Artykuł metodologiczny

Translaminarny model autonomicznego systemu do modulacji ciśnienia wewnątrzgałkowego i śródczaszkowego w tylnych segmentach dawcy człowieka

DOI:

10.3791/61006

⸱

24 kwietnia 2020

 ,  ,  , 
1North Texas Eye Research Institute, Department of Pharmacology and Neuroscience, University of North Texas Health Science Center, 2Mechanical Engineer Consultant, 3Department of Ophthalmology and Visual Sciences, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy i szczegółowo opisujemy zastosowanie translaminarnego systemu autonomicznego. System ten wykorzystuje ludzki tylny odcinek do niezależnej regulacji ciśnienia wewnątrz segmentu (wewnątrzgałkowego) i otaczającego nerw wzrokowy (wewnątrzczaszkowego) w celu wytworzenia translaminarnego gradientu ciśnienia, który naśladuje cechy jaskrowej neuropatii nerwu wzrokowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecnie istnieje niezaspokojona potrzeba nowego przedklinicznego modelu człowieka, który może celować w etiologię choroby ex vivo za pomocą ciśnienia śródczaszkowego (ICP) i ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP), które może zidentyfikować różne paradygmaty patogenne związane z patogenezą jaskry. Modele hodowli narządów perfuzji ludzkiego przedniego odcinka ex vivo były wcześniej z powodzeniem wykorzystywane i stosowane jako skuteczne technologie do odkrywania patogenezy jaskry i testowania środków terapeutycznych. Przedkliniczne badania przesiewowe leków i badania prowadzone na układach narządów ludzkich ex vivo mogą być bardziej przekładalne na badania kliniczne. W artykule szczegółowo opisano tworzenie i działanie nowatorskiego modelu ciśnienia translaminarnego ex vivo u człowieka zwanego translaminarnym systemem autonomicznym (TAS). Model TAS może niezależnie regulować ICP i IOP za pomocą tylnych segmentów ludzkiego dawcy. Model pozwala na badanie patogenezy w sposób przedkliniczny. Może ograniczyć wykorzystanie żywych zwierząt w badaniach okulistycznych. W przeciwieństwie do eksperymentalnych modeli in vitro, struktura, złożoność i integralność tkanki głowy nerwu wzrokowego (ONH) może być również zachowana w modelu TAS ex vivo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Globalne szacunki w ostatnich badaniach sugerują, że 285 milionów ludzi żyje z wadami wzroku, w tym 39 milionów to osoby niewidome1. W 2010 roku Światowa Organizacja Zdrowia udokumentowała, że trzy z dziewięciu wymienionych głównych przyczyn ślepoty występują w tylnym segmencie oka1. Choroby tylnego odcinka wzroku obejmują siatkówkę, naczyniówkę i nerw wzrokowy2. Siatkówka i nerw wzrokowy są przedłużeniami mózgu ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Aksony komórek zwojowych siatkówki (RGC) są podatne na uszkodzenia, ponieważ wychodzą z oka przez głowę nerwu wzrokowego (ONH), tworząc nerw wzrokowy3. ONH pozostaje najbardziej wrażliwym punktem dla aksonów RGC ze względu na siatkę 3D wiązek tkanki łącznej zwaną blaszką cribrosa (LC)4. ONH jest początkowym miejscem uszkodzenia aksonów RGC w jaskrze < sup class="xref">5,6,7, a zmiany ekspresji genów w obrębie ONH badano w modelach nadciśnienia ocznego i jaskry8,9,10. Aksony RGC są podatne na ONH ze względu na różnice ciśnień między przedziałem wewnątrzgałkowym, zwane ciśnieniem wewnątrzgałkowym (IOP), a w zewnętrznej peroptycznej przestrzeni podpajęczynówkowej, zwane ciśnieniem śródczaszkowym (ICP)11. Obszar LC oddziela oba obszary, utrzymując normalne różnice ciśnień, z IOP w zakresie 10–21 mmHg i ICP od 5–15 mmHg12. Różnica ciśnień przez blaszkę między dwiema komorami nazywana jest translaminarnym gradientem ciśnienia (TLPG)13. Głównym czynnikiem ryzyka jaskry jest podwyższone IOP14.

