Method Article

Charakterystyka struktur amyloidowych u starzejących się C. elegans za pomocą obrazowania czasu życia fluorescencji

DOI:

10.3791/61004

⸱

March 27th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology im Forschungsverbund Berlin, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Molecular Neuroscience Group, Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge, 4Cell Biology, University of Bremen

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie życia fluorescencji monitoruje, kwantyfikuje i rozróżnia tendencje agregacji białek w żywych, starzejących się i zestresowanych modelach choroby C. elegans.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fibryle amyloidowe są związane z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Huntingtona, Parkinsona czy Alzheimera. Te fibryle amyloidowe mogą sekwestrować endogenne białka metastabilne, a także składniki sieci proteostazy (PN), a tym samym nasilać nieprawidłowe fałdowanie białek w komórce. Dostępna jest ograniczona liczba narzędzi do oceny procesu agregacji białek amyloidowych w organizmie zwierzęcia. Przedstawiamy protokół mikroskopii czasu życia fluorescencji (FLIM), który umożliwia monitorowanie i kwantyfikację fibrylacji amyloidu w określonych komórkach, takich jak neurony, w sposób nieinwazyjny oraz wraz z postępem starzenia się i zaburzeniami PN. FLIM jest niezależny od poziomów ekspresji fluoroforu i umożliwia analizę procesu agregacji bez dalszego barwienia lub wybielania. Fluorofory są wygaszane, gdy znajdują się w bliskim sąsiedztwie struktur amyloidowych, co powoduje skrócenie czasu życia fluorescencji. Wygaszanie bezpośrednio koreluje z agregacją białka amyloidowego. FLIM to wszechstronna technika, którą można zastosować do porównania procesu fibrylacji różnych białek amyloidowych, bodźców środowiskowych lub tła genetycznego in vivo w sposób nieinwazyjny.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agregacja białek występuje zarówno w procesie starzenia się, jak i choroby. Szlaki prowadzące do powstawania i odkładania się dużych amyloidów lub amorficznych inkluzji są trudne do prześledzenia, a ich kinetyka jest podobnie trudna do rozwikłania. Białka mogą ulegać nieprawidłowemu fałdowaniu z powodu wewnętrznych mutacji w ich sekwencjach kodujących, jak w przypadku chorób genetycznych. Białka również ulegają nieprawidłowemu fałdowaniu, ponieważ sieć proteostazy (PN), która utrzymuje je rozpuszczalne i prawidłowo pofałdowane, jest upośledzona, jak to ma miejsce podczas starzenia. PN obejmuje molekularne białka opiekuńcze i maszynerię degradacji i jest odpowiedzialny za biogenezę, fałdowanie, transport i degradację białek1.

C. elegans pojawił się jako model do badania starzenia się i chorób ze względu na swoją krótką żywotność, izogeniczną naturę i łatwość manipulacji genetycznych. Stworzono kilka transgenicznych szczepów C. elegans, które eksprymują ludzkie białka chorobotwórcze we wrażliwych tkankach. Co ważne, wiele szczepów zawierających białka podatne na agregację podsumowuje cechę charakterystyczną zaburzeń amyloidowych, czyli tworzenie dużych inkluzji. Dzięki przezroczystemu ciału C. elegans, agregaty te mogą być wizualizowane in vivo, nieinwazyjnie i niedestrukcyjnie2. Generowanie dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI) w fuzji z fluoroforem pozwala na zbadanie jego lokalizacji, transportu, sieci interakcji i ogólnego losu.

