Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Transport aksonalny organelli w kulturach neuronów ruchowych z wykorzystaniem systemu komór mikroprzepływowych

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60993

⸱

5 maja 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Sagol School of Neuroscience, Tel Aviv University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Transport aksonalny jest kluczowym mechanizmem dla zdrowia neuronów ruchowych. W tym protokole przedstawiamy szczegółową metodę śledzenia transportu aksonalnego przedziałów kwasowych i mitochondriów w aksonach neuronów ruchowych za pomocą komór mikroprzepływowych.

Streszczenie

Neurony ruchowe (MN) to wysoce spolaryzowane komórki z bardzo długimi aksonami. Transport aksonalny jest kluczowym mechanizmem dla zdrowia MN, przyczyniając się do wzrostu, rozwoju i przeżycia neuronów. Opisano szczegółową metodę wykorzystania komór mikroprzepływowych (MFC) do śledzenia transportu aksonalnego organelli znakowanych fluorescencyjnie w aksonach MN. Ta metoda jest szybka, stosunkowo niedroga i pozwala na monitorowanie sygnałów wewnątrzkomórkowych w przestrzeni i czasie. Opisujemy krok po kroku protokół dla: 1) Wytwarzania MFC z polidimetylosiloksanu (PDMS); 2) Posiewanie eksplantatów brzusznego rdzenia kręgowego i hodowla zdysocjowana MN w MFC; 3) Znakowanie mitochondriów i przedziałów kwasowych, a następnie obrazowanie konfokalne na żywo; 4) Ręczna i półautomatyczna analiza transportu aksonalnego. Na koniec wykazujemy różnicę w transporcie mitochondriów i kwaśnych przedziałów HB9::GFP z eksplantacji brzusznego rdzenia kręgowego jako dowód ważności systemu. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten zapewnia skuteczne narzędzie do badania transportu aksonalnego różnych komponentów aksonalnych, a także uproszczony podręcznik użytkowania MFC, który pomaga odkryć przestrzenne możliwości eksperymentalne.

Wprowadzenie

MN to wysoce spolaryzowane komórki z długimi aksonami, osiągającymi do jednego metra długości u dorosłych ludzi. Zjawisko to stanowi krytyczne wyzwanie dla utrzymania łączności i funkcji MN. W związku z tym MN zależą od prawidłowego transportu informacji, organelli i materiałów wzdłuż aksonów z ich ciała komórkowego do synapsy iz powrotem. Różne składniki komórkowe, takie jak białka, RNA i organelle, są regularnie transportowane przez aksony. Mitochondria są ważnymi organellami, które są rutynowo transportowane w MN. Mitochondria są niezbędne do prawidłowej aktywności i funkcji MN, odpowiedzialne za dostarczanie ATP, buforowanie wapnia i procesy sygnalizacyjne1,2. Axonalny transport mitochondriów jest dobrze zbadanym procesem3,4. Co ciekawe, stwierdzono, że defekty w transporcie mitochondrialnym są zaangażowane w kilka chorób neurodegeneracyjnych, a w szczególności w choroby MN5. Przedziały kwasowe służą jako kolejny przykład wewnętrznych organelli, które poruszają się wzdłuż aksonów MN. Przedziały kwasowe obejmują lizosomy, endosomy, aparat trans-Golgiego i niektóre pęcherzyki wydzielnicze6. Defekty w transporcie aksonalnym kompartmentów kwasowych stwierdzono również w kilku chorobach neurodegeneracyjnych7, a ostatnie prace podkreślają ich znaczenie w chorobach MN8.

Aby efektywnie badać transport aksonalny, często stosuje się komory mikroprzepływowe, które oddzielają przedziały somatyczne i aksonalne9,10. Dwie istotne zalety układu mikroprzepływowego oraz podział na kompartmenty i izolację aksonów sprawiają, że jest on idealny do badania procesów subkomórkowych11. Przestrzenna separacja między ciałami komórek neuronalnych a aksonami może być wykorzystana do manipulowania środowiskami zewnątrzkomórkowymi różnych przedziałów neuronalnych (np. aksony vs. soma). Testy biochemiczne, wzrostu/degeneracji neuronów i immunofluorescencji czerpią korzyści z tej platformy. MFC mogą również pomóc w badaniu komunikacji międzykomórkowej poprzez kokulturację neuronów z innymi typami komórek, takimi jak mięśnie szkieletowe12,13,14.

Tutaj opisujemy prosty, ale precyzyjny protokół monitorowania mitochondriów i kwaśnego transportu kompartmentów w neuronach ruchowych. Dalej pokazujemy zastosowanie tej metody, porównując względny procent ruchomych organelli poruszających się wstecz i następczo, a także rozkład prędkości transportu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opieka i leczenie zwierząt w tym protokole odbywało się pod nadzorem i aprobatą Komitetu ds. Etyki Zwierząt Uniwersytetu w Tel Awiwie.

