Artykuł metodologiczny

Ocena specyficznej dla wieku zdolności fagocytarnej dorosłych hemocytów Drosophila melanogaster za pomocą testu fagocytozy in vivo

7.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60983

⸱

11 czerwca 2020

 ,  , 
1Department of Biology, University of Maryland Baltimore County

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje test in vivo fagocytozy używany do oceny i ilościowego określenia zdolności młodych i starszych hemocytów Drosophila melanogaster do fagocytozy bakterii.

Streszczenie

Fagocytoza jest podstawową funkcją wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Proces ten jest przeprowadzany przez hemocyty fagocytarne, których podstawową funkcją jest rozpoznawanie szerokiej gamy cząstek i niszczenie patogenów drobnoustrojowych. Wraz z wiekiem organizmów proces ten zaczyna zanikać, jednak niewiele wiadomo na temat mechanizmów leżących u podstaw immunosenescencji. W tym przypadku test fagocytozy oparty na wstrzyknięciu in vivo służy do oceny związanych z wiekiem zmian w różnych aspektach fagocytozy, takich jak wiązanie, pochłanianie i degradacja zinternalizowanych cząstek, poprzez ilościowe określenie zdarzeń fagocytarnych w hemocytach u dorosłych Drosophila. Drosophila melanogaster stała się idealnym modelem do badania związanych z wiekiem zmian we wrodzonej funkcji immunologicznej z wielu powodów. Po pierwsze, wiele składników genetycznych i funkcji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, w tym fagocytoza, jest ewolucyjnie zachowanych między Drosophila a ssakami. Z tego powodu wyniki uzyskane przy użyciu tego protokołu mogą mieć duże znaczenie dla zrozumienia związanych z wiekiem zmian w funkcjonowaniu układu odpornościowego w różnych organizmach. Ponadto zauważamy, że metoda ta zapewnia ilościowe oszacowanie zdolności fagocytarnej hemocytów, co może być przydatne w różnych tematach badawczych i nie musi ograniczać się do badań nad starzeniem się.

Wprowadzenie

Wrodzony układ odpornościowy, który składa się z fizycznych i chemicznych barier dla infekcji, jak również składników komórkowych, jest ewolucyjnie zachowany w organizmach wielokomórkowych1,2. Jako pierwsza linia obrony, wrodzony układ odpornościowy odgrywa kluczową rolę w zwalczaniu atakujących patogenów u wszystkich zwierząt1,2,3. Składniki wrodzonej odpowiedzi immunologicznej obejmują szeroki zakres typów komórek, które są klasyfikowane na podstawie braku swoistości i pamięci immunologicznej2,3,4. U ludzi te typy komórek obejmują monocyty fagocytarne i makrofagi, neutrofile i cytotoksyczne komórki NK 4,5. Chociaż posiadanie funkcjonalnego układu odpornościowego jest niezbędne do przetrwania gospodarza, jasne jest, że funkcja komórek odpornościowych zmniejsza się wraz z wiekiem, co jest zjawiskiem znanym jako immunosenescencja5,6. Możliwość oceny związanych z wiekiem zmian w odpowiedzi immunologicznej, w tym różnych aspektów procesu fagocytozy, może pomóc w zrozumieniu immunosenescencji. Opisana tutaj procedura zapewnia skuteczne i powtarzalne podejście do oceny i ilościowego określania zdarzeń fagocytarnych przez hemocyty u Drosophila melanogaster.

Drosophila jest idealnym modelem do badania odpowiedzi immunologicznej z wielu powodów. Po pierwsze, dostępny jest obszerny zestaw narzędzi genetycznych, które umożliwiają łatwe manipulowanie ekspresją genów w sposób zależny od tkanki7. Narzędzia te obejmują kolekcję mutantów, zasoby interferencyjne RNA, stada GAL4/UAS oraz Panel Referencyjny Genetyki Drosophila, który zawiera 205 różnych linii wsobnych, dla których skatalogowane są całe sekwencje genomu8. Krótki cykl życiowy Drosophila i duża liczba wyprodukowanych osobników pozwalają naukowcom na przetestowanie wielu osobników w kontrolowanym środowisku w krótkim czasie. To znacznie poprawia zdolność do identyfikowania subtelnych różnic w odpowiedziach immunologicznych na infekcję między genotypami, płciami lub w różnym wieku. Co ważne, wiele składników genetycznych i funkcji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, w tym fagocytoza, jest ewolucyjnie zachowanych między Drosophila a ssakami1,2.

U Drosophila, proces fagocytozy, który następuje po infekcji, jest przeprowadzany przez hemocyty fagocytarne zwane plazmatocytami, które są odpowiednikiem makrofagów ssaków9. Hemocyty są niezbędne do rozpoznawania szerokiej gamy cząstek i usuwania patogenów mikrobiologicznych9,10,11,12,13. Komórki te wyrażają różnorodne receptory, które muszą odróżniać siebie od nie-siebie i inicjować zdarzenia sygnalizacyjne potrzebne do przeprowadzenia procesu fagocytarnego10,11,12,13,14,15. Gdy cząstka jest związana, zaczyna być internalizowana przez reorganizację cytoszkieletu aktyny i przebudowę błony plazmatycznej, aby rozszerzała się wokół cząstki, tworząc fagocytarną miseczkę11,12,13,14. Podczas tego procesu inny zestaw sygnałów mówi komórce, aby dalej internalizowała cząstkę poprzez zamknięcie miseczki fagocytarnej, tworząc fagosom związany z błoną11,12,13,14,15. Fagosom przechodzi następnie proces dojrzewania, łącząc się z różnymi białkami i łącząc się z lizosomami, tworząc kwaśny fagolizosom11,12,13,14,15. W tym momencie cząsteczki mogą być skutecznie degradowane i eliminowane11,12,13,14,15. Badania Drosophila wykazały, że starsze muszki (w wieku 4 tygodni) mają zmniejszoną zdolność do usuwania infekcji w porównaniu z młodszymi muchami (w wieku 1 tygodnia), prawdopodobnie z powodu, przynajmniej częściowo, spadku niektórych aspektów fagocytozy16,17.