Przedstawiamy protokół monitorowania agregacji białek chorobotwórczych u żyjących i starzejących się C. elegans za pomocą mikroskopii obrazowania fluorescencji (FLIM). FLIM to potężna technika oparta na czasie życia fluoroforu, a nie na jego widmach emisyjnych. Czas życia (tau, τ) definiuje się jako średni czas potrzebny fotonowi do rozpadu ze stanu wzbudzonego z powrotem do stanu podstawowego. Czas życia danej cząsteczki oblicza się za pomocą techniki czasowo-dziedzinowej zliczania pojedynczych fotonów skorelowanych w czasie (TCSPC). W TCSPC-FLIM funkcję rozpadu fluorescencyjnego uzyskuje się poprzez wzbudzenie fluoroforu krótkimi impulsami laserowymi o wysokiej częstotliwości i zmierzenie czasu dotarcia emitowanego fotonu do detektora w odniesieniu do impulsów. Podczas skanowania próbki dla każdego piksela tworzona jest trójwymiarowa tablica danych: tablica zawiera informacje o rozkładzie fotonów w ich współrzędnych przestrzennych x,y i ich krzywej zaniku czasowego. Dana próbka staje się zatem mapą życiorysów, ujawniającą informacje o strukturze białka, wiązaniu i środowisku3,4. Każde białko fluorescencyjne ma wewnętrzny i precyzyjnie określony czas życia, zwykle wynoszący kilka nanosekund (ns), w zależności od jego właściwości fizykochemicznych. Co ważne, czas życia fluoroforu jest niezależny od jego stężenia, intensywności fluorescencji i metodologii obrazowania. Jednak w systemie biologicznym mogą na niego wpływać czynniki środowiskowe, takie jak pH, temperatura, stężenie jonów, nasycenie tlenem i jego partnerzy interakcji. Okresy życia są również wrażliwe na wewnętrzne zmiany strukturalne i orientację. Fuzja fluoroforu z punktem POI powoduje zmianę jego żywotności, a co za tym idzie, informację o zachowaniu skondensowanego białka. Kiedy fluorofor jest otoczony lub zamknięty w ściśle związanym środowisku, takim jak antyrównoległe arkusze beta struktury amyloidowej, traci energię nieradiacyjnie, proces znany jako wygaszanie5. Wygaszenie fluoroforu powoduje skrócenie jego pozornej żywotności. Po rozpuszczeniu czas życia białka pozostanie bliższy jego pierwotnej, wyższej wartości. W przeciwieństwie do tego, gdy białko zaczyna agregować, jego czas życia nieuchronnie zmieni się na niższą wartość6,7. W związku z tym możliwe staje się monitorowanie skłonności do agregacji dowolnego białka tworzącego amyloid w różnym wieku u żyjących C. elegans.

Tutaj opisujemy protokół do analizy agregacji białka fuzyjnego składającego się z różnych odcinków poliglutaminy (CAG, Q) (Q40, Q44 i Q85). Pokazujemy, w jaki sposób technika ta może być stosowana w równym stopniu do różnych fluoroforów, takich jak białko cyjanowo-fluorescencyjne (CFP), żółte białko fluorescencyjne (YFP) i monomeryczne białko czerwonej fluorescencji (mRFP); oraz we wszystkich tkankach C. elegans, w tym w neuronach, mięśniach i jelicie. Co więcej, w kontekście proteostazy, FLIM jest bardzo przydatnym narzędziem do obserwacji zmian po wyczerpaniu molekularnych białek opiekuńczych. Zniszczenie jednego z kluczowych molekularnych białek opiekuńczych, białka szoku cieplnego 1 (hsp-1), poprzez interferencję RNA, powoduje przedwczesne nieprawidłowe fałdowanie białek. Wzrost obciążenia agregacyjnego w wyniku starzenia się, choroby lub niedoboru białek opiekuńczych jest następnie mierzony jako skrócenie czasu życia fluorescencji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synchronizacja C. elegans

  1. Synchronizuj C. elegans albo poprzez alkaliczną obróbkę roztworem podchlorynu, albo przez proste składanie jaj przez 4 godziny w temperaturze 20 °C8.
  2. Hoduj i utrzymuj nicienie w temperaturze 20 °C na płytkach pożywki wzrostu nicieni (NGM) wysianych OP50 E. coli zgodnie ze standardowymi procedurami9. Nicienie należy starzeć do pożądanego etapu rozwoju lub dnia.
    UWAGA: W tym protokole młodzi dorośli są obrazowani w 4 dniu, a stare nicienie są obrazowane w 8 dniu życia.

2. Za pośrednictwem RNAi powalanie maszynerii opiekuńczej poprzez karmienie

UWAGA: Wykonaj knockdown białka opiekuńczego szoku cieplnego 1 (hsp-1), podając odpowiedni wektor RNAi do nicieni10. Plazmid hsp-1 RNAi uzyskano z biblioteki Ahringer (identyfikator klonu: F26D10.3).

