Ta praca opisuje dwie metody badania rozwoju narządów, ulepszone ustawienie ksenotransplantacji na błonie kosmówkowo-omoczniowej (CAM) z ptasich embrionów, które pozwala na unaczynienie hodowanych narządów embrionalnych i organoidów oraz nowatorską metodę hodowli narządów w stałym kierunku z zmodyfikowanymi warunkami eksperymentalnymi, która pozwala na obrazowanie konfokalne w wysokiej rozdzielczości w trybie poklatkowym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Optymalizacja organoidów nerkowych i hodowli organotypowych pod kątem unaczynienia, przedłużony rozwój i ulepszone obrazowanie mikroskopowe
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Embrionalne organotypy nerek, a zwłaszcza organoidy nerkowe pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych, są doskonałymi narzędziami do śledzenia procesów rozwojowych i modelowania chorób nerek. Modele są jednak ograniczone brakiem unaczynienia i funkcjonalności. Aby rozwiązać ten problem, opracowano ulepszony protokół dotyczący metody ksenoprzeszczepu komórek i tkanek do błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) ptasiego zarodka w celu unaczynienia i przywrócenia przepływu krwi. Szczepy są pokryte specjalnie wykonanymi minizbiornikami, które mocują próbki do CAM i dostarczają im pożywkę hodowlaną, która chroni przeszczepy przed wysuszeniem. Ulepszona metoda hodowli pozwala ksenoprzeszczepom rosnąć do 9 dni. W pracy opisano również, w jaki sposób zapewnić optymalne warunki do długoterminowego obrazowania konfokalnego organoidów nerkowych i kultur organotypowych z wykorzystaniem wcześniej opublikowanej metody Fixed Z-Direction (FiZD). Metoda ta delikatnie kompresuje narząd zarodkowy lub organoid między szklanym szkiełkiem nakrywkowym a błoną w dużej ilości podłoża i zapewnia doskonałe warunki do obrazowania przez okres do 12 dni. Razem metody te umożliwiają unaczynienie i przepływ krwi do organoidów nerkowych i organotypowych hodowli nerek z ulepszonym obrazowaniem konfokalnym. Opisane tutaj metody są bardzo korzystne dla badania podstawowych i stosowanych funkcji nerek ex vivo. Obie metody mają zastosowanie do różnych typów tkanek i organoidów.
Wprowadzenie
Organotypowa hodowla nerek embrionalnych stała się ważnym modelem do badania nefrostenezy dziesiątki lat temu1,2,3. Organoidy nerkowe reprezentują zaawansowany system modelowy do badania rozwoju zdrowych i chorych nerek4. Główną wadą obu metod jest jednak to, że żadna z nich nie podsumowuje głównej funkcji nerek: filtracji krwi. Nefrony i układ naczyniowy nerek rozwijają się w organoidach nerkowych i kulturach organotypowych podobnie jak we wczesnym stadium rozwoju in vivo; Jednak kłębuszki nerkowe powstałe in vitro pozostają anaczyniowe5. Unaczynienie nerek zarodkowych ex vivo i organoidów nerkowych wykazano wcześniej w eksperymentach transplantacyjnych tylko w warunkach in vivo. Na przykład, przeszczepienie ludzkich pluripotencjalnych organoidów nerkowych pochodzących z komórek macierzystych pod mysią torebkę nerkową umożliwia rozwój nefronów w organoidzie do etapu funkcjonalnego6.
Pośrednim podejściem między kulturami czysto in vitro a metodami transplantacji in vivo jest ksenotransplantacja do CAM ptasich embrionów. Unaczynienie nienaruszonej zawiązki nerki myszy wykazano już wcześniej przy użyciu tego systemu7,8. Wykazano jednak również, że unaczynienie nerek w mysiej nerce po ksenoprzeszczepie pochodziło ze śródbłonka gospodarza, a nie z graft9. Obserwacja ta znacznie zmniejszyła potencjał chimerycznych (ptasich ssaków) modeli embrionalnej nerki do badania rozwoju naczyń nerkowych, ponieważ warunki eksperymentalne nie pozwalały na przeżycie komórek śródbłonka pochodzących od dawcy.