Opisana tutaj metoda wykorzystuje dwie oddzielne, znakowane fluorescencyjnie, zabite termicznie cząstki E. coli, jedna z wzorcowym fluoroforem, a druga wrażliwą na pH, do oceny dwóch różnych aspektów fagocytozy: początkowego pochłaniania cząstek i degradacji cząstek w fagolizosomie. W tym teście fluorescencję cząstek można zaobserwować, gdy cząstki są związane i pochłaniane przez hemocyty, podczas gdy cząstki wrażliwe na pH fluoryzują tylko w warunkach niskiego pH fagosomu. Zdarzenia fluorescencyjne można następnie zaobserwować w hemocytach, które lokalizują się wzdłuż naczynia grzbietowego. Skupiamy się na hemocytach zlokalizowanych w naczyniu grzbietowym, które stanowią anatomiczny punkt orientacyjny do lokalizacji hemocytów, o których wiadomo, że przyczyniają się do usuwania bakterii i konsekwentnego ich izolowania. Jednak hemocyty w innych częściach ciała i hemolimfie są również ważne dla klirensu. Chociaż nie badaliśmy tej populacji komórek, nasza ogólna procedura może mieć zastosowanie również do testów fagocytarnych tych komórek. Jedną z zalet naszego podejścia jest to, że możemy określić ilościowo zdarzenia fagocytarne w obrębie poszczególnych hemocytów, co pozwala nam wykryć subtelne zmiany w procesach fagocytarnych. Inne badania, które wizualizują zdarzenia fluorescencyjne przez naskórek18,19 nie uwzględniają różnic w liczbie obecnych hemocytów, co jest szczególnie ważne do rozważenia w naszym przypadku, ponieważ oczekuje się, że całkowita liczba hemocytów zmieni się wraz z wiekiem17.

Protokół

1. Zbieranie i starzenie Drosophila

  1. Aby wygenerować muchy w tym samym wieku F1 do testowania fagocytozy, dodaj 5-10 dziewiczych samic i 5 samców o odpowiednich genotypach do fiolki zawierającej świeży pokarm dla much. Używamy food20 na bazie melasy z mąki kukurydzianej, ale metoda powinna działać niezależnie od rodzaju diety, na której hodowane są muchy. W tym eksperymencie użyliśmy Hemese (He)-GAL4; UAS-GFP leci do genetycznego znakowania hemocytów.
    UWAGA: Można użyć więcej much, ale niektóre linie D. melanogaster mogą nie kojarzyć się lub nie rozmnażać dobrze, gdy są przeludnione, a przeludnienie może mieć niekorzystny wpływ na rozwój larw21 i fagocytozę.
  2. Utrzymuj muchy w pożądanych warunkach eksperymentalnych. Na potrzeby tego eksperymentu utrzymuj He-GAL4; UAS-GFP leci w temperaturze 24 °C. Pozwolić dorosłym muchom na łączenie się w pary przez tydzień, a następnie usunąć dorosłe osobniki. Muchy F1 zostaną następnie zebrane z tych fiolek po eklozji do użytku eksperymentalnego.
  3. Zbieraj dziewicze muchy przez cały tydzień lub do momentu zebrania żądanej liczby much. Dziewice nie są wymagane; Jednak krycie może wpływać na odpowiedź immunologiczną. Jeśli muchy F1 mają być badane jako dziewice, należy oddzielić samce i samice w ciągu 8 godzin od zaniku i przechowywać w oddzielnych fiolkach, aby zapobiec kryciu. Zbierz wystarczającą liczbę much, aby umożliwić ocenę fagocytozy u co najmniej 10 much na genotyp/leczenie/płeć na wiek.
    1. Jeśli muchy starzeją się do jednego tygodnia, należy zebrać co najmniej 50 much lub 20 much na każdy warunek leczenia na każdą cząstkę, cząsteczki fluoru lub cząstki wrażliwe na pH, które mają zostać wstrzyknięte. Zapewni to co najmniej 10 much do oznaczenia w czasie eksperymentu.
    2. Jeśli starzenie się much trwa dłużej niż 3 tygodnie, zbierz łącznie co najmniej 100-150 much lub 50-75 much na stan leczenia, aby upewnić się, że dostępna jest wystarczająca liczba much do zmierzenia fagocytozy. Podczas starzenia się much w laboratorium zazwyczaj używamy klatek dla owadów utrzymywanych w temperaturze 24 °C w warunkach 12:12 L:D i zmieniamy pokarm co drugi dzień. Jeśli zamiast klatek używane są fiolki, końcówki są umieszczane w nowych fiolkach co 3-5 dni, w zależności od stanu pokarmu w fiolce. Liczba potrzebnych much będzie zależeć od tego, jak późno w wieku zostanie przeanalizowana fagocytoza oraz od wskaźników przeżycia tego genotypu w określonym wieku w określonych warunkach środowiskowych.
    3. Jeśli oceniane będą młode i starsze muchy, należy odpowiednio zaplanować, aby 1-tygodniowe i starsze muchy zostały wstrzyknięte tego samego dnia. Zminimalizuje to różnice w stężeniu cząstek między eksperymentami i zapewni, że wpływ wieku na pomiar fagocytarny nie zostanie pomylony z wpływem dnia, w którym przeprowadzono test.
  4. Zebrane muchy należy przechowywać w temperaturze 24 °C do 5-7 dnia życia lub utrzymywać muchy do pożądanego wieku.