  1. Hoduj HT115 (DE3) E. coli z ekspresją plazmidu RNAi hsp-1 przez 6 godzin do nocy w pożywce Luria Bertani (LB) zawierającej 50 μg/ml ampicyliny.
  2. Przygotować świeże płytki agarowe NGM zawierające β-D-1-tiogalaktopiranozyd izopropylu (IPTG; 1 mM) i ampicylinę (25 μg/ml) oraz nasiona z bakteriami RNAi hsp-1. Pozostaw płytki do wyschnięcia i indukuj w temperaturze pokojowej przez 1-3 dni.
  3. Umieścić zsynchronizowane jaja na płytce siRNA i pozostawić do wyklucia lub umieścić nicienie grawitacyjne i pozostawić do złożenia jaj na 4 godziny w temperaturze 20 °C przed wyjęciem. Hoduj nicienie do pożądanego wieku lub etapu.
    UWAGA: Drugie pokolenie nicieni może wykazywać silniejszy fenotyp nokdaunu. Opisany tutaj protokół siRNA i warunki są ogólne i dostosowane do hsp1. Interferencja RNA poprzez siRNA określonego klonu/genu musi zostać ustalona i zoptymalizowana przez użytkownika końcowego. Ważne jest, aby pamiętać, że nie wszystkie siRNA mają taką samą wydajność i dlatego zaleca się przetestowanie skuteczności knockdownu poprzez kwantyfikację za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) lub Western blot.

3. Przygotowanie preparatów mikroskopowych

  1. W dniu badania obrazowego należy rozpocząć od przygotowania preparatów obrazowych. Rozpuść agarozę w ddH2O w stężeniu 3% (w/v) i lekko ostudzić.
  2. Odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 1 ml i weź około 200 μl stopionej agarozy. Odpipetuj agarozę na czyste szklane szkiełko i natychmiast umieść drugą na wierzchu, unikając tworzenia się pęcherzyków. Pozostaw do wyschnięcia i delikatnie wyjmij górne szkiełko podstawowe. Rezultatem jest szklane szkiełko o równej powierzchni agarozy, na którym zostaną umieszczone nicienie.
    UWAGA: Każdy slajd zostanie wykorzystany do zobrazowania od 5 do 10 nicieni. Szkiełka można przygotować i przechowywać przez kilka godzin w humifikowanym pudełku, aby zapobiec wysychaniu agarozy.

4. Montaż nicieni na szkiełkach mikroskopowych

UWAGA: FLIM wymaga unieruchomienia nicieni. Wykonaj ten krok, gdy konfiguracja obrazowania (np. mikroskopy, lasery, detektory) jest gotowa do użycia.

  1. Za pomocą platynowego drucianego szpikulca umieść nicienie w pożądanym wieku na świeżej nieobsianej płytce i pozwól im się czołgać, aby usunąć nadmiar bakterii OP50 z ich ciał.
  2. Przygotuj związek znieczulający (azydek sodu lub lewamizol) w celu unieruchomienia nicienia. Przechowywać zapas o stężeniu 500 mM NaN3 w ciemności w temperaturze 4 °C i rozcieńczyć w świeżym ddH2O do końcowego stężenia 250 mM. W przypadku stosowania lewamizolu należy rozcieńczyć roztwór roboczy o stężeniu 20 mM do 2 mM w ddH2O.
    UWAGA: Azydek sodu (NaN3) jest wysoce toksyczny. Używaj rękawic i okularów ochronnych i pracuj pod wentylowanym kapturem.
  3. Pracując pod mikroskopem stereoskopowym, umieść 10 μl kropli związku znieczulającego na waciku agarozowym i delikatnie przenieś do niego 5-10 nicieni. Użyj końcówki rzęs, aby oddzielić nicienie. Trzymaj je blisko siebie, ale nie dotykaj, aby umożliwić łatwiejszą lokalizację nicieni podczas pozyskiwania obrazu.
  4. Ostrożnie przykryj nicienie szkiełkiem nakrywkowym. Pomiary należy wykonywać w ciągu 1 godziny po zamontowaniu.
    UWAGA: Oba środki znieczulające ostatecznie zabiją C. elegans. Nicienie muszą być całkowicie nieruchome podczas obrazowania, ponieważ mapa życia jest rejestrowana z każdego piksela. Każdy ruch parametrów x,y uniemożliwia odczyt czasu życia w tym samym wzbudzonym pikselu.