1. Przygotowanie MFC

  1. Odlewanie PDMS w formach pierwotnych (Rysunek 1)
    1. Kup lub stwórz podstawowe formy (wafle) zgodnie ze szczegółowym protokołem9.
    2. Użyj sprężonego powietrza, aby usunąć wszelkiego rodzaju zabrudzenia z platformy wafla przed przejściem do etapu powlekania. Powierzchnia wafli powinna wyglądać na gładką i wyraźną.
    3. Napełnij pojemnik 50 ml ciekłego azotu. Przygotować strzykawkę o pojemności 10 ml i igłę 23 g.
      UWAGA: Wszystkie procedury od tego kroku naprzód muszą być wykonywane w kapturze chemicznym.
    4. W kapturze chemicznym za pomocą strzykawki i igły zebrać 2 ml ciekłego azotu. Choć może się wydawać, że powietrze zostało zaczerpnięte, strzykawka jest wypełniona azotem (Rysunek 1A). Umieść płytkę zawierającą wafel w zamykanym pojemniku.
    5. Zakręcić butelkę z chlorotrimetylosilanem, przekłuć gumową nakrętkę za pomocą strzykawki wypełnionej azotem i wstrzyknąć całą zawartość strzykawki do butelki. Nie wyciągając igły, odwróć butelkę do góry dnem i odciągnij 2 ml chlorotrimetylosilianu.
      UWAGA: Ze względu na ciśnienie w strzykawce, niewielka ilość chlorotrimetylosilanu jest rozpylana z igły. Aby uniknąć zagrożenia, skieruj igłę w stronę wewnętrznej ścianki kaptura (Rysunek 1B).
    6. Chlorotrimetylosilan rozprowadzić równomiernie w pojemniku (od kroku 1.1.4), ale nie bezpośrednio na płytce lub płytce zawierającej płytkę. Zamknąć pojemnik i inkubować przez 5 minut na płytkę.
      UWAGA: Jeśli wafel jest powlekany chlorotrimetylosilanem, należy pozostawić 1 godzinę inkubacji dla każdej płytki.
    7. Nie wyjmuj wafli i pojemnika z okapu chemicznego przez 30 min.
      UWAGA: Chlorotrimetylosilan jest bardzo lotny.
    8. Zważyć bazę PDMS (patrz tabela materiałów) w probówce o pojemności 50 ml i dodać utwardzacz PDMS w stosunku odpowiednio 16:1 (np. 47,05 g zasady i 2,95 g utwardzacza). Mieszaj przez 10 minut za pomocą rotatora o niskiej prędkości.
    9. Wlej PDMS do każdej płytki zawierającej wafel na żądaną wysokość (Rysunek 1C).
      UWAGA: Stosowanie cienkich komór mikroprzepływowych (do 3-4 mm) poprawia przyleganie do naczynia hodowlanego i zapobiega wyciekom.
    10. Umieść wszystkie płytki razem w eksykatorze próżniowym na 2 godziny (Rysunek 1E). Proces ten usuwa powietrze uwięzione w PDMS, eliminując w ten sposób pęcherzyki powietrza i tworząc przezroczystą, jednolitą pleśń.
    11. Umieść talerze w piekarniku na 3 godziny (lub na noc) w temperaturze 70 °C (Rysunek 1E).
      UWAGA: Po włożeniu do piekarnika talerze powinny być wypoziomowane.
  2. Odlewanie PDMS w formach epoksydowych
    UWAGA: Ponieważ przygotowanie wafli jest drogie, wymaga specjalnego sprzętu i może uszkodzić kruche wafle, możliwe jest wygenerowanie epoksydowych replik wafli. Repliki są tańsze, trwalsze i mogą być wykorzystywane do masowej produkcji komór mikroprzepływowych.
    1. Odlewać i utwardzać PDMS (zgodnie z opisem w 1.1.8-1.1.11) do oryginalnej płytki.
    2. Usuń i odetnij nadmiar części PDMS, pozostawiając tylko elementy mikroprzepływowe i obszar funkcjonalny wymagany do przetworzenia ich na komory mikroprzepływowe.
    3. Natychmiast owiń PDMS grubą, lepką taśmą, aby zapobiec gromadzeniu się kurzu.
    4. Wybierz plastikowe naczynie do hodowli tkankowych, które mieści się w całym PDMS w środku i pozostaw miejsce na żywicę epoksydową wokół niego. Odległość od PDMS do plastikowego naczynia powinna być mniejsza niż 5 mm.
    5. Przygotować niewielką ilość PDMS wymieszaną w proporcji 10:1 (baza:utwardzacz). Świeży płynny PDMS zostanie użyty do przyklejenia stałego PDMS do dolnej części plastikowej płytki.
    6. Nałóż minimalną ilość płynnego PDMS na środkowe dno plastikowej płytki, a następnie usuń taśmę klejącą z PDMS i przyklej ją do plastikowego dna naczynia. Upewnij się, że elementy mikroprzepływowe są skierowane do góry.
    7. Pozostaw PDMS na utwardzenie przez 30 minut w piekarniku o temperaturze 70 °C.
    8. Przygotuj żywicę epoksydową, mieszając bazę i utwardzacz w proporcji odpowiednio 100:45 w probówce. Różne żywice epoksydowe mogą mieć różne proporcje mieszania. Wymagana objętość dla zwykłej płytki o średnicy 100 mm wynosi około 40 ml.
    9. Pozwól żywicy epoksydowej dobrze wymieszać przez 10 minut w rotatorze, aż mieszanina stanie się widocznie jednorodna (tj. w cieczy nie ma widocznych artefaktów przypominających włókna).
    10. Odwirować mieszaninę epoksydową o sile 400 x g przez 5 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione w środku.
    11. Podczas wirowania rozprowadź cienką warstwę smaru silikonowego wokół ścianek i wszystkich innych odsłoniętych plastikowych części naczynia hodowlanego. Zapobiegnie to polimeryzacji żywicy epoksydowej z tworzywem sztucznym naczynia i umożliwi łatwe usunięcie utwardzonej żywicy epoksydowej po zakończeniu protokołu.