W pierwszej części tego protokołu przedstawiona jest ulepszona metoda hodowli embrionalnych nerek myszy na CAM jaj ptaków, łącząca warunki mikrośrodowiskowe hodowli organotypowej i ksenotransplantacji. Główne ulepszenie w stosunku do poprzednich metod polega na tym, że zamiast umieszczać embrionalne nerki myszy i organoidy nerkowe bezpośrednio na CAM, obszar implantacji jest pokryty przepuszczalnymi minizbiornikami wypełnionymi pożywką, które zaopatrują przeszczepioną tkankę w składniki odżywcze i chronią ją przed wysuszeniem. Wskaźnik powodzenia eksperymentów znacznie wzrasta i poprawiają się warunki rozwoju naczyń krwionośnych pochodzących od dawcy. Zastosowanie tej metody do hodowli ksenotransplantacyjnych skutkuje rozwojem unaczynienia kłębuszkowego zbudowanego z endogennych komórek śródbłonka pochodzących z nerek dawcy.
Szczegółowa analiza morfogenezy komórkowej to kolejne ważne zastosowanie modeli hodowli nerek. Wcześniej opisywane metody pozyskiwania poklatkowych obrazów kultur nerkowych są wystarczające tylko do analizy ogólnej morfologii i wzorca nerki embrionalnej, ale nie do śledzenia pojedynczych komórek10. Niedawno opisano nowatorską metodę Fixed Z-Direction (FiZD) mającą na celu konfokalne obrazowanie poklatkowe 3D organoidów nerkowych i kultur organotypowych o wysokiej rozdzielczości11. W tej metodzie organoidy i narządy embrionalne są delikatnie ściskane między szklanym szkiełkiem nakrywkowym a przepuszczalną membraną wkładki transwell w specjalnie zaprojektowanej płytce, aż grubość próbki osiągnie 70 μm, zapewniając optymalne warunki optyczne do obrazowania. W drugiej części metod opisano szczegółowy protokół wytwarzania specjalnie zaprojektowanej płytki oraz konfiguracji eksperymentów FiZD do długoterminowego obrazowania organoidów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Opieka nad zwierzętami i procedury były zgodne z fińskim ustawodawstwem krajowym dotyczącym wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych, Europejską Konwencją o ochronie zwierząt kręgowych wykorzystywanych do celów doświadczalnych i innych celów naukowych (ETS 123) oraz Dyrektywą UE 86/609/EWG.
1. Produkcja minizbiorników do hodowli embrionalnych nerek myszy i organoidów nerkowych na CAM kurczaka i przeprowadzanie eksperymentów ksenotransplantacyjnych
- Stosować wkładki do hodowli komórkowych transwell przeznaczone do płytek 6-dołkowych lub 12-dołkowych.
UWAGA: W zależności od konkretnego eksperymentu można użyć dużych lub małych minizbiorników. Najlepiej jest używać małych minizbiorników do ksenoprzeszczepu do ośmiu nerek embrionalnych lub gdy kilka minizbiorników zostanie umieszczonych na tym samym zarodku kurczaka (np. próbki eksperymentalne i kontrolne na tym samym CAM kurczaka). - Wytnij boki wkładek za pomocą obrotowego narzędzia wielofunkcyjnego z tarczą piły tarczowej lub piły ręcznej, aby utworzyć plastikowy pierścień o wysokości 2 mm z przymocowaną do niego przepuszczalną membraną.
- Wypoleruj krawędzie tych minizbiorników skalpelem lub ostrym nożem.
- Sterylizuj minizbiorniki w 70% etanolu przez co najmniej 1 godzinę.
