Substructure Analyzer: Przyjazny dla użytkownika przepływ pracy do szybkiej eksploracji i dokładnej analizy ciał komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej

Summary

Prezentujemy swobodnie dostępny przepływ pracy stworzony do szybkiej eksploracji i dokładnej analizy ciał komórkowych w określonych przedziałach komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej. Ten przyjazny dla użytkownika przepływ pracy został zaprojektowany na oprogramowaniu open source Icy i wykorzystuje również funkcje ImageJ. Potok jest przystępny cenowo bez wiedzy z zakresu analizy obrazu.

Abstract

Ostatnia dekada charakteryzowała się przełomami w technikach mikroskopii fluorescencyjnej, zilustrowanymi poprawą rozdzielczości przestrzennej, ale także w obrazowaniu żywych komórek i technikach mikroskopii wysokoprzepustowej. Prowadziło to do stałego wzrostu ilości i złożoności danych mikroskopowych dla pojedynczego eksperymentu. Ponieważ ręczna analiza danych mikroskopowych jest bardzo czasochłonna, subiektywna i uniemożliwia przeprowadzanie analiz ilościowych, automatyzacja analizy bioobrazu staje się prawie nieunikniona. Zbudowaliśmy proces informatyczny o nazwie Substructure Analyzer, aby w pełni zautomatyzować analizę sygnału w obrazach biologicznych z mikroskopii fluorescencyjnej. Ten przepływ pracy został opracowany na przyjaznej dla użytkownika platformie open source Icy i jest uzupełniony o funkcje ImageJ. Obejmuje ona wstępne przetwarzanie obrazów w celu poprawy stosunku sygnału do szumu, indywidualną segmentację komórek (wykrywanie granic komórek) oraz wykrywanie/kwantyfikację ciał komórkowych wzbogaconych w określone przedziały komórkowe. Główną zaletą tego przepływu pracy jest proponowanie złożonych funkcji obrazowania biologicznego użytkownikom bez doświadczenia w analizie obrazu za pośrednictwem przyjaznego dla użytkownika interfejsu. Co więcej, jest wysoce modułowy i dostosowany do kilku zagadnień, od charakterystyki translokacji jądrowej/cytoplazmatycznej po analizę porównawczą różnych ciał komórkowych w różnych podstrukturach komórkowych. Funkcjonalność tego przepływu pracy jest zilustrowana poprzez badanie ciał Cajala (zwiniętych) w warunkach stresu oksydacyjnego (OS). Dane z mikroskopii fluorescencyjnej pokazują, że ich integralność w komórkach ludzkich ulega zmianie kilka godzin po indukcji OS. Efekt ten charakteryzuje się zmniejszeniem zarodkowania cewki do charakterystycznych ciał Cajala, związanych z nukleoplazmatyczną redystrybucją cewki do zwiększonej liczby mniejszych ognisk. Centralna rola cewki w wymianie między składnikami CB a otaczającą ją nukleoplazmą sugeruje, że indukowana przez OS redystrybucja cewkiny może wpływać na skład i funkcjonalność ciał Cajala.

Introduction

Mikroskopia świetlna, a dokładniej mikroskopia fluorescencyjna, są solidnymi i wszechstronnymi technikami powszechnie stosowanymi w naukach biologicznych. Dają one dostęp do precyzyjnej lokalizacji różnych biomolekuł, takich jak białka lub RNA, poprzez ich specyficzne znakowanie fluorescencyjne. Ostatnia dekada charakteryzowała się szybkim postępem w technologiach mikroskopii i obrazowania, czego dowodem jest Nagroda Nobla w dziedzinie chemii w 2014 r., przyznana Ericowi Betzigowi, Stefanowi W. Hellowi i Williamowi E. Moernerowi za rozwój superrozdzielczej mikroskopii fluorescencyjnej (SRFM)¹. SFRM omija granicę dyfrakcji tradycyjnej mikroskopii optycznej, aby przenieść ją do nanowymiaru. Udoskonalenie technik, takich jak obrazowanie na żywo lub wysokoprzepustowe badania przesiewowe, również zwiększa ilość i złożoność danych do przetwarzania dla każdego eksperymentu. W większości przypadków naukowcy mają do czynienia z wysoce heterogenicznymi populacjami komórek i chcą analizować fenotypy na poziomie pojedynczej komórki.

Początkowo analizy, takie jak liczenie ognisk, były wykonywane na oko, co jest preferowane przez niektórych badaczy, ponieważ zapewnia pełną wizualną kontrolę nad procesem liczenia. Jednak ręczna analiza takich danych jest zbyt czasochłonna, prowadzi do zmienności między obserwatorami i nie daje dostępu do bardziej złożonych funkcji, dlatego podejścia wspomagane komputerowo stają się powszechnie stosowane i prawie nieuniknione². Metody informatyczne bioobrazowe znacznie zwiększają efektywność analizy danych i są wolne od nieuniknionego subiektywizmu operatora i potencjalnej stronniczości ręcznej analizy liczenia. Zwiększony popyt w tej dziedzinie oraz poprawa mocy komputerów doprowadziły do rozwoju dużej liczby platform do analizy obrazu. Niektóre z nich są ogólnodostępne i dają dostęp do różnych narzędzi do wykonywania analiz za pomocą komputerów osobistych. Niedawno ustalono klasyfikację narzędzi otwartego dostępu³ i przedstawia Icy⁴ jako potężne oprogramowanie łączące użyteczność i funkcjonalność. Co więcej, Icy ma tę zaletę, że komunikuje się z ImageJ.