    12. Powoli wlewaj żywicę epoksydową do naczynia, aż całkowicie zakryje PDMS i wyjdzie poza niego na co najmniej 5 mm. Zapobiegaj tworzeniu się pęcherzyków w żywicy epoksydowej, zachowując zerową odległość między rurką a płytą. Umieść płytkę w bezpiecznym miejscu, aby nie była przesuwana przez następne 48 godzin.
    13. Po 48 h żywica epoksydowa powinna być całkowicie utwardzona. Włóż płytkę do piekarnika nagrzanego do 80 °C na 3 godziny w celu ostatecznego utwardzenia.
    14. Usuń utwardzoną żywicę epoksydową z płyty i oryginalnej formy PDMS, delikatnie szarpiąc plastikową ściankę płytki, aż pęknie. Następnie powinien łatwo oddzielić się od żywicy epoksydowej i odkleić się.
    15. Po wyjęciu zetrzyj pozostały tłuszcz z nowej repliki epoksydowej i włóż ją do góry nogami (tj. z replikowanymi elementami mikroprzepływowymi skierowanymi do góry) do nowego naczynia hodowlanego. Replika epoksydowa jest teraz gotowa do odlewania PDMS.
    16. Użyj sprężonego powietrza lub N2, aby zdmuchnąć wszelkie pozostałości PDMS lub brud z formy epoksydowej i spłukać ją 2x izopropanolem. Napełnij go po raz trzeci i inkubuj przez 10 minut na orbitalnej płytce wytrząsarki. Ponownie opłucz formę 3x izopropanolem i wylej pozostały płyn. Wysuszyć suszarką z użyciem soku N2 lub wstawić do piekarnika o temperaturze 70 °C do wyschnięcia.
      UWAGA: Przestrzegaj procedur bezpieczeństwa podczas pracy z izopropanolem i jego wyrzucania.
    17. Utrzymuj płyty formy zamknięte do momentu odlewania. Wykonaj kroki 1.1.8.-1.1.11.
  3. Dziurkowanie i rzeźbienie PDMS w MFC (Rysunek 2)
    1. Wytnij i usuń formę PDMS z płytki, postępując zgodnie ze znakami (+) na waflach za pomocą skalpela. Nie używaj siły, ponieważ formy są delikatne (Rysunek 2A).
    2. Postępuj zgodnie z instrukcjami narysowanymi na szkicu, aby przebić i przeciąć komory w zależności od konfiguracji eksperymentalnej (Rysunek 2B-F).
      1. W przypadku hodowli eksplantatów rdzenia kręgowego (Rysunek 2C, E), przebij dwie 7-milimetrowe studzienki w dystalnej stronie dużego MFC. Zlokalizuj studnie w taki sposób, aby zachodziły na krawędzie kanału. Po stronie proksymalnej przebij jedną studnię o średnicy 7 mm w środku kanału, z minimalnym zachodzeniem na siebie, tak aby pozostało wystarczająco dużo miejsca na eksplantaty. Przebij dwa dodatkowe otwory o średnicy 1 mm w dwóch krawędziach kanału proksymalnego. Obróć płytę melaminowaną z elementami mikroprzepływowymi skierowanymi do góry i za pomocą igły 20 G wytnij trzy małe jaskinie eksplantacji na wybitej studni o średnicy 7 mm.
      2. W przypadku zdysocjowanej hodowli MN (Rysunek 2D,F), przebij cztery 6-milimetrowe dołki w krawędziach dwóch kanałów małego MFC.
  4. Sterylizacja MFC do użytku w kulturach tkankowych
    1. Rozłóż na ławce taśmy klejące o długości 50 cm. Naciśnij i odciągnij komorę tak, aby była skierowana w stronę taśmy klejącej (zarówno górna, jak i dolna powierzchnia) i usuń surowy brud. Umieść czyste komory w nowym talerzu o średnicy 15 cm.
      UWAGA: Nie naciskaj bezpośrednio na elementy mikroprzepływowe, gdy są one skierowane do góry.
    2. Inkubować komory w 70% etanolu klasy analitycznej przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej.
    3. Wyrzucić etanol i wysuszyć komory w okapie do hodowli tkankowych lub w piecu w temperaturze 70 °C.
  5. Umieszczanie płyty melaminowanej na naczyniu ze szklanym dnem
    1. Umieść komorę w środku szklanego naczynia z dnem klasy hodowli tkankowej 35 mm/50 mm i przyłóż niewielką siłę do krawędzi, aby PDMS i dno naczynia się związały. Aby uniknąć stłuczenia szklanego dna, zawsze przykładaj siłę do twardej powierzchni.
    2. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 70 °C. Docisnąć komory, aby wzmocnić przyleganie do płytki.
    3. Inkubować w świetle UV przez 10 minut.
  6. Powlekanie i hodowla
    1. Dodaj 1,5 ng/ml poli-L-ornityny (PLO) do obu komór. Upewnij się, że PLO przepływa przez kanały, pipetując medium powlekające kilka razy bezpośrednio w wejściu do kanału.
    2. Zbadaj komorę mikroprzepływową pod mikroskopem świetlnym o 10-krotnym powiększeniu, aby sprawdzić, czy nie ma pęcherzyków powietrza. Jeśli pęcherzyki powietrza blokują mikrorowki, umieść MFC w eksykatorze próżniowym na 2 minuty. Później usuń nadmiar powietrza, które dostało się do kanałów, pipetując przez nie media powlekające. Inkubować przez noc.
    3. Zastąp PLO lamininą (3 μg/ml w DDW) do inkubacji przez noc w ten sam sposób.
    4. Przed posiewem przemyj lamininę pożywką do hodowli neuronów.

