Izolowanie miofibryli z biopsji mięśni szkieletowych i określanie funkcji skurczu za pomocą przetwornika siły o rozdzielczości nano-Newtona

Komórki mięśniowe prążkowane są niezbędne do codziennych czynności życiowych. Ruch kończyn, funkcja oddechowa i ruch pompowania serca zależą od siły generowanej przez komórki mięśniowe. Mięśnie szkieletowe składają się z pęczków mięśniowych zawierających wiązki pojedynczych włókien mięśniowych (Rysunek 1A). Te włókna mięśniowe składają się z miofibryli, które są tworzone przez szeregowo połączone sarkomery (Rysunek 1B, D). Sarkomery zawierają cienkie i grube włókna. Składają się one głównie z łańcuchów cząsteczek aktyny i miozyny odpowiednio (Rysunek 1B). Oddziaływania aktyna-miozyna są odpowiedzialne za zdolność mięśni do generowania siły. Pacjenci z mutacjami w genach kodujących białka sarkomeryczne, takie jak nebulina, aktyna i troponina T, cierpią na osłabienie mięśni z powodu dysfunkcji kurczliwości¹.

Jakość kurczliwości mięśni może być badana na różnych poziomach organizacji, począwszy od in vivo całych mięśni, a skończywszy na interakcjach aktyna-miozyna w testach ruchliwości in vitro. W ciągu ostatnich dziesięcioleci kilka grup badawczych opracowało konfiguracje do określania kurczliwości poszczególnych miofibryli^{2,3,4,5,6,7,8,9,10}. Konfiguracje te opierają się na wykrywaniu zmian w odchyleniu lasera od wspornika (tj. odchylenia wiązki optycznej) spowodowanych skurczem miofibrylu (aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz Labuda et al.¹¹). Chociaż określenie funkcji kurczliwości miofibryli ma pewne ograniczenia (np. brak dynamiki procesów sprzężenia wzbudzenie-skurcz, które zachodzą przed miofibrylami), podejście to ma wiele zalet. Należą do nich: 1) zdolność do oceny oddziaływań aktyna-miozyna w obecności ograniczeń geometrycznych sarkomerów; 2) zdolność do oceny interakcji aktyna-miozyna bez potencjalnych zakłócających skutków uszkodzonych, sąsiednich miofibryli (podczas pomiaru kurczliwości pojedynczych włókien mięśniowych ultrastrukturalne uszkodzenia i niewspółosiowość miofibryli mogą przyczyniać się do upośledzenia kurczliwości) (Rysunek 1D); 3) mała średnica miofibryli (~1 μm, Rysunek 2A) i brak błon pozwalają na niemal natychmiastową dyfuzję wapnia do sarkomerów. Ponadto, jeśli w miofibrylach występują uszkodzenia strukturalne, prawdopodobnie pękną one podczas ich izolacji lub podczas eksperymentu. W związku z tym ocena kurczliwości miofibryli jest elegancką metodą badania podstawowych mechanizmów skurczu mięśni i zrozumienia, czy zaburzone interakcje aktyna-miozyna są główną przyczyną chorób mięśni spowodowanych mutacjami w białkach sarkomerowych.

Ten protokół przedstawia nowo opracowany układ do określania kurczliwości miofibryli z sondą siły wspornikowej o rozdzielczości nano-Newton (tj. Optiforce). Ta sonda siły opiera się na zasadzie interferometrii. Interferometria umożliwia stosowanie stosunkowo sztywnych wsporników. Umożliwia to pomiar siły przy niewielkim ugięciu wspornika, zbliżając się do izometrycznych skurczów miofibrylu. Sonda pozwala na ocenę niskich sił biernych i aktywnych, które są wytwarzane przez pojedynczy miofibryl wyizolowany z różnych biopsji mięśni, w tym biopsji od ludzi, z wysokim stosunkiem sygnału do szumu. Optyczna sonda siły wspornikowej zastosowana w tej konfiguracji jest oparta na interferometrze Fabry'ego-Pérota¹². Interferometr wykrywa niewielkie przemieszczenia między światłowodem a pokrytym złotem wspornikiem zamontowanym na tulejce (Rysunek 3). Szczelina między światłowodem a wspornikiem nazywana jest wnęką Fabry'ego-Pérota. Miofibryle są montowane między sondą a silnikiem piezoelektrycznym za pomocą dwóch szklanych włókien montażowych pokrytych klejem. Siłę wytwarzaną przez miofibryl można matematycznie wyprowadzić z danych interferometru. Interferometria opiera się na superpozycji lub interferencji dwóch lub więcej fal (w tym układzie trzech fal świetlnych). Światło laserowe o długości fali od 1 528,77 do 1 563,85 nm jest emitowane z interferometru i przesyłane przez światłowód. W sondzie światło jest odbijane 1) na granicy między światłowodem a medium (Rysunek 3A); 2) na styku medium i wspornika (rysunek 3B); oraz 3) na styku metalu i złotej powłoki wspornika (Rysunek 3C). Odbicie na granicy faz A i B zależy od współczynnika załamania światła (n) ośrodka, w którym zanurzona jest sonda. Światło, składające się z trzech nałożonych na siebie odbić, wraca do fotodiody w interferometrze. Fotodioda mierzy natężenie światła, które jest wynikiem wzoru interferencyjnego trzech nałożonych na siebie odbić. Kiedy siła skurczu jest generowana przez aktywację lub rozciąganie miofibrylu, miofibryl ciągnie za wspornik. Ruch ten zmienia rozmiar wnęki (d), a co za tym idzie, liczbę długości fal, które mieszczą się we wnęce. Światło odbite na wsporniku będzie miało inną fazę, co spowoduje inny wzór interferencji. Fotodioda rejestruje tę zmianę intensywności charakterystyki interferencyjnej jako zmianę woltów. Następnie na podstawie tej zmiany oblicza się wytwarzanie siły miofibrylowej, biorąc pod uwagę sztywność wspornika. Sonda siły jest kalibrowana przez producenta poprzez dociśnięcie końcówki igły montażowej, przymocowanej do wolnego końca wspornika, do wagi przy jednoczesnym utrzymaniu wygięcia wspornika równego wielokrotności długości fali odczytu lasera¹³. Interferometria jest więc bardzo czułą metodą wykrywania niewielkich zmian odległości, pozwalającą na pomiar sił z rozdzielczością nanonewtonową. Rozdzielczość ta umożliwia ocenę produkcji siły miofibrylarnej przy wysokim stosunku sygnału do szumu. Podczas gdy tradycyjna interferometria ogranicza zakres pomiarów do liniowej części krzywej interferencji, użycie wzmacniacza blokującego i modulacji długości fali lasera pozwala przezwyciężyć to ograniczenie¹⁴. Jest to wyjaśnione bardziej szczegółowo w sekcji dyskusji.