Zwiększone IOP zwiększa obciążenie w obszarze laminarnym i w poprzek niego6,15,16. Obserwacje eksperymentalne na modelach ludzkich i zwierzęcych pokazują, że ONH jest początkowym miejscem uszkodzenia aksonów17,18. Biomechaniczny paradygmat stresu i odkształcenia związanego z IOP powodującego uszkodzenie jaskry w ONH wpływa również na patofizjologię jaskry19,20,21. Mimo że u ludzi zmiany wywołane ciśnieniem mechanicznie uszkadzają aksony RGC22, gryzonie pozbawione płytek kolagenowych w blaszce mogą również rozwinąć jaskrę7,23. Ponadto podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe pozostaje najważniejszym czynnikiem ryzyka u pacjentów z jaskrą pierwotną otwartego kąta, podczas gdy u pacjentów z jaskrą z prawidłowym napięciem rozwija się jaskrowa neuropatia nerwu wzrokowego nawet bez podwyższonego ciśnienia wewnątrzgałkowego. Ponadto istnieje również podgrupa pacjentów z nadciśnieniem ocznym, którzy nie wykazują uszkodzenia nerwu wzrokowego. Sugeruje się również, że ciśnienie płynu mózgowo-rdzeniowego (CSFp) może odgrywać rolę w patogenezie jaskry. Dowody wskazują, że ICP jest obniżone do ~5 mmHg u pacjentów z jaskrą w porównaniu z normalnymi osobami, powodując w ten sposób zwiększone ciśnienie translaminarne i odgrywając kluczową rolę w chorobie24,25. Wcześniej wykazano na psim modelu, że kontrolując zmiany IOP i CSFp, mogą wystąpić duże przemieszczenia tarczy nerwu wzrokowego26. Podniesienie CSFp w oczach świń wykazało również zwiększone główne obciążenie w obszarze LC i zalaminarnej tkance nerwowej. Zwiększone obciążenie RGC i regionu LC przyczynia się do zablokowania transportu aksonalnego i utraty RGCs27. Postępująca degeneracja RGC wiąże się z utratą wsparcia troficznego28,29, stymulacja procesów zapalnych/regulacja immunologiczna30,31, oraz efektory apoptotyczne29,32,33,34,35. Dodatkowo, uszkodzenie aksonów (Rysunek 3) powoduje szkodliwy wpływ na RGC, wywołując awarię regeneracyjną36,37,38,39. Mimo że wpływ ciśnienia wewnątrzgałkowego został dobrze zbadany, przeprowadzono minimalne badania nad nieprawidłowymi zmianami ciśnienia translaminarnego. Większość metod leczenia jaskry koncentruje się na stabilizacji ciśnienia wewnątrzgałkowego. Jednak, mimo że obniżenie ciśnienia wewnątrzgałkowego spowalnia postęp choroby, nie odwraca utraty pola widzenia i nie zapobiega całkowitej utracie RGC. Zrozumienie zmian neurodegeneracyjnych związanych z ciśnieniem w jaskrze będzie miało kluczowe znaczenie dla zapobiegania zgonom z powodu RGC.

Obecne dowody wskazują, że translaminarne modulacje ciśnienia spowodowane różnymi mechanicznymi, biologicznymi lub fizjologicznymi zmianami u pacjentów cierpiących na urazowe lub neurodegeneracyjne zaburzenia widzenia mogą powodować znaczną utratę wzroku. Obecnie nie istnieje prawdziwy przedkliniczny model ludzkiego tylnego segmentu, który mógłby pozwolić na badanie biomechanicznych uszkodzeń jaskrowych w ludzkim ONH ex vivo. Obserwacja i leczenie tylnego odcinka oka jest ogromnym wyzwaniem w okulistyce27. Istnieją fizyczne i biologiczne bariery celujące w tylne oko, w tym wysokie wskaźniki eliminacji, bariera krew-siatkówka i potencjalne odpowiedzi immunologiczne40. Większość testów skuteczności i bezpieczeństwa dla nowych celów leków jest przeprowadzana przy użyciu komórkowych i zwierzęcych modeli in vivo41. Anatomia oka jest złożona, a badania in vitro nie naśladują dokładnie anatomicznych i fizjologicznych barier prezentowanych przez systemy modeli tkankowych. Mimo że modele zwierzęce są niezbędne do badań farmakokinetycznych, fizjologia oka ludzkiego tylnego oka może się różnić w zależności od gatunku zwierząt, w tym anatomii komórkowej siatkówki, naczyń krwionośnych i ONH41,42.

Wykorzystanie żywych zwierząt wymaga intensywnych i szczegółowych przepisów etycznych, dużego zaangażowania finansowego i efektywnej odtwarzalności43. Ostatnio pojawiło się wiele innych wytycznych dotyczących etycznego wykorzystywania zwierząt w badaniach eksperymentalnych44,45,46. Alternatywą dla testów na zwierzętach jest wykorzystanie modeli ludzkiego oka ex vivo do badania patogenezy choroby i potencjalnej analizy leków chroniących przed uszkodzeniem ONH. Ludzka tkanka pośmiertna jest cennym źródłem do badania paradygmatów chorób ludzkich, zwłaszcza w przypadku ludzkich chorób neurodegeneracyjnych, ponieważ identyfikacja potencjalnych leków opracowanych w modelach zwierzęcych wymaga konieczności ich translacji na język ludzki47. Ludzka tkanka dawcy ex vivo była szeroko wykorzystywana do badania zaburzeń u ludzi47,48,49, a systemy hodowli narządów perfuzji ludzkiego przedniego odcinka wcześniej dostarczyły unikalny model ex vivo do badania patofizjologii podwyższonego IOP50,51,52.