2. Posiewanie kultur neuronalnych

  1. Zdysocjowana hodowla neuronów ruchowych
    1. Za pomocą prostych nożyczek i cienkich kleszczy wypreparuj rdzeń kręgowy z zarodka myszy E12.5 ICR-HB9::GFP. Pracuj w roztworze 1X HBSS z 1% penicyliną-streptomycyną (P/S) (Rysunek 3A-C).
    2. Za pomocą nożyczek do mikrodysekcji usuń opony mózgowe i rogi grzbietowe (Rysunek 3D).
    3. Zebrać kawałki rdzenia kręgowego i przenieść do probówki (#1) z 1 ml HBSS + 1% P/S.
    4. Przetnij rdzeń kręgowy na małe kawałki za pomocą zakrzywionych nożyczek i poczekaj, aż kawałki się usiądą.
    5. Dodać 10 μl trypsyny 2,5% i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 10 minut. Po 5 minutach wymieszaj, stukając w rurkę. Kawałki powinny tworzyć spiralną kępę.
    6. Przenieś grudkę do nowej probówki (#2) zawierającej 800 μl podgrzanego L-15, 100 μl BSA 4% i 100 μl 10 mg/ml DNazy. Zmiel 2x, a następnie odczekaj 2 minuty, aby nierozdzielone kawałki osiadły. Przenieść supernatant do nowej probówki (#3).
    7. Dodać 100 μl BSA 4%, 20 μl 10 mg/ml DNazy i 900 μl kompletnej pożywki neuropodstawowej (CNB, patrz tabela materiałów i tabela 1). Zmielić 8x i odczekać 2 min. Zebrać supernatant do probówki #3.
    8. Powtórz krok 2.1.7 i zmiel 10x. Zbierz supernatant do probówki #3. Na dnie probówki należy pozostawić niewielką ilość tkanki.
      UWAGA: Jeśli na dnie rurki #2 nadal pozostaje duża grudka, powtórz krok 2.1.8.
    9. Dodaj 1 ml poduszki BSA 4% na dno probówki #3.
    10. Wirować przy 400 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
    11. Ponownie zawiesić osad komórkowy, delikatnie stukając w probówkę, a następnie dodać 1 ml pożywki CNB. Odpipetować 6x i dodać 20 μL 10 mg/ml DNazy.
    12. Uzupełnij dodatkowymi 5 ml pożywki CNB i przenieś 3 ml do nowej probówki (#4).
    13. Dodaj 1 ml pożywki o gradiencie gęstości 10,4% (patrz Tabela 2) na dno każdej probówki (#3 i #4). Powinna pojawić się ostra separacja faz między dwoma interfejsami.
    14. Wirować przy 775 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT). Opóźnienie wirówki powinno być ustawione na niskim poziomie, aby uniknąć awarii separacji faz.
    15. Komórki powinny unosić się w powietrzu, pojawiając się jako mętna interfaza między pożywką. Zbierz komórki z obu probówek do nowej probówki (#5) zawierającej już podgrzane podłoże CNB o pojemności 1 ml.
    16. Dodaj dodatkowe 4-6 ml pożywki CNB.
    17. Dodaj 1 ml poduszki BSA 4% na dno probówki.
    18. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić osad z 1 ml pożywki CNB.
    19. Policz komórki. Oczekuje się plonu 0,75-1 x 106 MN na rdzeń kręgowy.
      UWAGA: Brzuszny rdzeń kręgowy zawiera również inne podtypy neuronów oprócz neuronów ruchowych (np. Interneurony). Czystość MN zależy głównie od usunięcia obszarów grzbietowych podczas sekcji i zdolności do dotarcia do obszarów rostralnych wzbogaconych w MN. Aby upewnić się, że zobrazowane neurony są MN, zaleca się użycie szczepu myszy z endogennym markerem MN, takiego jak myszy HB9::GFP. Aby uzyskać czystą hodowlę MN (ale ze zmniejszoną wydajnością komórek), możliwe jest użycie FACS purification15.
    20. Posiewanie zdysocjowanej kultury MN w MFC
      1. Zagęścić 150 000 MN na komorę przez odwirowanie przy 400 x g przez 5 minut.
      2. Odessać supernatant i delikatnie zawiesić komórki w bogatym podłożu neurobazalnym (RNB) w stężeniu 4 μl na MFC. RNB to CNB uzupełniony o dodatkowe 2% B27 i 25 ng/ml BDNF.
      3. Usunąć pożywkę z obu komór, pozostawiając małą objętość odpowiadającą ~10 μl w studzienkach dystalnej komory. Pojawia się jako cienki pierścień pożywki na obwodzie studni.
      4. Powoli załaduj 4 μl komórek do kanału. Wyjmij 4 μl studzienki po drugiej stronie kanału i powoli załaduj je z powrotem bezpośrednio do kanału, aby odwrócić przepływ prądu i zmaksymalizować gęstość komórek w kanale.
      5. Sprawdź, czy komórki dostały się do kanału za pomocą mikroskopu 10x światła i umieść komorę w inkubatorze na 30 minut bez dodawania większej ilości pożywki.
      6. Powoli dodaj ~10-15 μL RNB do studzienek proksymalnych i dystalnych i umieść komory w inkubatorze na kolejne 15 minut.
      7. Po tej inkubacji powoli dodaj ~75-80 μL RNB do każdej studzienki.
    21. Utrzymanie zdysocjowanej kultury MN
      1. Dzień po posiewie (DIV1) zastąp pożywkę RNB uzupełnionym 1 μM arabinozydem cytozyny (Ara-C), aby zahamować wzrost gleju.
      2. Dwa dni po zastosowaniu Ara-C (DIV3) zastąp pożywkę świeżą pożywką CNB w komorze proksymalnej (bez Ara-C).
      3. W celu ułatwienia przechodzenia aksonów przez mikrorowki, należy zastosować RNB uzupełniony 25 ng / ml czynnika neurotroficznego pochodzącego z komórek glejowych (GDNF) i 25 ng / ml neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF) tylko do dystalnego przedziału. Utrzymać gradient objętości wynoszący co najmniej 10 μl na studzienkę między dołkami dystalnymi aksonów (większa objętość) a studzienkami proksymalnymi.
      4. Odświeżaj podłoże co 2 dni. Dystalne skrzyżowanie aksonów może zająć do 4-6 dni.
  2. Posiew eksplantatów rdzenia kręgowego
    1. Za pomocą prostych nożyczek i cienkich kleszczy wypreparuj rdzeń kręgowy z zarodka myszy E12.5 ICR-HB9::GFP. Pracuj w roztworze 1X HBSS z 1% penicyliną-streptomycyną (P/S) (Rysunek 3A-C).
    2. Za pomocą nożyczek do mikrodysekcji usuń opony mózgowe i rogi grzbietowe (Rysunek 3D).
    3. Przeciąć rdzeń kręgowy na odcinki poprzeczne o grubości 1 mm (Rysunek 3E). Usunąć całe podłoże z proksymalnej komory MFC.
    4. Pobrać pipetą pojedynczy eksplant rdzenia kręgowego o łącznej objętości 4 μl. Wstrzyknąć eksplant jak najbliżej jaskini i wyciągnąć nadmiar płynu z dołu proksymalnego przez boczne ujścia (stemple 1 mm). Eksplantaty należy zassać do kanału proksymalnego.
    5. Powoli dodawać 150 μl pożywki eksplantacyjnej do rdzenia kręgowego (SCEX, patrz tabela materiałów i tabela 3) do studzienki proksymalnej.
    6. Utrzymanie hodowli eksplantatów rdzenia kręgowego
      1. Dodać pożywkę SCEX w przedziale proksymalnym i bogatą pożywkę SCEX (SCEX z 50 ng/ml BDNF i GDNF) w przedziale dystalnym. Utrzymać gradient objętości wynoszący co najmniej 15 μl na studzienkę między studzienkami dystalnymi (większa objętość) a studzienką proksymalną.
      2. Odświeżaj podłoże co 2 dni. Dystalne skrzyżowanie aksonów może zająć do 3-5 dni.

