Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiary fizjologicznych reakcji na stres u C. elegans

14.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61001

⸱

21 maja 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj charakteryzujemy komórkowe reakcje na stres proteotoksyczny u nicieni C. elegans, mierząc aktywację fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i oceniając wrażliwość na stres fizjologiczny.

Streszczenie

Organizmy są często narażone na zmienne warunki środowiskowe i zmiany w homeostazie wewnątrzkomórkowej, co może mieć szkodliwy wpływ na ich proteom i fizjologię. W ten sposób organizmy wyewoluowały ukierunkowane i specyficzne reakcje na stres przeznaczone do naprawy uszkodzeń i utrzymania homeostazy. Mechanizmy te obejmują niesfałdowaną odpowiedź białkową retikulum endoplazmatycznego (UPRER), niesfałdowaną odpowiedź białkową mitochondriów (UPRMT), odpowiedź na szok cieplny (HSR) i odpowiedź na stres oksydacyjny (OxSR). Przedstawione tutaj protokoły opisują metody wykrywania i charakteryzowania aktywacji tych szlaków oraz ich fizjologicznych konsekwencji u nicienia C. elegans. Po pierwsze, opisano zastosowanie specyficznych dla szlaku fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych do szybkiej charakterystyki komórek, badań przesiewowych leków lub badań genetycznych na dużą skalę (np. RNAi lub bibliotek mutantów). Ponadto opisano komplementarne, solidne testy fizjologiczne, które można wykorzystać do bezpośredniej oceny wrażliwości zwierząt na określone czynniki stresogenne, służąc jako walidacja funkcjonalna reporterów transkrypcyjnych. Łącznie metody te pozwalają na szybką charakterystykę komórkowych i fizjologicznych skutków wewnętrznych i zewnętrznych zaburzeń proteotoksycznych.

Wprowadzenie

Zdolność organizmu do reagowania na zmiany w środowisku wewnątrz- i zewnątrzkomórkowym jest kluczowa dla jego przetrwania i adaptacji. Osiąga się to na poziomie komórkowym poprzez liczne szlaki ochronne, które zapewniają integralność komórki. Podczas gdy wiele składników komórkowych ulega uszkodzeniom związanym ze stresem, jednym z głównych udziałów w reakcjach na stres komórkowy jest naprawa i ochrona homeostazy proteomu komórkowego. Jednak podział białek na specjalne struktury, zwane organellami, stanowi wyzwanie dla komórki, ponieważ nie może ona polegać na jednej scentralizowanej formie kontroli jakości białek, aby zapewnić, że wszystkie białka w komórce są prawidłowo pofałdowane i funkcjonalne. Dlatego, aby poradzić sobie z zaburzeniami ich białek, organelle wykształciły dedykowane mechanizmy kontroli jakości, które mogą wykrywać nieprawidłowo sfałdowane białka i aktywować reakcję na stres w celu złagodzenia stresu w tym przedziale. Na przykład cytozol opiera się na reakcji szoku cieplnego (HSR), podczas gdy retikulum endoplazmatyczne (ER) i mitochondria opierają się na specyficznych dla przedziałów odpowiedziach niesfałdowanych białek (UPR). OxSR służy do łagodzenia toksycznego działania reaktywnych form tlenu (ROS). Każda reakcja na stres jest wyzwalana w obecności wyzwań komórkowych i zniewag środowiskowych i indukuje dostosowaną odpowiedź transkrypcyjną. Cechy charakterystyczne tych reakcji obejmują syntezę cząsteczek, które ponownie fałdują nieprawidłowo sfałdowane białka (takie jak białka opiekuńcze) skierowane do odpowiednich organelli lub alternatywnie, usuwają uszkodzone białka przez degradację białek. Brak aktywacji tych reakcji stresowych powoduje akumulację uszkodzonych białek, dysfunkcję komórkową propagowaną do ogólnoustrojowej niewydolności tkanek i ostatecznie śmierć organizmu. Funkcja i regulacja różnych reakcji na stres są omówione w innym miejscu1.

Wiele spostrzeżeń dotyczących regulacji i aktywności reakcji na stres komórkowy przypisuje się nicieniu, Caenorhabditis elegans, wielokomórkowemu organizmowi modelowemu w badaniach genetycznych. Nicienie pozwalają nie tylko badać aktywację reakcji stresowych na poziomie komórkowym, ale także na poziomie organizmu; Nicienie zostały wykorzystane do badania wpływu zaburzeń genetycznych lub narażenia na leki i zanieczyszczenia na ich wzrost i przeżycie. Ich szybki czas wytwarzania, izogenność, przezroczystość, podatność genetyczna i łatwość użycia podczas eksperymentów sprawiają, że idealnie nadają się do takich badań. Dodatkowo, stosunkowo szybka reakcja fizjologiczna na stres (od kilku godzin do kilku dni) i ewolucyjne zachowanie szlaków komórkowych sprawiają, że nicienie są ważnym narzędziem w badaniu odporności na stres.

Istnieją dwa powszechnie używane szczepy E. coli używane jako źródło pożywienia do hodowli C. elegans: standardowy OP50, szczep B, w którym historycznie przeprowadzono większość eksperymentów2 i HT115, szczep K-12, który jest używany do prawie wszystkich eksperymentów RNAi3,4. Należy zauważyć, że istnieją znaczne różnice między dietami bakteryjnymi OP50 i HT115. Wykazano, że wzrost na tych różnych źródłach bakteryjnych powoduje znaczne różnice w profilu metabolicznym, liczbie kopii mitochondrialnego DNA i kilku głównych fenotypach, w tym długości życia5. Niektóre z tych różnic przypisuje się niedoborowi witaminy B12 związanemu ze wzrostem bakterii OP50, co może skutkować defektami homeostazy mitochondriów i zwiększoną wrażliwością na patogeny i stresy. Wykazano, że wszystkie te fenotypy są łagodzone przez wzrost bakterii HT115, które mają wyższy poziom witaminy B126. Dlatego zaleca się, aby wszystkie eksperymenty dotyczące fizjologicznych reakcji na stres były wykonywane na bakteriach HT115, niezależnie od konieczności wystąpienia warunków RNAi. Jednakże, ze względu na łatwość utrzymania zwierząt na OP50, cały standardowy wzrost (tj. utrzymanie i amplifikacja zwierząt) może być przeprowadzony na OP50, ponieważ znaczące różnice w opisanych tutaj paradygmatach eksperymentalnych nie zostały wykryte u robaków utrzymywanych na OP50, o ile zostały przeniesione do HT115 po synchronizacji (tj. z wylęgu po bieleniu z lub bez zatrzymania L1) do czasu eksperymentów.

Tutaj opisana jest charakterystyka aktywności komórkowych reakcji na stres przy użyciu dwóch metod funkcjonalnych. Należy zauważyć, że przedstawione protokoły koncentrują się przede wszystkim na komórkowych reakcjach na stres i ich wpływie na homeostazę białek. Po pierwsze, wykorzystywane są fluorescencyjne reportery transkrypcyjne, które są regulowane przez endogenne promotory genów, które są specyficznie aktywowane w odpowiedzi na różne stresy komórkowe. Te fluorescencyjne reportery transkrypcyjne opierają się na indukcji transkrypcji określonych genów, które są natywnie częścią odpowiedzi na stres. Na przykład HSP-4, białko szoku cieplnego ortologiczne dla ludzkiego białka opiekuńczego HSPA5 / BiP, jest aktywowane po stresie ER i lokalizuje się w ER, aby złagodzić stres. W warunkach stresu ER (np. narażenie na tunikamycynę) zielone białko fluorescencyjne (GFP), umieszczone pod kontrolą promotora hsp-4, jest syntetyzowane w wysokich poziomach, które można ocenić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub zmierzyć ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej dużych cząstek nicieni7. Podobnie, promotor mitochondrialnego białka opiekuńczego, hsp-6 (ortologiczny do ssaczego HSPA9), jest wykorzystywany do monitorowania aktywacji UPRMT8, a promotor cytozolowego białka opiekuńczego hsp-16.2 (ortologicznego dla ludzkich krystalicznych genów alfa) jest używany do oceny aktywności klasy HSR9. Reportery te pozwalają na szybką charakterystykę ścieżek aktywowanych w odpowiedzi na różne perturbacje.

Często prezentowane tutaj reportery są obrazowane za pomocą mikroskopii, która dostarcza jakościowych danych wyjściowych aktywacji reakcji na stres. Jednakże, chociaż techniki obrazowania dostarczają zarówno informacji na temat intensywności, jak i lokalizacji tkanek reporterów opisanych powyżej, ich kwantyfikacja nie zawsze jest dokładna lub solidna. Chociaż możliwe jest ilościowe określenie aktywacji fluorescencyjnej za pomocą narzędzi do analizy obrazowania, metody te mają stosunkowo niską przepustowość, a wielkość próbki jest niewielka ze względu na stosunkowo niską liczbę obrazowanych zwierząt. Łatwość i zdolność do szybkiego pozyskiwania dużych ilości zwierząt sprawiają, że C. elegans jest idealnym systemem modelowym do oznaczania aktywacji fluorescencyjnych reporterów stresu za pomocą cytometru przepływu dużych cząstek. Cytometr przepływowy o dużych cząstkach jest w stanie rejestrować, analizować i sortować na podstawie wielkości i fluorescencji wielu żywych zwierząt. Za pomocą tej metody możliwe jest uzyskanie intensywności fluorescencji, rozmiaru, a także informacji przestrzennych (2D) dla tysięcy robaków. Sterowanie systemem odbywa się za pomocą FlowPilot, który pozwala na pozyskiwanie danych w czasie rzeczywistym i analizę mierzonych parametrów. W tym przypadku oferowane są metody zarówno obrazowania mikroskopowego, jak i analizy ilościowej przy użyciu cytometru przepływowego o dużych cząstkach jako metody pomiaru aktywacji reakcji na stres.