2. Przygotuj fluorescencyjnie znakowane cząstki

  1. Odtworzyć zabite termicznie cząstki fluorowe E. coli lub wrażliwe na pH cząstki E. coli do stężenia podstawowego odpowiednio 20 mg/ml lub 1 mg/ml. Dostępne są inne bakterie, które mogą być bardziej odpowiednie do niektórych eksperymentów, ale należy zapoznać się z instrukcjami producenta, aby uzyskać informacje o odpowiednich stężeniach zapasów.
    1. W przypadku cząstek fluorowych dodać 990 μl 1x PBS (pH 7,4) lub preferowanego buforu i 10 μl 2 mM (20%) azydku sodu. Wir do mieszania.
      UWAGA: Azydek sodu jest środkiem konserwującym, który można pominąć; Jednak cząstki przygotowane bez azydku sodu nie utrzymują się tak długo. Cząsteczki fluoru należy zużyć w ciągu 24 godzin, a cząstki wrażliwe na pH należy zużyć w ciągu 7 dni.
    2. W przypadku cząstek wrażliwych na pH dodać 1 980 μl 1x PBS (pH 7,4) lub preferowanego buforu i 20 μl 2 mM (20%) azydku sodu. Wirować do mieszania.
    3. Przygotować wiele jednorazowych podwielokrotności 20 μl w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Cząsteczki fluoru należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do roku, a cząstki wrażliwe na pH w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy, chroniąc je przed światłem.
  2. W dniu wstrzyknięcia należy usunąć azydek sodu z cząstek przed użyciem. Aby to zrobić, odwiruj cząstki przez 5 minut w temperaturze 15 000 x g w temperaturze pokojowej.
  3. Usunąć supernatant i przepłukać cząstki dwukrotnie, ponownie zawieszając w 50 μl 1x PBS lub preferowanego buforu i wirować przez 5 minut przy 15 000 x g.
  4. Po drugim przemyciu usunąć supernatant i ponownie zawiesić cząstki w 100 μl 1x PBS lub preferowanego buforu. Trzymaj roztwór w probówce i zminimalizuj ekspozycję na światło przez cały czas trwania eksperymentu. Po usunięciu azydku sodu należy użyć cząsteczek fluoru w ciągu 24 godzin, a cząstek wrażliwych na pH w ciągu 5-7 dni.
    UWAGA: W naszych poprzednich eksperymentach odkryliśmy, że takie stężenie cząstek zapewnia policzalną liczbę zdarzeń fagocytarnych i że liczba cząstek dostępnych dla fagocytozy przez hemocyty nie była ograniczona17. Jednak użytkownicy tego protokołu mogą chcieć porównać wyniki przy użyciu innych stężeń, aby upewnić się, że w warunkach ich eksperymentów dostępna jest odpowiednia liczba cząstek do fagocytozy przez hemocyty.
    1. W przypadku pominięcia azydku sodu, należy rozcieńczyć cząstki w stosunku 1:5 w tym samym buforze, z którym przygotowano cząstki do wstrzykiwań.
  5. Dodaj kroplę (~10 μL) zielonego barwnika spożywczego do cząstek. Ułatwia to upewnienie się, że muchy zostały wstrzyknięte.

3. Wstrzyknąć muchy

  1. Przygotować szklane igły do wstrzykiwań.
    1. Wyciągnij szklane igły za pomocą ściągacza do pipet. Ustaw grzałkę ściągacza pipet na 55 °C, a elektrozawór na 45 °C. Używaj tylko igieł dostarczonych z wstrzykiwaczem, ponieważ nie ma gwarancji, że inne igły będą działać z taką samą precyzją.
    2. Napełnij sterylną strzykawkę o pojemności 1 ml olejem mineralnym i przymocuj igłę podskórną (G) o rozmiarze 30, dostarczoną z nanowtryskiwaczem.
    3. Napełnij ciągniętą igłę kapilarną, wkładając igłę 30 G w koniec wyciągniętej szklanej igły i napełnij olejem mineralnym. Powoli wyjąć igłę 30 G, upewniając się, że w całej igle nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ może to spowodować niedokładne objętości wstrzyknięć. Wtryskiwacz nie będzie działał prawidłowo bez zasypania igły.
    4. Za pomocą kleszczyków odłamać końcówkę igły, aby utworzyć otwór umożliwiający wyrzucenie roztworu.
  2. Zamontuj nano-wtryskiwacz.
    UWAGA: Można stosować inne wtryskiwacze. Metoda opisana poniżej ma zastosowanie do nanowtryskiwacza. W przypadku innych wtryskiwaczy zapoznaj się z instrukcją obsługi, aby uzyskać instrukcje.
    1. Ustaw wtryskiwacz na żądaną objętość (od 46 nL do 69 nL).
    2. Zdejmij tuleję zaciskową i umieść O-ring uszczelniający, białą przekładkę z wgłębieniem skierowanym do góry, aby przyjąć tylny koniec igły, a większy O-ring na metalowym tłoku, w tej kolejności. Ponownie zamocuj tuleję zaciskową bez jej dokręcania.
    3. Włożyć metalowy tłok do końca szklanej igły wypełnionej olejem. Delikatnie wciśnij igłę w dół, wkładając ją do większego O-ringu. Dokręć tuleję zaciskową, aż będzie bezpieczna.
      UWAGA: Jeśli metalowy tłok nie wystaje poza tuleję zaciskową, naciśnij i przytrzymaj przycisk "EMPTY", aż tłok będzie widoczny. Ułatwia to upewnienie się, że tłok jest włożony do igły.
    4. Naciśnij i przytrzymaj "EMPTY", aż wtryskiwacz wyda sygnał dźwiękowy. Powoduje to wyrzucenie większości oleju mineralnego z igły, pozostawiając niewielką objętość oleju, która działa jako bariera między tymi dwoma cieczami, a także usuwa pęcherzyki powietrza.
    5. Napełnij igłę cząstkami fluoru lub cząstkami wrażliwymi na pH, wkładając końcówkę szklanej igły do probówki mikrowirówki zawierającej przygotowane cząstki.
    6. Naciśnij i przytrzymaj "FILL", aż wtryskiwacz wyda sygnał dźwiękowy.
  3. Wstrzykiwań
    1. Muchy, które mają być wstrzyknięte, przenieść do pustej fiolki. Unieruchomić muchy, umieszczając fiolkę w lodzie. CO2 może być również używany do unieruchamiania much. Należy jednak pamiętać, że w przypadku stosowania cząstek wrażliwych na pH, podwyższony poziom CO2 może sztucznie zakwaszać wszelkie stosowane i może zwiększyć fluorescencję tła.
    2. Wstrzyknąć muchy do płytki mostkowo-opłucnowej klatki piersiowej (Ryc. 1A). Wstrzyknięcie jest udane, jeśli zauważy, że zielony barwnik dostaje się do muchy (Ryc. 1B). Jeśli mucha nie zmieni koloru na zielony, upewnij się, że igła nie jest zatkana.
      UWAGA: Alternatywnie, muchy mogą być wstrzykiwane w jamę brzuszną, ale miejsce wstrzyknięcia powinno być spójne we wszystkich eksperymentach.
    3. Umieść wstrzyknięte muchy w nowej fiolce z pokarmem, zwracając uwagę na czas, w którym wstrzyknięto pierwszą i ostatnią muchę. Aby zminimalizować błąd eksperymentalny spowodowany ilością czasu potrzebną do zakończenia wstrzyknięć, należy wykonać wstrzyknięcia w odpowiednim czasie. Przy nabraniu wprawy wstrzyknięcie jednego zestawu much nie powinno zająć więcej niż 10 minut. Położyć fiolkę na boku, aż wszystkie muchy wyzdrowieją, aby zapobiec utknięciu much w pożywieniu.
    4. Pozwól muszkom zregenerować się przez 60-90 minut, w zależności od warunków eksperymentalnych. W tym przypadku zastosowano 60-minutowy czas regeneracji. Należy zauważyć, że ten zakres czasu rekonwalescencji był optymalny do liczenia zdarzeń fagocytarnych w warunkach eksperymentalnych w badaniu Horn et al. 17. Jednak w niektórych warunkach może to być zbyt długie, aby wykryć subtelne różnice w fagocytozie między grupami leczonymi. Przydatne może być przeprowadzenie eksperymentów z kursem czasowym, tak jak to miało miejsce wcześniej17 w celu określenia czasu regeneracji, który ujawni maksymalne różnice między wynikami kontrolnymi i eksperymentalnymi. Niezależnie od wybranego czasu rekonwalescencji, należy go przestrzegać we wszystkich eksperymentalnych terapiach.
    5. W przypadku wstrzykiwania z cząstkami fluoru i cząstkami wrażliwymi na pH tego samego dnia, należy użyć nowej igły do każdego roztworu. Nie należy wstrzykiwać pojedynczym muszkom obu cząstek, jeśli obie fluoryzują na czerwono, ponieważ wynik nie rozróżniałby dwóch aspektów fagocytozy, wiązania/pochłaniania cząstek a inkluzji cząstek w fagosomie.