3. Transport aksonalny (Rysunek 4A)

  1. Znakowanie mitochondriów i kompartmentów kwasowych
    1. Przygotuj świeżą pożywkę SCEX (lub CNB dla zdysocjowanego MN) zawierającą 100 nM Mitotracker Deep Red FM i 100 nM LysoTracker Red. Inkubować przez 30-60 minut w temperaturze 37 °C. Inne kolory mogą być używane, o ile ich fluorofory nie zachodzą na siebie.
    2. Umyć 3x ciepłym medium CNB/SCEX. Płytki są gotowe do obrazowania.
  2. Obrazowanie na żywo
    1. Wykonaj 100 serii zdjęć poklatkowych z transportem aksonalnym w odstępach 3 s, łącznie 5 minut na film.
      UWAGA: System obrazowania użyty w tym badaniu obejmował mikroskop odwrócony wyposażony w konfokal z wirującym dyskiem, sterowany za pomocą zastrzeżonego oprogramowania do obrazowania komórek, soczewkę olejową 60x, NA = 1,4 i kamerę EMCCD. Filmy zostały zarejestrowane w kontrolowanym środowisku w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
      UWAGA: Można tworzyć dłuższe lub krótsze filmy poklatkowe, w zależności od eksperymentu. W razie potrzeby można nagrywać nawet filmy z nocy. Jednak bardzo ważne jest, aby spróbować skrócić czas naświetlania i moc lasera, a także liczbę całkowitych obrazów, aby zmniejszyć fototoksyczność i wybielanie podczas pozyskiwania filmów.