Poza analizą reportera, wrażliwość lub odporność zwierząt na stres może być mierzona za pomocą fizjologicznych testów stresu. Osiąga się to poprzez wystawianie zwierząt na stresujące środowisko, które aktywuje określone komórkowe szlaki stresu. W tym miejscu przedstawiono kilka metod pomiaru wrażliwości całych zwierząt na określone rodzaje stresorów.

ER stres jest stosowany do C. elegans za pomocą środka chemicznego, tunikamycyny, który blokuje glikozylację połączoną z N, powodując akumulację nieprawidłowo sfałdowanych białek w klasie ER10. U C. elegans wzrost po ekspozycji na tunikamycynę powoduje poważne zaburzenia funkcji ER i znacznie skróconą długość życia11. Mierząc przeżywalność zwierząt na płytkach zawierających tunikamycynę, można określić ilościowo wrażliwość zwierząt na stres ER. Na przykład zwierzęta z ektopową indukcjąUPR ER, a tym samym zwiększoną odpornością na stres związany z nieprawidłowym fałdowaniem białek w ER, mają zwiększoną przeżywalność po ekspozycji na tunikamycynę w porównaniu ze zwierzętami typu dzikiego12.

Stres oksydacyjny i mitochondrialny jest stosowany do C. elegans poprzez wystawienie zwierząt na działanie czynnika chemicznego, parakwatu. Parakwat jest powszechnie stosowanym herbicydem, który powoduje powstawanie ponadtlenków w mitochondriach13. Ze względu na specyficzną lokalizację reaktywnych form tlenu (ROS) pochodzących z mitochondriów, testy parakwatu są często stosowane jako "mitochondrialne" testy stresu. Jednak ponadtlenek jest szybko przekształcany w nadtlenek wodoru przez mitochondrialne dysmutazy ponadtlenkowe (SODs)14. Nadtlenek wodoru może następnie dyfundować z mitochondriów i powodować stres oksydacyjny w innych przedziałach komórki. Dlatego opisujemy testy przeżycia parakwatu jako mierzące czułość zarówno na stres mitochondrialny, jak i oksydacyjny (inne testy stresu oksydacyjnego można znaleźć15).

Testy termotolerancji są przeprowadzane u C. elegans poprzez umieszczanie zwierząt w podwyższonych temperaturach. Temperatury otoczenia dla nicieni wynoszą ~15-20 °C, a stres termiczny jest indukowany w temperaturach powyżej 25 °C16,17. Testy termotolerancji są zwykle wykonywane w temperaturach w zakresie 30-37 °C, ponieważ zwierzęta wykazują poważne defekty komórkowe w tej temperaturze, a testy przeżycia są wykonywane w ciągu 24 godzin16,18. W tym przypadku przewidziano dwie alternatywne metody przeprowadzania testów termotolerancji: wzrost w temperaturze 34 °C i wzrost w temperaturze 37 °C. Razem przedstawione tutaj protokoły mogą być wykorzystane do wykonywania badań przesiewowych na dużą skalę w połączeniu ze standardowym knock-downem genów przy użyciu interferencji RNA lub bibliotek leków chemicznych.

Protokół można podzielić na 4 szerokie procedury - wzrost C. elegans i przygotowanie do obrazowania (sekcje 1 i 2), obrazowanie reporterów transkrypcyjnych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (sekcje 3-5), pomiary ilościowe reporterów za pomocą cytometru przepływowego o dużych cząstkach (sekcja 6) oraz testy fizjologiczne do pomiaru wrażliwości na stres u C. elegans (sekcja 7).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Standardowe warunki wzrostu temperatur & OP50 vs HT115

  1. Standardowy wzrost i ekspansja
    1. Hoduj kulturę OP50 w LB (Tabela 1) lub równoważnym wybranym podłożu przez 24-48 godzin w temperaturze otoczenia (~22-25 °C). Hodować bakterie w temperaturze pokojowej, ponieważ OP50 jest auksotrofem uracylowym i występuje większa częstość występowania rewertantów (np. mutantów supresorowych) podczas uprawy w temperaturze 37 °C. Nie zaleca się długotrwałego przechowywania kultur OP50 (maks. 1 tydzień w temperaturze 4 °C).
    2. Wysiewać objętość ~100-200 μL nasyconej kultury OP50 na 60 mm płytce NGM (Tabela 1) w celu utrzymania robaków i 1 ml nasyconej kultury OP50 na 100 mm płytce w celu namnażania zwierząt w celu eksperymentowania.
    3. Pozostaw talerze do wyschnięcia na noc na blacie.
      UWAGA: Płyty 100 mm mogą potrzebować więcej czasu na wyschnięcie, zwłaszcza jeśli używasz płyt bez wentylacji. Wszystkie płytki C. elegans należy przechowywać w hermetycznych pojemnikach w temperaturze 4 °C. elegans. Nie należy używać płytek w wieku powyżej 6 miesięcy, ponieważ nastąpi wysuszenie płytek, co zmieni fizjologię zwierząt na płytkach ze względu na różne ciśnienie osmotyczne i sztywność płytek.
    4. W przypadku standardowej konserwacji przenieś 10-15 młodych zwierząt (jaja, stadia L1 lub L2) na płytkę o średnicy 60 mm, chociaż można przenieść więcej, jeśli masz do czynienia z mutantami lub zwierzętami transgenicznymi o niższej płodności. W przypadku zwierząt z wadami rozwojowymi lub wadami płodności należy podzielić bardziej zmienną pulę zwierząt, aby zapobiec utracie stada. W przypadku przetrzymywania w temperaturze 15 °C zwierzęta przemieszczać co tydzień; dla 20 °C przemieszczać zwierzęta co 3-4 dni.
    5. Świeże rozmrażanie zwierząt należy wykonywać co 25-30 przejść (~ 6 miesięcy, jeśli zwierzęta są przenoszone raz w tygodniu i trzymane w temperaturze 15 °C).
    6. W celu rozbudowy pokrój pełną płytę 60 mm na płyty 100 mm w celu rozszerzenia. Jako punkt odniesienia, zwierzęta z płodnością typu dzikiego mogą mieć pełną płytkę o średnicy 60 mm pokrojoną na 4-6 części i pokrojone na dużą płytkę w temperaturze 20 °C przez 2 dni lub 15 °C przez 3 dni, aby stworzyć pełną płytkę o średnicy 100 mm bez osiągnięcia głodu.