- Umyj minizbiorniki w autoklawowanej wodzie podwójnie destylowanej i pozwól im wyschnąć w okapie laminarnym.
- Przepłukać minizbiorniki w PBS i pożywce hodowlanej (DMEM o wysokiej zawartości glukozy/10% FBS/1% penicylina-streptomycyna).
- Umieścić zbiornik na szalce Petriego, na kropli (600 μl/400 μl) pożywki hodowlanej, z membraną skierowaną do góry.
- Wypreparowane ex vivo nerki embrionalne lub organoidy nerkowe ułożyć równomiernie na błonie za pomocą pipety lub szklanej rurki kapilarnej. Unikaj pozostawiania dużej ilości płynu wokół nerek.
- Pozostawić próbki do membrany na 2–24 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
UWAGA: Na małej wkładce można umieścić do ośmiu embrionalnych nerek myszy E11.5 lub organoidów nerkowych. Duża wkładka jest zalecana, jeśli do ksenotransplantacji będą używane większe fragmenty tkanki embrionalnej lub mieszanina komórkowo-hydrożelowa na większej powierzchni CAM. - Z inkubatora hodowli komórkowych należy wyjąć 8-dniowe kurczaki embrionalne hodowane ex ovo przygotowane zgodnie z wcześniej opublikowanymi metodami12,13.
- Przenieś minizbiorniki do CAM tak, aby przeszczepy były skierowane w stronę CAM, a membrana je pokrywała. Umieść minizbiorniki na obrzeżach CAM, tak aby nie zakrywały zarodka kurczaka.
UWAGA: W przypadku korzystania z mniejszych minizbiorników wykonanych z wkładek transwell dla płytek 12-dołkowych, na jednym CAM można umieścić do trzech minizbiorników. - Dodać 500 μl (wkładka 6-dołkowa) lub 300 μl (wkładka 12-dołkowa) pożywki hodowlanej do minizbiorników.
- Próbki należy hodować na CAM dla kurczaków przez maksymalnie 9 dni. Codziennie wymieniaj pożywkę hodowlaną w minizbiornikach.
UWAGA: Unaczynienie próbek można zaobserwować już po 24–48 godzinach od przeszczepienia.
2. Wytwarzanie płyt projektowanych na zamówienie i ustawianie kultur FiZD
- Wywierć otwory o średnicy 20 mm w dnie płytki 6-dołkowej.
UWAGA: Do eksperymentów FiZD należy użyć 6 płytek dołkowych o głębokości studzienki 16 mm (określonej w Tabeli Materiałów). - Wypoleruj krawędzie otworów (szczególnie na górnej stronie) za pomocą wiertarki elektrycznej z wiertłem pogłębiającym, skalpela lub ostrego noża.
- Sterylizuj płytki w 70% etanolu przez co najmniej 1 godzinę.
- Umyj płytki w autoklawowanej wodzie podwójnie destylowanej i pozostaw do wyschnięcia w sterylnych warunkach.
- Szkiełka nakrywkowe ze szkła o wymiarach 22 mm x 22 mm należy dokładnie umyć 70% etanolem lub wyczyścić zgodnie z opublikowanym protokołem przez Saarela et al.11.
- Przyklej szkiełka nakrywkowe do górnej strony otworów w płytkach 6-dołkowych za pomocą nietoksycznego kleju tkankowego. Nałóż klej wokół otworu i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe, aby go zakryć. Pozostaw klej do wyschnięcia.
- Sprawdź płytki pod mikroskopem stereoskopowym i w razie potrzeby usuń nadmiar zaschniętego kleju z powierzchni szkiełek nakrywkowych.
UWAGA: Sprawdź, czy nad szkiełkiem nakrywkowym nie ma kleju, aby zapewnić równomierne ściskanie próbek. - Wymieszaj kulki polistyrenowe (wielkość cząstek 70 μm) z równą objętością hydrożelu. Wystarczająca jest objętość 50–100 μl na studzienkę.