4. Analiza obrazu (Rysunki 4-5)

  1. Analiza rozkładu i gęstości transportu cząstek za pomocą analizy kimografowej
    1. Otwórz plik w FIDŻI. Oddzielne kanały naciskając Obraz | Stosy | Narzędzia | Usuń przeplot.
    2. Ustaw właściwości obrazu, naciskając Obraz | Właściwości.
    3. Wybierz narzędzie Linia podzielona na segmenty, klikając prawym przyciskiem myszy ikonę linii. Ustaw szerokość na 8-10, klikając dwukrotnie ikonę linii. Zachowaj spójność z tą samą szerokością linii w całej analizie.
    4. Zaznacz odcinkową linię biegnącą wzdłuż ścieżki aksonów od dystalnej do bliższej. Kliknij dwukrotnie, aby zatrzymać oznaczanie linii.
    5. Kliknij t, aby dodać nowy obszar zainteresowania (ROI) do Menedżera ROI. Dodaj to do tabeli analizy arkusza kalkulacyjnego.
    6. Kliknij m, aby zmierzyć obszar i długość aksonu. Dodaj to do tabeli analizy.
    7. Wygeneruj kimograf, klikając Wtyczki | Skrzynka narzędziowa KymoToolBox | Narysuj Kymo. Alternatywnie można użyć innych dostępnych wtyczek do generowania kymografów.
    8. Ręcznie policz cząstki poruszające się (wsteczne lub następcze) i nieruchome i dodaj je do tabeli w odpowiedniej kolumnie.
      UWAGA: Cząstki są klasyfikowane jako poruszające się w kierunku następczym (tj. poruszającym się w lewo na kimografie) lub wstecznym (tj. poruszającym się w prawo), jeśli ich przemieszczenie jest większe niż 10 μm w określonym kierunku. Możliwe jest zmierzenie przemieszczenia, po prostu zaznaczając poziomą linię za pomocą ikony linii i naciskając m. Cząstki nieruchome lub te, które nie spełniają kryteriów przemieszczenia, są definiowane jako nieruchome (Rysunek 4B).
  2. Śledzenie pojedynczych cząstek: Śledzenie ręczne
    1. Pobierz wtyczkę do ręcznego śledzenia dla oprogramowania FIJI (opracowaną przez Fabrice'a P. Cordelière'a) ze strony http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
    2. Otwórz plik w formacie FIJI/ImageJ. Użyj opcji Obróć, aby wyrównać rowki MFC w poziomie.
    3. Aby w razie potrzeby poprawić stosunek sygnału do szumu, kliknij przycisk Przetwarzaj | Odejmij tło.
    4. Otwórz wtyczkę Śledzenie ręczne. Ustaw parametry (np. rozmiar piksela, interwał czasowy itp.) zgodnie z konkretnym mikroskopem używanym do obrazowania. W przypadku przedstawionych tutaj wyników mikroskop i obiektyw współczynnik wynosił 0,239 μm/piksel, a odstęp między klatkami wynosił 3 s.
    5. Uzyskaj współrzędne X i Y ścieżek i zapisz wyniki, kopiując tekst do arkusza kalkulacyjnego.
    6. Analizowanie filmów wielokanałowych przez kliknięcie opcji Obraz | Kolor | Scal kanały, aby scalić kanały, a następnie śledzić tylko kolokalizowane punkty punktowe.
  3. Śledzenie pojedynczych cząstek: Półautomatyczne śledzenie (Rysunek 5)
    1. Otwórz oprogramowanie do analizy. W badaniu wykorzystano oprogramowanie Bitplane Imaris w wersji 8.4.1.
    2. Przełącz się na Surpass w górnym menu.
    3. Kliknij opcję Przetwarzanie obrazu | Czas wymiany i Z | Dobrze.
    4. Kliknij Edytuj | Właściwości obrazu (Ctrl+I) | Geometria | Wiersz rozmiaru wokseli. Ustaw właściwości obrazu zgodnie z używaną konfiguracją mikroskopii.
      UWAGA: W przypadku wyświetlanych tutaj danych stosunek mikroskopu i obiektywu wynosił 0,239 μm/piksel.
    5. Kliknij opcję Wszystkie równoodległe i zmień interwał czasu. Na przykład użyj 3 s jako interwału. Kliknij przycisk Resetuj w prawym dolnym rogu lub kliknij Ctrl+B.
    6. Dodaj warstwę plam w lewym górnym rogu, klikając ikonę małych żółtych punktów. W lewym dolnym rogu otwiera się nowe menu do edycji miejsc.
    7. Naciskaj niebieską strzałkę w prawo, aż rozpocznie się wykrywanie plam.
      UWAGA: Ważne jest, aby odfiltrować niektóre kropki za pomocą filtra w lewym dolnym rogu okna. Sprawdź film kilka razy, aby zobaczyć, czy wybrano wystarczającą liczbę kropek.