Dla użytkowników bez doświadczenia w analizie obrazów, głównymi przeszkodami są wybór odpowiedniego narzędzia zgodnie z problematycznymi i poprawnie dostrojonymi parametrami, które często nie są dobrze zrozumiałe. Co więcej, czas konfiguracji jest często długi. Icy proponuje przyjazny dla użytkownika interfejs typu "wskaż i kliknij" o nazwie "Protokoły" do rozwijania przepływu pracy poprzez połączenie niektórych wtyczek znajdujących się w wyczerpującym zbiorze⁴. Elastyczna modułowa konstrukcja i interfejs typu "wskaż i kliknij" sprawiają, że konfiguracja analizy jest możliwa dla osób niebędących programistami. Tutaj przedstawiamy przepływ pracy o nazwie Substructure Analyzer, opracowany w interfejsie Icy, którego funkcją jest analiza sygnałów fluorescencyjnych w określonych przedziałach komórkowych i pomiar różnych cech, takich jak jasność, liczba ognisk, rozmiar ognisk i rozkład przestrzenny. Ten przepływ pracy dotyczy kilku problemów, takich jak kwantyfikacja translokacji sygnału, analiza transfekowanych komórek wyrażających fluorescencyjny reporter lub analiza ognisk z różnych podstruktur komórkowych w poszczególnych komórkach. Umożliwia jednoczesne przetwarzanie wielu obrazów, a wyniki wyjściowe są eksportowane do arkusza rozdzielanego tabulatorami, który można otworzyć w powszechnie używanych programach do obsługi arkuszy kalkulacyjnych.

Potok analizatora podstruktury jest przedstawiony w Rysunek 1. Po pierwsze, wszystkie obrazy zawarte w określonym folderze są wstępnie przetwarzane, aby poprawić ich stosunek sygnału do szumu. Ten krok zwiększa wydajność kolejnych kroków i skraca czas działania. Następnie identyfikowane i segmentowane są obszary zainteresowania (ROI), odpowiadające obszarom obrazu, w których powinien zostać wykryty sygnał fluorescencyjny. Na koniec sygnał fluorescencyjny jest analizowany, a wyniki są eksportowane do arkusza rozdzielanego tabulatorami.

Segmentacja obiektów (wykrywanie granic) jest najtrudniejszym krokiem w analizie obrazu, a jej skuteczność decyduje o dokładności wynikowych pomiarów komórek. Pierwszymi obiektami zidentyfikowanymi na obrazie (zwanymi obiektami pierwotnymi) są często jądra z obrazów barwionych DNA (barwienie DAPI lub Hoechsta), chociaż obiektami pierwotnymi mogą być również całe komórki, koraliki, plamki, guzy lub jakiekolwiek barwione obiekty. W większości obrazów biologicznych komórki lub jądra stykają się ze sobą lub nakładają się na siebie, co powoduje awarię prostych i szybkich algorytmów. Do tej pory żaden uniwersalny algorytm nie jest w stanie przeprowadzić idealnej segmentacji wszystkich obiektów, głównie dlatego, że ich cechy (rozmiar, kształt lub tekstura) modulują efektywność segmentacji⁵. Narzędzia do segmentacji powszechnie dystrybuowane z oprogramowaniem do mikroskopii (takie jak MetaMorph Imaging Software firmy Molecular Devices⁶ lub oprogramowanie NIS-Elements Advances Research firmy Nikon⁷) są na ogół oparte na standardowych technikach, takich jak dopasowywanie korelacji, progowanie lub operacje morfologiczne. Chociaż te nadmiernie uogólnione metody są skuteczne w podstawowych systemach, szybko pojawiają ograniczenia, gdy są używane w trudniejszych i bardziej szczegółowych kontekstach. Rzeczywiście, segmentacja jest bardzo wrażliwa na parametry eksperymentalne, takie jak typ komórki, gęstość komórek lub biomarkery, i często wymaga wielokrotnej korekty dla dużego zestawu danych. Przepływ pracy Substructure Analyzer integruje zarówno proste, jak i bardziej wyrafinowane algorytmy, aby zaproponować różne alternatywy dostosowane do złożoności obrazu i potrzeb użytkownika. W szczególności proponuje algorytm zlewiska oparty na znacznikach⁸ dla silnie zgrupowanych obiektów. Skuteczność tej metody segmentacji opiera się na doborze indywidualnych znaczników na każdym obiekcie. Znaczniki te są w większości przypadków wybierane ręcznie, aby uzyskać prawidłowe parametry dla pełnej segmentacji, co jest bardzo czasochłonne, gdy użytkownicy mają do czynienia z dużą liczbą obiektów. Substructure Analyzer proponuje automatyczne wykrywanie tych markerów, zapewniając wysoce wydajny proces segmentacji. Segmentacja jest w większości przypadków granicznym etapem analizy obrazu i może znacznie modyfikować czas przetwarzania w zależności od rozdzielczości obrazu, liczby obiektów na obrazie i poziomu grupowania obiektów. Typowe potoki wymagają od kilku sekund do 5 minut na obraz na standardowym komputerze stacjonarnym. Analiza bardziej złożonych obrazów może wymagać mocniejszego komputera i podstawowej wiedzy z zakresu analizy obrazu.

Elastyczność i funkcjonalność tego przepływu pracy są zilustrowane różnymi przykładami w reprezentatywnych wynikach. Korzyści płynące z tego przepływu pracy są w szczególności widoczne w badaniu podstruktur jądrowych w warunkach stresu oksydacyjnego (OS). OS odpowiada nierównowadze homeostazy redoks na korzyść utleniaczy i jest związane z wysokimi poziomami reaktywnych form tlenu (ROS). Ponieważ ROS działają jako cząsteczki sygnałowe, zmiany w ich stężeniu i lokalizacji subkomórkowej wpływają pozytywnie lub negatywnie na niezliczone szlaki i sieci, które regulują funkcje fizjologiczne, w tym transdukcję sygnału, mechanizmy naprawy, ekspresję genów, śmierć komórki i proliferację9^,10. OS jest więc bezpośrednio zaangażowany w różne patologie (choroby neurodegeneracyjne i sercowo-naczyniowe, nowotwory, cukrzyca itp.), ale także w starzenie się komórek. Dlatego rozszyfrowanie wpływu OS na organizację i funkcję komórki ludzkiej stanowi kluczowy krok w zrozumieniu roli OS w powstawaniu i rozwoju patologii u ludzi. Ustalono, że OS reguluje ekspresję genów poprzez modulację transkrypcji za pomocą kilku czynników transkrypcyjnych (p53, Nrf2, FOXO3A)¹¹, ale także poprzez wpływ na regulację kilku procesów ko- i potranskrypcyjnych, takich jak alternatywny splicing (AS) pre-RNAs^12,13,14. Alternatywne splicowanie pierwotnych i niekodujących transkryptów jest podstawowym mechanizmem, który zwiększa zdolność kodowania genomów poprzez wytwarzanie izoform transkryptów. AS jest wykonywany przez ogromny kompleks rybonukleoproteinowy zwany spliceosomem, zawierający prawie 300 białek i 5 małych jądrowych RNA bogatych w U (UsnRNAs)¹⁵. Składanie spliceosomów i AS są ściśle kontrolowane w komórkach, a niektóre etapy dojrzewania spliceosomu zachodzą w pozbawionych błony przedziałach jądrowych zwanych ciałami Cajala. Te podstruktury jądrowe charakteryzują się dynamicznym charakterem ich struktury i składem, które są prowadzone głównie przez wielowartościowe oddziaływania ich RNA i składników białkowych z białkiem cewki. Analiza tysięcy komórek za pomocą przepływu pracy Substructure Analyzer pozwoliła na scharakteryzowanie nigdy nie opisanego wpływu OS na ciała Cajala. Rzeczywiście, uzyskane dane sugerują, że OS modyfikuje zarodkowanie ciał Cajala, indukując nukleoplazmatyczną redystrybucję białka cewki do licznych mniejszych ognisk jądrowych. Taka zmiana struktury ciał Cajala może wpływać na dojrzewanie spliceosomu i uczestniczyć w modulacji AS przez OS.