Aby zmierzyć aktywne napięcie miofibryli, zastosowano szybki system perfuzyjny, który wystawiał miofibryl na działanie roztworów wapnia (Rysunek 4A). Szybki system perfuzji umożliwia zmianę roztworu w ciągu 10 ms. Ze względu na ich małą średnicę, dyfuzja wapnia do miofibryli jest niemal natychmiastowa. W związku z tym system ten jest szczególnie odpowiedni do pomiaru szybkości wiązania aktyny-miozyny podczas aktywacji i uwalniania podczas relaksacji. Szybkość aktywacji (k_ACT) i relaksacji (k_REL) można wyznaczyć na podstawie krzywych aktywacji-relaksacji. Ponadto, wystawiając miofibryle na działanie roztworów wapnia o rosnącym stężeniu, można określić zależność siła-wapń i wrażliwość na wapń.

Ponadto, silnik o długości piezoelektrycznej umożliwia szybkie rozciąganie i skracanie miofibrylu. Daje to możliwość zbadania właściwości lepkosprężystych (tj. napięcia biernego) miofibrylu, a także wykonania szybkiego skracania i ponownego rozciągania miofibrylu w celu określenia szybkości ponownego rozwoju napięcia (k_TR). Parametry uzyskane zarówno z eksperymentów z napięciem aktywnym, jak i pasywnym mogą być zmieniane przez mutacje genów w białku sarkomerycznym.

Ten niestandardowy zestaw został użyty do zmierzenia aktywnych i pasywnych cech kurczliwości miofibryli wyizolowanych ze zdrowych mięśni szkieletowych ludzi, pacjentów i myszy.

Protokół pobierania biopsji u ludzi został zatwierdzony przez instytucjonalną komisję rewizyjną w Uniwersyteckim Centrum Medycznym VU (#2014/396) i uzyskano pisemną świadomą zgodę od badanych. Protokół pobierania biopsji mięśni zwierzęcych został zatwierdzony przez lokalną komisję etyki zwierząt na Uniwersytecie VU (AVD114002016501)

1. Przygotowanie i izolacja miofibryli

UWAGA: Użyj wcześniej opisanych metod do biopsji gliceryny, przygotuj roztwory o różnym stężeniu wapnia (pCa)7^,16,17, i wyizoluj miofibryle^2,18.

1. Rozmrozić roztwory relaksujące (pCa 9,0, Rx) i aktywujące (pCa 4,5, Act) oraz inhibitory (1 M E64, 1 M DTT, 1 M leupeptin, 1 M PMSF), które są przechowywane w temperaturze -80 °C.
2. Pobrać glicerynowy fragment biopsji mięśnia prążkowanego o średnicy około 1 mm³ i umieścić go na małej szalce Petriego z roztworem 1:1 Rx/glicerolu (v/v) i umieścić szalkę Petriego na zimnej płytce w temperaturze 4 °C.
3. Wypreparuj fragment mięśnia za pomocą mikroskopu preparacyjnego i kleszczy, oddzielając pojedyncze włókna mięśniowe bez izolowania ich od kawałka mięśnia.
   UWAGA: Należy usunąć jak najwięcej tkanki tłuszczowej i łącznej, aby zapobiec zanieczyszczeniu zawiesiny miofibryli.
4. Przenieś fragment wypreparowanej tkanki do probówki o pojemności 5 ml z 1,5 ml roztworu relaksującego z inhibitorami (1 μL/ml E-64, 1 μL/ml leupeptyny, 1 μL/ml DTT i 125 μL/ml PMSF). Pozostawić tkankę do temperamentu w temperaturze około 4 °C przez 1 godzinę.
5. Podczas inkubacji uruchom oba komputery, włącz urządzenia i otwórz powiązane oprogramowanie (patrz Spis materiałów).
6. Zanurz sondę siły w ultraczystej wodzie na szalce Petriego i skalibruj sondę.
   1. Naciśnij przycisk "Uruchom kreatora" na interferometrze i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie. Po naciśnięciu przycisku Kalibruj dotknij stolika mikroskopu.
      UWAGA: Stuknięcie w stolik mikroskopu spowoduje ugięcie się wspornika i przejście przez prążki. Umożliwia to kalibrację sondy.
   2. Po kalibracji pozostaw sondę zanurzoną w ultraczystej wodzie na szalce Petriego.
7. Zainicjuj pozycję silnika piezoelektrycznego. Aby to zrobić, wykonaj jedną z czynności opisanych poniżej.
   1. Gdy silnik piezoelektryczny będzie używany do naprężenia k_TR, ustaw długość na 0 μm.
      Ustawienia generatora sygnału można znaleźć w Tabeli 1, Rysunek 5A.
   2. Gdy silnik piezoelektryczny będzie używany do naprężenia pasywnego, ustaw długość na 50 μm.
      Ustawienia generatora sygnału można znaleźć w tabeli 1.
      UWAGA: Różnica między krokami to początkowe położenie silnika o długości piezoelektrycznej. Aby rozciągnąć miofibryl, silnik piezoelektryczny musi pociągnąć, aby zwiększyć odległość między obiema igłami montażowymi i wydłużyć miofibryl. Aby rozluźnić miofibryl, silnik piezoelektryczny musi naciskać, aby zmniejszyć odległość między obiema igłami montażowymi i skrócić miofibrylę.
8. Przygotuj szkiełko mikroskopowe. Odmierzyć pipetą 150 μl roztworu polihydroksyetylometakrylanu (poli-HEMA) (5% poli-HEMA w 95% etanolu, w/v) na szkiełku mikroskopowym i rozprowadzić na szkiełku podstawowym tak, aby był całkowicie pokryty.
   UWAGA: Jeśli zawiesina miofibrylowa jest pipetowana na niepowlekanym szkiełku mikroskopowym, miofibryle, które opadają na dno, przykleją się do szkiełka mikroskopowego i nie będzie można ich skleić.
9. Napełnij strzykawki roztworami pCa (patrz Rysunek 4A) i zalać system perfuzyjny.
   UWAGA: Na tych etapach wszystkie rurki są wstępnie napełnione odpowiednim roztworem, aby upewnić się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte z rurki.
   1. Napełnij rurkę dopływową dopływu tła komory przepływowej (Rysunek 3, 4A) za pomocą Rx.
   2. Po użyciu przepłucz kolektor ultraczystą wodą, aby usunąć powietrze. W tym celu należy podłączyć strzykawkę z ultraczystą wodą do wylotu i przepłukać ją w odwrotnym kierunku. Zablokuj nieużywane porty kolektora.
   3. Umożliwić każdej strzykawce pCa napełnienie odpowiednich probówek roztworem pCa. Następnie podłącz je do kolektora i szkła Ɵ.
   4. Otwórz zawory 1 i 6 za pomocą oprogramowania panelu akwizycji danych (patrz tabela materiałów), zaznaczając przycisk "1 + 6" ( Rysunek 6A), aby napełnić szklankę Ɵ roztworami relaksującymi (pCa 9,0) i aktywującymi (4.5) i zamknij zawory, gdy szkło Ɵ jest napełnione (Rysunek 6B).