2. Inscenizacja/synchronizacja robaków za pomocą wybielania

  1. Protokół wybielania w celu synchronizacji robaków
    1. Zmyj robaki grawitacyjne (dorosłe osobniki pełne jaj) z płytek agarowych za pomocą M9 (Tabela 1). Zacznij od niezsynchronizowanej populacji robaków (tj. poszatkowanych robaków z kroku 1.1.6) do wybielania do eksperymentów, ponieważ znaczny dryf genetyczny może wystąpić po kolejnych rundach synchronizacji poprzez bielenie.
    2. Przenieść mieszaninę robaka/M9 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą szklanej pipety; kilka płytek z robakami można zebrać do jednej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    3. Obracaj zwierzęta w dół przez 30 s przy 1,000 x g. Odsysać supernatant M9. Nie ma potrzeby zmywania resztek bakterii, chyba że występuje rażąca ilość zanieczyszczeń lub duże skupiska bakterii. W takim przypadku wykonaj kilka prań za pomocą M9.
    4. Przygotować świeży zapas roztworu wybielającego (Tabela 1). Roztwór wybielający można przechowywać przez kilka dni w temperaturze 4 °C, ale należy używać świeżo przygotowanego roztworu wybielającego, ponieważ nieefektywne wybielanie może spowodować nierównomierne bielenie, które spowoduje uszkodzenie jaj przed wyeliminowaniem wszystkich tusz robaków.
    5. Dodaj zwierzętom 2-10 ml roztworu wybielającego (~1 ml roztworu wybielacza na każde ~0,1 ml granulatu zwierzęcego). Odwróć mieszaninę wybielacza i robaków przez ~5 minut (nie przekraczaj 10 minut; należy pamiętać, że czas wybielania może się różnić i powinien być miareczkowany specjalnie dla każdego laboratorium). Energicznie wstrząsnąć, aby szybciej rozpuścić tusze robaków i zapewnić optymalną konserwację jaj. Od czasu do czasu zaglądaj pod mikroskop preparacyjny lub umieszczaj stożkową rurkę w świetle, aby obserwować, kiedy tusze dorosłych robaków całkowicie się rozpuszczą i w probówce pozostaną tylko jaja.
    6. Jaja należy otulić, wirując z prędkością 1,000 x g przez 30 sekund, a następnie odessać supernatant. Jaja można odwirowywać szybciej niż robaki bez naruszania ich integralności, więc jeśli nie masz pewności co do prędkości wirowania, jaja można odwirować z prędkością do 2,500 x g bez wpływu na ich fizjologię.
    7. Dodaj M9 do 15 ml i odwróć probówkę, aby usunąć wybielacz z jaj.
    8. Powtórz kroki 2.1.6-2.1.7 (proces prania/granulowania) jeszcze 2-3 razy, aby usunąć wybielacz.
    9. Odpipetuj jajko/M9 wymieszaj na talerze i wyrośnij w temperaturze 15-20 °C w celu eksperymentowania. Aby uzyskać miarę, ile robaków należy użyć, wykonaj przybliżone liczenie jaj, pipetując 5 μl mieszanki jaj na płytkę agarową lub szkiełko i dzieląc liczbę jaj przez 5, aby określić liczbę jaj na 1 μl objętości. Uśrednienie 3 niezależnych zliczeń może poprawić dokładność. Aby uniknąć głodu, tabela z zalecaną liczbą jaj na talerzu jest dostępna w tabeli 2.
    10. W razie potrzeby L1 zatrzymuje zwierzęta w celu ściślejszej synchronizacji czasowej, umieszczając mieszankę jaj/M9 w rotatorze w temperaturze 20 °C na okres do 24 godzin. W przypadku zwierząt typu dzikiego nie wykryto żadnych wad w fizjologii zwierząt, gdy L1 zatrzymuje się na okres do 48 godzin. Jednak mutanty, które są wrażliwe na głód (np. mutanty lizosomów lub autofagii) bardzo słabo radzą sobie z zatrzymywaniem L1, dlatego nie zaleca się wykonywania tej metody synchronizacji dla mutantów, o których wiadomo, że są wrażliwe na głód. Jeżeli wymagana jest ściślejsza synchronizacja w przypadku zwierząt, które nie mogą zostać zatrzymane przez L1, należy zastosować metodę składania jaj opisaną w sekcji 2.2.
  2. Protokół składania jaj do synchronizacji robaków
    UWAGA: Jako alternatywną metodę do bielenia można przeprowadzić test nieśności. Składanie jaj stosuje się, gdy bielenie zwierząt nie zapewnia wystarczająco ścisłej synchronizacji, ponieważ jaja w woreczku jajowym dorosłych zwierząt mogą być oddalone od siebie nawet o 8-12 godzin. W przypadku paradygmatów eksperymentalnych, w których kluczowe jest, aby zwierzęta były jak najbliżej siebie, ale gdzie zatrzymanie L1 nie jest możliwe (np. w mutantach głodowych), zaleca się testy składania jaj. Należy jednak zauważyć, że ze względu na pracę związaną z protokołem składania jaj mniej wykonalne jest przeprowadzanie eksperymentów na dużą skalę.
    1. Umieść 4-12 ciężarnych dorosłych (patrz uwaga po kroku 2.2.2) na standardowej płytce NGM z nasionami OP50 lub HT115 (patrz sekcja 1 powyżej, aby zapoznać się z zaleceniami dotyczącymi szczepów bakteryjnych). W zależności od skali eksperymentów można użyć wielu płytek. Pamiętaj, aby dokładnie udokumentować, ile zwierząt znajduje się na każdej tabliczce w kroku 2.2.
    2. Umieść zwierzęta w żądanej temperaturze do eksperymentów (15-20 °C) przez 4-8 godz.
      UWAGA: Liczba godzin, przez które zwierzęta pozostają na talerzu, określi, jak ściśle zsynchronizowane będzie pierwsze złożone jajo i ostatnie złożone jajo, więc czas można dostosować w razie potrzeby. Ponieważ krótszy czas inkubacji oznacza, że każde zwierzę ma mniej czasu na złożenie jaj, więcej zwierząt należy umieścić na talerzach, aby zapewnić złożenie wystarczającej ilości jaj. Podczas gdy rzeczywiste tempo składania jaj nie jest w pełni znormalizowane ze względu na tendencję zwierząt do przechodzenia przez krótkie serie składania jaj, a nie znormalizowane tempo składania jaj, średnie tempo składania jaj na zwierzę można oszacować na ~5 jaj na godzinę dla zwierząt wykazujących płodność typu dzikiego19. Próbując wyhodować zwierzęta do stadium dorosłego w dniu 1, zaplanuj składanie jaj tak, aby mieć <100 jaj na talerzu, aby uniknąć głodu (więcej informacji na temat zalecanych zwierząt na talerzu znajduje się w Tabeli 2).
    3. Usuń dorosłe zwierzęta z talerzy. Upewnij się, że wszystkie dorosłe zwierzęta zostały usunięte z płytek, ponieważ zwierzęta będą nadal składać jaja i spowodują niezsynchronizowaną populację i/lub głód płytki.

3. Warunki wzrostu robaków do obrazowania reporterów transkrypcyjnych

  1. Wzrost robaków
    1. Zaszczepić kulturę bakteryjną HT115 zawierającą plazmid pL4440 RNAi (EV) i/lub przenoszącą kasetę RNAi przeciwko pożądanemu genowi (genom) docelowemu w pożywce LB uzupełnionej 100 μg/ml karbenicyliny i 20 μg/ml tetracykliny.
    2. Hoduj kulturę przez noc (~16 godzin) do nasycenia w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    3. Punktowe płytki RNAi NGM 60 mm z 200 μl nasyconej kultury bakteryjnej i płytki 100 mm RNAi NGM z 1 000 μl nasyconej kultury bakteryjnej. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze otoczenia (~22 °C) przez noc w ciemności (luźno przykryte folią aluminiową).
    4. Umieść zsynchronizowaną populację transgenicznych robaków przenoszących fluorescencyjne reportery (patrz Tabela 3 dla pełnej listy) na płytkach RNAi NGM obsianych wybranymi bakteriami.
    5. Rośnie w temperaturze 15-20 °C do wymaganych etapów dla określonych reporterów, jak opisano poniżej.
  2. Uwagi dotyczące inscenizacji robaków do eksperymentów
    1. Przeprowadzaj eksperymenty dla reporterów transkrypcyjnych w 1. dniu dorosłości, z wyjątkiem testów, które wymagają zwierząt L4. Według WormAtlas, zwierzęta L4 uzyskuje się około 2,5 dnia (~56 godzin) wzrostu w temperaturze 20 °C od fazy jaja (www.wormatlas.org).
    2. W przypadku "dorosłych osobników w dniu 1" należy użyć zwierząt po około 3-4 dniach (~65-96 godzinach) wzrostu w temperaturze 20 °C po posianiu jaj.
      UWAGA: Ten szeroki zakres jest wyjaśniony w następujący sposób: ~65 godzin w temperaturze 20 °C to moment, w którym zwierzęta osiągają "składanie jaj", co jest prawdziwym stanem "dorosłości". 96 godzin to moment, w którym zwierzęta wchodzą w to, co WormAtlas opisuje jako "maksimum składania jaj", co oznacza, że dorosły osobnik jest ciężarnym dorosłym osobnikiem i ma pełny woreczek jajowy. Jest to moment, w którym zwierzęta byłyby opisywane jako starsze niż dzień 1 i mogą zacząć wykazywać różnice, a zatem wszystkie opisane tutaj protokoły są zalecane, aby rozpocząć ten etap "dnia 1", zaczynając już po 65 godzinach, a dopiero po 96 godzinach. W przypadku opisanych tutaj testów nie zaobserwowano większych różnic przy użyciu zwierząt w tym oknie ~65-96 godzin.
    3. W przypadku powtórzeń pojedynczego eksperymentu należy użyć podobnego punktu czasowego, aby uzyskać bardziej wiarygodną odtwarzalność (np. wszystkie eksperymenty należy przeprowadzić po ~65 godzinach lub ~96 godzinach po posiewie jaj).
      UWAGA: Niektóre transgeniczne zwierzęta i mutanty wykazują spowolnione tempo wzrostu. W tym celu istnieją dwa zalecenia. 1) Stosuj synchronizację rozłożoną w czasie, w której zwierzęta mogą być bielone w różnym czasie, aby eksperymenty były przeprowadzane w tym samym czasie. Jest to zalecane, gdy zmienność techniczna w teście może być większa niż zmienność techniczna, która może wynikać z testu synchronizacyjnego (np. testy przeżycia, które trwają przez długi czas, mogą ucierpieć, jeśli nie są wykonywane jednocześnie). 2) Stosuj analizę rozłożoną w czasie, w której zwierzęta mogą być bielone w tym samym czasie, ale sam test jest wykonywany w różnym czasie. Jest to zalecane w przypadku bardzo prostych testów, które nie mają wrodzonej zmienności (np. indukcja RNAi reakcji na stres).