    8. Sprawdź lub skonfiguruj parametry tak, aby odpowiadały potrzebom eksperymentalnym. Na przykład maksymalna odległość = 12 μm (maksymalna dozwolona odległość między dwoma odrębnymi punktami, aby nadal uwzględniać je na tej samej pojedynczej ścieżce); Maksymalny rozmiar odstępu = 1 (liczba klatek, które ścieżka może pominąć i nadal jest uważana za jedną ścieżkę).
    9. Kliknij Ustawienia, a następnie Styl ścieżki = Wyłączone, Punkty = Sfera.
    10. Korzystając z paska filtrów, wybierz różne filtry do dostosowania. Na przykład w podanych tutaj danych czas trwania ścieżki = 9 usunął wszystkie ścieżki zawierające mniej niż 3 klatki. Po ustawieniu wszystkich parametrów kliknij zieloną strzałkę w prawo. Dalsza edycja po tym kroku nie jest możliwa.
    11. Kliknij mały ołówek z kropkami, aby ręcznie edytować wszystkie ścieżki.
    12. Zobacz film (Rysunek 5B). Jeśli wystąpi błąd, istnieje kilka możliwych opcji:
      1. Aby odłączyć ścieżkę, kliknij opcję Obiekt i wybierz dwa miejsca, które należy rozłączyć, przytrzymując Ctrl, a następnie wybierz opcję Rozłącz.
      2. Aby połączyć ścieżkę, kliknij opcję Obiekt, wybierz dwa miejsca, które mają zostać połączone, przytrzymując Ctrl i wybierz Połącz.
      3. Aby usunąć ślad lub miejsce, za pomocą odpowiedniej opcji (Ścieżka/Obiekt) przełącz się na ekran za pomocą ikony zwykłego ołówka i wybierz opcję Usuń.
      4. Aby dodać plamy ręcznie, przełącz się na ekran zwykłej ikony ołówka. U dołu ekranu znajduje się ręczny znacznik śledzenia. Upewnij się, że pole wyboru Automatyczne łączenie ma wartość V. Na samym filmie, aby dodać miejsce, przytrzymaj przycisk Shift i kliknij lewym przyciskiem myszy.
    13. Aby dodać miejsce do istniejącej ścieżki, wybierz żądaną ścieżkę (żółtą) i ramkę, przełącz się na ekran zwykłej ikony ołówka i dodaj miejsce ręcznie. Gdy cały film zostanie ukończony, przełącz się na ikonę, która wygląda jak czerwony wykres (statystyki). Możliwa jest późniejsza edycja analizowanych parametrów. Aby edytować, w lewym dolnym rogu ekranu naciśnij ikonę szwedzkiego. Na przykład: Pozycja X, Pozycja Y.
    14. Naciśnij ikonę, która wygląda jak kilka dyskietek, wyeksportuj wszystkie statystyki.
      UWAGA: Dane wyjściowe arkusza kalkulacyjnego mogą być obsługiwane bezpośrednio lub dalej analizowane za pomocą opublikowanego kodu 9 używanego do tej analizy, który zostanie udostępniony na żądanie. Z analizy pobierane są następujące parametry: prędkość, przemieszczenie toru, długość przejazdu, prędkość (w tym kierunkowość), liczba zatrzymań, średni czas trwania postoju, alfa, zmiany kierunku i prędkość chwilowa. Szczegółowe wyjaśnienie każdego parametru jest opisane w Gluska et al.9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z opisanym protokołem, eksplanty rdzenia kręgowego myszy zarodkowej HB9::GFP hodowano w MFC (Rycina 4A). Eksplanty hodowano przez 7 dni, do czasu całkowitego przerostu aksonów do przedziału dystalnego. Do przedziałów dystalnego i proksymalnego dodano barwniki Mitotracker Deep Red oraz Lysotracker Red w celu oznakowania mitochondriów i przedziałów kwaśnych (Rysunek 4C). Obrazowano aksony w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym protokole opisujemy system śledzenia transportu aksonalnego mitochondriów i kwaśnych przedziałów w neuronach ruchowych. Ta uproszczona platforma in vitro umożliwia precyzyjną kontrolę, monitorowanie i manipulację subkomórkowymi przedziałami neuronalnymi, umożliwiając eksperymentalną analizę lokalnych funkcji neuronów ruchowych. Protokół ten może być przydatny do badania chorób MN, takich jak ALS, aby skupić się na zrozumieniu mechanizmu leżącego u podstaw dysfunkcji transportu aksonalnego w chorobie