2. Montaż miofibrylu

1. Pokryj szkiełko mikroskopowe poli-HEMA, aby zapobiec przywieraniu miofibryli do szkła.
2. Przygotować homogenizator (patrz tabela materiałów) do homogenizacji tkanek. Wyczyść wewnętrzny pręt wirnika czystą bibułą, zmontuj homogenizator i wiruj 1x przez 15 s w alkoholu i trzy razy po 15 s w ultraczystej wodzie. Wstępnie przepłukać homogenizator w roztworze relaksującym 1 x przez 15 s na lodzie.
3. Umieścić pręt homogenizatora w probówce zawierającej tkankę mięśniową, jak opisano w kroku 1.4 i, trzymając rurkę na lodzie, obracać wirnikiem przez 15 sekund z prędkością 5, aby rozerwać tkankę mięśniową i uzyskać zawiesinę miofibryli.
4. Odpipetować ~50 μL zawiesiny miofibrylowej i ~250 μL roztworu relaksującego na szkiełku mikroskopowym pokrytym poli-HEMA w kąpieli tkankowej. W ten sposób utworzy się kropla cieczy. Przykryj wannę pokrywką, aby chronić ją przed kurzem i odczekaj 5–10 minut, aby miofibryle opadły na dno.
   UWAGA: Stosunek między zawiesiną a roztworem relaksującym zależy od jakości izolacji, dlatego należy go odpowiednio dostosować. Na przykład, jeśli wydajność miofibryli jest niska, a w zawiesinie znajduje się niewiele odpowiednich miofibryli, dodaj więcej zawiesiny miofibryli i rozcieńcz mniej relaksującym roztworem (np. 75 μl zawiesiny miofibryli i 225 μl roztworu relaksującego). Tkanka serca i mięśni szkieletowych jest łatwa do rozpoznania ze względu na wzór prążkowania. W przypadku obiektywu 10x lub 40x wzór ten jest również widoczny w pojedynczym miofibrylu. W przypadku, gdy w zawiesinie obecna jest inna tkanka, miofibryle można wybrać wizualnie. Można pominąć 5-10 minutowe oczekiwanie. Zwiększa to jednak trudność klejenia miofibrylu.
5. Pokryj igły montażowe klejem (szelak + etanol; 120 mg szelaku w 2 ml 70% etanolu). W tym celu należy podgrzać klej w temperaturze 65 °C przez 30–60 s i odpipetować ~6 μl na nowym, niepowlekanym szkiełku podstawowym. Zanurz końcówkę każdej igły montażowej w kleju i powtarzaj, aż będzie widoczna warstwa kleju. Przesuń sondę i piezo pionowo w górę za pomocą mikromanipulatorów, aby zrobić miejsce na umieszczenie kąpieli tkankowej na stoliku mikroskopu. Usuń szklane szkiełko zawierające klej.
6. Montaż miofibryli
   1. Umieścić kąpiel tkankową ze szkiełkiem mikroskopowym pokrytym poli-HEMA zawierającym zawiesinę miofibrylu na stoliku mikroskopu. Skorzystaj ze stolika, aby znaleźć odpowiednią miofibrylę z obiektywem 40x. W razie potrzeby przesunąć i obrócić kąpiel tkankową, aby przesunąć miofibryl do pozycji montażowej.
      UWAGA: Szukaj miofibryli z widocznym wzorem prążków o długości około 30 μm. Jak opisano szczegółowo w krokach 3.1 i 3.2.1, możliwe jest sprawdzenie długości i długości sarkomeru przed sklejeniem miofibrylu. Nie należy sklejać rozdartych miofibryli, ponieważ mogą one pęknąć podczas skurczu.
   2. Wsunąć komorę przepływową na miejsce bezpośrednio nad kroplą cieczy zawierającą miofibryle w kąpieli tkankowej (pipetowaną na szkiełko w kroku 2.4) i opuścić ją. Zatrzymaj się, zanim uderzy w kroplę cieczy.
   3. Opuść igłę do montażu piezoelektrycznego i dociśnij ją do dolnej końcówki miofibrylu. Lekko go unieś, aby sprawdzić, czy miofibryl jest przymocowany do igły.
   4. Opuść komorę przepływu na tyle daleko, aby igła montażowa sondy dotarła do dna, a sonda nie dotykała komory przepływowej.
   5. Naciśnij igłę montażową sondy na górnej końcówce miofibrylu. Lekko go unieś, aby sprawdzić, czy miofibryl jest przymocowany do igły.
   6. Podnieś miofibryl z dna wanny tak daleko, jak to możliwe, nie tracąc przy tym zdolności do skupienia się bez dotykania dna szklanki.