5. Akwizycja danych FLIM

UWAGA: W tym protokole czas życia fluoroforu jest uzyskiwany za pomocą metody TCSPC w dziedzinie czasu. FLIM wymaga, aby impuls światła był generowany przez laser z ustaloną i stałą częstotliwością powtarzania. Częstotliwość powtarzania różni się w zależności od typu lasera i musi być znana użytkownikowi. Pomiary żywotności są osiągane za pomocą detektorów i sprzętu elektronicznego zainstalowanego wraz z konwencjonalnym mikroskopem. W tym protokole pomiary są wykonywane na trzech różnych laserowych skaningowych mikroskopach konfokalnych z detektorami i oprogramowaniem dostarczonym przez dwie różne firmy (Tabela materiałów) do pozyskiwania odpowiednio czasów życia mRFP, CFP i YFP. Przed rozpoczęciem sprawdź, czy zainstalowane są odpowiednie filtry emisji/wzbudzenia i zminimalizuj podświetlenie tła lub monitora. Przed rozpoczęciem jakiegokolwiek eksperymentu należy ustalić fotostabilność wybranego fluoroforu. Jeśli fluorofor bieleje w krótkim czasie w tkankach nicienia, nie nadaje się do pomiarów FLIM u C. elegans.

  1. Otwórz oprogramowanie do akwizycji FLIM. Oprogramowanie FLIM umożliwia również sterowanie mikroskopem konfokalnym. Znajdź zakładkę/przycisk, aby umożliwić włączenie wyjść czujnika i naciśnij Włącz wyjścia.
  2. Zapoznaj się z funkcją odpowiedzi instrumentu (IRF), która opisuje precyzję pomiaru czasu konfiguracji instrumentalnej.
    UWAGA: Ten krok należy wykonać najlepiej przed zamontowaniem nicieni.
    1. Jeśli to możliwe, wyjmij filtry wzbudzenia/emisji.
    2. Umieść puste szkiełko nakrywkowe nad obiektywem i znajdź jego powierzchnię. Zapisać sygnał punktowy uzyskany ze szkiełka nakrywkowego przez co najmniej 30 s.
      UWAGA: W przypadku czasów życia wynoszących kilka nanosekund oprogramowanie do akwizycji może automatycznie oszacować przesunięcie IRF. Uzyskanie IRF jest zawsze zalecane.
  3. Umieść zjeżdżalnię z zamontowanymi C. elegans na scenie. Za pomocą soczewki z 10-krotnym powiększeniem w trybie transmisji i zlokalizuj położenie nicieni na szkiełku.
  4. Zdejmij szkiełko, zmień obiektyw na soczewkę o powiększeniu 63x i nałóż wymagane medium immersyjne (np. olej). Załóż szkiełko na stoliku i zlokalizuj nicienie.
  5. Znajdź Pinhole Manager w oprogramowaniu do akwizycji i otwórz go do maksimum. Rozpocznij skanowanie próbki, wybierz obszar zainteresowania (np. głowa, górna część ciała) i skup się na jego maksymalnej płaszczyźnie projekcji.
  6. Monitoruj częstotliwość impulsów lasera i trzy inne wartości obecne w interfejsie oprogramowania: dyskryminator stałej frakcji (CFD), czas do amplitudy (TAC) i przetwornik analogowo-cyfrowy (ADC).
    UWAGA: Laser powinien mieć maksymalną bramkę 1 x 108 pojedynczych fotonów. Liczba ta reprezentuje maksymalną liczbę fotonów dostarczanych przez laser. CFD dostarcza informacji o odbiorze impulsu pojedynczego fotonu w odniesieniu do impulsu laserowego przez detektor. Ta wartość powinna wynosić w przybliżeniu 1 x 105. TAC rozróżnia czas wykrycia jednego fotonu od następnego impulsu laserowego. Na koniec przetwornik ADC przekształca napięcie TAC na sygnał pamięci, który można przechowywać11. CFD, TAC i ADC powinny mieć podobne wartości, aby zapewnić, że fotony emitowane przez fluorofor nie zostaną utracone. Prawidłowa ocena tych parametrów zapewnia, że zbierana jest wystarczająca ilość fotonów, aby stworzyć dokładną mapę czasu życia.
  7. W interfejsie oprogramowania FLIM wyświetl podgląd liczby wykrytych fotonów: wartość ADC powinna mieścić się w przedziale od 1 x 104 do 1 x 105. W razie potrzeby przenieś ostrość na inną płaszczyznę lub zwiększ moc lasera, aby zebrać więcej fotonów.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, liczba rejestrowanych fotonów na sekundę nie powinna przekraczać 1% częstotliwości powtarzania lasera.
  8. Na pasku menu wybierz kartę, aby ustawić parametry pozyskiwania. Wybierz opcję Skanuj synchronizację, aby umożliwić wykrywanie pojedynczych fotonów.
  9. Ustaw akwizycję na określony czas lub ustaloną liczbę fotonów. Na przykład uzyskaj krzywą rozpadu czasu życia przez 2 minuty lub do momentu, gdy pojedynczy piksel osiągnie liczbę fotonów wynoszącą 2 000 pojedynczych zdarzeń. Naciśnij Start, aby rozpocząć pobieranie.
    UWAGA: Różne fluorofory będą wymagały różnych laserów i filtrów wzbudzających i emisyjnych. W zależności od jasności próbki moc lasera można również regulować, co nie będzie kolidować z żywotnością. Protokoły te używają następujących ustawień wzbudzenia/emisji: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. Do pomiarów CFP przy użyciu ex800/em440 nm wykorzystano impulsowy laser dwufotonowy. Ilość czasu i liczba fotonów wymagane do uzyskania mapy FLIM będzie musiała zostać empirycznie ustalona dla każdej konfiguracji i każdego celu eksperymentalnego.

