład odczynników do wykrywania Duolink In Situ Czerwony zestaw DUO92008
Mikroskop epifluorescencyjny	Leica		DFC300G kamera, mikroskop DM5500B
Koza anty-mysz Alexa 594	JacksonImmuno	115-585-146	Użyj w 1:500
Koza anty-królik Alexa 488	JacksonImmuno	111-545-144	Użyj w 1:200
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu	Adobe		Adobe Photoshop + Illsutrator CS3
Szklana pipeta	Corning	7095B-5X
Lewamizol	ACROS Organics	187870100	Przygotuj zapas roboczy o pojemności 250 mM
Metanol Fisher	Scientific	A454
Mysz anty-FLAG	Sigma	F1804	Stosować w skali 1:1000 do immunofluorescencji i PLA, zalecany wstępny blok z normalną kozią surowicą Lakier
paznokci	L.A. kolory	CNP195
Pożywka do wzrostu nicieni (NGM)	różne		Zobacz wormbook.org dla protokół
Normalna surowica kozia	JacksonImmuno	005-000-121
Polietylenowa pipeta Pasteura	Globe Scientific	135030
Poli-L-Lizyna	Sigma-Aldrich	P1524	Przygotowany jako 0,1% roztwór podstawowy w wodzie, przechowywany w temperaturze -20C i rozcieńczony w stosunku 1:100 w wodzie do powlekania szkiełek
Szalki Petriego	Tritech	PD7060	średnica 60 mm
Królik anty-GFP	Thermo Fisher	G10362	Stosować w skali 1:200 dla immunofluorescencji, 1:4000 dla prowadnic PLA
	Thermo Fisher	30-2066A-Brown	Trzykwadratowe autoklawowalne prowadnice 14x14mm z prętami są zamawiane na zamówienie przez Fisher Scientific. Poli-L-lizyna dodawana do szkiełek w laboratorium
Roztwór podchlorynu sodu	Fisher Scientific	SS290-1
	Kimtech	34120	Chusteczki robocze 4,4x8,4 cala
Tace (242x241x20mm)	Thermo Fisher	240845	Służy do produkcji komory wilgotnej
Triton X-100	ACROS Organics	327372500
Woda ultraczysta	Milli-Q		Ultraczysta woda uzyskana z Milli-Q Integral Water Purification System
Watchglass	Carolina Biological	742300-20
° C zamrażarka-80
° C zamrażarka
Folia aluminiowa Szczep
OP50 E. coli
Orbital Shaker
Tape
Szczepy nicieni użyte w tym badaniu (oba dostępne na życzenie)
mntSi13[pME4.1] II; UNC-119(ED3) III; teIs1 [pRL475]		UMT 376	dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Kod źródłowy 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III	UMT 422		dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Odniesienie: to badanie

Sonda do Chusteczki zadaniowe