4. Indukcja reakcji na stres

  1. Używanie hsp-4p::GFP jako odczytu dla aktywacjiUPR ER
    1. Indukowanie stresu ER za pomocą RNAi
      1. Przygotować płytki nakrapiane bakteriami RNAi ukierunkowanymi na interesujący gen na płytki RNAi NGM (Tabela 1), jak w sekcji 3. Użyj EV jako kontroli podstawowych poziomówUPR ER i knockdown RNAi tag-335 (enzym do glikozylacji sprzężonej z N białek rezydujących w ER; Nokaut RNAi ma podobne działanie do leczenia tunikamycyną) jako pozytywna kontrola aktywacjiUPR ER pod wpływem stresu ER.
      2. Zsynchronizuj zwierzęta reporterskie hsp-4p::GFP przy użyciu metod opisanych w sekcji 2.
      3. Jaja należy umieszczać na płytkach RNAi, stosując kryteria zalecane w tabeli 2.
      4. Wysiaduj jaja w temperaturze 20 °C przez około 3-4 dni (~65-96 godzin), aby przeprowadzić eksperymenty w 1. dniu dorosłości. W eksperymentach UPRER istnieją różnice w podstawowej fluorescencji reportera hsp-4::GFP uprawianego w różnych temperaturach. Dlatego wszystkie eksperymenty należy wykonywać w temperaturze 20 °C.
    2. Wywoływanie stresu ER za pomocą środka chemicznego
      1. Zsynchronizuj zwierzęta zgłaszające hsp-4p::GFP przy użyciu metod opisanych w sekcji 2 i rosnąć w temperaturze 20 °C, aż zwierzęta osiągną stadium L4. Przenieś zwierzęta do probówki M9. Pozwól robakom się uspokoić (~2-3 minuty grawitacyjnie lub 30 s wirowania przy 1,000 x g), a następnie usuń M9.
      2. Rozcieńczyć tunikamycynę do 25 ng/ml w M9 (rozcieńczenie 1:40 z 1 mg/ml preparatu). Jako kontrolę, należy również rozcieńczyć równoważną objętość DMSO w M9.
      3. Dodaj 25 ng/ml tunikamycyny/M9 lub kontrolny roztwór DMSO/M9 do robaków (użyj 400-500 ml dla probówki 1,5 ml lub 2 ml dla 15 ml probówki stożkowej). Inkubować w temperaturze 20 °C na platformie obrotowej przez 3-4 godziny.
        UWAGA: Tunikamycyna może być również rozcieńczana bezpośrednio do mieszanki robak/M9.
      4. Pozwól robakom się uspokoić, usuń roztwór M9/TM i przemyj 1 ml M9.
      5. Przenieść zwierzęta na płytki NGM lub płytki RNAi NGM i pozostawić do rekonwalescencji przez noc (lub ~15-20 godzin) i osiągnąć 1. dzień dorosłości w temperaturze 20 °C przed wykonaniem mikroskopii fluorescencyjnej (sekcja 5). Przeprowadza się regenerację przez noc, aby umożliwić akumulację wykrywalnego poziomu GFP.
      6. Alternatywnie, indukować hsp-4p::GFP, przenosząc zwierzęta L4 na płytki agarowe zawierające 25 ng / μL tunikamycyny przez 16-24 godziny. Ma to znacznie bardziej solidną indukcję hsp-4p::GFP ze względu na dłuższy czas trwania naprężenia, a zatem zakres dynamiki jest znacznie niższy niż w teście opisanym powyżej.
  2. Używanie hsp-6p::GFP jako odczytu do aktywacjiMT UPR
    1. Indukowanie stresu mitochondrialnego za pomocą RNAi
      1. AktywowaćUPR MT zgodnie z tym samym protokołem, co w sekcji 4.1.1, z wyjątkiem użycia knockdownu RNAi genów mitochondrialnych, takich jak cox-5b/cco-1 (podjednostka 5B oksydazy cytochromu c; knockdown hamuje aktywność łańcucha transportu elektronów). W celu aktywacjiMT UPR poprzez perturbacje w funkcji łańcucha transportu elektronów, należy przeprowadzić knockdown RNAi na wczesnym etapie rozwoju20. Dlatego do tych eksperymentów należy wykonać RNAi z włazu.
    2. Wywoływanie stresu mitochondrialnego za pomocą środka chemicznego
      1. Przygotować płytki nakrapiane bakteriami RNAi ukierunkowanymi na gen będący przedmiotem zainteresowania, jak w sekcji 3. Bakterie HT115 należy stosować nawet w eksperymentach nieobejmujących knockdownu RNAi (patrz punkt 1). Upewnij się, że obie płytki NGM RNAi (lub NGM RNAi + DMSO0,2) i płytki NGM RNAi + antymycyna A (Tabela 1) są przygotowane do kroku 4.2.2.5.
      2. Zsynchronizuj zwierzęta reporterskie hsp-6p::GFP lub hsp-60p::GFP przy użyciu metod opisanych w sekcji 2.
      3. Jaja należy umieszczać na talerzach z nasionami według wyboru, stosując kryteria zalecane w tabeli 2. Ponieważ antymycyna A rozpuszcza się w DMSO, hoduj zwierzęta na płytkach NGM RNAi + DMSO0,2 od wylęgu.
      4. Inkubować jaja w temperaturze 20 °C przez 2 dni (~56 h) do etapu L4. Alternatywnie, zamiast tego hoduj zwierzęta w temperaturze 15 °C przez 3 dni (~75 godzin).
      5. Przenieś robaki z płytek NGM RNAi + DMSO0,2 na płytki NGM RNAi + antymycyna A lub płytki NGM RNAi + DMSO0,2 jako kontrola. Robaki można przenosić ręcznie za pomocą kilofa do eksperymentów na małą skalę, ale w przypadku eksperymentów na dużą skalę zalecamy mycie zwierząt M9, osadzanie się za pomocą wirowania, aspirowanie M9, a następnie posiew na płytkach NGM RNAi + antymycyna A.
      6. Wysiaduj robaki przez dodatkowe ~20 godzin i zobrazuj w 1. dniu dorosłego osobnika (sekcja 5).
  3. Używanie gst-4p::GFP jako odczytu odpowiedzi na stres oksydacyjny.
    1. Indukowanie OxSR za pomocą RNAi
      1. Alternatywnie, indukuj gst-4p::GFP za pomocą RNAi-knockdown wdr-23 (koduje ujemny regulator skn-1; w ten sposób jego knockdown indukuje OxSR) przy użyciu protokołu opisanego w sekcji 4.1.1.
    2. Indukowanie OxSR za pomocą narażenia na utleniacz chemiczny wodoronadtlenek tert-butylu (TBHP)
      1. Przygotować płytki nakrapiane bakteriami RNAi ukierunkowanymi na gen będący przedmiotem zainteresowania, jak w sekcji 3. Bakterie HT115 należy stosować nawet w eksperymentach nieobejmujących knockdownu RNAi (patrz punkt 1).
      2. Zsynchronizuj zwierzęta reporterskie gst-4p::GFP przy użyciu metod opisanych w sekcji 2.
      3. Jaja należy umieszczać na talerzach z nasionami według wyboru, stosując kryteria zalecane w tabeli 2. Pamiętaj, aby przygotować więcej talerzy niż to konieczne, ponieważ protokół leczenia farmakologicznego powoduje utratę >10-20% zwierząt. W przypadku obrazowania zacznij od >100 zwierząt, a w przypadku sortowania zacznij od >1 000 zwierząt.
      4. Wysiadywać jaja w temperaturze 20 °C przez 2 dni (~56 h) do etapu L4. Alternatywnie, zamiast tego hoduj zwierzęta w temperaturze 15 °C przez 3 dni (~75 godzin).
      5. Umyj zwierzęta L4 z płytek i podziel na dwie stożkowe probówki o pojemności 15 ml na warunek. Odessać objętość do co najmniej 1 ml i dodać równą objętość świeżo przygotowanego 2 mM TBHP. Użyj całkowitej objętości płynu do co najmniej 2 ml, ponieważ mniejsze objętości mogą spowodować znaczną śmierć robaków podczas wirowania. Nie myć przed leczeniem farmakologicznym, ponieważ resztki bakterii z płytek pomogą zapewnić, że robaki nie będą nadmiernie głodować podczas inkubacji.
      6. Inkubować robaki na rotatorze przez 4 godziny w temperaturze 20 °C.
      7. Umyj robaki, wirując z prędkością 1,000 x g, zasysając mieszankę M9 + TBHP i zastępując 15 ml M9. Powtórz dla drugiego prania.
      8. Robaki płytkowe na EV RNAi regenerują się przez noc (~16-24 h) w temperaturze 20 °C. Robaki można odzyskać na pasującym RNAi do wyboru, ale nie zaobserwowano znaczących różnic po odzyskaniu na EV RNAi, więc można to zrobić dla ułatwienia konfiguracji eksperymentalnej. Rób zdjęcia osobom dorosłym w 1. dniu po wyzdrowieniu.
        UWAGA: Odzyskiwanie przez noc jest przeprowadzane, aby umożliwić akumulację wykrywalnego poziomu GFP. Bez tego odzyskiwania nie ma wykrywalnego sygnału GFP. Jeżeli pożądana jest krótkotrwała rekonwalescencja, możliwe jest zastosowanie testu opisanego w sekcji 4.3.3.
    3. Indukowanie OxSR za pomocą ekspozycji na parakwas chemiczny utleniający (PQ)
      1. Powtórz wszystkie kroki opisane w sekcji 4.2.2, aby uzyskać 2 partie zwierząt L4 gst-4p::GFP w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml na warunek.
      2. Odessać objętość do co najmniej 1 ml i dodać równą objętość świeżo przygotowanego 100 μM PQ. Podobnie jak w ppkt 4.3.2.5, zalecana jest minimalna objętość 2 ml.
      3. Inkubować robaki na rotatorze przez 2 godziny w temperaturze 20 °C.
      4. Umyj robaki, wirując z prędkością 1,000 x g, zasysając mieszankę M9 + PQ i zastępując 15 ml M9. Powtórz dla drugiego prania.
      5. Robaki płytkowe na EV RNAi w celu odzyskania przez 2 godziny w temperaturze 20 °C, a następnie wykonania zdjęć natychmiast po odzyskaniu.
        UWAGA: 2 godziny rekonwalescencji to minimalny czas rekonwalescencji wymagany do wizualizacji indukcji GFP.
  4. Używanie hsp-16.2p::GFP i hsp-70p::GFP jako odczytu dla aktywacji HSR.
    1. Indukowanie HSR za pomocą ekspozycji na podwyższone temperatury
      1. Przygotować płytki nakrapiane bakteriami RNAi ukierunkowanymi na gen będący przedmiotem zainteresowania, jak w sekcji 3. Używaj bakterii HT115, nawet w eksperymentach nieobejmujących knockdown RNAi (patrz Wprowadzenie).
      2. Zsynchronizuj zwierzęta reporterskie hsp-16.2p::GFP lub hsp-70p::GFP przy użyciu metod opisanych w sekcji 2.
      3. Jaja należy umieszczać na talerzach z nasionami według wyboru, stosując kryteria zalecane w tabeli 2. Pamiętaj, aby przygotować 2 razy więcej płytek niż jest to konieczne, ponieważ połowa próbki będzie wystawiona na działanie podwyższonych temperatur w celu indukcji szoku cieplnego, a druga połowa posłuży jako kontrola bez szoku cieplnego.
      4. Wysiaduj jaja w temperaturze 20 °C przez około 3-4 dni (~65-96 godzin), aby przeprowadzić eksperymenty w 1. dniu dorosłości. Nie hoduj robaków w temperaturze 15 °C do eksperymentów z szokiem cieplnym, ponieważ istnieją tylko niewielkie różnice między zwierzętami doświadczającymi szoku cieplnego w temperaturze powyżej 15 °C a 20 °C.
      5. Przenieść grupy doświadczalne zwierząt do inkubatora o temperaturze 34 °C na 2 godziny. Umieścić płytki w inkubatorze jako pojedynczą warstwę (tj. bez układania płytek w stosy), aby zapewnić najszybszy i najbardziej równomierny rozkład ciepła na płytkach.
      6. Przenieść zwierzęta poddane szokowi cieplnemu do inkubatora o temperaturze 20 °C w celu rekonwalescencji przez 2 godziny, a następnie natychmiast wykonać zdjęcie (patrz sekcja 5). W razie potrzeby zwierzęta mogą być odzyskiwane dłużej w celu uzyskania wyższej indukcji GFP.
        UWAGA: 2 godziny rekonwalescencji to minimalny czas rekonwalescencji wymagany do wizualizacji indukcji GFP.

