Izolowanie miofibryli z biopsji mięśni szkieletowych i określanie funkcji skurczu za pomocą przetwornika siły o rozdzielczości nano-Newtona

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół do oceny właściwości kurczliwych miofibryli mięśni prążkowanych z rozdzielczością nano-Newtona. Protokół wykorzystuje konfigurację z opartą na interferometrii sondą siły optycznej. Taka konfiguracja generuje dane o wysokim stosunku sygnału do szumu i umożliwia ocenę kinetyki kurczliwości miofibryli.

Streszczenie

Komórki mięśniowe prążkowane są niezbędne do aktywności ludzi i zwierząt. Pojedyncze włókna mięśniowe składają się z miofibryli, które składają się z szeregowo połączonych sarkomerów, najmniejszych jednostek kurczliwych w mięśniach. Dysfunkcja sarkomeryczna przyczynia się do osłabienia mięśni u pacjentów z mutacjami w genach kodujących białka sarkomeryczne. Badanie mechaniki miofibryli pozwala na ocenę interakcji aktyna-miozyna bez potencjalnych zakłócających skutków uszkodzonych, sąsiednich miofibryli podczas pomiaru kurczliwości pojedynczych włókien mięśniowych. Uszkodzenia ultrastrukturalne i niewspółosiowość miofibryli mogą przyczyniać się do upośledzenia kurczliwości. Jeśli w miofibrylach występuje uszkodzenie strukturalne, prawdopodobnie pękną one podczas procedury izolacji lub podczas eksperymentu. Ponadto badania na miofibrylach zapewniają ocenę interakcji aktyna-miozyna w obecności ograniczeń geometrycznych sarkomerów. Na przykład pomiary miofibryli mogą wyjaśnić, czy dysfunkcja miofibrylarna jest głównym skutkiem mutacji w białku sarkomerycznym. Ponadto perfuzja z roztworami lub związkami wapnia jest prawie natychmiastowa ze względu na małą średnicę miofibrylu. To sprawia, że miofibryle doskonale nadają się do pomiaru szybkości aktywacji i relaksacji podczas wytwarzania siły. Protokół opisany w tej pracy wykorzystuje sondę siły optycznej opartą na zasadzie interferometru Fabry'ego-Pérota zdolnego do pomiaru sił w zakresie nano-Newtonów, sprzężonego z silnikiem piezoelektrycznym i systemem perfuzji o szybkim kroku. Taka konfiguracja umożliwia badanie mechaniki miofibryli za pomocą pomiarów siły o wysokiej rozdzielczości.

Wprowadzenie

Komórki mięśniowe prążkowane są niezbędne do codziennych czynności życiowych. Ruch kończyn, funkcja oddechowa i ruch pompowania serca zależą od siły generowanej przez komórki mięśniowe. Mięśnie szkieletowe składają się z pęczków mięśniowych zawierających wiązki pojedynczych włókien mięśniowych (Rysunek 1A). Te włókna mięśniowe składają się z miofibryli, które są tworzone przez szeregowo połączone sarkomery (Rysunek 1B, D). Sarkomery zawierają cienkie i grube włókna. Składają się one głównie z łańcuchów cząsteczek aktyny i miozyny odpowiednio (Rysunek 1B). Oddzi....

Protokół

Protokół pobierania biopsji u ludzi został zatwierdzony przez instytucjonalną komisję rewizyjną w Uniwersyteckim Centrum Medycznym VU (#2014/396) i uzyskano pisemną świadomą zgodę od badanych. Protokół pobierania biopsji mięśni zwierzęcych został zatwierdzony przez lokalną komisję etyki zwierząt na Uniwersytecie VU (AVD114002016501)

1. Przygotowanie i izolacja miofibryli

UWAGA: Użyj wcześniej opisanych metod do biopsji gliceryny, przygotuj roztwory o różnym stężeniu wapnia (pCa)7^,16,17, i wyizoluj miofibryle

Wyniki

Zapisano ślady danych i otwarto je za pomocą oprogramowania sterownika systemu (patrz Tabela materiałów). Pełne ślady lub wybrane segmenty eksportowano do schowka lub pliku tekstowego w celu dalszej analizy za pomocą wybranego oprogramowania. Zawory sterujące przepływem poszczególnych roztworów przełączano za pomocą specjalistycznego oprogramowania lub ręcznie. Do analizy szybkości aktywacji, regeneracji napięcia i relaksacji wykorzystano specjalny skrypt MATLAB. Maksymalna siła aktywna oraz siła szczyto.......

Dyskusja

Opisano protokół oceny funkcji skurczowej miofibryli wyizolowanych z ludzkich lub zwierzęcych tkanek mięśni szkieletowych. Rozdzielczość siły tego układu została opisana wcześniej przez Chavana i ^wsp.12. Krótko mówiąc, określa się go na podstawie losowych fluktuacji długości wnęki Fabry'ego-Pérota utworzonej między włóknem detekcyjnym a wspornikiem, które wytwarzają dominującą część hałasu na wyjściu odczytu (wyrażoną w V), która pomnożona przez czułość ugięcia (wyrażoną w m/V) i przez stałą spręż.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Produkty Bio Spec, Inc.	985370-XL	Do izolacji miofibryli
Niestandardowo kodowany		Matlab
Produkowany na zamówienie		Zawiera program Labview do kontroli połączenia szeregowego; Do sterowania zaworami
Wykonane		Do chłodzenia modułu
			Wykonane na
zamówienie Wykonane na		Aluminiowa komora
Wykonane na zamówienie Do		sterowania zaworami; Zawiera oprogramowanie komputerowe do sterowania przez USB
IonOptix		Oprogramowanie kontrolera systemu: oprogramowanie do nagrywania danych z zaawansowanym generatorem sygnału dla piezoelektrycznego i szybkiego kroku
IonOptix	MCS100	Do rejestrowania długości
IonOptix		Zawiera: Optiforce (interferometr), mikromanipulatory, interfejs sygnałowy, silnik piezoelektryczny i sterownik. Oparty na sondzie MyoStretcher
IonOptix		Force
Sigma-Aldrich	529265	Poli(2-hydroksyetylometakrylan); Powłoka do szkiełek mikroskopowych zapobiegająca przywieraniu tkanek
Sigma-Aldrich	78471	Kryształy rozpuszczają się w etanolu, co skutkuje powstawaniem kleju
TE Technology, Inc.	TE-63-1.0-1.3	Do chłodzenia komory
TE Technology, Inc.	TC-720	Zawiera oprogramowanie komputerowe do sterowania przez USB
Tecan Trading AG	20736652
Tecan Trading AG	20739263	Pompa strzykawkowa do indukowania przepływu tła wraz z szybkim systemem perfuzji; Odpływ z komory
Thermo scientific	2441081
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)	wycofana z produkcji	: SF-77CST/VCS-77CSP
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)	TG150-4	Aby perfuzja tkanki
		1 PC dla IonWizard i 1 PC dla innego oprogramowania

na zamówienie Peltiera zamówienie na chusteczkisarkomeru Koolance ADT-EX004S Koolance EX2-755 Do chłodzenia modułu Peltiera Microsoft Rejestracja danych Olympus IX71 Olympus TH4-200 przepływu tkanekprzepływu tkanekAlternatywa