4. Sekcja naczynia grzbietowego

  1. Po wyzdrowieniu much przez 60-90 minut, przenieś wszystkie żywe muchy do pustej fiolki i unieruchomij na lodzie.
  2. Przenoś jedną muchę na raz na płytkę preparacyjną z elastomeru silikonowego.
    UWAGA: Płytki rozwarstwiające należy przygotować co najmniej 1 tydzień przed użyciem, jeśli utwardzają się w temperaturze pokojowej. Aby to zrobić, przygotuj elastomer i wlej go do szalki Petriego o wymiarach 33 mm x 10 mm, wypełniając naczynie mniej więcej do połowy. Delikatnie postukaj naczyniem o płaską powierzchnię, aby zminimalizować pęcherzyki powietrza. Pozostaw talerze w temperaturze pokojowej w spokoju przez co najmniej tydzień.
    1. Pod mikroskopem stereoskopowym zorientuj muchę brzuszną stroną do góry.
    2. Za pomocą szpilek do owadów przypnij muchę do płytki, wkładając jedną szpilkę przez klatkę piersiową, a drugą szpilkę przez najbardziej tylny koniec brzucha, w pobliżu genitaliów (Ryc. 2A). Przydatne może być przecięcie szpilek na pół przed przypinaniem próbki, aby nie utrudniać sekcji. Powtórz z maksymalnie 10 muchami na płytkę preparacyjną.
      UWAGA: Opcjonalnie: Zdejmij skrzydła i nogi przed przypięciem muchy do płyty. Pomoże to zapobiec tworzeniu się pęcherzyków wokół muchy po dodaniu pożywki.
    3. Gdy wszystkie muchy zostaną przypięte do płytki, dodaj wystarczającą ilość pożywki do preparacji, aby pokryć muchy (~1 ml) za pomocą pipety transferowej.
    4. Za pomocą kleszczy lub nożyczek do skórek zdejmij głowę.
    5. Za pomocą nożyczek do skórek wykonaj dwa poziome nacięcia: jedno bezpośrednio nad tylną szpilką w jamie brzusznej, a drugie na najbardziej wysuniętym do przodu końcu brzucha, gdzie spotykają się klatka piersiowa i brzuch (Ryc. 2B, C). W Rysunek 2, głowa pozostała nienaruszona, aby wyjaśnić orientację.
    6. Wykonaj pionowe nacięcie, łącząc dwa poziome nacięcia (trzy nacięcia przypominają literę I). Spowoduje to otwarcie jamy brzusznej (Rysunek 2D).
    7. Za pomocą kleszczy usuń narządy wewnętrzne i tkanki, omijając naczynie grzbietowe. Jeśli nie jest zakłócone, przezroczyste naczynie grzbietowe często można zobaczyć pulsujące w pobliżu przedniego końca brzucha. Dodatkowe szpilki mogą być użyte do otwarcia nowo obciętych końców naskórka (Rysunek 2E, F).
    8. Za pomocą nożyczek do skórek usuń klatkę piersiową. Alternatywnie, klatkę piersiową można usunąć przed zamontowaniem wypreparowanych skórek i naczynia grzbietowego na szkiełku mikroskopowym.
    9. Powtórz z pozostałymi muchami. Wypreparuj muchy w odpowiednim czasie, aby zminimalizować możliwe wahania szybkości fagocytarów. Po wycięciu wszystkich much pozostaw skórki z dołączonym naczyniem grzbietowym przypięte do płytki. Wszystkie kroki 5 zostaną przeprowadzone na płycie preparcyjnej. Zapobiegnie to uszkodzeniu lub przypadkowemu wyrzuceniu skórek między krokami.