3. Eksperyment inicjalizacyjny

1. Użyj mikromanipulatorów, kamery i oprogramowania sterującego systemem (Rysunek 7A, patrz tabela materiałów), aby zmierzyć długość sarkomeru. Przesuń sondę piezoelektryczną i/lub siłową, aby ustawić początkową długość sarkomeru miofibrylu na 2,5 μm.
   UWAGA: Długość sarkomeru wynosząca 2,5 μm zapewnia optymalne zachodzenie na siebie główek miozyny i aktyny.
2. Korzystając z funkcji naczynia w oprogramowaniu sterownika systemu, zmierz długość i szerokość miofibrylu (Rysunek 7B,C).
   UWAGA: Podczas obracania kamery może ona przechylać się w poziomie i/lub w pionie. Aby sprawdzić wyrównanie kamery, można użyć poziomicy, aby sprawdzić, czy kamera jest obrócona, a nie przechylona.
   1. Umieść miofibryl w środku obrazu wideo za pomocą stolika mikroskopu.
   2. Narysuj kwadrat z jednej strony miofibrylu na drugą. Jeśli chodzi o długość, upewnij się, że w kwadracie znajduje się ciemna krawędź kropelek kleju (Rysunek 2A), ponieważ przetwarzanie obrazu opiera się na kontraście.
   3. Rozpocznij rejestrowanie danych w oprogramowaniu sterownika systemu (patrz tabela materiałów), naciskając "Start" i po 5 sekundach wstrzymaj rejestrację danych oprogramowania kontrolera systemu, naciskając przycisk "Pauza". Długość jest teraz rejestrowana w danych.
   4. Aby uzyskać szerokość, najpierw obróć kamerę o 90° (patrz tabela materiałów), a następnie użyj kontrastu krawędzi samej miofibryli
   .
   5. Rozpocznij rejestrowanie danych w oprogramowaniu sterownika systemu (patrz tabela materiałów), naciskając "Start" i po 5 sekundach wstrzymaj rejestrację danych oprogramowania kontrolera systemu, naciskając przycisk "Pauza". Szerokość jest teraz rejestrowana w danych.
3. Jeśli konieczne jest określenie czynnego napięcia miofibrylu, należy zastosować konfigurację perfuzji. Jeśli tak, przejdź do kroku 3.4. Jeśli zostanie określone tylko napięcie pasywne, pomiń kroki 3.4–4.1.3.7 i kontynuuj od kroku 4.2.
4. Ustaw i zainicjuj konfigurację perfuzji.
   UWAGA: Jest to konieczne tylko do generowania siły czynnej. Kontynuuj do kroku 4.2 podczas wykonywania eksperymentów z naprężeniem pasywnym.
   1. Ustaw pozycję silnika szybkiego kroku na 4 V (Rysunek 5B).
   2. Przesuń podstawkę perfuzyjną na stół, aby wyrównać lewy dolny róg stojaka z taśmą na stole.
      UWAGA: Uważaj, aby nie uderzyć w sondę siły ani silnik piezoelektryczny.
   3. Użyj manipulatora, aby z grubsza ustawić szkło Ɵ na oko.
   4. Spójrz przez okular i ostrożnie przesuń szkło Ɵ w kierunku miofibrylu za pomocą manipulatora.
   5. Wyrównaj górny kanał szkła Ɵ z miofibrylem za pomocą manipulatora i sprawdź pozycję, wykonując szybki krok (ustawienia generatora sygnału można znaleźć w Tabeli 1) za pomocą oprogramowania sterownika systemu (Rysunek 2B–C, patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Upewnij się, że dolny kanał będzie wyrównany z miofibrylem podczas fazy aktywacji szybkiego kroku (Rysunek 2B–C).
5. Włącz przepływ tła Rx (Rysunek 4A), aby utworzyć laminarny przepływ tła w komorze przepływu.
   UWAGA: Przepływ tła jest niezbędny, aby zapobiec turbulentnemu przepływowi w wyniku przepływu roztworu pCa ze szkła Ɵ.
   1. Włączyć dopływ komory przepływowej za pomocą dźwigni zaworu Luer.
      1. Wyślij następujące parametry do pompy odpływowej, aby rozpocząć opróżnianie komory przepływowej i zapobiec przepełnieniu komory przepływowej (Rysunek 9): Zawór = zawór kąpielowy (2); Tryb Microstep = Mikro; Cel tłoka = 48 000; Prędkość tłoka = 38–40 (dowolna).
         UWAGA: Upewnij się, że poziom płynu jest stabilny przez cały czas. Miofibryl nie powinien wyschnąć, podobnie jak wspornik. Lepiej jest mieć trochę przelewu niż zbyt mały przepływ.
6. Aby ustawić temperaturę na żądaną wartość za pomocą termoelektrycznego regulatora temperatury (Rysunek 8, patrz Tabela materiałów), wprowadź żądaną temperaturę i naciśnij "Start". Poczekaj, aż zostanie osiągnięta żądana temperatura, sprawdzając wykres w oprogramowaniu termoelektrycznego regulatora temperatury i kontynuuj.
   UWAGA: Podczas wykonywania eksperymentów w temperaturze pokojowej nie trzeba używać termoelektrycznego regulatora temperatury.