5. Obrazowanie za pomocą mikroskopu stereoskopowego lub mikroskopu szerokokątnego/złożonego o małym powiększeniu

  1. Przygotowanie robaków do mikroskopii fluorescencyjnej
    1. Odpipetować 5-10 μl 100 mM azydku sodu na standardowej płytce NGM (tj. bez bakterii).
      UWAGA: Stężenie azydku sodu można obniżyć nawet do 10 mM, chociaż najsilniejszą immobilizację zaobserwowano przy 100 mM azydku sodu bez wykrywalnego wpływu na sygnał fluorescencyjny.
    2. Pod mikroskopem preparacyjnym wybierz 10-20 zwierząt z płytek doświadczalnych i przenieś do miejsca azydku sodu. Zwierzęta powinny zaprzestać ruchu wkrótce po wylądowaniu w azydku sodu, a sam azydek sodu wyparuje w ciągu kilku sekund.
    3. Po odparowaniu azydku sodu ustaw zwierzęta w linii do żądanej konfiguracji obrazowania. Przesuwaj zwierzęta obok siebie przednią i tylną stroną w tej samej orientacji dla wszystkich zwierząt. Natychmiast zobrazuj zwierzęta.
      UWAGA: Nie zaobserwowano zmian w sygnale reporterowym dla żadnego z reporterów transkrypcyjnych w Tabeli 3 przez okres do 15 minut po paraliżu w azydku sodu.
  2. Akwizycja obrazu za pomocą mikroskopu stereoskopowego
    UWAGA: Do tego protokołu użyto mikroskopu Leica M205FA wyposażonego w monochromatyczną kamerę CCD Leica DFC3000G, standardowy filtr Leica GFP (ex 395-455, EM 480 LP) i oprogramowanie LAS X. Zalecane ustawienia czasów naświetlania można znaleźć w Tabeli 4.
    1. Uruchom program LAS X.
    2. Rozpocznij nowy projekt: Otwórz zakładkę przejęcia, kliknij Otwórz projekty i kliknij Folder, aby otworzyć nowy projekt. Nazwę tego projektu można zmienić, klikając folder prawym przyciskiem myszy i przewijając w dół do pozycji Zmień nazwę lub klikając F2. W zakładce akwizycja dostępne są również opcje dostosowania czasu ekspozycji i powiększenia do żądanych ustawień.
    3. Umieść próbkę robaka pod obiektywem mikroskopu i zlokalizuj właściwy punkt ogniskowy robaków, korzystając z ustawienia jasnego pola, aby zminimalizować blaknięcie fluorescencyjne. Środek próbki to miejsce, w którym linia jaj jest wyraźnie widoczna i nie jest rozmyta. Ustaw żądane ustawienia czasu ekspozycji, zoomu, ostrości i kondensorów jasnego pola.
    4. Uzyskaj obraz za pomocą przycisku Przechwyć obraz.
    5. Zapisz obraz w formacie .lif (Leica Image File), ponieważ zapisuje to wszystkie surowe obrazy i metadane. Plik TIFF można również wyeksportować, klikając obraz (lub projekt) prawym przyciskiem myszy, a następnie w opcji Zapisz jako kliknij opcję TIFF. Spowoduje to zapisanie wszystkich kanałów (np. jasnego pola i GFP) z dowolnymi modyfikacjami (np. jeśli dostosowano kontrast, zostanie to zapisane w formacie TIFF).
  3. Analiza ilościowa obrazów fluorescencyjnych
    1. Jeśli będzie przeprowadzana analiza ilościowa, wykonaj zdjęcia 3D. Odbywa się to poprzez kliknięcie opcji przekroju z oznaczonej literą "z" w prawym górnym rogu. Sekcje Z będą aktywne, jeśli to pole jest czerwone.
    2. Zoptymalizuj przekroje Z, wybierając zakres i grubość plastra w lewym dolnym rogu regulowanych opcji. Jeśli to możliwe, użyj przycisku Zoptymalizowany system, aby uzyskać optymalne ustawienia.
    3. Przechwyć obraz i zapisz go w sposób opisany powyżej w sekcji 5.2. Ułóż robaki z odstępami między nimi, aby ułatwić pomiary.
    4. Zaimportuj obrazy TIFF do wybranego oprogramowania do przetwarzania obrazu (np. ImageJ).
    5. W przypadku ImageJ z menu Analizuj wybierz opcję Ustaw pomiary. Sprawdź następujące elementy: obszar, średnia wartość szarości, zintegrowana gęstość, etykieta wyświetlacza.
    6. Korzystając z narzędzia ROI (region zainteresowania), narysuj ROI. Zmierz każdego robaka indywidualnie. Z menu Analizuj wybierz opcję Zmierz lub naciśnij M. Narysuj ROI w tle, w którym nie ma robaków, a następnie zmierz tło w ten sam sposób. Skopiuj lub zapisz pomiary, które pojawią się w oknie Wyniki.
    7. Odejmij zintegrowaną gęstość tła od zintegrowanej gęstości każdego zmierzonego zwrotu z inwestycji. Intensywność tła dla ROI definiuje się jako iloczyn średniej wartości szarości tła i obszaru narysowanego zwrotu z inwestycji.
  4. Akwizycja obrazu za pomocą mikroskopu złożonego/szerokokątnego
    UWAGA: Do obrazowania reporterów transkrypcyjnych przy użyciu mikroskopu złożonego/szerokokątnego, w protokole tym wykorzystuje się mikroskop Revolve ECHO R4 wyposażony w soczewkę obiektywową Olympus 4x Plan Fluorite NA 0,13, standardowy filtr Olympus FITC (ex 470/40; em 525/50; DM 560) oraz iPad Pro do aparatu i do sterowania oprogramowaniem ECHO. Zalecane ustawienia czasów naświetlania można znaleźć w Tabeli 4.
    1. Użyj touchpada, aby uruchomić program sterujący. Utwórz nowy album i nazwę pliku.
    2. Umieść płytkę pod soczewką obiektywu. Ustaw czas ekspozycji i intensywność fluorescencji, korzystając z linii bazowej (EV/leczenie kontrolne) i kontroli dodatniej, tak aby sygnał był widoczny, ale nie nasycony.
    3. Zapisz obraz w jasnym polu i obraz GFP/FITC.

6. Pomiary ilościowe reporterów za pomocą cytometru przepływowego dużych cząstek

UWAGA: Hodowla i przygotowanie robaków do analizy cytometrem przepływowym dużych cząstek może przebiegać według tych samych paradygmatów, co sekcje 1-5 dotyczące przygotowania robaków do obrazowania fluorescencyjnego, z wyjątkiem tego, że wymagana jest większa liczba zwierząt. Użyj >500 zwierząt na warunek, ponieważ niektóre zwierzęta giną podczas manipulacji, nie wszystkie zwierzęta przechodzą kryteria filtrowania podczas kwantyfikacji, a niektóre zwierzęta nie są prawidłowo odczytywane przez cytometr przepływowy. Umyć zwierzęta gotowe do sortowania płytek w 5-10 ml roztworu M9 do stożkowych probówek o pojemności 15 ml w celu późniejszego sortowania na cytometrze przepływowym.