Protocol

UWAGA: Przyjazne dla użytkownika samouczki są dostępne na stronie internetowej Icy http://icy.bioimageanalysis.org.

1. Pobierz Icy i protokół Substructure Analyzer

1. Pobierz Icy ze strony internetowej Icy (http://icy.bioimageanalysis.org/download) i pobierz protokół Substructure Analyzer: http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest.
   UWAGA: Jeśli używasz 64-bitowego systemu operacyjnego, upewnij się, że używasz 64-bitowej wersji oprogramowania Java. Ta wersja pozwala na zwiększenie pamięci przydzielonej do Icy (Preferencje | Ogólne | Maksymalna pamięć).

2. Otwarcie protokołu

1. Otwórz Icy i kliknij Narzędzia w menu Wstążki.
2. Kliknij Protokoły, aby otworzyć interfejs Edytora protokołów.
3. Kliknij na Load (Załaduj) i otwórz protokół Substructure Analyzer. Wczytywanie protokołu może potrwać kilka sekund. Upewnij się, że otwieranie protokołu zostało zakończone przed jego użyciem.
   UWAGA: Przepływ pracy składa się z 13 ogólnych bloków przedstawionych w Rysunek 2a. Każdy blok działa jako potok złożony z kilku pól wykonujących określone podzadania.

3. Interakcja z przepływem pracy na Icy

UWAGA: Każdy blok lub pole jest ponumerowane i ma określoną rangę w przepływie pracy (Rysunek 2b). Klikając na ten numer, najbliższa możliwa pozycja do pierwszej jest przypisywana do wybranego bloku/pola, a następnie pozycja pozostałych bloków/pól jest reorganizowana. Przestrzegaj właściwej kolejności bloków podczas przygotowywania przepływu pracy. Na przykład blok detektora punktowego wymaga wstępnie zdefiniowanych zwrotów z inwestycji, aby bloki segmentacji musiały działać przed blokami detektora punktowego. Nie zmieniaj położenia pól. Nie używaj znaku "." w nazwie obrazu.

1. Klikając na ikonę w lewym górnym rogu, zwiń, rozwiń, powiększ, zawęź lub usuń blok (Rysunek 2b).
2. Każdy potok przepływu pracy charakteryzuje się siecią skrzynek połączonych za pomocą ich wejścia i wyjścia (Rysunek 2b). Aby utworzyć połączenie, kliknij Wyjście i utrzymaj, aż kursor osiągnie dane wejściowe. Połączenia można usunąć, klikając tag Wyjście.

4. Łączenie kanałów obrazu

1. Użyj bloku Scal kanały, aby wygenerować scalone obrazy. W razie potrzeby zmień nazwy plików tak, aby sekwencje, które mają zostać scalone, miały ten sam prefiks nazwy, po którym następuje odrębny separator. Na przykład sekwencje poszczególnych kanałów z obrazu A mają nazwy: ImageA_red, ImageA_blue.
   UWAGA: Jako separator nie należy używać znaków już obecnych w nazwie obrazu.
2. W tym samym folderze utwórz po jednym nowym folderze na kanał, który chcesz scalić. Na przykład, aby scalić kanały czerwony, zielony i niebieski, utwórz 3 foldery i zapisz w nich odpowiednie sekwencje.
3. Używaj tylko bloku Scal kanały, usuń inne bloki i zapisz protokół jako Scal kanały.
   1. Uzyskaj dostęp do pól, aby ustawić parametry. Dla każdego kanału wypełnij odpowiednio pola Numer kanału X (pola 1, 5 lub 9), Kanał folderu numer X (pola 2, 6 lub 10), Kanał separatora numer X (pola 3, 7 lub 11) i Kanał mapy kolorów nb X (pola 4, 8 i 12).
      UWAGA: Te pola są pogrupowane poziomo według czterech, z których każda odpowiada temu samemu kanałowi. W każdym wierszu dostępny jest również wyświetlacz (pola 23, 24 lub 25), który bezpośrednio wizualizuje sekwencję odpowiedniego kanału.
      1. W polu Numer kanału X wybierz kanał, który chcesz wyodrębnić (w klasycznych obrazach RGB 0 = czerwony, 1 = zielony, 2 = niebieski). Użytkownik szybko uzyskuje dostęp do różnych kanałów obrazu w oknie Inspector programu Icy, na karcie Sekwencja. Wpisz wartość najmniejszego kanału w górnym wierszu i najwyższą w dolnym wierszu.
      2. W polu Folder kanał o numerze X wpisz \Name folderu zawierającego obrazy kanału X.
      3. W polu Separator kanału o numerze X wpisz separator używany dla nazwy obrazu (w poprzednim przykładzie: "_red", "_green" i "_blue").
      4. W polu Kanał mapy kolorów nb X wskaż liczbą, który model mapy kolorów ma być używany do wizualizacji odpowiedniego kanału w języku Icy. Dostępne mapy kolorów są widoczne w zakładce Sekwencja w oknie Inspektor
      .
      5. W polu Format scalonych obrazów (pole 28) wpisz rozszerzenie, aby zapisać scalone obrazy: .tif, .gif, .jpg, .bmp lub .png.
         UWAGA: Aby scalić tylko 2 kanały, nie wypełniaj czterech pól odpowiadających trzeciemu kanałowi.
   2. W lewym górnym rogu bloku Scal kanały kliknij link znajdujący się bezpośrednio po prawej stronie folderu. W wyświetlonym oknie dialogowym Otwórz kliknij dwukrotnie folder zawierający sekwencje pierwszego kanału, który został zdefiniowany w polu Kanał folderu numer 1 (pole 2). Następnie kliknij Otwórz.
   3. Uruchom protokół, klikając czarną strzałkę w lewym górnym rogu bloku Scal kanały (więcej informacji można znaleźć w części 7). Scalone obrazy są zapisywane w folderze scalania w tym samym katalogu, co foldery poszczególnych kanałów.