4. Eksperymentalny protokół(y)

1. Zdecyduj, które protokoły siły aktywnej należy wykonać.
   UWAGA: W zależności od danych niezbędnych do badania, można przeprowadzić wiele rodzajów eksperymentów z siłą czynną: krok 4.1.1, pomiar maksymalnej siły przy nasyceniu [Ca²⁺]; krok 4.1.2, uzyskanie krzywej siły pCa w celu określenia wrażliwości na wapń w uzupełnieniu do kroku 4.1.1; Krok 4.1.3, Określenie szybkości przebudowy napięcia poprzez wykonanie protokołu skracania-ponownego rozciągania jako dodatek do kroku 4.1.1 lub 4.1.2.
   1. Zmierz maksymalną siłę czynną.
      1. Rozpocznij rejestrowanie danych w oprogramowaniu sterownika systemu (patrz tabela materiałów), naciskając przycisk "Start".
      2. Otwórz zawory 1 i 6 za pomocą oprogramowania panelu akwizycji danych (patrz tabela materiałów), zaznaczając przycisk "1+6", aby uruchomić przepływ Ɵ-szklanego roztworu relaksującego i aktywującego roztwór przez szkło Ɵ (Rysunek 6A).
      3. Zresetuj zakres interferometru tak, aby siła podstawowa wynosiła 0 V, wybierając i naciskając "Resetuj zakres" na interferometrze (patrz Tabela materiałów).
      4. Gdy ślad siły jest stabilny, wykonaj szybki krok szkła Ɵ (rozmiar kroku = 100 μm).
         Ustawienia generatora sygnału można znaleźć w Tabeli 1 (Rysunek 5C). Ślad aktywacji-relaksacji podobny do Rysunek 4D zostanie zarejestrowany i będzie widoczny w oprogramowaniu kontrolera systemu.
      5. Wstrzymaj rejestrowanie danych oprogramowania kontrolera systemu, naciskając przycisk "Pauza".
      6. Jeśli nie ma być wykonywana więcej aktywacji, zamknij zawory 1 i 6, aby zatrzymać przepływ szkła Ɵ, odznaczając przycisk "1+6" (Rysunek 6B), zatrzymaj pompę strzykawkową (Rysunek 9, patrz Tabela materiałów), naciskając "Zakończ" i zatrzymaj przepływ tła, zamykając zawór Luer.
   2. Krzywa siła-pCa
      UWAGA: Jest to podobne do kroku 4.1.1 w celu uzyskania maksymalnej siły czynnej, ale z wieloma aktywacjami przy użyciu różnych rozwiązań pCa.
      1. Rozpocznij rejestrowanie danych w oprogramowaniu kontrolera systemu, naciskając przycisk "Start".
      2. Otwórz zawory 1 i 2 za pomocą oprogramowania panelu akwizycji danych, aby rozpocząć przepływ roztworu relaksującego i pCa 6,2 przez szkło Ɵ.
      3. Zresetuj zakres interferometru tak, aby siła podstawowa wynosiła 0 V, wybierając i naciskając "Resetuj zakres" na interferometrze.
      4. Gdy ślad siły jest stabilny, wykonaj szybki krok szkła Ɵ (rozmiar kroku = 100 μm).
         Ustawienia generatora sygnału można znaleźć w Tabeli 1.
      5. Wstrzymaj oprogramowanie kontrolera systemu, naciskając przycisk "Pauza".
      6. Powtórzyć kroki 4.1.2.1–4.1.2.4 dla zaworów 1 i 3 (pCa 5.8), zaworów 1 i 4 (pCa 5.6), zaworów 1 i 5 (pCa 5.4) oraz zaworów 1 i 6 (pCa 4.5).
      7. Jeśli nie ma być wykonywana więcej aktywacji, zamknij zawory 1 i 6, aby zatrzymać przepływ szkła Ɵ, odznaczając przycisk "1+6" (Rysunek 6A), zatrzymaj pompę strzykawkową (Rysunek 9), naciskając "Zakończ" i zatrzymaj przepływ tła, zamykając zawór Luer.
   3. Zmierz szybkość przebudowy rozciągania (k_TR).
      UWAGA: Jest to podobne do kroku 4.1.1 dla maksymalnej siły czynnej, ale z pewnymi zmianami i dodanymi krokami.
      1. Oblicz ruch piezoelektryczny niezbędny do poluzowania miofibrylu o 15% i wprowadź tę wartość do generatora sygnału (Rysunek 5D, Tabela 1).
      2. Rozpocznij rejestrowanie danych w oprogramowaniu kontrolera systemu, naciskając przycisk "Start".
      3. Otwórz zawory 1 i 6 za pomocą oprogramowania panelu akwizycji danych (Rysunek 6A), aby rozpocząć przepływ roztworu relaksującego i pCa 4,5 przez szkło Ɵ.
      4. Zresetuj zakres interferometru tak, aby siła podstawowa wynosiła 0 V, wybierając i naciskając "Resetuj zakres" na interferometrze.
      5. Gdy ślad siły jest stabilny, wykonaj szybki krok szkła Ɵ (rozmiar kroku = 100 μm).
         Ustawienia generatora sygnału można znaleźć w Tabeli 1.
      6. Gdy dojdzie do plateau siły, wykonaj skracanie-ponowne rozciąganie za pomocą piezo.
         Ustawienia generatora sygnału można znaleźć w (Rysunek 5D, Tabela 1). Ślad aktywacji-relaksacji podobny do Rysunek 4E zostanie zarejestrowany i widoczny w oprogramowaniu sterownika systemu.
         UWAGA: Można utworzyć niestandardowy protokół, aby zautomatyzować powyższe kroki.
      7. Wstrzymaj oprogramowanie kontrolera systemu, naciskając przycisk "Pauza".
      8. Jeśli nie ma być wykonywana więcej aktywacji, zamknij zawory 1 i 6, aby zatrzymać przepływ szkła Ɵ, odznaczając przycisk "1+6" (Rysunek 6B), zatrzymaj pompę strzykawkową ( Rysunek 9), naciskając "Zakończ" i zatrzymaj przepływ tła, zamykając zawór Luer.
2. Wykonaj pomiary siły biernej.
   1. Wykonaj ciągłe rozciąganie.
      1. Oblicz ruch piezoelektryczny niezbędny do rozciągnięcia miofibrylu i wprowadź tę wartość do generatora sygnału (Tabela 1).
         UWAGA: To są przykładowe ustawienia. Oblicz stopień rozciągnięcia i czas rozciągania w stosunku do długości sarkomeru. Ustawienia te są niezbędne, aby zapewnić, że prędkość rozciągania na sarkomer pozostaje równa we wszystkich miofibrylach.
      2. Rozpocznij rejestrowanie danych w oprogramowaniu kontrolera systemu, naciskając przycisk "Start".
      3. Zresetuj zakres interferometru tak, aby siła podstawowa wynosiła 0 V, wybierając i naciskając "Resetuj zakres" na interferometrze.
      4. Wykonaj ciągłe rozciąganie za pomocą generatora sygnału w oprogramowaniu sterownika systemu, aby obsługiwać piezo. Przykładowe ustawienia generatora sygnału można znaleźć w Tabeli 1.
      5. Skróć miofibryl do luźnej długości za pomocą piezoelektrycznego po zakończeniu rozciągania (Tabela 1).
   2. Wykonaj rozciąganie krokowe.
      1. Rozpocznij rejestrowanie danych w oprogramowaniu kontrolera systemu, naciskając przycisk "Start".
      2. Zresetuj zakres interferometru tak, aby siła podstawowa wynosiła 0 V, wybierając i naciskając "Resetuj zakres" na interferometrze.
      3. Wykonaj stopniowe rozciąganie za pomocą generatora sygnału w oprogramowaniu sterownika systemu, aby obsługiwać piezo. Przykładowe ustawienia generatora sygnału można znaleźć w Tabeli 1 (Rysunek 5E).
   3. Skróć miofibryl do luźnej długości za pomocą piezoelektrycznego po zakończeniu rozciągania. Przykładowe ustawienia generatora sygnału można znaleźć w Tabeli 1.
3. Wstrzymaj oprogramowanie kontrolera systemu, naciskając przycisk "Pauza".
4. Zatrzymaj rejestrowanie danych, naciskając przycisk "Stop" w oprogramowaniu sterownika systemu.
5. Zapisz dane, naciskając "Plik" i "Zapisz dane" w oprogramowaniu kontrolera systemu.