  1. Konfiguracja sortowania za pomocą cytometru przepływu dużych cząstek
    1. Przed włączeniem cytometru przepływowego
      1. Upewnij się, że butelka z płynem w osłonie nie jest pusta. Przygotuj płyn do osłon z zapasu 250x co najmniej kilka godzin przed użyciem sortera, ponieważ w płynie osłonowym znajduje się niewielka ilość detergentu, który może powodować powstawanie pęcherzyków, które mogą powodować artefakty podczas pozyskiwania.
      2. Upewnij się, że wszystkie pojemniki na odpady nie są pełne.
    2. Włączanie cytometru przepływowego
      1. Włącz sprężarkę powietrza. Przełącz go na Auto. Sprawdź manometr - powinien wynosić około 30 psi.
      2. Włącz instrument. Użyj wyłącznika zasilania, który znajduje się obok przewodu zasilającego po lewej stronie instrumentu.
      3. Włącz lasery. Źródło światła o długości fali 488 nm jest zwykle wystarczające do większości eksperymentów, chociaż źródło światła o długości fali 561 nm musi być użyte, jeśli wymagane jest wyższe wzbudzenie dla czerwonej fluorescencji.
      4. Otwórz oprogramowanie FlowPilot; przyrząd powinien wydać serię kliknięć, przełączając różne zawory.
      5. Włącz lasery w oknie oprogramowania, klikając przycisk Start. Zainicjuj laser w wyskakującym oknie sterowania laserem argonowym, klikając przycisk Uruchom. Powinno to spowodować włączenie lasera i osiągnięcie około 12 mW. Poziom źródła światła 488 wzrośnie do około 12.
      6. Kliknij przycisk Gotowe, aby zamknąć okno.
    3. Sprawdzanie oprogramowania przed przejściem dalej
      1. Sprawdź manometry -Spójrz na 4 wartości ciśnienia wyświetlane w dolnej części okna. Wartości powinny być zbliżone do oryginalnej konfiguracji (Pochwa 5.5-5.7; Próbka 5.7-6.0; Sortownik 3.1-3.3; Czysty 8,5-8,7). Jeśli wygląda podobnie, zaznacz pole obok opcji Ciśnienie OK.
      2. Sprawdź płynność -Aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza i zanieczyszczeń blokujących przepływ osłony/próbki przez celę przepływową, kliknij kilka razy przycisk Wyczyść.
      3. Sprawdź natężenie przepływu osłony -W tym celu zbierz osłonę przez 60 s. Wyłącz sortowanie, a następnie włącz osłonę w ręcznych elementach sterujących, aby rozpocząć przepływ osłony. Zbierać w probówce o pojemności 15 ml przez 60 s; natężenie przepływu powinno wynosić ~9-10 ml/min.
    4. Czyszczenie przed użyciem cytometru przepływowego
      1. Wlej ~ 3-5 ml 10% roztworu wybielacza do "kubka" kolekcji i kliknij Pobierz. Pozwól działać przez ~ 30 s, kliknij Przerwij i usuń nadmiar za pomocą podciśnienia.
      2. Opłucz "kubek" z kolekcji wodą dejonizowaną i usuń za pomocą próżni. Powtórz 2 razy.
      3. Wlej ~3-5 ml roztworu czyszczącego COPAS do "kubka" kolekcji i kliknij Pobierz. Pozwól działać przez ~30 s, kliknij Przerwij i usuń nadmiar roztworu czyszczącego za pomocą odkurzacza.
      4. Opłucz "kubek" z kolekcji wodą dejonizowaną i usuń za pomocą próżni. Powtórz 2 razy.
      5. Umieść ~3-5 ml roztworu M9 w "kubku" do kolekcji i kliknij Pobierz. Pozwól działać przez ~ 30 sekund, kliknij Stop i usuń nadmiar roztworu M9 za pomocą podciśnienia.
  2. Uruchamianie próbek na sorterze
    1. Dostosuj moc i rozmiar bramkowania laserowego PMT w oparciu o warunek, który powoduje najjaśniejszą aktywację interesującego nas reportera transkrypcyjnego. Zalecane ustawienia można znaleźć w Tabeli 4.
    2. Dodaj przygotowane robaki do "kubka". Kliknij przycisk Pobierz. Uważaj, aby upewnić się, że cały płyn nie został wchłonięty do urządzenia; Spowoduje to, że cytometr przepływowy pobierze powietrze i utworzy pęcherzyki w detektorze.
    3. Kliknij opcję Przerwij, gdy liczba próbek jest niska i/lub zebrano wystarczającą liczbę zwierząt.
    4. Kliknij opcję Ustawienia | Przechowywanie danych | Tylko bramkowane. Spowoduje to zapisanie danych tylko na podstawie ograniczeń rozmiaru. Kliknij opcję Przechowuj bramkowane i zapisz dane z bramką. Kliknij przycisk Wymaż, aby usunąć dane.
    5. Opłucz "kubek" z kolekcji wodą dejonizowaną i usuń za pomocą próżni. Powtórz 2 razy.
    6. Powtórzyć kroki 6.2.1-6.2.5 z pozostałymi próbkami.
  3. Kalibracja/ Kontrola jakości - w razie potrzeby
    UWAGA: Wymaga to zapewnienia kontroli nad 42 μM cząstkami fluorescencyjnymi GYR, aby skalibrować laser 488.
    1. Naciśnij metalową wargę na górze kubka na próbkę, aby wyjąć rurkę powietrzną. Odkręcić nakrętkę i za pomocą strzykawki usunąć płyn z kubka na próbkę.
    2. Przed użyciem dobrze wymieszać butelkę z cząstkami kontrolnymi i dodać kilka mililitrów do kubka na próbkę. Zamknij nasadkę i ponownie wlej powietrze, naciskając ją, aż zatrzaśnie się na swoim miejscu.
    3. W oprogramowaniu przejdź do opcji Narzędzia i kliknij Uruchom cząstki kontrolne.
    4. W przypadku cząstek kontrolnych zresetuj wartości PMT na: ZIELONY - 325; ŻÓŁTY - 365; CZERWONY - 575.
    5. Kliknij przycisk Pobierz. Osłona powinna się włączyć, a następnie próbka. Gdy kulki zaczną przechodzić przez komórkę przepływową, natężenie przepływu będzie widoczne u dołu ekranu. Optymalnie natężenie przepływu powinno wynosić od 5/s do 15/s. Jeśli natężenie przepływu jest zbyt niskie lub zerowe, obróć sample zawór fizycznie zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby zwiększyć natężenie przepływu. Jeśli natężenie przepływu jest zbyt wysokie, obróć sample zawór fizycznie w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby zmniejszyć natężenie przepływu.
      UWAGA: Zwykle w trybie oszczędzania koralików przed wyłączeniem odczytywanych jest 500 koralików. Dane można usunąć, a koraliki ponownie odczytać.
    6. Po zakończeniu odczytu sprawdź, czy pojedyncze piki są czyste dla 5 parametrów, a także wartości CV. Współczynnik wariancji (CV) powinien wynosić <15%. Upewnij się również, że wartości CV dla trzech różnych kanałów fluorescencyjnych są blisko siebie.
    7. Zapisz kontrolę jakości: na karcie Plik kliknij Zapisz jako obraz ekranu.
  4. Czyszczenie i wyłączanie
    1. Użyć próżni, aby wyjąć próbkę z kubka na próbkę i powtórzyć czynności opisane w ppkt 4.1.4.
    2. Wlej ~ 3-5 ml wody dejonizowanej do "kubka" do zbierania i kliknij Pobierz, pozwól działać przez ~ 30 s, a następnie kliknij Przerwij. Pozostawić trochę wody destylowanej w kubku na próbkę.
    3. Opróżnij kubek do odzyskiwania próbki i butelkę na odpady.
    4. Wyłącz oprogramowanie. Na karcie Plik kliknij przycisk Zakończ. W menu podręcznym kliknij opcję Wyłącz bez usuwania.
    5. Wyłącz laser, wyłącz instrument, a następnie wyłącz sprężarkę powietrza. Zamknij właz, aby zakryć instrument.