5. Utrwalanie i barwienie

  1. Przymocuj wypreparowane skórki z dołączonym naczyniem grzbietowym w 4% paraformaldehydzie (PFA).
    1. Używając nowej jednorazowej pipety transferowej do każdego etapu, wyrzuć pożywkę do preparacji i zastąp ją 1 ml 4% PFA. Przez cały czas utrwalania i barwienia należy w miarę możliwości chronić sekcje przed światłem.
    2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut z kołysaniem przy 20 obr./min. Nie pozwól, aby sekcje pozostawały w utrwalaczu dłużej niż 20 minut, ponieważ może to spowodować uszkodzenie tkanki.
  2. Umyj skórki 2x w 1x PBS + 0,1% Tween (PBST).
    1. Usuń utrwalacz i zastąp go 1 ml 1x PBST.
    2. Prać w temperaturze pokojowej przez 15 min z bujaniem.
    3. Powtórz 1x.
      UWAGA: Wypreparowaną, utrwaloną tkankę można przechowywać w temperaturze 4 °C, do 3 dni, chroniąc przed światłem, po pierwszym praniu poprzez wymianę prania na świeży PBST. Nie przechowywać utrwalonej tkanki, jeśli będą używane przeciwciała. Aby uzyskać najlepsze wyniki, przeciwciała należy stosować ze świeżą tkanką.
  3. Opcjonalnie: barwienie przeciwciałami. Przeciwciała mogą być używane do wyraźnej wizualizacji naczynia grzbietowego (Ryc. 3) lub do wykrywania markerów specyficznych dla hemocytów. Może to zapewnić, że policzone zostaną tylko komórki wzdłuż naczynia grzbietowego lub oznaczyć błonę hemocytów.
    1. Usunąć drugie płukanie, dodać przeciwciało pierwszorzędowe w odpowiednim rozcieńczeniu. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, kołysząc się.
    2. Usuń przeciwciało pierwszorzędowe i przemyj dwukrotnie PBST przez 15 minut z kołysaniem.
    3. Dodaj fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe. Zalecamy przeciwciało zielonofluorescencyjne, aby nie przesłaniało cząstek fluorescencyjnych. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, z bujaniem.
    4. Usunąć przeciwciało drugorzędowe, przemyć dwukrotnie przez 15 minut każdy PBST.
  4. Plama za pomocą DAPI.
    1. Usuń końcowe płukanie i zastąp 1 ml DAPI rozcieńczonym w PBST (1:1000).
    2. Bejcować przez 20 minut z kołysaniem w temperaturze pokojowej.
    3. Usuń DAPI i umyj 2x (powtórz krok 5.2).
    4. Wymień końcowe pranie na świeże 1x PBST.
      UWAGA: Muchy można przechowywać w temperaturze 4 °C, do 3 dni, chroniąc przed światłem, po pierwszym praniu poprzez wymianę prania na świeży PBST.

6. Montaż skórek na szkiełkach mikroskopowych i obrazowanie

  1. Przygotuj wypreparowane skórki.
    1. Pod mikroskopem stereoskopowym odetnij nadmiar naskórka, który mógłby zakłócać obrazowanie.
    2. Za pomocą kleszczy przenieś skórki z dołączonym naczyniem grzbietowym do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 70% glicerolu. Umieszczenie skórek w glicerolu pomoże usunąć PBST i pozwoli na uzyskanie wyraźniejszego obrazu podczas obrazowania.
  2. Zamontuj skórki na szkiełku mikroskopowym.
    1. Dodaj kilka kropli 70% glicerolu do szkiełka mikroskopowego.
    2. Za pomocą kleszczyków usuń skórki z tubki z glicerolem i umieść glicerol na szkiełku.
    3. Pod mikroskopem stereoskopowym do preparowania użyj kleszczyków, aby zorientować skórki brzuszną stroną do góry, upewniając się, że naczynie grzbietowe jest widoczne. Ciemniejszy pigment naskórka będzie skierowany w dół.
    4. W razie potrzeby dodaj dodatkową kroplę glicerolu. Pomaga to zapobiegać powstawaniu pęcherzyków powietrza i pozwala uzyskać wyraźniejszy obraz.
    5. Delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na skórki i uszczelnij krawędzie lakierem do paznokci. Pozostaw do wyschnięcia na 10-15 minut przed kontynuacją. Muchy należy natychmiast wyobrazić lub przechowywać w nieprzepuszczającym światła pudełku w temperaturze 4 °C.
  3. Wyobraź sobie naczynie grzbietowe.
    1. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego użyj systemu interferencji strukturalnej do wygenerowania przekrojów optycznych naczynia grzbietowego. Alternatywnie można użyć mikroskopu konfokalnego, który może zapewnić dodatkową dokładność. Uzyskaj obrazy Z-stack naczynia grzbietowego za pomocą obiektywu 20x i preferowanego oprogramowania do obrazowania. Dodaj podziałkę liniową 10 mm, a następnie odpowiednio oznacz i zapisz obrazy jako pliki tiff (Rysunek 4) lub żądany format.
      UWAGA: Liczba uzyskanych obrazów ze stosu Z może się różnić w zależności od sekcji i zależy od tego, jak dobrze naczynie grzbietowe zostało wypreparowane oraz od pożądanego rozmiaru kroku między obrazami. W tym przypadku rozmiar kroku został ustawiony na 0,49 mm. Z naszego doświadczenia wynika, że liczba ta może wynosić od 3 do 40 obrazów na stos
      2. .

7. Analizuj obrazy

  1. Określ ilościowo zdarzenia fluorescencyjne za pomocą ImageJ.
    1. Otwórz obrazy i ułóż je w stos: Image à Stacks à Images to Stack.
    2. Policz tylko sygnały fluorescencyjne o wielkości ~1 mm o średnicy 10 mm wyśrodkowane na jądrze DAPI-dodatnim, klikając każde zdarzenie z co najmniej 10 komórek na muchę, z co najmniej 10 much na wiek na wstrzyknięty typ cząstki: Plugins à Analyze à Cell Counter Notice (Rysunek 5A). Narzędzie do powiadamiania o liczniku komórek przypisuje inny kolor do każdej śledzonej komórki, z kolorową kropką, która odpowiada każdemu zdarzeniu fluorescencyjnemu klikniętemu w tej komórce.
    3. Aby wyświetlić listę licznika i pozycji stosu skojarzonej z każdym punktem, naciśnij "m" lub wybierz Zmierz na karcie Analizuj, lub aby wyświetlić liczbę zdarzeń zliczonych w każdej komórce w tabeli wyników, naciśnij "alt + y" (Rysunek 5B).
    4. Przenieś liczbę komórek do arkusza kalkulacyjnego, który ma być używany do analizy statystycznej.
  2. Przeprowadzanie analiz statystycznych.
    1. Analizuj różnice w zdarzeniach fagocytarnych przy użyciu ANOVA o stałych efektach lub zagnieżdżonej ANOVA w modelu mieszanym. Modele mieszane mogą być używane do testowania głównych stałych efektów wieku i genotypu oraz losowego wpływu osobników zagnieżdżonych w każdym genotypie17.
      UWAGA: Badacze powinni być rygorystyczni w testowaniu założeń każdej procedury statystycznej używanej do analizy danych.