6. Analiza danych FLIM za pomocą oprogramowania FLIMfit

UWAGA: Przeprowadź analizę danych za pomocą narzędzia FLIMfit opracowanego w Imperial College London12 (zobacz Rysunek 1).

  1. Otwórz oprogramowanie i zaimportuj pliki danych FLIM za pomocą opcji Plik | Załaduj dane FLIM. Załaduj wszystkie próbki z jednego warunku, nawet jeśli zostały uzyskane w różnych sesjach i z różnych powtórzeń biologicznych.
  2. W razie potrzeby podziel pojedynczy nicień na segmenty z dowolnego obrazu FLIM za pomocą segmentacji | Menedżer segmentacji. Przeciągnij narzędzie do przycinania wokół obszaru zainteresowania, aż zostanie podświetlone. Po zakończeniu naciśnij OK.
    UWAGA: Segmentacja musi być wykonana dla wszystkich obrazów.
  3. Wybierz mały obszar, w którym pojawia się oparty na intensywności obraz C. elegans (Rysunek 1, Strzałki 1). Krzywa rozpadu tego obszaru pojawi się w dużym oknie zaniku po prawej stronie interfejsu (Rysunek 1, strzałka 2).
    UWAGA: Rozkład może być wyświetlany liniowo lub logarytmicznie.
  4. Ustaw prawidłowe parametry, aby ekstrapolować okres eksploatacji za pomocą algorytmu oprogramowania, zgodnie z opisem w krokach 6.5-6.8.
  5. Na karcie Dane (Rysunek 1, strzałka 3):
    1. Ustaw dowolną wartość Zintegrowane minimum, aby wykluczyć wszystkie piksele, które są zbyt ciemne, aby uzyskać dobre dopasowanie. W zależności od próbki C. elegans wartość ta waha się od 40 do 300. Wprowadzaj różne wartości, aż do uzyskania zadowalającego podglądu.
    2. Wybierz liczbę Time Min i Time Max, aby ograniczyć sygnał FLIM do tych wartości. Wszystkie zdarzenia, które pojawiają się przed i po tym progu, zostaną wykluczone.
      UWAGA: Na przykład na potrzeby analizy mRFP wykluczono zdarzenia przed 800 ps i po 4 000 ps. Wartości te zależą od żywotności fluoroforu i muszą być określone przez użytkownika końcowego.
    3. Nie zmieniaj wstępnie ustawionej liczby zliczeń/fotonów na 1.
    4. Wprowadź częstotliwość powtarzania w MHz lasera używanego podczas akwizycji.
      UWAGA: W obecnym protokole zastosowano różne lasery o różnej częstotliwości powtarzania. Laser dwufotonowy używany do akwizycji czasów życia CFP ma częstotliwość powtarzania 80 MHz, dla YFP laser powtarza się z częstotliwością 40 MHz, a dla mRFP wartość ta wynosi 78,01 MHz. Wartości te zostały wprowadzone do FLIMfit zgodnie z analizowaną próbką.
    5. Wprowadź wartość Gate Max, aby wykluczyć wszystkie nasycone piksele.
      UWAGA: W przypadku pomiarów żywotności C. elegans wartość ta jest ustawiana na dowolną dużą liczbę (np. 1 x 108).