5. Segmentacja regionów zainteresowania

UWAGA: Substructure Analyzer integruje zarówno proste, jak i bardziej wyrafinowane algorytmy, aby zaproponować różne alternatywy dostosowane do złożoności obrazu i potrzeb użytkownika.

1. Wybierz dostosowany blok.
   1. Jeśli obiekty nie stykają się ze sobą lub użytkownik nie musi rozróżniać obiektów zgrupowanych pojedynczo, należy użyć bloku Segmentacja A: Obiekty niezgrupowane.
   2. Gdy obiekty nie stykają się ze sobą, ale niektóre z nich są blisko, użyj bloku Segmentacja B: Słabo zgrupowane obiekty.
   3. W przypadku obiektów o wysokim poziomie klastrowania i wypukłym kształcie należy użyć bloku Segmentacja C: Zgrupowane obiekty o wypukłych kształtach.
   4. Jeśli obiekty mają wysoki poziom klastrowania i nieregularne kształty, należy użyć bloku Segmentacja D: Zgrupowane obiekty o nieregularnych kształtach.
   5. Użyj bloku Segmentacja E: Cytoplazma zgrupowana, aby podzielić cytoplazmy stykające się indywidualnie przy użyciu segmentowanych jąder jako markerów. Ten blok bezwzględnie potrzebuje segmentowanych jąder do przetworzenia.
      UWAGA: Bloki przystosowane do segmentacji obiektów pierwotnych są przetwarzane niezależnie, dzięki czemu kilka bloków może być używanych w tym samym przebiegu w celu porównania ich wydajności dla określonej konstrukcji nośnej lub do segmentacji różnych typów podkonstrukcji. Jeśli poziom klastrowania jest niejednorodny w obrębie tego samego zestawu obrazów, małe i wysoce zgrupowane obiekty należy przetwarzać oddzielnie w dostosowanych blokach.
2. Połącz wyjście0 (Plik) bloku Wybierz folder z wejściem folderu wybranego bloku segmentacji.
3. Ustaw parametry wybranego bloku segmentacji.
   1. Segmentacja A: Obiekty niegrupowane i Segmentacja C: Obiekty zgrupowane o wypukłych kształtach
      1. W polu Sygnał kanału (pole 1) ustaw kanał obiektów do segmentacji.
      2. Opcjonalnie, w polu filtra Gaussa (ramka 2), zwiększ wartości sigma X i Y, jeśli sygnał wewnątrz obiektów jest niejednorodny. Filtr Gaussa wygładza tekstury w celu uzyskania bardziej jednorodnych obszarów oraz zwiększa szybkość i wydajność segmentacji jąder. Im mniejsze obiekty, tym niższa jest wartość sigma. Unikaj wysokich wartości sigma. Ustaw wartości domyślne na 0.
      3. W polu HK-Średnie (pole 3) ustaw parametr Klasy intensywności oraz przybliżone minimalne i maksymalne rozmiary (w pikselach) obiektów, które mają być wykrywane.
         UWAGA: W przypadku klas intensywności wartość 2 klasyfikuje piksele w 2 klasach: tła i pierwszego planu. W ten sposób dostosowuje się, gdy kontrast między obiektami a tłem jest wysoki. Jeśli obiekty pierwszego planu mają różną intensywność lub jeśli kontrast z tłem jest niski, zwiększ liczbę klas. Ustawienie domyślne to 2. Rozmiar obiektu można szybko ocenić, ręcznie rysując ROI wokół interesującego obiektu. Rozmiar ROI (Interior in pixels) pojawia się bezpośrednio na obrazie po najechaniu na niego kursorem lub można uzyskać do niego dostęp w oknie statystyk ROI (otwórz go z paska wyszukiwania). Optymalne parametry wykrywają każdy obiekt pierwszego planu w jednym ROI. Można je ręcznie zdefiniować w Icy (Wykrywanie i śledzenie | HK-Średnie).
      4. W polu Aktywne kontury (ramka 4) zoptymalizuj wykrywanie granic obiektów. Wyczerpująca dokumentacja tej wtyczki jest dostępna online: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Active_Contours. Prawidłowe parametry można również zdefiniować ręcznie w Icy (Wykrywanie i śledzenie | Aktywne kontury).
      5. Podczas tego procesu automatycznie tworzony jest folder do zapisywania obrazów obiektów podzielonych na segmenty. W polu Tekst (pole 6) nazwij ten folder (np. Segmented nuclei). Aby ustawić format zapisywania obrazów obiektów podzielonych na segmenty (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG), wypełnij format pola obrazów obiektów podzielonych na segmenty. Folder zostanie utworzony w folderze zawierającym scalone obrazy.
      6. Uruchom przepływ pracy (szczegółowe informacje można znaleźć w części 7).
   2. Segmentacja B: Słabo zgrupowane obiekty
      1. Wykonaj te same kroki, co w 5.3.1, aby ustawić parametry pól Sygnał kanału, HK-Średnie, Aktywne kontury, Rozszerzenie do zapisania segmentowanych obiektów i Tekstu (rangi pól nie są takie same jak w kroku 5.3.1).
      2. W polu Wywołaj wtyczkę IJ (pole 4) ustaw parametr Walcowanie, aby sterować odejmowaniem tła. Ustaw ten parametr na co najmniej rozmiar największego obiektu, który nie jest częścią tła. Zmniejszenie tej wartości zwiększa usuwanie tła, ale może również spowodować utratę sygnału pierwszego planu.
      3. W polu Adaptacyjne wyrównywanie histogramu (ramka 6) popraw kontrasty między obiektami pierwszego planu a tłem. Zwiększenie nachylenia daje bardziej kontrastowe sekwencje.
      4. Uruchom przepływ pracy (szczegółowe informacje można znaleźć w części 7).
   3. Segmentacja D: Zgrupowane obiekty o nieregularnych kształtach
      UWAGA: Do każdego obrazu mają zastosowanie trzy różne metody segmentacji: po pierwsze, stosuje się grupowanie HK-średnich w połączeniu z metodą Active Contours. Następnie klasyczny algorytm działu wodnego (wykorzystujący euklidesową mapę odległości) jest stosowany do wcześniej błędnie podzielonych na segmenty obiektów. Na koniec używany jest algorytm zlewni oparty na znacznikach. Tylko metody oparte na średnich HK i znacznikach zlewisk wymagają interwencji użytkownika. W przypadku obu metod te same parametry mogą być stosowane do wszystkich obrazów (wersja w pełni zautomatyzowana) lub zmieniane dla każdego obrazu (wersja półautomatyczna). Jeśli użytkownik nie jest przeszkolony w zakresie tych metod segmentacji, zdecydowanie zaleca się przetwarzanie półautomatyczne. Podczas przetwarzania tego bloku konieczna jest ręczna interwencja. Po zakończeniu metody segmentacji użytkownik musi ręcznie usunąć błędnie podzielone na segmenty obiekty przed rozpoczęciem następnej metody segmentacji. Pomyślnie podzielone na segmenty obiekty są zapisywane i nie są brane pod uwagę w następnych krokach. Aby blok ten działał poprawnie, musi być połączony z blokiem Segmentacja obiektów podstawowych o zgrupowanych/niejednorodnych kształtach.
      1. Pobierz kolekcję ImageJ MorphoLibJ na https://github.com/ijpb/MorphoLibJ/releases. W tym protokole używana jest wersja MorphoLibJ 1.4.0. Umieść plik MorphoLibJ_-1.4.0.jar w folderze icy/ij/plugins. Więcej informacji na temat zawartości tej kolekcji można znaleźć na stronie https://imagej.net/MorphoLibJ.