5. Czyszczenie

1. Usuń zmierzoną miofibrylę i przygotuj się na następną miofibrylę.
   1. Aby to zrobić, ostrożnie oderwij miofibryl, patrząc przez oko za pomocą obiektywu 40x.
   2. Przesuń sondę siły w górę i piezo. Przesuń szklankę Ɵ w górę do samej góry, w prawo i do tyłu. Następnie przesuń się w górę i odsuń komorę przepływu. Usuń kąpiel tkankową.
   3. Aby wyczyścić igłę montażową, ustaw ją w ostrości za pomocą 10x i okularu. Zanurz pędzel w etanolu i ostrożnie zetrzyj i usuń klej z igły.
      UWAGA: Pamiętaj, że może minąć trochę czasu, zanim klej zejdzie.
   4. Przepłukać komorę przepływową i kąpiel tkankową ultraczystą wodą.
   5. Umieść sondę na małej szalce Petriego wypełnionej ultraczystą wodą. Upewnij się, że sonda jest całkowicie zanurzona.
2. Po zakończeniu eksperymentów wyczyść konfigurację jak powyżej i wykonaj następujące dodatkowe kroki.
   1. Opróżnij rurkę z kąpieli przepływowej. Wyślij parametry do pompy strzykawkowej odpływowej (patrz tabela materiałów, Rysunek 9). Zawór = zawór kąpielowy (2); Tryb mikrokroku = Normalny; Cel tłoka = 0; Prędkość tłoka = 30.
      UWAGA: Zakończ polecenie, gdy przewód jest pusty.
   2. Zainicjuj pompę kilka razy (Rysunek 9B).
   3. Opróżnić strzykawki. Aby to zrobić, zamknij wszystkie zawory Luer, otwórz wszystkie zawory, wyjmij rurkę z igły strzykawki, przytrzymaj rurkę o określonym pCa pod igłą i otwórz zawór Luer. Użyj korków ciśnieniowych, aby przyspieszyć proces.
   4. Ponownie przymocować rurkę do igły strzykawki. Napełnij strzykawki ~5 ml ultraczystej wody. Umieść filiżankę pod szklanką Ɵ. Otwórz wszystkie zawory i otwórz zawór ciśnieniowy, aby przepłukać system.
   5. Zamknij system. Wyłącz komputer, interferometr i blok zasilania kontrolera piezoelektrycznego.

6. Analiza danych

1. Eksportuj ślady danych z oprogramowania kontrolera systemu (patrz tabela materiałów) do arkusza kalkulacyjnego lub schowka, otwierając plik danych i wybierając żądany segment. Pokazane ślady zostaną wyeksportowane (np. surowa siła, długość sarkomeru i pozycja piezoelektryczna).
2. Wykonuj analizę za pomocą wybranego oprogramowania (np. MATLAB).

Ślady danych zostały zarejestrowane i otwarte za pomocą oprogramowania kontrolera systemu (patrz Tabela materiałów). Kompletne ślady lub wybrane segmenty zostały wyeksportowane do schowka lub pliku tekstowego w celu dalszej analizy za pomocą żądanego oprogramowania. Zawory do sterowania przepływem różnych rozwiązań były przełączane za pomocą niestandardowego oprogramowania lub ręcznie. Niestandardowy skrypt MATLAB został użyty do analizy szybkości aktywacji, przebudowy napięcia i relaksacji. Maksymalna siła czynna oraz siła szczytowa i plateau w eksperymentach z siłą pasywną zostały pobrane bezpośrednio ze śledzenia siły w oprogramowaniu sterownika systemu. Po zamontowaniu miofibrylu (Rysunek 2) wybrano żądany protokół.

Maksymalna aktywna siła i wrażliwość na wapń siły w miofibrylach wyizolowanych z mysich i ludzkich biopsji mięśni szkieletowych
W Rysunek 4A schematycznie przedstawiono układ eksperymentalny używany do eksperymentów z aktywną siłą. Pokazano ślady siły w eksperymencie z aktywną siłą z miofibrylem wyizolowanym ze zdrowego ludzkiego mięśnia czworogłowego. Miofibryl aktywowano 5 razy roztworami o różnym pCa (pCa 6,2, 5,8, 5,6, 5,4, 4,5; dane pokazane w Figura 4B). Średnia maksymalna siła wszystkich miofibryli w tym eksperymencie wynosiła ~123 mN/mm2. Krzywa siła-pCa została skonstruowana na podstawie sił plateau osiąganych podczas każdej aktywacji w każdym z pięciu roztworów wapnia. Wyniki są pokazane w Rysunek 4C. Na podstawie tej krzywej obliczono pCa przy 50% maksymalnej wytworzonej siły (pCa50). W tej miofibrylu pCa50 wynosiło 5,75.