  6. Na karcie Okres istnienia wybierz dopasowanie globalne, które ma zostać użyte (np. dopasowanie pikselowe). Zobacz Rysunek 1, strzałka 4.
    UWAGA: Dopasowanie pikselowe spowoduje powstanie zaniku dopasowanego do każdego pojedynczego piksela. Dopasowanie obrazu spowoduje utworzenie globalnego dopasowania każdego pojedynczego obrazu i wyświetlenie pojedynczej wartości okresu istnienia dla każdego obrazu. Dopasowanie globalne spowoduje utworzenie pojedynczego dopasowania w całym zestawie danych. Dla wszystkich obrazów podawana jest jedna wartość okresu istnienia.
  7. Nie zmieniaj żadnego innego parametru z wyjątkiem Nie. Wybór exp, jeśli wiadomo, że wybrany rozpad fluorescencji jest wielowykładniczy i wykazuje więcej niż jeden czas życia.
    UWAGA: W niniejszym protokole funkcja ta została wykorzystana do obliczenia czasu życia dwuwykładniczego fluoroforu CFP.
  8. Prześlij IRF za pomocą menu IRF: IRF | Załaduj IRF. Aby oszacować przesunięcie IRF, wybierz IRF | Oszacuj przesunięcie IRF. Zestaw wartości pojawi się automatycznie na karcie IRF. Po ustaleniu tego nie zmieniaj żadnych innych parametrów tej zakładki.
  9. Po ustawieniu wszystkich parametrów naciśnij Dopasuj zestaw danych (Rysunek 1, strzałka 5). Algorytm określi dopasowanie do krzywej zaniku i ustali wartość czasu życia dla każdego obrazu.
    UWAGA: Wynikowe dopasowanie, zaznaczone niebieską linią, powinno nakładać się na wszystkie zdarzenia. Dobre dopasowanie uzyskuje się, gdy wszystkie zdarzenia są wyrównane wzdłuż dopasowania.
  10. Kliknij zakładkę Parametry (Rysunek 1, Strzałka 6), znajdującą się w prawym górnym menu interfejsu oprogramowania, a następnie wybierz Statystyka: w_mean (średnia ważona) i sprawdź, czy wartość chi2 jest jak najbardziej zbliżona do 1,
    UWAGA: Złącze chi2 bliskie jedności zapewnia dokładność dopasowania. W ten sposób wartość życiowa wybranego obrazu jest ujawniana jako tau_1.
  11. Eksportuj dowolne informacje, które Cię interesują: Plik | Eksportuj obrazy intensywności/tabelę wyników dopasowania/obrazy/histogramy. Zapisz ustawienia danych używane do obliczenia okresu istnienia: Plik | Zapisz ustawienia danych.
    UWAGA: Zastosowane parametry zostaną zapisane do przyszłej analizy wybranych próbek.

7. Graficzne reprezentacje danych FLIM

UWAGA: Czasy życia zebrane z różnych próbek mogą być wizualnie reprezentowane na różne sposoby. Wybierz, aby oznaczać wartości okresu istnienia w nanosekundach lub pikosekundach.