      2. Wykonaj te same czynności, co w kroku 5.3.1, aby ustawić parametry pól Sygnał kanału, Filtr Gaussa, Aktywne kontury, Rozszerzenie do zapisywania obiektów podzielonych na segmenty i Tekst. Rangi boksów nie są takie same jak w kroku 5.3.1.
      3. Ustaw parametry pola Adaptacyjna korekcja histogramu (patrz krok 5.3.2.3).
      4. Aby aktywować opcję Odejmij tło, wpisz tak w polu Zastosuj odejmij tło? (ramka 5). W przeciwnym razie napisz Nie. Jeśli wtyczka jest aktywna, ustaw parametr rolling (patrz krok 5.3.2) w polu Subtract Background parameter (pole 7).
      5. Automatyzacja średnich HK: Aby zastosować te same parametry dla wszystkich obrazów (w pełni zautomatyzowane przetwarzanie), należy ustawić wartość Nb klas (ramka 11), rozmiar minimalny (ramka 12) i rozmiar maksymalny (ramka 13) (patrz krok 5.3.1). Te parametry muszą być ustawione tak, aby wybrać maksymalną liczbę pikseli pierwszego planu i zoptymalizować indywidualizację obiektów pierwszego planu. W przypadku wersji z przetwarzaniem półautomatycznym nie jest wymagana żadna interwencja.
      6. Automatyzacja ekstrakcji znaczników: w przypadku wersji w pełni zautomatyzowanej rozwiń pole Ekstrakcja znaczników wewnętrznych (pole 27) i ustaw wartość parametru "dynamic" w wierszu 13 skryptu. W przypadku wersji z przetwarzaniem półautomatycznym nie jest wymagana żadna interwencja.
         UWAGA: Znaczniki są wyodrębniane przez zastosowanie transformacji rozszerzonych minimów na obrazie wejściowym kontrolowanym przez parametr "dynamiczny". W algorytmie zlewni opartym na znacznikach symulowane jest zalewanie z tych znaczników w celu przeprowadzenia segmentacji obiektów. Aby pomyślnie segmentować obiekty na pierwszym planie, należy wyodrębnić jeden znacznik na każdy obiekt na pierwszym planie. Ustawienie parametru "dynamicznego" dla optymalnego wyodrębniania znaczników zależy głównie od rozdzielczości obrazów. Tak więc, jeśli nie jesteś zaznajomiony z tym parametrem, użyj wersji półautomatycznej.
      7. Uruchom przepływ pracy (szczegółowe informacje można znaleźć w części 7).
      8. Na początku przetwarzania kolejno otwierane są okna dialogowe HK-średnie parametry i Zlewnia oparta na znaczniku. Aby zastosować te same parametry dla wszystkich obrazów (wersja w pełni zautomatyzowana), kliknij TAK. W przeciwnym razie kliknij NIE. Otworzy się okno informacyjne z prośbą o "Określ optymalne ROI za pomocą wtyczki HK-Means i zamknij obraz". Kliknij OK i ręcznie zastosuj wtyczkę HK-Means (Wykrywanie i śledzenie|HK-Środki) na obrazie, który otworzy się automatycznie. Wybierz opcję Eksportuj ROI w polu wtyczki HK-Means. Zastosuj najlepsze parametry, aby uzyskać zwrot z inwestycji zawierający maksymalnie piksele pierwszego planu i zoptymalizować indywidualizację obiektów pierwszego planu. Po znalezieniu optymalnych zwrotów z inwestycji bezpośrednio zamknij obraz.
      9. Na końcu pierwszej metody segmentacji otwiera się okno informacyjne z prośbą o "Usuń niechciane ROI i zamknij obraz". Te ROI odpowiadają granicom podzielonych na segmenty obiektów. Wybierz przycisk OK i usuń ROI nieprawidłowo podzielonych na segmenty obiektów na obrazie, który zostanie automatycznie otwarty. Zwrot akcji można łatwo usunąć, umieszczając kursor na jego obramowaniu i używając przycisku "Usuń" na klawiaturze. Zamknij obraz. Powtórz tę samą procedurę po zakończeniu drugiego etapu segmentacji.
      10. Na tym etapie, jeśli przycisk TAK został wybrany do pełnej automatyzacji algorytmu zlewni opartego na znaczniku, wcześniej ustawione parametry zostaną zastosowane do wszystkich obrazów.
      11. Jeśli wybrano przycisk NIE, otworzy się okno informacyjne z prośbą o "Określ i dostosuj znaczniki wewnętrzne". Kliknij OK iw interfejsie ImageJ Icy przejdź do Wtyczki | MorphoLibJ | Minima i Maxima|Rozszerzone Min i Max. W obszarze Operation (Operacja) wybierz opcję Extended Minima (Rozszerzone minima).
      12. Wybierz opcję Podgląd, aby wstępnie zwizualizować wynik transformacji na automatycznie otwartym obrazie. Przesuwaj dynamikę, aż zostaną zaobserwowane optymalne znaczniki. Znaczniki to grupy pikseli o wartości 255 (niekoniecznie białe piksele). Optymalne parametry prowadzą do jednego markera na obiekt. Skoncentruj się na pozostałych obiektach, które nie zostały dobrze podzielone na segmenty za pomocą dwóch poprzednich metod segmentacji.
      13. W razie potrzeby ulepsz znaczniki, stosując dodatkowe operacje morfologiczne, takie jak "Otwieranie" lub "Zamykanie" (Wtyczki | MorphoLibJ | Filtry morfologiczne). Uzyskując ostateczny obraz znaczników, pozostaw go otwartym i zamknij wszystkie inne obrazy kończące się obrazem początkowo używanym jako dane wejściowe dla operacji Extended Minima. Kliknij Nie, jeśli pole ImageJ prosi o zapisanie zmian na tym obrazie.
      14. W polu Nb obrazów z ramką informacyjną (pole 14) określ, ile obrazów z ramkami informacyjnymi powinno się pojawić.
   4. Segmentacja E: Cytoplazma skupiona
      UWAGA: Ten blok wykorzystuje wcześniej segmentowane jądra jako indywidualne markery do zainicjowania segmentacji cytoplazmy. Upewnij się, że blok segmentacji jąder został przetworzony przed jego użyciem.
      1. W polu Cytoplazma kanału (ramka 1) ustaw kanał sygnału cytoplazmatycznego.
      2. W polu Jądra segmentowane na przedłużenia (ramka 2) wpisz format używany do zapisywania obrazów jąder podzielonych na segmenty (tif, jpeg, bmp, png). Domyślnym formatem jest tif.
      3. W polu Tekst (ramka 3) wpisz \Name folderu zawierającego segmentowane jądra.
      4. W polu Format obrazów podzielonych na segmenty cytoplazm (pole 4) ustaw format, który ma być używany do zapisywania obrazów obiektów podzielonych na segmenty (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG).
      5. Podczas tego procesu automatycznie tworzony jest folder do zapisywania obrazów segmentowanych cytoplazm. W polu Tekst (pole 5) nazwij ten folder (np. Segmentowane cytoplazmy). Folder zostanie utworzony w folderze zawierającym scalone obrazy.
      6. Wykonaj te same czynności, co w kroku 5.3.1, aby ustawić parametry pól Filtr Gaussa i Aktywne kontury (Bądź ostrożny, rangi pól nie są takie same jak w kroku 5.3.1).
      7. Uruchom przepływ pracy (szczegółowe informacje można znaleźć w części 7).