Aby badać ciśnienie translaminarne związane z IOP i ICP w ludzkich oczach, udało nam się zaprojektować i rozwinąć dwukomorowy translaminarny system autonomiczny (TAS), który może niezależnie regulować IOP i ICP za pomocą tylnych segmentów z ludzkich oczu dawcy. Jest to pierwszy ludzki model ex vivo, który bada ciśnienie translaminarne i wykorzystuje biomechaniczne skutki TLPG na ONH.

Ten model TAS ex vivo może być używany do wykrywania i klasyfikowania modyfikacji komórkowych i funkcjonalnych, które występują z powodu przewlekłego wzrostu ciśnienia wewnątrzgałkowego lub ICP. W tym raporcie szczegółowo opisujemy krok po kroku protokół analizy, konfiguracji i monitorowania modelu ludzkiego tylnego segmentu TAS. Protokół pozwoli innym badaczom skutecznie odtworzyć ten nowatorski model ludzkiego tylnego segmentu pod ciśnieniem ex vivo w celu zbadania patogenezy chorób biomechanicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczy zostały uzyskane zgodnie z postanowieniami Deklaracji Helsińskiej do badań nad tkankami ludzkimi.

UWAGA: Oczy z renomowanych banków oczu (np. Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL) zostały pobrane w ciągu 6-12 godzin od śmierci, a surowica dawcy została przetestowana na obecność wirusowego zapalenia wątroby typu B, zapalenia wątroby typu C oraz ludzkiego wirusa niedoboru odporności 1 i 2. Po ich otrzymaniu, oczy zostały wypreparowane i ustawione w modelu TAS w ciągu 24 godzin. Kryteria wykluczenia obejmowały wszelkie patologie oczu. Oczy nie były wykluczane ze względu na wiek, rasę lub płeć. Aby zapewnić żywotność siatkówki po jej otrzymaniu, eksplantaty siatkówki pobrano od dawców tkanek i hodowano przez 7 i 14 dni (rysunek uzupełniający 1). Te siatkówki zostały również zdysocjowane i rosły zdrowe RGC w hodowli przez 7 dni z dodatnim barwieniem markera RGC, białkiem wiążącym RNA z wielokrotnym splicingiem (RBPMS), a także barwieniem dodatnim łańcuchem lekkim neurofilamentów (NEFL) w ich neurofilamentach (rysunek uzupełniający 2).

1. Przygotowanie i sterylizacja sprzętu i materiałów eksploatacyjnych

  1. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać pełną listę wymaganych materiałów eksploatacyjnych, a także numery dostawców i katalogowe.
  2. Przed użyciem wysterylizuj cały sprzęt i narzędzia w autoklawie lub przy użyciu ampułek z tlenku etylenu.

2. Przygotowanie podłoża perfuzyjnego

  1. Dodaj 1% streptomycyny penicyliny (10 000 j/ml penicyliny, 10 000 μg/ml streptomycyny w 0,85% NaCl) i 1% L-glutaminy (200 mM) do 1 000 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco o wysokim poziomie glukozy.
  2. Wysterylizuj pożywkę perfuzyjną, przechodząc przez filtr 0,22 μm.

3. Konfiguracja translaminarnego systemu autonomicznego (TAS)

  1. Skonfigurować strzykawki dopływowe (zbiorniki IOP i ICP).
    1. Dodać 30 ml pożywki perfuzyjnej (sekcja 2) do strzykawki o pojemności 30 ml. Podłączyć 3-kierunkowy kran do strzykawki o pojemności 30 ml. Podłączyć filtr hydrofilowy 0,22 μm do 3-drogowego kranu. Podłącz adapter króćca Luer 15 G do filtra hydrofilowego 0,22 μm.
    2. Usunąć pęcherzyki powietrza z zestawu strzykawki. Podłącz rurkę do adaptera króćca Luer 15 G. Zamknij boczny port kranu za pomocą niewentylowanej uniwersalnej nasadki zamka. Powtórz tę czynność dla łącznie dwóch ustawień.
    3. Oznacz jedną strzykawkę jako ciśnienie śródczaszkowe kanału 1 (CH1 ICP), a drugą strzykawkę jako ciśnienie wewnątrzgałkowe kanału 2 (CH2 IOP).
  2. Ustawić strzykawki odpływowe (zbiorniki IOP i ICP).
    1. Podłączyć 3-kierunkowy kran do strzykawki o pojemności 30 ml. Podłączyć króciec Luer 15 G do 3-drogowego krana odcinającego. Podłącz rurkę do adaptera króćca Luer 15 G.
    2. Zamknij boczny port kranu za pomocą niewentylowanej uniwersalnej nasadki zamka. Powtórz tę czynność dla łącznie dwóch ustawień. Oznaczyć jedną strzykawkę jako CH1 ICP, a drugą strzykawkę jako CH2 IOP.

