Method Article

Charakterystyka struktur amyloidowych u starzejących się C. elegans za pomocą obrazowania czasu życia fluorescencji

DOI:

10.3791/61004

⸱

March 27th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology im Forschungsverbund Berlin, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Molecular Neuroscience Group, Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge, 4Cell Biology, University of Bremen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie życia fluorescencji monitoruje, kwantyfikuje i rozróżnia tendencje agregacji białek w żywych, starzejących się i zestresowanych modelach choroby C. elegans.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fibryle amyloidowe są związane z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Huntingtona, Parkinsona czy Alzheimera. Te fibryle amyloidowe mogą sekwestrować endogenne białka metastabilne, a także składniki sieci proteostazy (PN), a tym samym nasilać nieprawidłowe fałdowanie białek w komórce. Dostępna jest ograniczona liczba narzędzi do oceny procesu agregacji białek amyloidowych w organizmie zwierzęcia. Przedstawiamy protokół mikroskopii czasu życia fluorescencji (FLIM), który umożliwia monitorowanie i kwantyfikację fibrylacji amyloidu w określonych komórkach, takich jak neurony, w sposób nieinwazyjny oraz wraz z postępem starzenia się i zaburzeniami PN. FLIM jest niezależny od poziomów ekspresji fluoroforu i umożliwia analizę procesu agregacji bez dalszego barwienia lub wybielania. Fluorofory są wygaszane, gdy znajdują się w bliskim sąsiedztwie struktur amyloidowych, co powoduje skrócenie czasu życia fluorescencji. Wygaszanie bezpośrednio koreluje z agregacją białka amyloidowego. FLIM to wszechstronna technika, którą można zastosować do porównania procesu fibrylacji różnych białek amyloidowych, bodźców środowiskowych lub tła genetycznego in vivo w sposób nieinwazyjny.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agregacja białek występuje zarówno w procesie starzenia się, jak i choroby. Szlaki prowadzące do powstawania i odkładania się dużych amyloidów lub amorficznych inkluzji są trudne do prześledzenia, a ich kinetyka jest podobnie trudna do rozwikłania. Białka mogą ulegać nieprawidłowemu fałdowaniu z powodu wewnętrznych mutacji w ich sekwencjach kodujących, jak w przypadku chorób genetycznych. Białka również ulegają nieprawidłowemu fałdowaniu, ponieważ sieć proteostazy (PN), która utrzymuje je rozpuszczalne i prawidłowo pofałdowane, jest upośledzona, jak to ma miejsce podczas starzenia. PN obejmuje molekularne białka opiekuńcze i maszynerię degradacji i jest odpowiedzialny....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synchronizacja C. elegans

  1. Synchronizuj C. elegans albo poprzez alkaliczną obróbkę roztworem podchlorynu, albo przez proste składanie jaj przez 4 godziny w temperaturze 20 °C8.
  2. Hoduj i utrzymuj nicienie w temperaturze 20 °C na płytkach pożywki wzrostu nicieni (NGM) wysianych OP50 E. coli zgodnie ze standardowymi procedurami9. Nicienie należy starzeć do pożądanego etapu rozwoju lub dnia.
    UWAGA: W tym protokole młodzi dorośli są obrazowani w 4 dniu, a stare nicienie są obrazowane w 8 dniu życia.

2. Za pośrednictwem RNAi powalanie mas....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół pokazuje, jak dokładnie monitorować powstawanie zagregowanych gatunków u żyjących C. elegans, zarówno podczas jego naturalnego starzenia, jak i podczas stresu. Wybraliśmy cztery różne szczepy transgenicznych nicieni wykazujących ekspresję białek poliglutaminy o powtórzeniach 40Q, 44Q lub 85Q. Białka te są syntetyzowane w różnych tkankach i zostały połączone z różnymi fluoroforami. Szczepy C. elegans wykazywały ekspresję Q40-mRFP w mięśniach ściany ciała (mQ40-RF.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół opisuje technikę opartą na mikroskopii do identyfikacji zagregowanych gatunków w systemie modelowym C. elegans . FLIM może dokładnie scharakteryzować obecność zarówno zagregowanych, jak i rozpuszczalnych gatunków połączonych z fluoroforem poprzez pomiar ich rozpadów czasu życia fluorescencji. Gdy białko fuzyjne zacznie agregować, jego zarejestrowany średni czas życia zmieni się z wyższej na niższą wartość16. Skłonność do agregacji można następnie wywnioskować .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczep mięśniowo-Q40-mRFP dostarczony przez CGC, który jest finansowany przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440). Neuronal-Q40-CFP był miłym darem od Laboratorium Morimoto. Dziękujemy DFG (KI-1988/5-1 do JK, stypendium doktoranckie NeuroCure przyznawane przez NeuroCure Cluster of Excellence dla MLP), EMBO (krótkoterminowe stypendium dla MLP) oraz Company of Biologists (stypendia na podróże do CG i MLP) za finansowanie. Dziękujemy również ośrodku obrazowania Advanced Light Microscopy w Centrum Medycyny Molekularnej im. Maxa Delbrücka w Berlinie za dostarczenie zestawu do obrazowania konstruktów YFP.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agar-Agar Kobe I, Carl Roth GmbH + Co. KG5210.2Składnik NGM
Biblioteka Ahringer hsp-1 siRNAŹródło: BioScience, Wielka Brytania LimitedF26D10.3
AmpicylinaCarl Roth GmbH + Co. KGK029.3Antybiotyk
B& H DCS-120 SPC-150Becker & Hickl GmbHFLIM Aquisition oprogramowanie
B& H SPC830-SPC ObrazBecker & Hickl GmbHFLIM Oprogramowanie Aquisition
BD Bacto PeptoneBD-Bionsciences211677NGM component
C. elegans iQ44-YFPCAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)OG412
C. elegans iQ85-YFPMiły prezent od Morimoto Lab
C. elegans mQ40-RFPMiły prezent od Morimoto Lab
C. elegans nQ40-CFPMiły prezent od Morimoto Lab
Deckglä ser-18x18mmCarl Roth GmbH + Co. KG0657.2Szkiełka nakrywkowe
Izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Carl Roth GmbH + Co. KG2316.4
Leica M165 FCLeica Camera AGMontaż Mikroskop stereoskopowy
Leica TCS SP5Leica Camera AGMikroskop konfokalny
Chlorowodorek lewamizoluAppliChem GmbHA4341Anesthetic
OP50 Escherichia coliCAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)OP50
PicoQuant PicoHarp300PicoQuant GmbHFLIM Aquisition Oprogramowanie
Sodium AzideCarl Roth GmbH + Co. KGK305.1Znieczulający
chlorek soduCarl Roth GmbH + Co. KG3957.2Składnik
NGMStandard-Objektträ gerCarl Roth GmbH + Co. KG0656.1Szkiełka szklane
Universal AgaroseBio & Sprzedaj GmbHBS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1Carl Zeiss AGMikroskop konfokalny
Zeiss LSM510-meta NLOCarl Zeiss AG
, , Mikroskop konfokalny

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
  2. Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Bio....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Lifetime ImagingAmyloid FibrilizationC Elegans ModelProtein Aggregation AnalysisNoninvasive MonitoringFLIM AcquisitionLifetime MeasurementPhoton DetectionAgarose Pad PreparationNeurodegenerative Disease Study

Related Articles