6. Wykrywanie i analiza sygnału fluorescencyjnego

1. Wybierz dostosowany blok.
   1. W bloku Analiza fluorescencji A: 1 kanał należy przeprowadzić detekcję i analizę ognisk w jednym kanale wewnątrz jednego typu obiektu segmentowanego: detekcja ognisk cewki (kanał czerwony) w jądrze.
   2. W bloku Analiza fluorescencji B: 2 kanały w tym samym przedziale należy przeprowadzić detekcję i analizę ognisk w dwóch kanałach wewnątrz jednego typu segmentowanego obiektu: detekcję ognisk cewki (kanał czerwony) i 53BP1 (kanał zielony) w jądrze.
   3. W bloku Analiza fluorescencji C: 2 kanały w dwóch przedziałach, przeprowadzić detekcję i analizę ognisk w jednym lub dwóch kanałach, szczególnie wewnątrz jąder i odpowiadającej im cytoplazmy: wykrywanie ognisk cewki (kanał czerwony) zarówno w jądrze, jak i odpowiadającej mu cytoplazmie lub wykrywanie ognisk cewki (kanał czerwony) w jądrze i ognisk G3BP (kanał zielony) w odpowiedniej cytoplazmie.
   4. W bloku Analiza fluorescencji D: Translokacja globalna oblicz procentowy udział sygnału z jednego kanału w dwóch przedziałach komórkowych (a i b). Na przykład w teście translokacji cytoplazmy/jądra wyeksportuj obliczone wartości procentowe sygnałów jądrowych i cytoplazmatycznych dla każdego obrazu w końcowym arkuszu kalkulacyjnym "Wyniki". Wzór używany do obliczania procentu sygnału jądrowego pokazano poniżej. Ten blok może być używany do dowolnego przedziału subkomórkowego:
      