Wyniki

Aby zilustrować opisane metody iniekcji, Rysunek 1A przedstawia miejsce iniekcji u Drosophila melanogaster, a także sposób, w jaki barwnik spożywczy pozwala na wizualne potwierdzenie wykonania iniekcji u muchy (Rysunek 1B). Dodatek barwnika spożywczego ułatwia również rozpoznanie zatkanej igły. Iniekcje można wykonywać w odwłoku, jednak należy zachować spójność miejsca iniekcji we wszystkich doświadczeniach. Pomoże to zminimalizować możliwe różnice między poszczególnymi eksperymentami.

Aby zwizualizować fluorescencyjnie znakowane cząsteczki w obrębie hemocyt rezydentnych wzdłuż naczynia grzbietowego, wypreparowano naczynie grzbietowe oraz przylegającą kutykulę odwłosa. Rysunek 2A-F przedstawia metody preparowania.

Aby ocenić zależną od wieku zdolność młodych i starych much do przeprowadzania fagocytozy, hemocyty wzdłuż naczynia grzbietowego są wizualizowane przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Aby upewnić się, że liczone są tylko komórki wzdłuż naczynia grzbietowego, można zastosować przeciwciała lub geny z tagiem GFP dla określonych markerów komórek krwi lub kolagenu specyficznego dla serca, takich jak Hemese i Hemolectin, lub Pericardin (Rycina 3)2,23,24. Cząsteczki E. coli znakowane fluorescencyjnie mają długość 1 mm, podczas gdy hemocyty mają średnicę 10 mm17. Liczone są tylko te zdarzenia fluorescencyjne, które znajdują się w obrębie obszaru o średnicy 10 mm z centrum w jądrze DAPI-dodatnim (Rycina 4). Do ilościowego określenia zdarzeń fluorescencyjnych wykorzystuje się oprogramowanie ImageJ (Rycina 5).

Disekcja Drosophila i ekspresja GFP; obraz mikroskopowy; badanie genetyczne.
Rysunek 1: Miejsce wstrzyknięcia i weryfikacja wizualna. (A) Boczną stronę klatki piersiowej przebija się igłą z kapilarą o wyciągniętym końcu. (BWstrzyknięcia są weryfikowane wizualnie poprzez dodanie zielonego barwnika spożywczego do roztworu cząstek. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Disekcja Drosophila, obrazy mikroskopowe, przedstawiające proces analizy genetycznej z użyciem markerów krok po kroku.
Rysunek 2: Disekcja naczynia grzbietowego. (A) Szpilki umieszcza się w klatce piersiowej oraz tylnej części odwłoka (czarne strzałki). (B-C) Wykonuje się dwa poziome nacięcia (zielone strzałki) na tylnym końcu odwłoka (B), oraz koniec przedni (C). (D) Wykonuje się pionate nacięcie (zielona strzałka) wzdłuż środka brzucha, łącząc dwa nacięcia poziome. (E) Opcjonalne piny (*) są wykorzystywane do rozwarcia jamy brzusznej w celu odsłonięcia tkanek wewnętrznych. (F) Usunięto tkanki wewnętrzne (wole, jelita, macicę, jajniki, ciała tłuszczowe), odsłaniając naczynie grzbietowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obraz mikroskopowy aktywności sieci neuronalnej w mikroskopii fluorescencyjnej, uwidaczniający szlaki neuronalne.
Rycina 3: Widok brzuszny wypreparowanego naczynia grzbietowego samicy w wieku 5 tygodni, której wstrzyknięto cząstki wrażliwe na pH, z barwieniem przeciwciałem skierowanym przeciwko perikardynie (A). Biała przerywana linia obrysowuje boczną stronę naczynia grzbietowego, a strzałka wskazuje region przedni.B) Powiększony obraz (A): skupiska hemocytów (niebieska strzałka) aktywnie degradujących bakterie, w obrębie pierwszej komory aorty naczynia grzbietowego. (C) Powiększony obraz (A) z zaznaczeniem białka przypominającego kolagen z macierzy pozakomórkowej (ECM), perikardyny (zielona strzałka), która stabilizuje naczynie grzbietowe w jego położeniu24. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna; barwienie na czerwono i niebiesko; struktury komórkowe; skala 10 µm; schemat; analiza.
Rycina 4: Disekowane naczynie grzbietowe i powiązane z nim hemocyty z samicy muchy po wstrzyknięciu cząsteczek wrażliwych na pH lub cząsteczek fluorescencyjnych. (A) naczynie grzbietowe i powiązane hemocyty z pochłoniętym znacznikiem wrażliwym na pH E. coli cząstki (czerwone), lub (E) znakowany fluorescencyjnie E. coli cząsteczki (czerwone), wyizolowane z 1-tygodniowej muchy, po 60 min regeneracji (B,F) Powiększony wycinek (A) i (E) (biała ramka), odpowiednio, przedstawiające dwa poszczególne hemocyty z policzalnymi zdarzeniami. (C) Naczynie grzbietowe oraz powiązane hemocyty z pochłoniętymi znacznikami wrażliwymi na pH *E. coli* cząsteczki (czerwone) lub ( G) znakowane fluorescencyjnie E. coli cząsteczki (czerwone), wyizolowane z 5-tygodniowej muchy, po 60 min regeneracji (D,H) Powiększony wstawka z (C) i (G) (biała ramka), odpowiednio, przedstawiające dwa pojedyncze hemocyty z policzalnymi zdarzeniami. Biała przerywana linia obrysowuje boczną stronę naczynia grzbietowego, a strzałka wskazuje region przedni. Jądra barwione DAPI (niebieski). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające segmentację i analizę komórek; zastosowanie wtyczki ImageJ.
Rycina 5: Ilościowe określanie zdarzeń fagocytozy w obszarze 10 mm hemocyty za pomocą licznika komórek w programie ImageJ. (APo otwarciu obrazu lub obrazów w programie ImageJ można użyć narzędzia Cell Counter Notice, aby monitorować liczbę zdarzeń fagocytozy w każdej komórce.BNarzędzie to przypisze inny kolor do każdej komórki wybranej do policzenia, przy czym każda kropka będzie odpowiadać zdarzeniu fluorescencyjnemu w obrębie danej komórki. Naciśnięcie kombinacji klawiszy „alt+y” spowoduje wyświetlenie tabeli przedstawiającej liczbę zdarzeń policzonych w każdej komórce. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół jest wiarygodnym sposobem ilościowego określenia różnych aspektów fagocytozy w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych. Zwracamy uwagę, że przetestowaliśmy tę procedurę tylko z cząstkami bakterii Gram-ujemnych, a wyniki mogą się różnić, jeśli używane są cząstki bakterii Gram-dodatnich. Rzeczywiście, interesujące byłoby porównanie odpowiedzi fagocytarnych zarówno na bakterie Gram-ujemne, jak i Gram-dodatnie w różnych warunkach eksperymentalnych. Zastosowanie nanoiniektora pozwala na precyzyjną kontrolę nad objętościami iniekcji, zapewniając, że każda mucha jest wstrzykiwana z tą samą objętością cząstek. Jednym z ograniczeń protokołu są niespójności w przygotowaniu cząstek. Cząstki agregują się po zamrożeniu, więc niewielkie różnice w objętościach rozcieńczeń lub brak wirowania mogą wpływać na stężenie cząstek między eksperymentami. Aby zminimalizować możliwe różnice w stężeniach cząstek w zależności od wieku, korzystne jest wstrzykiwanie 1- i 5-tygodniowych muszek tego samego dnia, przy użyciu tej samej igły i roztworu cząstek. Inną potencjalną wadą jest to, że podczas sekcji naczynie grzbietowe i/lub naskórek mogą łatwo ulec uszkodzeniu, jeśli szpilki nie są odpowiednio obsługiwane. Aby uniknąć przerwania naczynia grzbietowego, zminimalizuj liczbę szpilek używanych na preparację. Zaletą tej metody preparacji jest to, że wszystkie etapy utrwalania, mycia i barwienia można wykonać na płycie preparcyjnej. Ponieważ skórki są przyklejone, zapobiega to gubieniu skórek między krokami.

