Transport aksonalny jest kluczowym mechanizmem dla zdrowia neuronów ruchowych. W tym protokole przedstawiamy szczegółową metodę śledzenia transportu aksonalnego przedziałów kwasowych i mitochondriów w aksonach neuronów ruchowych za pomocą komór mikroprzepływowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Transport aksonalny organelli w kulturach neuronów ruchowych z wykorzystaniem systemu komór mikroprzepływowych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Neurony ruchowe (MN) to wysoce spolaryzowane komórki z bardzo długimi aksonami. Transport aksonalny jest kluczowym mechanizmem dla zdrowia MN, przyczyniając się do wzrostu, rozwoju i przeżycia neuronów. Opisano szczegółową metodę wykorzystania komór mikroprzepływowych (MFC) do śledzenia transportu aksonalnego organelli znakowanych fluorescencyjnie w aksonach MN. Ta metoda jest szybka, stosunkowo niedroga i pozwala na monitorowanie sygnałów wewnątrzkomórkowych w przestrzeni i czasie. Opisujemy krok po kroku protokół dla: 1) Wytwarzania MFC z polidimetylosiloksanu (PDMS); 2) Posiewanie eksplantatów brzusznego rdzenia kręgowego i hodowla zdysocjowana MN w MFC; 3) Znakowanie mitochondriów i przedziałów kwasowych, a następnie obrazowanie konfokalne na żywo; 4) Ręczna i półautomatyczna analiza transportu aksonalnego. Na koniec wykazujemy różnicę w transporcie mitochondriów i kwaśnych przedziałów HB9::GFP z eksplantacji brzusznego rdzenia kręgowego jako dowód ważności systemu. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten zapewnia skuteczne narzędzie do badania transportu aksonalnego różnych komponentów aksonalnych, a także uproszczony podręcznik użytkowania MFC, który pomaga odkryć przestrzenne możliwości eksperymentalne.
Wprowadzenie
MN to wysoce spolaryzowane komórki z długimi aksonami, osiągającymi do jednego metra długości u dorosłych ludzi. Zjawisko to stanowi krytyczne wyzwanie dla utrzymania łączności i funkcji MN. W związku z tym MN zależą od prawidłowego transportu informacji, organelli i materiałów wzdłuż aksonów z ich ciała komórkowego do synapsy iz powrotem. Różne składniki komórkowe, takie jak białka, RNA i organelle, są regularnie transportowane przez aksony. Mitochondria są ważnymi organellami, które są rutynowo transportowane w MN. Mitochondria są niezbędne do prawidłowej aktywności i funkcji MN, odpowiedzialne za dostarczanie ATP, buforowanie wapnia i procesy sygnalizacyjne
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Opieka i leczenie zwierząt w tym protokole odbywało się pod nadzorem i aprobatą Komitetu ds. Etyki Zwierząt Uniwersytetu w Tel Awiwie.
1. Przygotowanie MFC
- Odlewanie PDMS w formach pierwotnych (Rysunek 1)
- Kup lub stwórz podstawowe formy (wafle) zgodnie ze szczegółowym protokołem9.
- Użyj sprężonego powietrza, aby usunąć wszelkiego rodzaju zabrudzenia z platformy wafla przed przejściem do etapu powlekania. Powierzchnia wafli powinna wyglądać na gładką i wyraźną.
- Napełnij pojemnik 50 ml ciekłego azotu. Przygotować strzykawkę o pojemności 10 ml i i....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zgodnie z opisanym protokołem, eksplanty rdzenia kręgowego myszy zarodkowej HB9::GFP hodowano w MFC (Rycina 4A). Eksplanty hodowano przez 7 dni, do czasu całkowitego przerostu aksonów do przedziału dystalnego. Do przedziałów dystalnego i proksymalnego dodano barwniki Mitotracker Deep Red oraz Lysotracker Red w celu oznakowania mitochondriów i przedziałów kwaśnych (Rysunek 4C). Obrazowano aksony w.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym protokole opisujemy system śledzenia transportu aksonalnego mitochondriów i kwaśnych przedziałów w neuronach ruchowych. Ta uproszczona platforma in vitro umożliwia precyzyjną kontrolę, monitorowanie i manipulację subkomórkowymi przedziałami neuronalnymi, umożliwiając eksperymentalną analizę lokalnych funkcji neuronów ruchowych. Protokół ten może być przydatny do badania chorób MN, takich jak ALS, aby skupić się na zrozumieniu mechanizmu leżącego u podstaw dysfunkcji transportu aksonalnego w chorobie
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty z Izraelskiej Fundacji Naukowej (ISF, 561/11) i Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC, 309377).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 35mm Fluodish – szklane dno | talerz World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – szklana podstawka | Świat Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 Kamera EMCCD | Andor | ||
| ARA-C (Cytozyna β-D-arabinofuranozyd) | Sigma-Aldrich | C1768 | zapas 2mM w filtrowanym DDW |
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Rozcieńczony do 10 &mikro; g / ml w filtrowanym ddw z 0,01% BSA) |
| Dziurkacz do biopsji 1,25 mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | Do przygotowania dużego |
| stempla do biopsji MFC 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | Do przygotowania małego stempla do |
| biopsji MFC 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | Do przygotowania dużego MFC |
| Bitplane Oprogramowanie Imaris - wersja 8.4.1 | Imaris | ||
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v w ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Rozcieńczony do 10 i mikro; g / ml w przefiltrowanym ddw z 0,01% BSA) |
| Gradient gęstości Medium - Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoksyrybonukleaza I (DNAse) z trzustki bydła | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL w neurobasenie |
| Dow Corning Wysokopróżniowy smar silikonowy | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | Do przygotowania formy epoksydowej |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | Rozcieńczyć 1:10 w DDW |
| Drobne kleszcze Dumont #55 0,05 i razy; 0,02 mm | FST | ||
| Utwardzacz epoksydowy | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | Do przygotowania formy epoksydowej |
| Żywica epoksydowa | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | Do przygotowania formy epoksydowej |
| Oprogramowanie FIJI | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Rozcieńczony do 10 i mikro; g/mL w filtrowanym ddw z 0,01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP szczep myszy | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Rozcieńczyć 1:10 w ddw z dodatkiem 1% P/S i filtrem |
| iQ software | Nożyczki Andor | ||
| Iris, zakrzywione, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Nożyczki do przysłony, proste, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Podłoże neuropodstawowe | Thermo Fisher | 21103049 | |
| mikorskop Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| Penicylina-Streptomycyna (P/S) Rozwiązanie | Przemysł biologiczny | 03-031-1 | |
| Poli-L-Ornityna (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Rozcieńczyć 1:1000 w roztworze 1X PBS |
| Sylgard 184 zestaw elastomerów silikonowych | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsyna z trzustki bydlęcej | Sigma-Aldrich | T1426 | zapas 25 mg / ml w 1XPBS |
| Vannas sprężynowe nożyczki do mikrodysekcji, ostrze 3 mm | FST | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
Bibliografia
- Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
- Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neu....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