   5. W bloku Analiza fluorescencji E: Translokacja pojedynczej komórki oblicz procent sygnału z jednego kanału w dwóch przedziałach komórkowych dla każdej komórki. Blok ten jest specjalnie zoptymalizowany do oznaczania translokacji jądra/cytoplazmy na poziomie pojedynczej komórki.
      UWAGA: Ponieważ blok Analiza fluorescencji E: Translokacja pojedynczej komórki przeprowadza analizę na poziomie pojedynczej komórki, potrzebna jest wydajna segmentacja jądra i cytoplazmy.
2. Połącz wyjście0 (Plik) bloku Wybierz folder (blok 1) z wejściem folderu (białe strzałki w czarnych kółkach) wybranego bloku.
3. Ustaw parametry wybranego bloku.
   1. Analiza fluorescencji A: 1 kanał, analiza fluorescencji B: 2 kanały w tym samym przedziale i analiza fluorescencji C: 2 kanały w dwóch komorach
      1. W polu Zwrot z inwestycji w obrazy folderów wpisz nazwę folderu zawierającego obrazy obiektów podzielonych na segmenty poprzedzone ukośnikiem odwrotnym. (Na przykład: \Jądra podzielone na segmenty).
      2. W polu Format obrazów obiektów podzielonych na segmenty (ramka 2) wpisz format używany do zapisywania obrazów obiektów podzielonych na segmenty (tif, jpeg, bmp, png). Domyślnym formatem jest tif.
      3. W polu Kill Borders?, wpisz Tak, aby usunąć obiekty obramowania. W przeciwnym razie napisz Nie. Do korzystania z tej funkcji wymagana jest instalacja kolekcji MorphoLibJ ImageJ (patrz krok 5.3.3).
      4. W polu (polach) Sygnał punktów kanału ustaw kanał, w którym mają być wykrywane punkty. W klasycznych obrazach RGB 0 = czerwony, 1 = zielony i 2 = niebieski.
      5. W polach Nazwa zlokalizowanej cząsteczki wpisz nazwę cząsteczki lokalizującej się w plamkach. Liczba pól, które należy wprowadzić, zależy od liczby cząsteczek.
      6. W polu (polach) Wavelet Spot Detector Block ustaw parametry wykrywania punktowego dla każdego kanału. Ustaw skalę (odnoszącą się do rozmiaru plamki) i czułość wykrywania (mniejsza czułość zmniejsza liczbę wykrywanych punktów, przy czym wartość domyślna to 100, a wartość minimalna to 0). Wyczerpująca dokumentacja tej wtyczki jest dostępna online: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Spot_Detector. Parametry można również definiować ręcznie w Icy (Wykrywanie i śledzenie | Detektor punktowy).
      7. Opcjonalnie w polu Filtruj ROI według rozmiaru przefiltruj segmentowane obiekty, w których wykryto plamy, ustawiając interwał rozmiaru (w pikselach). Ten krok jest szczególnie przydatny do usuwania obiektów z podsegmentami lub nadsegmentami. Aby ręcznie oszacować rozmiar obiektów, zobacz krok 5.3.1. Parametry domyślne nie obejmują filtrowania ROI według rozmiaru. Blok 2 Kanały w dwóch komorach zawiera dwa pola: Filtruj jądra według wielkości (pole 19) i Filtruj cytoplazmę według wielkości (pole 46).
      8. Opcjonalnie w polu Filtruj plamy według rozmiaru, przefiltruj wykryte plamy według ich rozmiaru (w pikselach), aby usunąć niechciane artefakty. Aby ręcznie oszacować rozmiar plamki, kliknij Wykrywanie i śledzenie i otwórz wtyczkę Wykrywacz plam. W obszarze Opcje wyjściowe wybierz opcję Eksportuj do ROI. Należy uważać, aby parametry domyślne nie obejmowały filtrowania plam według rozmiaru, a przefiltrowane miejsca nie były brane pod uwagę w analizie. Liczba pól do wprowadzenia zależy od liczby kanałów.
      9. Opcjonalnie w polu Filtruj plamy nałóż dodatkowy filtr (kontrast, jednorodność, obwód, okrągłość) na wykryte miejsca. Należy uważać, aby parametry domyślne nie obejmowały filtrowania punktowego i aby przefiltrowane miejsca nie były brane pod uwagę w analizie. Liczba pól do wprowadzenia zależy od liczby kanałów.
      10. Opcjonalnie w polach Próg rozmiaru plamki ustaw próg dla obszaru (w pikselach) analizowanych plam. Liczba zliczonych miejsc poniżej i powyżej tego progu jest eksportowana w końcowym arkuszu kalkulacyjnym wyników. Liczba skrzynek, które mają być informowane, zależy od liczby kanałów.
      11. Uruchom przepływ pracy (szczegółowe informacje można znaleźć w części 7). Dane są eksportowane w arkuszu kalkulacyjnym Wyniki zapisanym w folderze zawierającym scalone obrazy.
   2. Analiza fluorescencji D: Translokacja globalna i analiza fluorescencji E: Translokacja poszczególnych komórek:
      1. W polach Obrazy folderów (pola 1 i 2) wpisz \Name folderu zawierającego obrazy obiektów podzielonych na segmenty. W bloku Analiza fluorescencji D: Translokacja globalna dwa typy ROI są identyfikowane jako ROI a i ROI b. Dla bloku Analiza fluorescencji E: Translokacja pojedynczej komórki, w polach Obrazy folderów segmentowane jądra i Obrazy folderów segmentowane cytoplazmy wpisz nazwę folderu zawierającego odpowiednio segmentowane jądra i cytoplazmy.
      2. W polu Sygnał kanału (pole 3) wprowadź kanał sygnału.
      3. W polu Format obrazów obiektów podzielonych na segmenty (ramka 4) wpisz format używany do zapisywania obrazów obiektów podzielonych na segmenty (tif, jpeg, bmp, png). Domyślnym formatem jest tif. Dostępna jest również opcja Usuń obramowania, aby usunąć obiekty obramowania (patrz krok 6.3.1).
      4. Opcjonalnie w polach Filtruj ROI według rozmiaru przefiltruj podzielone na segmenty obiekty, ustawiając interwał rozmiaru (w pikselach). Ten krok może być przydatny do usuwania obiektów z podsegmentami lub nadmiernie segmentowanymi. Aby ręcznie oszacować rozmiar obiektu, zobacz krok 5.3.1. Do wprowadzenia są dwa pola, po jednym na kanał. Parametry domyślne nie obejmują filtrowania ROI według rozmiaru.
      5. Uruchom przepływ pracy (szczegółowe informacje można znaleźć w części 7). Eksportowanie danych w arkuszu kalkulacyjnym Wyniki zapisane w folderze zawierającym scalone obrazy.