Dodatkowo, jeden lub wiele związków może być dodanych do perfundowanego roztworu, aby zmierzyć jego wpływ na siłę wytwarzaną przez miofibryl. W Rysunek 4D, zilustrowany jest wpływ N-benzylo-p-toluensulfonamidu (BTS), inhibitora mięśni szybkokurczliwych (typu II) miozyny o łańcuchu ciężkim II (MHCII). 19 Miofibryl został aktywowany najpierw roztworem pCa 5.6, a następnie roztworem pCa 5.6 + BTS. Podczas drugiej aktywacji wyprodukowano mniejszą siłę, co wskazuje, że był to miofibryl, który zawierał MHCII. Istnieją mutacje w białkach, które są obecne wyłącznie w określonych typach mięśni, a zatem wpływają tylko na miofibryle z tego konkretnego typu mięśni. W takim przypadku "typowanie" miofibryli jest ważne, aby dostrzec wpływ mutacji na różne typy mięśni. Przykład ten ilustruje również możliwość badania skuteczności związków terapeutycznych w miofibrylach.

Rysunek 4E pokazuje ślad siły czynnej pojedynczego miofibrylu wyizolowanego z tkanki mięśnia płaszczkowatego szkieletu myszy. Miofibryl zamontowano w układzie i perfuzjono roztworem relaksującym (pCa 9,0), a następnie perfuzją roztworem aktywującym (pCa 4,5, ~0,032 mM wapnia). Jednocześnie rejestrowaliśmy siłę i długość sarkomeru. Był to skurcz prawie izometryczny, ponieważ ugięcie wspornika wynosiło ~0,5 μm, co stanowiło około 1% długości luzu miofibrylu (~50 μm). W Rysunek 4E podczas aktywnego skurczu przeprowadzono protokół szybkiego skracania i ponownego rozciągania, aby ocenić tempo przebudowy napięcia (kTR, żółta przerywana linia). kTR jest miarą kinetyki jazdy na rowerze przez most. Dopasowano również krzywe aktywacji i relaksacji, aby określić odpowiednio szybkość aktywacji (kACT, czerwona linia przerywana) i relaksacji (kREL, zielona linia przerywana). Rysunek 4 pokazuje bardziej szczegółowy widok fazy relaksacji wyróżniony w Rysunek 4F. Uwidoczniły się dwie fazy: 1) początkowa powolna faza relaksacji (zdominowana przez oderwanie od mostu poprzecznego) i 2) szybka faza relaksacji (zdominowana przez oderwanie od mostu krzyżowego i dysocjację wapnia)20.

Siła bierna w miofibrylach wyizolowana z ludzkiej biopsji mięśni szkieletowych
Rysunek 10 pokazuje ślad eksperymentu z użyciem siły pasywnej z miofibrylem wyizolowanym ze zdrowej ludzkiej tkanki mięśniowej przepony. Pierwszy protokół obejmował jedno lub wiele pasywnych rozciągnięć w celu określenia właściwości lepkosprężystych sarkomerów. Rysunek 10 pokazuje ślad siły ciągłego rozciągania miofibrylu (rozciągnięcie od sarkomeru o długości 2,2–3,0 μm). Podczas rozciągania miofibryle wykazywały zarówno właściwości lepkie, jak i elastyczne. Widać to wyraźnie po krzywej pokazanej na Rysunek 10A. Ostry szczyt reprezentuje obie cechy, podczas gdy siła plateau jest miarą elastyczności. Lepkość jest odporna na odkształcenia liniowo. W ten sposób siła spadła po usunięciu odkształcenia. Rysunek 10B podkreśla sam odcinek i ilustruje wysoki stosunek sygnału do szumu. Należy pamiętać, że ślady siły są niefiltrowane.