4. Przygotowanie całego oka ludzkiego

oka

UWAGA: Jeśli odbierane są całe oczy, postępuj zgodnie z poniższą procedurą, aby oddzielić przedni segment od tylnego odcinka oka. Jeśli oczy są podzielone na pół, zacznij od kroku 4.4.

  1. Umieść całe oko w roztworze jodu powidonu na 2 minuty.
  2. Przepłukać oko jałowym roztworem buforowanym fosforanem (PBS) w celu spłukania jodu powidonu. Powtórz 2 razy.
  3. Usuń przydatki z całej gałki oka za pomocą kleszczy i nożyczek. Przetnij oko na pół na równiku, aby oddzielić przedni i tylny segment oka.
  4. Usuń osłonkę nerwu wzrokowego. Usuń ciało szkliste z tylnego segmentu.
  5. W razie potrzeby przyciąć dodatkową twardówkę z tylnego segmentu, aby zapewnić dobre dopasowanie do okrągłej kopuły komory IOP (dolnej). Za pomocą kleszczy upewnij się, że siatkówka jest równomiernie rozłożona na tylnej części segmentu.
  6. Konfiguracja komory IOP (dolnej)
    1. Umieść ludzki tylny segment w komorze IOP (dolnej) TAS nad okrągłą kopułą z nerwem wzrokowym skierowanym do góry.
    2. Uszczelnij tylny segment za pomocą O-ringu z żywicy epoksydowej z czterema, zapewniając szczelne uszczelnienie.
    3. Włóż rurkę do portów IN i OUT komory IOP (na dole). Strzykawka wlotowa IOP z rurką zawierającą medium jest wkładana do portu IN, a pusta strzykawka odpływowa IOP z rurką jest wkładana do portu OUT.
    4. Użyj metody pchania/ciągnięcia, aby powoli wlewać medium perfuzyjne do portu dopływowego, aby napełnić tylną muszlę oczną, jednocześnie powoli wyciągając medium perfuzyjne przez strzykawkę odpływową, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z przewodów. Przerwij zaparzanie pożywki, gdy zarówno rurki IN, jak i OUT są wolne od pęcherzyków powietrza.
    5. Zablokuj kurki w pozycji wyłączonej. Wyjmij strzykawkę o pojemności 30 ml z zespołu filtra portu IOP IN i napełnij ją łącznie 30 ml pożywki. Umieścić strzykawkę o pojemności 30 ml na zespole filtra.
  7. Konfiguracja komory ICP (górnej)
    1. Umieść komorę/pokrywę ICP (górną) z tyłu tylnego segmentu. Upewnij się, że nerw wzrokowy znajduje się w górnej komorze. Uszczelnij górną komorę czterema.
    2. Włóż rurkę do portów IN i OUT komory ICP (górnej). Strzykawka odpływowa ICP z rurką zawierającą medium jest wkładana do portu IN, a pusta strzykawka odpływowa ICP z rurką jest wkładana do portu OUT.
    3. Delikatnie i powoli wlej medium do portu IN, aby napełnić komorę ICP i usunąć pęcherzyki powietrza z przewodów metodą push/pull. Przerwij zaparzanie pożywki, gdy komora ICP oraz rurki IN i OUT będą wolne od pęcherzyków powietrza.
    4. Zablokuj kurki w pozycji wyłączonej. Wyjąć strzykawkę o pojemności 30 ml z ICP w zespole filtra portu i ponownie napełnić łącznie 30 ml pożywki. Umieścić strzykawkę o pojemności 30 ml na zespole filtra.

5. Ustawienia systemu rejestracji danych

UWAGA: System rejestracji danych składa się z 8-kanałowego źródła zasilania, wielokanałowego wzmacniacza mostkowego, przetworników ciśnienia hydrostatycznego oraz komputera z oprogramowaniem do akwizycji danych (patrz Tabela Materiałów). Poniżej opisano, jak skonfigurować i skalibrować system.