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Izraelskiej Fundacji Naukowej (ISF, 561/11) i Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC, 309377).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
35mm Fluodish – szklane dnotalerz World Precision Instruments WPIFD35-100
50mm Fluodish – szklana podstawkaŚwiat Precision Instruments WPIFD5040-100
Andor iXon DU-897 Kamera EMCCDAndor
ARA-C (Cytozyna β-D-arabinofuranozyd)Sigma-AldrichC1768zapas 2mM w filtrowanym DDW
B-27 Suplement (50X)Thermo Fisher17504044
BDNFAlomone LabsB-250Rozcieńczony do 10 &mikro; g / ml w filtrowanym ddw z 0,01% BSA)
Dziurkacz do biopsji 1,25 mmWorld Precision Instruments WPI504530Do przygotowania dużego
stempla do biopsji MFC 6mmWorld Precision Instruments WPI504533Do przygotowania małego stempla do
biopsji MFC 7mmWorld Precision Instruments WPI504534Do przygotowania dużego MFC
Bitplane Oprogramowanie Imaris - wersja 8.4.1Imaris
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-Aldrich#A3311-100G5% w/v w ddw
ChlorotrimetylsilaneSigma-Aldrich#386529-100ML
CNTFAlomone LabsC-240Rozcieńczony do 10 i mikro; g / ml w przefiltrowanym ddw z 0,01% BSA)
Gradient gęstości Medium - OptiprepSigma-AldrichD1556
Deoksyrybonukleaza I (DNAse) z trzustki bydłaSigma-AldrichDN-25stock 10mg/mL w neurobasenie
Dow Corning Wysokopróżniowy smar silikonowySigma-AldrichZ273554-1EADo przygotowania formy epoksydowej
DPBS 10XThermo Fisher#14200-067Rozcieńczyć 1:10 w DDW
Drobne kleszcze Dumont #55 0,05 i razy; 0,02 mmFST
Utwardzacz epoksydowyTrias Chem S.R.LIPE 743Do przygotowania formy epoksydowej
Żywica epoksydowaTrias Chem S.R.LRP 026UVDo przygotowania formy epoksydowej
Oprogramowanie FIJIImageJ
GDNFAlomone LabsG-240Rozcieńczony do 10 i mikro; g/mL w filtrowanym ddw z 0,01% BSA)
Glutamax 100XThermo Fisher#35050-038
HB9:GFP szczep myszyJackson Laboratories005029
HBSS 10XThermo Fisher#14185-045Rozcieńczyć 1:10 w ddw z dodatkiem 1% P/S i filtrem
iQ softwareNożyczki Andor
Iris, zakrzywione, 10 cmAS Medizintechnik11-441-10
Nożyczki do przysłony, proste, 9 cmAS Medizintechnik11-440-09
LamininSigma-Aldrich#L-2020
Leibovitz's L-15 MediumThermo Fisher11415064
LysoTracker RedThermo FisherL7528
Mitotracker Deep-Red FMThermo FisherM22426
Podłoże neuropodstawoweThermo Fisher21103049
mikorskop Nikon Eclipse TiNikon
Penicylina-Streptomycyna (P/S) RozwiązaniePrzemysł biologiczny03-031-1
Poli-L-Ornityna (PLO)Sigma-Aldrich#P8638Rozcieńczyć 1:1000 w roztworze 1X PBS
Sylgard 184 zestaw elastomerów silikonowychDOW Corning Corporation#3097358-1004
Trypsyna z trzustki bydlęcejSigma-AldrichT1426zapas 25 mg / ml w 1XPBS
Vannas sprężynowe nożyczki do mikrodysekcji, ostrze 3 mmFST15000-00
Yokogawa CSU X-1Yokogawa
1125520

Bibliografia

  1. Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
  2. Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).
  3. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
  4. Mandal, A., Drerup, C. M. Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373(2019).
  5. Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).
  6. Anderson, R. G. W., Orci, L. A view of acidic intracellular compartments. Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).
  7. Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration. Current Biology. 28, R471-R486 (2018).
  8. Ya-Cheng Liao, A., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179, 147-164 (2019).
  9. Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers. Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).
  10. Gershoni-Emek, N., et al. Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311(2018).
  11. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  12. Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).
  13. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  14. Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ. Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).
  15. Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).
  16. Ionescu, A., et al. Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model. Cell Death & Disease. 10 (3), 210(2019).
  17. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  18. Maimon, R., et al. Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS. Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kultura neuron w ruchowychformowanie w PDMSznakowanie organellikonfokalne obrazowanie ywych kom rekanaliza kymograficznaMitoTracker Deep RedLysoTracker Redrdze kr gowy HB9 GFP
Transport aksonalny organelli w kulturach neuronów ruchowych z wykorzystaniem systemu komór mikroprzepływowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.