  1. Pokaż jakość dopasowania i dokładność krzywej, eksportując krzywą zaniku bezpośrednio z FLIMfit.
  2. Przedstaw rozkład fotonów, wykreślając częstotliwość liczby fotonów w funkcji wartości czasu życia na histogramie.
  3. Na koniec, w celu porównania statystycznego, w przypadku porównywania dwóch lub więcej próbek, umieść wartości czasu życia oraz odchylenie standardowe średniej na wykresie słupkowym wykresu punktowego. Wykonaj dowolną analizę statystyczną.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół pokazuje, jak dokładnie monitorować powstawanie zagregowanych gatunków u żyjących C. elegans, zarówno podczas jego naturalnego starzenia, jak i podczas stresu. Wybraliśmy cztery różne szczepy transgenicznych nicieni wykazujących ekspresję białek poliglutaminy o powtórzeniach 40Q, 44Q lub 85Q. Białka te są syntetyzowane w różnych tkankach i zostały połączone z różnymi fluoroforami. Szczepy C. elegans wykazywały ekspresję Q40-mRFP w mięśniach ściany ciała (mQ40-RF...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół opisuje technikę opartą na mikroskopii do identyfikacji zagregowanych gatunków w systemie modelowym C. elegans . FLIM może dokładnie scharakteryzować obecność zarówno zagregowanych, jak i rozpuszczalnych gatunków połączonych z fluoroforem poprzez pomiar ich rozpadów czasu życia fluorescencji. Gdy białko fuzyjne zacznie agregować, jego zarejestrowany średni czas życia zmieni się z wyższej na niższą wartość16. Skłonność do agregacji można następnie wywnioskować ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczep mięśniowo-Q40-mRFP dostarczony przez CGC, który jest finansowany przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440). Neuronal-Q40-CFP był miłym darem od Laboratorium Morimoto. Dziękujemy DFG (KI-1988/5-1 do JK, stypendium doktoranckie NeuroCure przyznawane przez NeuroCure Cluster of Excellence dla MLP), EMBO (krótkoterminowe stypendium dla MLP) oraz Company of Biologists (stypendia na podróże do CG i MLP) za finansowanie. Dziękujemy również ośrodku obrazowania Advanced Light Microscopy w Centrum Medycyny Molekularnej im. Maxa Delbrücka w Berlinie za dostarczenie zestawu do obrazowania konstruktów YFP.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agar-Agar Kobe I, Carl Roth GmbH + Co. KG5210.2Składnik NGM
Biblioteka Ahringer hsp-1 siRNAŹródło: BioScience, Wielka Brytania LimitedF26D10.3
AmpicylinaCarl Roth GmbH + Co. KGK029.3Antybiotyk
B& H DCS-120 SPC-150Becker & Hickl GmbHFLIM Aquisition oprogramowanie
B& H SPC830-SPC ObrazBecker & Hickl GmbHFLIM Oprogramowanie Aquisition
BD Bacto PeptoneBD-Bionsciences211677NGM component
C. elegans iQ44-YFPCAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)OG412
C. elegans iQ85-YFPMiły prezent od Morimoto Lab
C. elegans mQ40-RFPMiły prezent od Morimoto Lab
C. elegans nQ40-CFPMiły prezent od Morimoto Lab
Deckglä ser-18x18mmCarl Roth GmbH + Co. KG0657.2Szkiełka nakrywkowe
Izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Carl Roth GmbH + Co. KG2316.4
Leica M165 FCLeica Camera AGMontaż Mikroskop stereoskopowy
Leica TCS SP5Leica Camera AGMikroskop konfokalny
Chlorowodorek lewamizoluAppliChem GmbHA4341Anesthetic
OP50 Escherichia coliCAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)OP50
PicoQuant PicoHarp300PicoQuant GmbHFLIM Aquisition Oprogramowanie
Sodium AzideCarl Roth GmbH + Co. KGK305.1Znieczulający
chlorek soduCarl Roth GmbH + Co. KG3957.2Składnik
NGMStandard-Objektträ gerCarl Roth GmbH + Co. KG0656.1Szkiełka szklane
Universal AgaroseBio & Sprzedaj GmbHBS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1Carl Zeiss AGMikroskop konfokalny
Zeiss LSM510-meta NLOCarl Zeiss AG
, , Mikroskop konfokalny

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
  2. Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Biology Direct. 11, 58(2016).
  3. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
  4. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer US. New York, NY. (2006).
  5. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).
  6. Kaminski Schierle, G. S., et al. A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo. ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).
  7. Sandhof, C. A., et al. Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading. Autophagy. , 1-22 (2019).
  8. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. 64, e4019(2012).
  9. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
  10. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).
  11. Becker, W., et al. Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).
  12. Warren, S. C., et al. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PloS one. 8 (8), e70687(2013).
  13. Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
  14. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  15. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).
  16. Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).
  17. Laine, R. F., et al. Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of α-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).
  18. Kelbauskas, L., Dietel, W. Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation. Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).
  19. Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors. Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).
  20. Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Lifetime ImagingAmyloid FibrilizationC Elegans ModelProtein Aggregation AnalysisNoninvasive MonitoringFLIM AcquisitionLifetime MeasurementPhoton DetectionAgarose Pad PreparationNeurodegenerative Disease Study

Related Articles