7. Uruchom protokół

1. Aby przetworzyć jeden blok w przebiegu, usuń połączenie między wybranym blokiem a blokiem Wybierz folder. Umieść poszukiwany blok na^{1 stopniu.} W lewym górnym rogu poszukiwanego bloku kliknij link znajdujący się bezpośrednio po prawej stronie folderu. W wyświetlonym oknie dialogowym Otwórz kliknij dwukrotnie folder zawierający scalone obrazy. Następnie kliknij Otwórz. Kliknij Uruchom, aby uruchomić przepływ pracy. Przetwarzanie można zatrzymać, klikając przycisk Zatrzymaj.
2. Aby przetworzyć różne bloki w przebiegu, zachowaj połączenia wybranych bloków z blokiem Wybierz folder (blok 1). Upewnij się, że ich ranga pozwala na prawidłowe przetwarzanie przepływu pracy. Na przykład, jeśli określony blok wymaga do przetworzenia obiektów podzielonych na segmenty, upewnij się, że blok segmentacji jest przetwarzany wcześniej. Przed uruchomieniem przepływu pracy usuń nieużywane bloki i zapisz nowy protokół pod inną nazwą.
3. Kliknij Uruchom, aby uruchomić przepływ pracy. Gdy pojawi się okno dialogowe otwierania, kliknij dwukrotnie folder zawierający scalone obrazy. Następnie kliknij Otwórz. Przepływ pracy zostanie uruchomiony automatycznie. W razie potrzeby zatrzymaj przetwarzanie, klikając przycisk Zatrzymaj.
4. Pod koniec przetwarzania sprawdź, czy w prawym dolnym rogu pojawił się komunikat Workflow completed successfully (Przepływ pracy został wykonany pomyślnie) i czy wszystkie bloki są oznaczone zielonym znakiem (Rysunek 2b). Jeśli nie, blok i wewnętrzne pole przedstawiające znak błędu wskazują element do poprawienia (Rysunek 2b).
   UWAGA: Po pomyślnym wykonaniu przepływu pracy nie można bezpośrednio uruchomić nowego przebiegu, a aby ponownie przetworzyć przepływ pracy, co najmniej jeden blok powinien być oznaczony znakiem "gotowy do przetworzenia". Aby zmienić stan bloku, usuń i ponownie utwórz link między dwoma polami wewnątrz tego bloku lub po prostu zamknij i ponownie otwórz protokół. Jeśli podczas przetwarzania wystąpi błąd, można bezpośrednio uruchomić nowy przebieg. Podczas nowego przebiegu przetwarzane są wszystkie bloki potoku, nawet jeśli niektóre z nich są oznaczone zielonym znakiem.

Results

Wszystkie opisane analizy zostały przeprowadzone na standardowym laptopie (64-bitowy, czterordzeniowy procesor o częstotliwości 2,80 GHz z 16 GB pamięci o dostępie swobodnym (RAM)) pracującym z 64-bitową wersją Javy. Pamięć o dostępie swobodnym jest ważnym parametrem, który należy wziąć pod uwagę, w zależności od ilości i rozdzielczości analizowanych obrazów. Korzystanie z 32-bitowej wersji Javy ogranicza pamięć do około 1300 MB, co mogłoby być nieodpowiednie do analizy dużych zbiorów danych, podczas gdy wersja 64-bitowa...

Discussion

Dostępnych jest coraz więcej bezpłatnych narzędzi programowych do analizy obrazów komórek fluorescencyjnych. Użytkownicy muszą prawidłowo wybrać odpowiednie oprogramowanie w zależności od złożoności problemu, wiedzy na temat przetwarzania obrazu oraz czasu, jaki chcą poświęcić na analizę. Icy, CellProfiler lub ImageJ/Fiji to potężne narzędzia łączące w sobie zarówno użyteczność, jak i funkcjonalność³. Icy to samodzielne narzędzie, które prezentuje przejrzysty graficzny interfejs użytkownika (GUI),...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% roztwór formaldehydu (w/v) bez metanolu	Thermo Fisher Scientific	28908	do utrwalania komórek
Alexa Fluor 488 kozy anty-królik	Thermo Fisher Scientific	A-11008	fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe
Alexa Fluor 555 kozy anty-myszy	Thermo Fisher Scientific	A-21425	fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe
Alexa Fluor 555 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A34055	fluorescencyjne przeciwciało wtórne
Wzorzec albuminy surowicy bydlęcej (BSA)	euromedex	04-100-812-E
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796-500ml	pożywka do hodowli komórkowych
Duolink In Situ z	podłożem montażowym	DAPI Sigma-Aldrich	DUO82040-5ML
Człowiek: Komórki HeLa S3	IGBMC, Strasburg, Francja		linia komórkowa użyta do przeprowadzenia eksperymentów
Roztwór nadtlenku wodoru 30% (H2O2)	Sigma-Aldrich	H1009-100ml	stosowany jako środek stresogenny
Odczynnik Lipofectamine 2000	Odczynnik do transfekcji	Thermo Fisher Scientific	11668-019
Mysi monoklonalny anty-coilin	abcam	ab11822	Przeciwciało swoiste dla cewki
Mikroskop fluorescencyjny Nikon Optiphot-2	Mikroskop epifluorescencyjny	Nikon
Opti-MEM I Medium o obniżonej surowicy	Thermo Fisher Scientific	31985062	pożywka do transfekcji
PBS pH 7,4 (10x)	gibco	70011-036	do mycia komórek
Królik poliklonalny anty-53BP1	Thermo Fisher Scientific	PA1-16565	Przeciwciało specyficzne dla 53BP1
Królicze poliklonalne przeciwciało anty-EDC4	Sigma-Aldrich	SAB4200114	Przeciwciało specyficzne dla EDC4
Triton X-100	Roth	6683	do przenikania komórek