W porównaniu z istniejącymi metodami 18,19,25,26,27,28,29, opisany protokół ma swoje zalety i ograniczenia. Przeprowadzając sekcję naczynia grzbietowego, jesteśmy w stanie uwidocznić i określić ilościowo poszczególne hemocyty w tym miejscu. Umożliwia to wykrycie subtelnych zmian w aktywności fagocytarnej między grupami eksperymentalnymi. Inne metody wizualizują fluorescencyjnie znakowane cząstki poprzez zbieranie hemocytów za pomocą testu Bleed/Scrape 19,25,26,27 lub przez nienaruszony naskórek brzuszny 18,19,28,29; Jednak poszczególnych hemocytów nie można ocenić, gdy są one uwidocznione przez naskórek grzbietowy. Zaletą tego protokołu, w porównaniu z metodą Bleed/Scrape, jest to, że nasza metoda pozwala nam ocenić tylko te hemocyty związane z naczyniem grzbietowym i uwzględnia komórki krążące lub te wzdłuż ściany ciała, które mogą być funkcjonalnie różne. Wypreparowanie naczynia grzbietowego eliminuje również potrzebę włączania drugiej rundy iniekcji z gaszeniem fluorescencji, takim jak błękit trypanowy19,26. Dzieje się tak, ponieważ wszelkie cząsteczki, które nie są związane z komórką lub przez nią pochłonięte, zostaną zmyte podczas etapów prania. I odwrotnie, metody alternatywne mogą być łatwiejsze do wykonania, ponieważ nie wymagają sekcji. Chociaż preparowanie naczynia grzbietowego jest łatwe do nauczenia, ten krok dodaje poziom złożoności, który może być niewykonalny w niektórych projektach eksperymentalnych.