  1. Podłącz przewód zasilający z tyłu 8-kanałowego źródła zasilania i podłącz do urządzenia podtrzymującego bateryjnie.
  2. Podłącz USB z 8-kanałowego źródła zasilania z tyłu komputera.
  3. Podłącz 8-kanałowe źródło zasilania do mostka wielokanałowego amplifier za pomocą dostarczonego przewodu I2C.
  4. Podłącz Bayonet Neill-Concelman (BNC) do wejść kanałów przed 8-kanałowym źródłem zasilania, a koniec do odpowiednich kanałów z tyłu wielokanałowego amplifier.
  5. Podłącz przetwornika do przodu wielokanałowego amplifier.
  6. Zainstaluj oprogramowanie do gromadzenia danych na komputerze.
    1. Uruchom instalator oprogramowania do akwizycji danych z dostarczonego dysku CD z oprogramowaniem.
    2. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie komputera.
    3. Po zakończeniu instalacji wybierz pozycję Zakończ.
  7. Włącz 8-kanałowe źródło zasilania.
  8. Włącz komputer i uruchom oprogramowanie do akwizycji danych.
    1. Wybierz punkt menu Plik | Nowy.
    2. Wybierz kolejno opcje Ustawienia | Ustawienia kanału. Wybierz trzy kanały (lewy dolny róg ekranu). W kolumnie Channel Title (Tytuł kanału) zmień nazwy kanałów na następujący: CH1 ICP; CH2 IOP; CH3 TLPG (IOP-ICP).
    3. Wybierz 2 mV dla zakresu na wszystkich kanałach. W kolumnie Obliczenia wybierz opcję Brak obliczeń dla kanałów 1 i 2.
    4. W kolumnie Obliczenia wybierz pozycję Arytmetyka dla kanału 3. W sekcji Formuła: Wybierz kanały/CH2; Wybierz arytmetykę "-"; Wybierz kanały/CH1. W sekcji Output (Wyjście) wybierz mmHg. Wybierz przycisk OK. Ponownie wybierz przycisk OK.
  9. Ustawić i skalibrować przetworniki ciśnienia hydrostatycznego.
    UWAGA: Przetworniki ciśnienia hydrostatycznego muszą być skalibrowane przed eksperymentami przy użyciu następującej metody.
    1. Podłącz przetworniki ciśnienia hydrostatycznego do przewodów przetworników podłączonych do mostka wielokanałowego amplifier.
    2. Podłącz strzykawkę o pojemności 30 ml wypełnioną powietrzem do bocznego portu przetwornika ciśnienia CH1 (ICP). Przymocuj ciśnieniomierz do dolnej części przetwornika ciśnienia CH1 (ICP).
    3. Na wykresie wyświetl stronę oprogramowania do akwizycji danych, ustaw prędkość próbkowania, klikając lewym przyciskiem myszy strzałkę obok czasu próbkowania i wybierz 100. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy w obszarze CH1 (ICP) strony.
    4. Wybierz opcję Bridge Amp (Wzmacniacz mostka). Wybierz opcję Filtr sieciowy. Wybierz Zero i poczekaj, aż system się wyzeruje, uważając, aby nie przesunąć przetwornika ciśnienia.
    5. Ściśnij białe wypustki przetwornika ciśnienia i przepchnij powietrze przez przetwornik, aż do uzyskania 40 mmHg na ciśnieniomierzu. Zwolnij białe wypustki i wyjmij strzykawkę oraz ciśnieniomierz.
    6. Na stronie Konwersja jednostek wybierz znak "minus (-)". Podkreśl najwyższy płaskowyż, aby wskazać 40 mmHg. Kliknij strzałkę odpowiadającą punktowi 1 i wprowadź wartość 40.
    7. Podświetl najniższy plateau, aby wskazać 0 mmHg. Kliknij strzałkę wskazującą punkt 2 i wprowadź wartość 0. Wybierz mmHg dla jednostek. Wybierz przycisk OK.
    8. Wybierz przycisk OK (strona Bridge Amp). Powtórz kroki 9.1–9.7 dla CH2 (IOP), używając 100 mmHg dla najwyższego plateau i 0 dla najniższego plateau.
  10. Podłączyć jednostkę TAS/segmentu tylnego do systemu akwizycji danych.
    1. Umieścić jednostkę TAS/tylnego segmentu w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ). Podłącz rurkę ICP z portu OUT do przetwornika ciśnienia CH1 (ICP).
    2. Podłącz rurkę IOP z portu OUT do przetwornika ciśnienia CH2 (IOP).
    3. Podłącz zestawy strzykawek (ICP i IOP) z medium z portów IN do stojaka pierścieniowego.
    4. Na stronie Widok wykresu wybierz pozycję Rozpocznij próbkowanie. Ustaw prędkość próbkowania, klikając lewym przyciskiem myszy strzałkę obok czasu próbkowania i wybierz Wolno i 1 min.
    5. Wyreguluj strzykawki na podstawie pierścienia w górę lub w dół, aby dostosować ciśnienie ICP i IOP do wymagań protokołu.
    6. Systematyczne uzupełnianie pożywki w systemie należy wykonywać co 48–72 godziny metodą push and pull.