UWAGA: Mieszaninę hydrożelu i kulek polistyrenowych należy przechowywać na lodzie. - Umieść wkładkę transwell pod mikroskopem preparacyjnym z membraną do góry.
- Próbki (np. zarodkowe nerki ex vivo lub organoidy nerkowe) należy równomiernie ułożyć na błonie.
- Ostrożnie dodaj mieszaninę hydrożelu i kulek polistyrenowych obok próbek, aby uniknąć uszkodzenia delikatnych tkanek.
- Odwróć wkładkę transwell tak, aby membrana z zamontowanymi na niej próbkami była skierowana w dół.
- Delikatnie umieść wkładkę w studzience zmodyfikowanej płytki 6-dołkowej i delikatnie dociśnij ją, aby próbki zostały ściśnięte do poziomu kulek.
UWAGA: Śledź postęp kompresji za pomocą mikroskopu. - Jedną ręką przytrzymaj wkładkę lekko dociśniętą do studni i przymocuj ją do płytki, topiąc plastik lutownicą w trzech punktach na obrzeżach wkładki.
- Gdy wkładka jest przymocowana do płytki, dodaj 2 ml pożywki hodowlanej (DMEM/10% FBS/1% penicyliny-streptomycyny) do dołka i kontynuuj składanie pozostałych studzienek na płytce w ten sam sposób.
- Przenieś gotową płytkę do inkubatora na stoliku mikroskopu odwróconego w celu obrazowania poklatkowego.
- Wykonaj obrazowanie poklatkowe próbek przy użyciu odpowiednich ustawień eksperymentalnych.
UWAGA: Zmiana pożywki hodowlanej w dołkach płytki podczas eksperymentów poklatkowych nie jest wymagana, ale można ją łatwo wykonać przez otwory po bokach wkładu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przedstawiony tutaj protokół hodowli na błonie chalazowej (CAM) umożliwił bardzo wydajną unaczynienie organoidów nerkowych i nerek embrionalnych w wyniku ksenotransplantacji na CAM kurczaka (Rysunek 1, Film 1). Minireservoiry zawierające pożywkę dostarczały składników odżywczych do tkanki dawcy i chroniły ją przed wysychaniem w okresie poprzedzającym właściwe unaczynienie. Metoda ta zapewniła sprzyjające warunki do wzrostu komórek śródbłonka pochodzących od dawcy. W związku ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiono dwa szczegółowe protokoły, które udoskonalają klasyczną metodę organotypowej hodowli nerek i umożliwiają unaczynienie, rozszerzony rozwój oraz optymalne obrazowanie 4D (tj. obraz 3D i czas) zarodkowych nerek i organoidów ex vivo. W tej sekcji przedstawiono krytyczne kroki metod i omówiono rozwiązywanie problemów.
Istotną różnicą między innymi metodami hodowli CAM a tą ulepszoną metodą hodowli CAM kurcząt jest zastosowanie specjalnie zaprojektowanych minizbiorników w ksenoprzeszcz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana finansowo przez Suomen Akatemia (Akademię Fińską) (206038, 121647, 250900, 260056; Grant Centrum Doskonałości 2012-2017 251314), Munuaissäätiö - Fińskie Stowarzyszenie Nerek i Wątroby, Sigrid Juseliuksen Säätiö, Victoriastiftelsen, Szwedzka Fundacja Kulturalna w Finlandii, Novo Nordisk, Syöpäjärjestöt (Fińskie Towarzystwo Walki z Rakiem), Siódmy Program Ramowy Wspólnoty Europejskiej (FP7/2007-2013; grant FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608), oraz Horyzont 2020 działania "Skłodowska-Curie", innowacyjna sieć szkoleniowa "RENALTRACT", numer identyfikacyjny projektu 642937. Autorzy dziękują Pauli Haipus, Johannie Kekolahti-Liias i Hannele Härkman za pomoc techniczną.