Chociaż opisane zastosowanie tego testu fagocytozy in vivo polega na ocenie i ilościowym określeniu zdarzeń fagocytarnych w różnym wieku, protokół ten jest wysoce elastyczny i może być używany do analizy różnych aspektów fagocytozy między genotypem, płcią lub typem tkanki. Ponieważ fagocytoza ma kluczowe znaczenie dla większości zwierząt wielokomórkowych, zrozumienie, w jaki sposób proces ten zanika wraz z wiekiem, może prowadzić do lepszych metod leczenia starzejącej się populacji. Podejście to oferuje długoterminowy potencjał w zakresie wyjaśniania aspektów związanych z wiekiem zmian w odpowiedzi immunologicznej, ze szczególnym uwzględnieniem fagocytozy.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z National Institutes of Health R03 AG061484-02 oraz UMBC College of Natural and Mathematical Sciences Becton Dickinson Faculty Research Fund.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,10 mm Szpilki do owadówFine Science Tools26002-10Tutaj: szpilki są przecinane na pół, a ostry koniec jest używany
1 ml sterylne strzykawkiBecton Dickinson309602Wypełniony olejem mineralnym do ładowania igły
15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)Gibco16000-044do podłoża preparacyjnego
16 % ParaformaldehydMikroskopia elektronowa Nauki15710Klasa EM, 4% pracy, rozcieńczona w 1X PBS
1x Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)SigmaP3813
3 mL Trasnfer PipetFalcon357524
3,5-calowe szklane kapilaryDrummond3-000-203-G / X1,14 mm OD X 3,5 "długości X 0,53" ID
35x10 mm Szalki PetriegoBecton Dickinson351008Używany jako płytka preparacyjna, wypełniona do połowy Sylgard
6x penicylina/streptomycynaLife Technologies15140-122do mediów preparacyjnych
70% GlycerolSigmaG9012
Analogowy mieszalnik wirowyVWR58816-121
Biologiczne kleszcze punktowe, Dumont No. 5Fine Science Tools11295-10
DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol)Life TechnologiesD1306Rozcieńczony w stosunku 1:1000 w 1x PBST
Drosophilaw[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8
E. coli (szczep K-12) BioParticles™, Alexa Fluor™ 594 sprzężonyLife TechnologiesE23370
SzkiełkaPremiereD17026102
Rozwiązanie do obrazowania żywych komórekLife TechnologiesA14291DJpreferowany bufor do przygotowania i rozcieńczania cząstek
Olej mineralnyMpbio
Automatyczny wtryskiwacz nanolitrów Nanoject IIDrummond3-000-204
Wąskie fiolki z polistyrenu Super Bulk DrosophilaGenesee32-116SBRozmiar: 25 X 95 mm
Mikser nutacyjnyFisher Scientific88-861-043Używana prędkość: 20 obr./min
pHrodo™ Czerwone biocząstki E. coli i handel; Koniugat do fagocytozyLife TechnologiesP35361
Pożywka do hodowli komórkowych Drosophila Schneidera (1x)Gibco21720-024Pożywki preparacyjne, łączenie: Schneiders, FBS i długopis / paciorkowiec; filtr sterylizować
Azydek soduSigma-AldrichS20022mM (lub 20%) robocze
Nożyczki sprężynoweFine Science Tools15000-00
Sylgard 184 Elastomer silikonowyMikroskopia elektronowa Nauki24236-10Przygotuj zgodnie z dostarczonym protokołem
Tween 20SigmaP1379Dla pionowego ściągacza do pipet PBS + 0,1% teen
Model 700CDavid Kopf Instrumenty812368Grzałka: 55? Elektrozaid: 45
Mikroskop fluorescencyjny Zeiss AxioImager.Z1ZeissHere: System interferencji strukturalnej Apotome z oprogramowaniem do obrazowania Zeiss Zen
szczep podstawowe 194836

Bibliografia

  1. Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in ageing animals by regulating sphingolipid metabolism. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 22 (2018).
  2. DeVeale, B., Brummel, T., Seroude, L. Immunity and aging: the enemy within. Aging Cell. 3 (4), 195-208 (2004).
  3. Gomez, C. R., Nomellini, V., Faunce, D. E., Kovacs, E. J. Innate immunity and aging. Experimental Gerontology. 43 (8), 718-728 (2008).
  4. Panda, A., et al. Human innate immunosenescence: causes and consequences for immunity in old age. Trends in Immunology. 30 (7), 325-333 (2009).
  5. Aw, D., Silva, A. B., Palmer, D. B. Immunosenescence: emerging challenges for an ageing population. Immunology. 120 (4), 435-446 (2007).
  6. Min, K. -J., Tatar, M. Unraveling the molecular mechanism of immunosenescence in Drosophila. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), 2472(2018).
  7. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  8. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  9. Banerjee, U., Girard, J. R., Goins, L. M., Spratford, C. M. Drosophila as a genetic model for hematopoiesis. Genetics. 211 (2), 367-417 (2019).
  10. Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. B. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).
  11. Garschall, K., Flatt, T. The interplay between immunity and aging in Drosophila. F1000Research. 7, (2018).
  12. Brennan, C. A., Anderson, K. V. Drosophila: The genetics of innate immune recognition and response. Annual Review of Immunology. 22 (1), 457-483 (2004).
  13. Rosales, C., Uribe-Querol, E. Phagocytosis: a fundamental process in immunity. BioMed Research International. 9042851, Research article (2017).
  14. Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (10), 781-795 (2008).
  15. Stuart, L., et al. A systems biology analysis of the Drosophila phagosome. Nature. 445 (7123), 95-101 (2007).
  16. Mackenzie, D. K., Bussière, L. F., Tinsley, M. C. Senescence of the cellular immune response in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 46 (11), 853-859 (2011).
  17. Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes. Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).
  18. Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila. Current Biology. 10 (13), 781-784 (2000).
  19. Garg, A., Wu, L. P. Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus. Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).
  20. Bloomington Drosophila Stock Center: Indiana University Bloomington. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/innformation/recipes/molassesfood.html (2019).
  21. Fellous, S., Lazzaro, B. P. Larval food quality affects adult (but not larval) immune gene expression independent of effects on general condition. Molecular Ecology. 19 (7), 1462-1468 (2010).
  22. Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2622-2627 (2003).
  23. Goto, A., et al. A Drosophila haemocyte-specific protein, hemolectin, similar to human von Willebrand factor. Biochemical Journal. 359, Pt 1 99-108 (2001).
  24. Cevik, D., Acker, M., Michalski, C., Jacobs, J. R. Pericardin, a Drosophila collagen, facilitates accumulation of hemocytes at the heart. Developmental Biology. 454 (1), 52-65 (2019).
  25. Ghosh, S., Mandal, S., Mandal, L. Detecting proliferation of adult hemocytes in Drosophila by BrdU incorporation and PH3 expression in response to bacterial infection. Wellcome Open Research. 3, (2018).
  26. Hao, Y., Yu, S., Luo, F., Jin, L. H. Jumu is required for circulating hemocyte differentiation and phagocytosis in Drosophila. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 95(2018).
  27. Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying blood cell populations of the Drosophila melanogaster larva. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
  28. Gyoergy, A., et al. Tools allowing independent visualization and genetic manipulation of Drosophila melanogaster macrophages and surrounding Tissues. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (3), 845-857 (2018).
  29. Bosch, P. S., et al. Blood cells of adult Drosophila do not expand, but control survival after bacterial infection by induction of Drosocin around their reservoir at the respiratory epithelia. BioRxiv. 578864, (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hemocyty Drosophilaobrazowanie in vivoizolacja hemocyt wobrazowanie fluorescencyjneanaliza w programie ImageJbarwienie przeciwcia amiprotok sekcjiodporno zwi zana z wiekiemodporno kom rkowa
Ocena specyficznej dla wieku zdolności fagocytarnej dorosłych hemocytów Drosophila melanogaster za pomocą testu fagocytozy in vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.