6. Pobieranie i analiza danych

  1. Otwórz plik danych w oprogramowaniu do akwizycji danych.
  2. W sekcji Data Pad (Konsola danych) kliknij ikonę Multiple Add to Data Pad (Dodaj wiele do konsoli danych). Pojawi się nowe okno.
    1. W sekcji Znajdź za pomocą wybierz opcję Czas z menu rozwijanego.
    2. W sekcji Wybierz wybierz 1 godzinę co 1 godzinę z menu rozwijanych.
    3. W sekcji Krok po kroku wybierz opcję Cały plik, a następnie kliknij przycisk Dodaj.
  3. W sekcji Data Pad (Konsola danych) kliknij ikonę Data Pad View (Widok konsoli danych). Zaznacz wszystkie dane i skopiuj/wklej do arkusza kalkulacyjnego.
  4. Oblicz średnią i odchylenia standardowe dla IOP, ICP i TLPG dla każdych 24 godzin. Zbierz dane za pomocą opcji tabeli przestawnej w programie arkusza kalkulacyjnego i wykresie.

7. Immunohistochemia i barwienie hematoksyliną i eozyną tylnych odcinków

  1. Usuń tylne segmenty oka zgodnie z różnymi punktami czasowymi z modelu TAS i utrwal w formalinie przed parafinizacją.
  2. Przekrój oczy, aby uzyskać strzałkowe płaszczyzny tkanki.
  3. Segmenty zatopione w parafinie należy odparafinować roztworem 100% ksylenu, 95% etanolu, 50% etanolu.
  4. Myć szkiełka PBS przez 10 minut i blokować buforem blokującym w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  5. Oznacz skrawki z przeciwciałami pierwszorzędowymi: antykolagenem IV (marker macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), NB120-6586, 1:100) i antylamininą (marker ECM, NB300-144, 1:100, anty-RBPMS (marker RGC), GTX118619, 1:50).
  6. Wykryj przeciwciała pierwszorzędowe za pomocą przeciwciał drugorzędowych Alexa Fluor (Alexa Fluor 488 kozia anty-królicza, A11008, 1:500).
  7. Przeciwbarwić jądra komórkowe za pomocą roztworu przeciw blaknięciu DAPI.
  8. Uchwyć obrazy barwionych skrawków i obrazy fazowe za pomocą soczewek obiektywowych 4x i 10x za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów).
  9. W przypadku barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) skrawki należy przetworzyć w automatycznym systemie barwienia (patrz tabela materiałów) w celu odparafinowania przy użyciu 100%, 95% roztworu etanolu ksylenowego, 50% etanolu i barwienia H&E.
  10. Rejestruj obrazy za pomocą soczewek obiektywowych 4x i 10x za pomocą mikroskopu ze źródłem światła w jasnym polu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projektowanie i tworzenie translaminarnego systemu autonomicznego
Translaminarna różnica ciśnień jest potencjalnie kluczowym mechanizmem w patogenezie różnych chorób, w tym jaskry. Zastosowania opisanego modelu obejmują między innymi badanie jaskry (podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe, być może zmniejszone ICP), urazowe uszkodzenie mózgu (podwyższone ICP) i długotrwałe narażenie na upośledzenie wzroku związane z mikrograwitacją (podwyższone ICP, podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe). Aby pomóc w o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie tkanki pośmiertne są szczególnie cennym źródłem do badania ludzkich chorób neurodegeneracyjnych, ponieważ identyfikacja potencjalnych leków opracowanych w modelach zwierzęcych musi być możliwa do przełożenia na ludzi47. Wpływ podwyższenia ciśnienia wewnątrzgałkowego u ludzi jest dobrze znany, ale przeprowadzono minimalne badania nad nieprawidłowymi zmianami ciśnienia translaminarnego ONH. Mimo że istnieje wiele modeli zwierzęcych i skończone modelowanie ludzkiego ONH, nie ma ludzkiego mode...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy manuskryptu nie mają do ujawnienia potencjalnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie tego projektu pochodziło z uznaniowych funduszy dr Colleen M. McDowell. Praca ta była częściowo wspierana przez nieograniczony grant od Research to Prevent Blindness, Inc. dla Wydziału Okulistyki i Nauk Wizualnych UW Madison. Dziękujemy doktorom Abbotowi F. Clarkowi i Weimingowi Mao za ich pomoc techniczną przy modelu hodowli narządów perfuzyjnych. Dziękujemy Lions Eye Institute for Transplant and Research (Tampa, Floryda) za dostarczenie ludzkich oczu dawcy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#122, 1-1/8" wewnątrz x 1-5/16" średnica zewnętrzna, O-ring Viton, grubość 3/32", twardość