7. Testy fizjologiczne do pomiaru wrażliwości na stres u C. elegans

  1. Pomiar wrażliwości ER na stres przy użyciu ekspozycji na tunikamycynę
    1. Przygotować płytki NGM RNAi DMSO nakrapiane bakteriami RNAi ukierunkowanymi na gen będący przedmiotem zainteresowania, jak w sekcji 3. Bakterie HT115 należy stosować nawet w eksperymentach nieobejmujących knockdownu RNAi (patrz punkt 1). Pamiętaj również o wysiewaniu płytek NGM RNAi TM (patrz Tabela 1). Zasiej wystarczającą ilość płytek: zaplanuj ~5-7 zestawów płytek NGM RNAi DMSO i ~2-3 zestawy płytek NGM RNAi TM.
    2. Zsynchronizuj wybrane zwierzęta przy użyciu metod opisanych w sekcji 2.
    3. Umieścić jaja na wybranych płytkach z nasionami NGM RNAi DMSO, stosując kryteria zalecane w Tabeli 2. Należy pamiętać, aby przygotować 2 razy więcej płytek niż jest to konieczne, ponieważ połowa próbki zostanie przeniesiona na płytki NGM RNAi TM.
    4. Wysiadywać jaja w temperaturze 20 °C przez około 3-4 dni (~65-96 godzin) do 1. dnia dorosłości.
    5. W pierwszym dniu przygotuj długość życia, przenosząc zwierzęta na osobne talerze. Aby zachować talerze (ponieważ koszty TM są wysokie), użyj 8 talerzy po 15 zwierząt na warunek, co daje w sumie 120 zwierząt na warunek. Pozwala to na kontrolowanie liczby zwierząt na tablicy do oceny punktowej i pozwala na wystarczającą liczbę zwierząt do analiz statystycznych, nawet przy pewnej cenzurze.
    6. Przez pierwsze 5-7 dni dorosłe zwierzęta należy codziennie odsuwać od potomstwa na nową płytę, aż potomstwo przestanie być widoczne. Na tym etapie cenzuruj zwierzęta, które są zapakowane w worki, wykazują wystające sromy/eksplozje lub pełzają po bokach płyt, ponieważ nie są to zgony związane z wrażliwością na stres ER. Należy pamiętać, że leczenie TM powoduje zatrzymanie u zwierząt, a zatem wystarczy tylko 1-2 ruchy tych zwierząt co 2-3 dni, aby zminimalizować koszty związane z produkcją płytek zawierających TM. Zwierzęta typu dzikiego mają średnią przeżywalność ~15-17 dni na DMSO i 12-14 dni na tunicamcyinie.
    7. Po tym, jak zwierzęta przestaną produkować potomstwo, co 1-2 dni oceniaj długość życia, aż wszystkie zwierzęta zostaną ocenione jako martwe lub ocenzurowane. TM-Treat animals codziennie w 6-14 dniu dorosłości w celu uzyskania wyższej rozdzielczości.
  2. Pomiar wrażliwości mitochondriów i stresu oksydacyjnego z wykorzystaniem ekspozycji na parakwat
    1. Przygotować płytki nakrapiane bakteriami RNAi ukierunkowanymi na gen będący przedmiotem zainteresowania, jak w sekcji 3. Używaj bakterii HT115 nawet w eksperymentach nieobejmujących knockdownu RNAi (patrz Wprowadzenie).
    2. Zsynchronizuj wybrane zwierzęta przy użyciu metod opisanych w sekcji 2.
    3. Umieścić jaja na płytkach na wybranych płytkach z nasionami RNAi NGM, stosując kryteria zalecane w Tabeli 1. Test wymaga ~60-100 zwierząt na warunek, więc odpowiednio się przygotuj.
    4. Wysiadywać jaja w temperaturze 20 °C przez około 3-4 dni (~65-96 godzin) do 1. dnia dorosłości.
    5. Przygotować świeżą fiolkę ze 100 mM parakwatu w roztworze M9.
    6. Odpipetować 50-75 μl M9+parakwat do tylu dołków płaskiej 96-dołkowej płytki, ile chcesz. Ogólnie zaleca się posiadanie ~8-10 dołków na warunek zawierających ~8-10 zwierząt na studzienkę. Pozwala to na łatwo widoczną liczbę zwierząt w studzience z ~80 zwierzętami na szczep.
    7. Wybierz 8-10 zwierząt na warunek i przenieś je do każdej studzienki zawierającej M9 + parakwat. Użyj kilofa, aby przenieść zwierzęta do studzienek, zamiast pipetować, aby uniknąć różnic w objętości i niezamierzonych zmian stężeń parakwatu.
    8. Co 2 godziny zdobywaj punkty za śmierć zwierząt w każdej studni. Delikatnie postukaj w talerze, co spowoduje, że żywe zwierzęta będą się rzucać lub zginać. Należy pamiętać, że możliwe jest, że żywe zwierzęta są czasami sparaliżowane na tyle długo, że można je uznać za martwe. W związku z tym, jeśli liczba żywych zwierząt przekracza liczbę żywych zwierząt z poprzedniego punktu czasowego, prawdopodobne jest, że zwierzę było żywe i nie powinno być oceniane (np. jeśli w godzinie 4 2/10 zwierząt jest ocenianych jako martwe, a w godzinie 6 tylko 1/10 zwierząt jest martwych, godzina 4 powinna zostać ponownie oceniona jako 1/10 martwych zwierząt).
  3. Pomiar wrażliwości na ciepło przy użyciu ekspozycji na podwyższone temperatury
    1. Przygotować płytki nakrapiane bakteriami RNAi ukierunkowanymi na gen będący przedmiotem zainteresowania, jak w sekcji 3. Bakterie HT115 należy stosować nawet w eksperymentach nieobejmujących knockdownu RNAi (patrz punkt 1).
    2. Zsynchronizuj wybrane zwierzęta przy użyciu metod opisanych w sekcji 2.
    3. Jaja należy umieszczać na wybranych talerzach z nasionami, stosując kryteria zalecane w tabeli 1. Miej 60-100 zwierząt na warunek do testów termotolerancji. W przypadku testów termotolerancji należy użyć testów zatrzymania L1 lub zniesienia jaj, aby uzyskać najlepszą synchronizację, ponieważ istnieje duża zmienność w zależności od wieku zwierząt w teście.
    4. Inkubować zwierzęta w temperaturze 20 °C przez około 3-4 dni (~65-96 godzin), aby przeprowadzić eksperymenty w 1. dniu dorosłości. Nie hoduj robaków w temperaturze 15 °C w eksperymentach z szokiem cieplnym, ponieważ istnieje niewielka różnica między zwierzętami doświadczającymi szoku cieplnego w temperaturze 15 °C a 20 °C.
    5. W dniu 1 przygotuj zwierzęta, przenosząc je na osobne talerze. Ogólnie zaleca się, aby na talerzu znajdowało się ~10-15 zwierząt z 4-6 talerzami, co daje w sumie 60 zwierząt. Pozwala to na kontrolowanie liczby zwierząt na płytce do nacinania i pozwala na minimalny czas na wyciągnięcie zwierząt z podwyższonej temperatury.
    6. Umieszczać zwierzęta w inkubatorze o temperaturze 37 °C i oceniać co 2 godziny. Rozpocząć ocenę tolerancji termicznej w temperaturze 37 °C o godzinie 5, ponieważ przed upływem 5 godzin śmierć jest niewielka lub nie ma jej wcale. Mediana termotolerancji osiąga się po ~ 9 godzinach, więc godziny 7, 9 i 11 są krytycznymi punktami czasowymi, chociaż ze względu na zmienność inkubatora i między laboratoriami może być konieczne miareczkowanie na laboratorium. Co więcej, pomocne będą wszelkie metody zmniejszania zmienności (np. nieukładanie płytek w stosy, umieszczanie płytek w tym samym obszarze w jednym inkubatorze, minimalizowanie czasu otwierania lub zamykania inkubatora, wyjmowanie jak najmniejszej liczby płytek na raz, aby zminimalizować czas spędzany przez zwierzęta poza temperaturą 37 °C itp. Aby uzyskać pełny przewodnik, zobacz21).
    7. Alternatywnie do kroku 7.3.6 należy umieścić zwierzęta w temperaturze 34 °C zamiast 37 °C. Mediana tolerancji temperatury w temperaturze 34 °C wynosi nieco ponad 14 godzin, więc punkty czasowe 12, 14 i 16 są krytyczne dla testów termotolerancji 34 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykorzystanie reporterów transkrypcyjnych do pomiaru aktywacji odpowiedzi stresowych
W niniejszym protokole zastosowano fluorescencyjne reportery transkrypcyjne, które stanowią niezawodne narzędzia do pomiaru aktywacji większości odpowiedzi stresowych u C. elegans. Ekspresja GFP jest sterowana przez promotory kanonicznych genów docelowych głównych regulatorów transkrypcyjnych zaangażowanych w odpowiedź na stresy specyficzne dla konkretnych przedziałów komór...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisano metody badania reakcji na stres komórkowy u C. elegans, przy użyciu fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i testów przeżycia stresu fizjologicznego. Wszystkie reportery wykorzystują ekspresję GFP napędzaną pod wpływem promotora dalszego celu transkrypcyjnego czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w narastanie odpowiedzi na stres komórkowy. Wyjaśniono zastosowanie hsp-4p::GFP modulowanego przez UPRER, za pośrednictwem XBP-1s, hsp-6p::GFP kontrolowanego...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

R.BZ. jest wspierany przez długoterminowe stypendium EMBO i Fundację Larry'ego L. Hillbloma. R.H.S jest wspierany przez grant 5F32AG032023-02 za pośrednictwem National Institute of Aging (NIA) i stypendium podoktorskiego Glenn Foundation for Medical Research. A.F. jest wspierany przez F32AG051355 grantowe za pośrednictwem NIA. H.K.G. jest wspierany przez granty DGE1752814 w ramach programu stypendialnego National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. M.G.M. jest obsługiwany przez 1F31AG060660-01 przez NIA. A.D. jest wspierany przez Fundację Thomasa i Stacey Siebel, Instytut Medyczny Howarda Hughesa oraz 4R01AG042679-04 i 5R01AG055891-02 z NIA oraz 5R01ES021667-09 z NIEHS. Dziękujemy Larry'emu Joe, Melissie Sanchez, Naame Kelet i Anel Esquivel za znaczącą pomoc techniczną. Dziękujemy laboratorium Morimoto i CGC (finansowane przez NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) za szczepy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Antymycyna ASigma-AldrichA8674na stres mitochondrialny
Bacto PeptoneFisher ScientificDF0118072do płytek NGM
Agar granulowany BD DifcoVWR90000-782do płytek NGM
Chlorek wapnia dwuwodnyVWR97061-904do płytek NGM
KarbenicylinaBioPioneerC0051-25dla RNAi
CholesterolSigma-Aldrich57-88-5do płytek
NGM COPAS BiosorterUnion Biometrica350-5000-000wyposażony w źródło światła o długości fali 488 nm.
COPAS Cleaning SolutionUnion Biometrica300-5072-000do stosowania z COPAS
COPAS Scover SolutionUnion Biometrica300-5070-100do stosowania z COPAS
DMSOSigma-Aldrich472301rozpuszczalnik do leków
IPTG wolny od dioksanuDenville ScientificCI8280-4do RNAi
LB Bulion MillerFisher ScientificBP1426500dla stereoskopu LB
M205FALeica10450040wyposażona w monochromatyczną kamerę CCD Leica DFC3000G, standardowy filtr Leica GFP (ex 395-455, EM 480 LP) oraz oprogramowanie LAS X
Siarczan magnezu siedmiowodnyVWREM-MX0070-3do płyt NGM, M9
ParaquatSigma-Aldrich36541do stresu oksydacyjnego/mitochondrialnego
Chlorek potasuFisherP217-500do roztworu wybielacza
Fosforan potasu dwuzasadowyVWREM-PX1570-2do płytek NGM
Fosforan potasu jednozasadowyVWREM-PX1565-5do M9
RevolveECHO75990-514wyposażony w soczewkę obiektywową Olympus 4x Plan Fluorite NA 0,13, standardowy filtr Olympus FITC (ex 470/40; em 525/50; DM 560) oraz iPad Pro do aparatu fotograficznego i do sterowania oprogramowaniem ECHO
Sodium AzideSigma-Aldrich71289-50Gdo obrazowania
Sodium ChlorideEMD MilliporeSX0420-5do płytek NGM, M9
Sodium Phosphate dibasicVWR71003-472do M9
Wodoronadtlenek tert-butyluSigma-Aldrich458139na stres
oksydacyjnyChlorowodorek tetracyklinySigma-AldrichT7660-5Gdla RNAi
TunicamycinSigma-AldrichT7765-50MGdla stresu ER