Rysunki 3, 4 i Film 2 są przedrukowane za zgodą Działu Rozwoju.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Regulowane wiertło łopatkowe | Bosch | 2609255277 | Do wiercenia otworów o średnicy 20 mm |
| Automatyczna obracarka do jaj | OLBA B.V., Holandia | AT-42 | Do inkubacji jaj przed ustawieniem ex ovo. |
| Inkubator komórkowy | Panasonic | 13090543 | Temperatura ustawiona na 37° C, 90% wilgotności, 5% CO2 |
| Cell Inkubator | SANYO | 10070347 | Inkubator do hodowli kurczaków. Temperatura ustawiona na 37° C, wilgotność 90%, 5% CO2 |
| Płytka 6-dołkowa Cellstar | Greiner | M9062 | Głębokość studzienek 16 mm dopasowana do wkładów |
| Brzeszczot piły tarczowej do narzędzia obrotowego Dremel Mikroskop | Dremel | SC690 | |
| Płytka wielodołkowa Zeiss | LSM780 | ||
| Corning Transwell z przepuszczalnymi wkładkami z membrany poliwęglanowej | Corning | 10301031 | Do płytek 6-dołkowych. 40 i mikro; m wielkość porów |
| Wiertło stożkowe | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | Do polerowania (20,5 mm, 1/4", HSS) |
| Jednorazowa szklana rurka kapilarna | Blaubrand | 7087 33 | |
| Jednorazowy skalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Mikroskop preparacyjny | Olympus | SZ61 | |
| Wiertarka | Bosch | GSR 18 V-EC Profesjonalny | |
| wysokiej zawartości glukozy | Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 |
| Compact S84 | Grumbach, Niemcy | 8012 | Do inkubacji jaj przed konfiguracją ex ovo. Temperatura ustawiona na 38° C przy wilgotności względnej powyżej 60% |
| Etanol (70%) | Jaja | ||
| Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finlandia | Hy-Line White and Nick | ||
| Chick Płodowa surowica bydlęca Hyklon | SH3007003HI Thermo Scientific | ||
| Kleszcze DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Szkiełka nakrywkowe szklane | Menzel-Glä ser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22x22 mm |
| Klej Histoacryl | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Inkubator nasadowy | Okolab | Boldline, wykonany na zamówienie | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Mycie mini zbiorników. |
| Penicylina i Streptomycyna | Sigma | P4333 | |
| Koraliki polistyrenowe | Krwinkowe | 1000263-10 | 70 &mikro; m średnicy |
| Obrotowy system narzędzi wielofunkcyjnych | Lutownica Dremel | 4000 | |
| Weller | TCP S | Można również stosować podgrzewaną szklaną kapilarnę | |
| Thincert 12-dołkowe wkładki do hodowli komórkowych o 0,4 i mikro; M-pore Polistyren Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-dołkowe wkładki do hodowli komórkowych z 0,4 i mikro; Membrana polistyrenowa m-pore | Greiner Bio-One | 657610 |
Bibliografia
- Saxen, L., Wartiovaara, J. Cell contact and cell adhesion during tissue organization. International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).
- Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. Untersuchungen über die tubulogenese der niere. Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).
- Saxen, L. Organogenesis of the Kidney. 1st ed. , Cambridge University Press. Cambridge. (1987).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 536 (7615), 238(2016).
- Halt, K. J., et al. CD146+ cells are essential for kidney vasculature development. Kidney International. 90, 311-324 (2016).
- van den Berg, C. W., et al. Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane. Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).
- Sariola, H. Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli. Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).
- Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. The origin of the glomerular endothelium. Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).
- Short, K. M., et al. Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney. Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).
- Saarela, U., et al. Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging. Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. 44, e2154(2010).
- Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958(2013).
- Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract. Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).
- Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice. Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