755 opakowanie 50 sztuk		AmazonB07DRGPPZJ
114 O-ring Buna-N, twardość 70A,, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Szerokość (opakowanie 100 sztuk)AmazonB000FMYRHK
Strzykawki 30 ml bez igłyVitality Medical302832
3-drożny kran odcinający, 2 żeńskie zamki typu Luer, obrotowa męska blokada typu Luer, nasadka wentylowanaQOSINA2C6201
4-40 x 1/2 PH PAN MS SS/CHROME i śrubokręt krzyżakowy odpowiedniej wielkościŁączniki ze stali nierdzewnej BrikksenPPMSSSCH4C,5 
ANPROLENE 16 DUŻA AMPULAFisher ScientificNC9085343 
BetadinePurduePUR1815001EACH 
Corning 100 x 20mm Naczynia hodowlane poddane kulturze tkankowejSigma-AldrichCLS430167-100EAstrong> 
Corning  Roztwór L-glutaminyFisher ScientificMT25005CI
Covidien 3033 Curity Gąbka z gazy, 4" x 4", 12-warstwowa, sterylna, 1200/CSMed Plus Zaopatrzenie medyczneCOV-3033-CS
Kleszczyki opatrunkowe Delikatne zakrzywione (ząbkowane)KatenaK5-4010
Dumont #5 - Kleszcze do drobnych tkaninFST11254-20
Nożyczki do oczu Standardowe zakrzywioneKatenaK4-7410
Falcon 150 x 15mm Zwykłe sterylne jednorazowe szalki PetriegoCapitol Scientific351058
Fisherbrand 4 uncje Pojemniki na próbkiFisher Scientific16-320-730
Fisherbrand Woreczki do sterylizacji z natychmiastowym uszczelnieniemFisher Scientific01-812-54
Fisherbrand Instant Sealing Woreczki do sterylizacjiFisher Scientific01-812-55
Fisherbrand Instant Sealing Woreczki do sterylizacjiFisher Scientific01-812-58
HyClone Dulbecco's Modified Eagles MediumFisher ScientificSH3024302
HyClone Penicylina Streptomycyna 100X RoztwórFisher ScientificSV30010
Filtr hydrofilowy z żeńskim wlotem Luer Lock, męskim wylotem Luer Slip, niebieskim i przezroczystymQosina28217
Hydrostatyczne przetworniki ciśnienia, DELTRAN ® II, Katalog # DPT-200 z natężeniem przepływu 3CC / HRInstrumenty ADDPT-200
JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Końcówka dozująca 50/BoxJenson GlobalJG15-0.5HPX 15
Keyence B2? Mikroskop X710KeyenceB2-X710
LabChart 8Instrumenty ADLabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainerLeicaST5020
Niewentylowana uniwersalna nasadka Luer Lock, białaQOSINA65811
Ósemkowy wzmacniacz mostkowy (model # FE228)Instrumenty ADFE228
Pharmco Products ALKOHOL ETYLOWY, 200 DOWODÓWFisher ScientificNC1675398
Roztwór buforowany fosforanem (PBS)Sigma-AldrichD8537-500ML
PowerLab 8/35 (Model # PL3508)Instrumenty ADPL3508
ProLong Gold Antifade Mountant z DAPIThermoFisherP36935
Złączka rurkowa Push-to-Connect do powietrza i wody  Adapter prosty, rura 1/8" OD x 1/8 NPT męskiMcMAster-Carr7880T113
Złączka rurkowa Push-to-Connect z gwintem uniwersalnym  do powietrza i wody, adapter, 1/8" rura o średnicy zewnętrznej x 1/8 ruraMcMAster-Carr51235K101
Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Elastyczny przewód 500 ft.Fisher Scientific14-171-268
Superblok T20
- ostre-FST14001-14
Kleszczyki do tkanek Delikatne zęby 1x2 ZakrzywioneKatenaK5-4110
Translaminarny system autonomiczny (TAS)Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Północnego TeksasuN/A
USA Rozmiar 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer,, Buna-N
(NBR, nitryl, Buna)		Marco Rubber & Tworzywa sztuczneB1000-030
< Nożyczki chirurgiczne Fisher Scientific PI37536