Bibliografia

  1. Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A Futile Battle? Protein Quality Control and the Stress of Aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
  2. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  3. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10B), 2162-2168 (2004).
  4. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  5. Reinke, S. N., Hu, X., Sykes, B. D., Lemire, B. D. Caenorhabditis elegans diet significantly affects metabolic profile, mitochondrial DNA levels, lifespan and brood size. Molecular Genetics and Metabolism. 100 (3), 274-282 (2010).
  6. Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 15 (3), e1008011(2019).
  7. Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
  8. Yoneda, T., Benedetti, C., Urano, F., Clark, S. G., Harding, H. P., Ron, D. Compartment-specific perturbation of protein handling activates genes encoding mitochondrial chaperones. Journal of Cell Science. 117 (Pt 18), 4055-4066 (2004).
  9. Link, C. D., Cypser, J. R., Johnson, C. J., Johnson, T. E. Direct observation of stress response in Caenorhabditis elegans using a reporter transgene. Cell Stress & Chaperones. 4 (4), 235-242 (1999).
  10. Heifetz, A., Keenan, R. W., Elbein, A. D. Mechanism of action of tunicamycin on the UDP-GlcNAc:dolichyl-phosphate Glc-NAc-1-phosphate transferase. Biochemistry. 18 (11), 2186-2192 (1979).
  11. Struwe, W. B., Hughes, B. L., Osborn, D. W., Boudreau, E. D., Shaw, K. M. D., Warren, C. E. Modeling a congenital disorder of glycosylation type I in C. elegans: a genome-wide RNAi screen for N-glycosylation-dependent loci. Glycobiology. 19 (12), 1554-1562 (2009).
  12. Taylor, R. C., Dillin, A. XBP-1 is a cell-nonautonomous regulator of stress resistance and longevity. Cell. 153 (7), 1435-1447 (2013).
  13. Castello, P. R., Drechsel, D. A., Patel, M. Mitochondria are a major source of paraquat-induced reactive oxygen species production in the brain. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14186-14193 (2007).
  14. Oberley, L. W., Buettner, G. R. Role of Superoxide Dismutase in Cancer: A Review. Cancer Research. 39 (4), 1141-1149 (1979).
  15. Senchuk, M. M., Dues, D. J., Van Raamsdonk, J. M. Measuring Oxidative Stress in Caenorhabditis elegans: Paraquat and Juglone Sensitivity Assays. Bio-protocol. 7 (1), (2017).
  16. Lithgow, G. J., White, T. M., Hinerfeld, D. A., Johnson, T. E. Thermotolerance of a long-lived mutant of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (6), B270-B276 (1994).
  17. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The Biology of Proteostasis in Aging and Disease. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 435-464 (2015).
  18. Park, H. E. H., Jung, Y., Lee, S. J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
  19. Waggoner, L. E., Hardaker, L. A., Golik, S., Schafer, W. R. Effect of a Neuropeptide Gene on Behavioral States in Caenorhabditis elegans Egg-Laying. Genetics. 154 (3), 1181-1192 (2000).
  20. Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144 (1), 79-91 (2011).
  21. Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological Considerations for Heat Shock of the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods (San Diego, Calif). 68 (3), 450-457 (2014).
  22. Shen, X., Ellis, R. E., Sakaki, K., Kaufman, R. J. Genetic interactions due to constitutive and inducible gene regulation mediated by the unfolded protein response in C. elegans. PLoS genetics. 1 (3), e37(2005).
  23. Frakes, A. E., Dillin, A. The UPR(ER): Sensor and Coordinator of Organismal Homeostasis. Molecular Cell. 66 (6), 761-771 (2017).
  24. Martinus, R. D., et al. Selective induction of mitochondrial chaperones in response to loss of the mitochondrial genome. European Journal of Biochemistry. 240 (1), 98-103 (1996).
  25. Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science (New York, N.Y). 337 (6094), 587-590 (2012).
  26. Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial protein quality control during biogenesis and aging. Trends in Biochemical Sciences. 36 (5), 254-261 (2011).
  27. Shore, D. E., Carr, C. E., Ruvkun, G. Induction of Cytoprotective Pathways Is Central to the Extension of Lifespan Conferred by Multiple Longevity Pathways. PLOS Genetics. 8 (7), e1002792(2012).
  28. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
  29. Chiang, S. M., Schellhorn, H. E. Regulators of oxidative stress response genes in Escherichia coli and their functional conservation in bacteria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 525 (2), 161-169 (2012).
  30. Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88 (Pt B), 290-301 (2015).
  31. Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 284 (20), 13291-13295 (2009).
  32. Lo, J. Y., Spatola, B. N., Curran, S. P. WDR23 regulates NRF2 independently of KEAP1. PLOS Genetics. 13 (4), e1006762(2017).
  33. Link, C., Johnson, C. Reporter Transgenes for Study of Oxidant Stress in Caenorhabditis elegans. Methods in enzymology. 353, 497-505 (2002).
  34. Choe, K. P., Przybysz, A. J., Strange, K. The WD40 Repeat Protein WDR-23 Functions with the CUL4/DDB1 Ubiquitin Ligase To Regulate Nuclear Abundance and Activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2704-2715 (2009).
  35. Velazquez, J. M., Lindquist, S. hsp70: nuclear concentration during environmental stress and cytoplasmic storage during recovery. Cell. 36 (3), 655-662 (1984).
  36. Tissières, A., Mitchell, H. K., Tracy, U. M. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs. Journal of Molecular Biology. 84 (3), 389-398 (1974).
  37. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).
  38. Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network. PLoS genetics. 9 (4), e1003466(2013).
  39. Hentze, N., Le Breton, L., Wiesner, J., Kempf, G., Mayer, M. P. Molecular mechanism of thermosensory function of human heat shock transcription factor Hsf1. eLife. 5, (2016).
  40. Li, J., Labbadia, J., Morimoto, R. I. Rethinking HSF1 in Stress, Development, and Organismal Health. Trends in Cell Biology. , (2017).
  41. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
  42. Senchuk, M. M., et al. Activation of DAF-16/FOXO by reactive oxygen species contributes to longevity in long-lived mitochondrial mutants in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 14 (3), (2018).
  43. Henderson, S. T., Bonafè, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).
  44. Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the Cellular Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans by Thermosensory Neurons. Science. 320 (5877), 811-814 (2008).
  45. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
  46. Shivers, R. P., Kooistra, T., Chu, S. W., Pagano, D. J., Kim, D. H. Tissue-specific activities of an immune signaling module regulate physiological responses to pathogenic and nutritional bacteria in C. elegans. Cell Host & Microbe. 6 (4), 321-330 (2009).
  47. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), (2018).
  48. Glover-Cutter, K. M., Lin, S., Blackwell, T. K. Integration of the Unfolded Protein and Oxidative Stress Responses through SKN-1/Nrf. PLOS Genetics. 9 (9), e1003701(2013).
  49. Liu, Y., Chang, A. Heat shock response relieves ER stress. The EMBO journal. 27 (7), 1049-1059 (2008).
  50. Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The Caenorhabditis elegans Lifespan Machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
  51. Leung, D. T. H., Chu, S. Measurement of Oxidative Stress: Mitochondrial Function Using the Seahorse System. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1710, 285-293 (2018).
  52. Morton, E. A., Lamitina, T. Caenorhabditis elegans HSF-1 is an essential nuclear protein that forms stress granule-like structures following heat shock. Aging Cell. 12 (1), 112-120 (2013).
  53. Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13 (4), 467-480 (2007).
  54. Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
  55. An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
  56. Daniele, J. R., Esping, D. J., Garcia, G., Parsons, L. S., Arriaga, E. A., Dillin, A. High-Throughput Characterization of Region-Specific Mitochondrial Function and Morphology. Scientific Reports. 7 (1), 6749(2017).
  57. Daniele, J. R., et al. A non-canonical arm of UPRER mediates longevity through ER remodeling and lipophagy. bioRxiv. , 471177(2018).
  58. Xu, N., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 895-911 (2012).
  59. Baird, N. A., et al. HSF-1-mediated cytoskeletal integrity determines thermotolerance and life span. Science (New York, N.Y.). 346 (6207), 360-363 (2014).
  60. Higuchi-Sanabria, R., et al. Spatial regulation of the actin cytoskeleton by HSF-1 during aging. Molecular Biology of the Cell. 29 (21), 2522-2527 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Odpowiedź stresowa C. elegansodpowiedź na szok termicznyodpowiedź na nieprawidłowo sfałdowane białkaodpowiedź na stres oksydacyjnyfluorescencyjne reportery transkrypcyjneanaliza za pomocą cytometrii przepływowejtest wrażliwości na paraquattest przeżywalności w warunkach termotolerancjiknockdown XBP-1knockdown DAF-2
Pomiary fizjologicznych reakcji na stres u C. elegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.