Ryc. 1: Schematyczne przedstawienie i obrazy z mikroskopii elektronowej mięśnia szkieletowego i jego morfologii. (A) pokazuje strukturę mięśni szkieletowych i (B) pokazuje strukturę sarkomeru, najmniejszej jednostki skurczowej. Te schematyczne obrazy zostały zaczerpnięte z Servier Medical Art. (C) Pokazuje obraz pojedynczego włókna mięśniowego i (D) pokazuje obraz z mikroskopii elektronowej włókna mięśniowego, ujawniający uszkodzenie miofibrylarne, a także zachowaną ultrastrukturę miofibrylarną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Obrazy przedstawiające zamontowaną miofibryl, wyrównanie Ɵ ze szkłem i igłę do montażu piezoelektrycznego. (A) Miofibryl zamontowany na luźnej długości między igłami z włókna szklanego pokrytymi szelakiem, widziany przez obiektyw 40x. (B) Obrazy położenia szkła Ɵ względem miofibrylu (zaznaczone białymi owalami) widziane przez obiektyw 10x. (Góra) Wyrównany do górnego kanału (roztwór relaksujący, pCa 9,0); (Na dole) Wyrównany do dolnego kanału (roztwór aktywujący, pCa 4,5) w celu perfuzji miofibrylu z wapniem i wywołania skurczu. (C) Schematyczne przedstawienie położenia szkła Ɵ względem miofibrylu. (Góra) Wyrównany z górnym kanałem (roztwór relaksujący, pCa 9,0); (Na dole) Wyrównany z dolnym kanałem (roztwór aktywujący, pCa 4,5) w celu perfuzji miofibrylu z wapniem i wywołania skurczu. (D) Igła montażowa przymocowana do pręta węglowego uchwytu piezoelektrycznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Schematyczne przedstawienie układu i końcowej części komory przepływu tkanek. W kolorze ciemnoniebieskim komora przepływu tkanek wykonana z aluminium, a w kolorze białym wnęka, w której sonda siły i szkło Ɵ są pokazane na swoim miejscu; (Środek) Miofibryl przymocowany między dwiema igłami montażowymi z włókna szklanego przymocowanymi do sondy siły i silnika o długości piezoelektrycznej. Szkło Ɵ jest wyrównane z miofibrylem. Szkło Ɵ może poruszać się w górę iw dół, aby wystawić miofibryl na działanie roztworu wapnia. (Po prawej) Zbliżenie na sondę siły wspornika. Wskazany jest rozmiar ubytku (lub ubytek Fabry'ego-Pérota, d); interfejsy odbicia A, B i C; oraz przykład fali świetlnej emitowanej przez laser (kolor czerwony). Wspornik jest zamontowany na ramieniu tulejki. Włókno, które przenosi laser z interferometru, wychodzi z tulejki na końcu wspornika. Szklane włókno montażowe jest mocowane na wsporniku za pomocą wosku. (Lewy górny róg) Interferometr analizuje sygnał interferometryczny przesyłany do oprogramowania sterownika systemu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Układ doświadczalny i dane z eksperymentów z aktywnym napięciem. (A) Schematyczne przedstawienie zastosowanego układu perfuzji i roztworów. Należy pamiętać, że pierwsza i ostatnia probówka (jasnoniebieska) zawierają roztwór bezwapniowy (tj. roztwór relaksujący). (B) Przykładowe ślady siły w eksperymencie z aktywnym napięciem z miofibrylem wyizolowanym z ludzkiej tkanki mięśni szkieletowych, wykazujące pięć aktywacji od roztworu rozluźniającego (pCa 9,0) do roztworów wielokrotnej aktywacji (pCa 6,2 – 4,5). (C) krzywa siła-wapń; Poziomy sił na płaskowyżach w panelu (B) zostały znormalizowane i wykreślone w stosunku do odpowiednich poziomów wapnia. (D) Przykładowy ślad siły miofibrylu typu II (szybkokurczliwego) wyizolowanego z ludzkich mięśni szkieletowych aktywowanego roztworem pCa 5,6 (niebieski), a następnie pCa 5,6 + BTS (inhibitor mostka krzyżowego specyficzny dla typu II, czerwony). (E) Przykładowy ślad danych z eksperymentu z aktywnym napięciem z miofibrylami wyizolowanymi z tkanki mięśni szkieletowych mięśni płaszczkowatych myszy z protokołem szybkiego skracania-ponownego rozciągania podczas aktywacji w celu określenia szybkości przebudowy napięcia (kTR, żółta linia przerywana). Dopasowano również krzywą aktywacji i relaksacji, aby określić odpowiednio szybkość aktywacji (kACT, czerwona przerywana linia) i relaksacji (kREL, zielona przerywana linia). (F) Zbliżenie fazy relaksacji (lewy górny róg), podświetlone w (E). Szybki sygnał silnika (na dole po lewej) wskazywał punkt czasowy, w którym roztwór zmienił się z roztworu aktywacyjnego (pCa 4,5) na roztwór relaksujący (pCa 9,0). Faza relaksacji składała się z fazy liniowej, powolnej (u góry po prawej) i fazy wykładniczej, szybkiej (u dołu po prawej). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Przykładowe ustawienie generatora sygnału w oprogramowaniu sterującym systemem (patrz tabela materiałów). 1) Wskazuje przycisk do wykonania poleceń wprowadzonych w generatorze sygnału. (A) Ustawianie silnika o długości piezoelektrycznej. (B) Ustawianie silnika szybkokrokowego. (C) Wykonanie szybkiego kroku w celu aktywacji miofibrylu na czas 5 s. (D) Wykonanie szybkiego skracania i ponownego rozciągania miofibrylu w celu określenia kTR. (E) Wykonywanie stopniowego rozciągania miofibrylu w celu określenia właściwości lepkosprężystości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Oprogramowanie sterownika zaworu używane na komputerze. (A) Przycisk służący do otwierania zaworów 1 (Rx) i 6 (Act). (B) Stan przycisków, gdy wszystkie zawory są zamknięte. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Pomiar długości sarkomeru, długości miofibryla i szerokości miofibrylu za pomocą oprogramowania sterującego systemem. Jako przykład używana jest linijka. (A) Pomiar długości sarkomeru: fioletowe pudełko umieszcza się wokół miofibrylu, a długość sarkomeru pokazano w (1). (B) Pomiar długości: Cyjan box umieszcza się od początku do końca miofibrylu. (C) Szerokość pomiaru: Po obróceniu kamery o 90° niebieskozielone pudełko umieszcza się z jednej strony miofibrylu na drugą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Oprogramowanie termoelektrycznego regulatora temperatury. (A) Nawiąż połączenie z termoelektrycznym regulatorem temperatury. (B) Rozwiń ustawienia temperatury. (C) Ustaw żądaną temperaturę, w tym przypadku: 15 °C. (D) Włącz termoelektryczny regulator temperatury i wyślij napięcie do modułu chłodnicy termoelektrycznej Peltiera. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Ustawienia pompy odpływowej strzykawki. (A) Otwórz połączenie z pompą, naciskając (1). (B) Uruchomić pompę z predefiniowanymi ustawieniami, naciskając (2). (C) Rozpocznij pompowanie odpływowe, ustawiając "Polecenia zaworu" na "Zawór kąpielowy" (2) i wprowadzając "Parametry zestawu poleceń", jak pokazano. Wykonaj polecenie, naciskając (3). Polecenia można zakończyć, naciskając (4). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 10: Przykładowy ślad danych z eksperymentu z napięciem pasywnym z miofibrylami wyizolowanymi z ludzkiej tkanki mięśni szkieletowych. (A) Zapis siły (górnej) i długości sarkomeru (dolnej) podczas protokołu rozciągania i zwalniania. (B) Powiększenie (A) pokazujące siłę (górną) i długość sarkomeru podczas fazy rozciągania miofibrylu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 11: Konfiguracja eksperymentalna i dane z eksperymentów preaktywacji wapnia w kardiomiocytach. (A) Schematyczne przedstawienie układu perfuzji. Należy pamiętać, że ostatnia tubka (jasnoniebieska) zawiera roztwór bezwapniowy (roztwór relaksujący). (B) Nałożone na siebie krzywe aktywacji kardiomiocytów bez (jasnoniebieskiej) i z (ciemnoniebieską) wstępną aktywacją wapnia, ze stężeniami wapnia odpowiednio 1 nM i 80 nM. (C) Porównanie preaktywacji wapnia w kardiomiocytach typu dzikiego (WT) i heterozygotycznych RBM20 (HET) wyizolowanych z lewej komory szczura. Ten rysunek został zmodyfikowany z Najafi et al.21. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Tabela opisująca różne ustawienia generatora sygnału używane w oprogramowaniu kontrolera systemu do obsługi silnika piezoelektrycznego i silnika szybkokrokowego.

Michiel Helmes jest udziałowcem i współwłaścicielem IONOptix Inc.