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. The British Journal of Ophthalmology. 96 (5), 614-618 (2012).
  2. Bastawrous, A., et al. Posterior segment eye disease in sub-Saharan Africa: review of recent population-based studies. Tropical Medicine & International Health. 19 (5), 600-609 (2014).
  3. Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye. 18 (11), 1089-1095 (2004).
  4. Burgoyne, C. F. A biomechanical paradigm for axonal insult within the optic nerve head in aging and glaucoma. Experimental Eye Research. 93 (2), 120-132 (2011).
  5. Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. II. Effect of extended intraocular pressure elevation on optic nerve head and axonal transport. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 19 (2), 137-152 (1980).
  6. Quigley, H. A., Addicks, E. M., Green, W. R., Maumenee, A. E. Optic nerve damage in human glaucoma. II. The site of injury and susceptibility to damage. Archives of Ophthalmology. 99 (4), 635-649 (1981).
  7. Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. The Journal of Cell Biology. 179 (7), 1523-1537 (2007).
  8. Johnson, E. C., Jia, L., Cepurna, W. O., Doser, T. A., Morrison, J. C. Global changes in optic nerve head gene expression after exposure to elevated intraocular pressure in a rat glaucoma model. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (7), 3161-3177 (2007).
  9. Howell, G. R., et al. Molecular clustering identifies complement and endothelin induction as early events in a mouse model of glaucoma. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1429-1444 (2011).
  10. Qu, J., Jakobs, T. C. The Time Course of Gene Expression during Reactive Gliosis in the Optic Nerve. PloS one. 8 (6), 67094(2013).
  11. Berdahl, J. P., Fautsch, M. P., Stinnett, S. S., Allingham, R. R. Intracranial pressure in primary open angle glaucoma, normal tension glaucoma, and ocular hypertension: a case-control study. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 49 (12), 5412-5418 (2008).
  12. Berdahl, J. P., Allingham, R. R. Intracranial pressure and glaucoma. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (2), 106-111 (2010).
  13. Morgan, W. H., et al. The correlation between cerebrospinal fluid pressure and retrolaminar tissue pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 39 (8), 1419-1428 (1998).
  14. Leske, M. C., Connell, A. M., Wu, S. Y., Hyman, L. G., Schachat, A. P. Risk factors for open-angle glaucoma. The Barbados Eye Study. Archives of Ophthalmology. 113 (7), 918-924 (1995).
  15. Quigley, H. A., Green, W. R. The histology of human glaucoma cupping and optic nerve damage: clinicopathologic correlation in 21 eyes. Ophthalmology. 86 (10), 1803-1830 (1979).
  16. Burgoyne, C. F., Downs, J. C., Bellezza, A. J., Hart, R. T. Three-dimensional reconstruction of normal and early glaucoma monkey optic nerve head connective tissues. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (12), 4388-4399 (2004).
  17. Diekmann, H., Fischer, D. Glaucoma and optic nerve repair. Cell and Tissue Research. 353 (2), 327-337 (2013).
  18. Nickells, R. W., Howell, G. R., Soto, I., John, S. W. Under pressure: cellular and molecular responses during glaucoma, a common neurodegeneration with axonopathy. Annual Review of Neuroscience. 35, 153-179 (2012).
  19. Burgoyne, C. F., Downs, J. C. Premise and prediction-how optic nerve head biomechanics underlies the susceptibility and clinical behavior of the aged optic nerve head. Journal of Glaucoma. 17 (4), 318-328 (2008).
  20. Sigal, I. A., Ethier, C. R. Biomechanics of the optic nerve head. Experimental Eye Research. 88 (4), 799-807 (2009).
  21. Sigal, I. A., Flanagan, J. G., Tertinegg, I., Ethier, C. R. Modeling individual-specific human optic nerve head biomechanics. Part I: IOP-induced deformations and influence of geometry. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 8 (2), 85-98 (2009).
  22. Morgan, J. E., Jeffery, G., Foss, A. J. Axon deviation in the human lamina cribrosa. The British Journal of Ophthalmology. 82 (6), 680-683 (1998).
  23. Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 44 (12), 5151-5162 (2003).
  24. Berdahl, J. P., Allingham, R. R., Johnson, D. H. Cerebrospinal fluid pressure is decreased in primary open-angle glaucoma. Ophthalmology. 115 (5), 763-768 (2008).
  25. Fleischman, D., Allingham, R. R. The role of cerebrospinal fluid pressure in glaucoma and other ophthalmic diseases: A review. Saudi Journal of Ophthalmology. 27 (2), 97-106 (2013).
  26. Morgan, W. H., et al. Optic disc movement with variations in intraocular and cerebrospinal fluid pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 43 (10), 3236-3242 (2002).
  27. Feola, A. J., et al. Deformation of the Lamina Cribrosa and Optic Nerve Due to Changes in Cerebrospinal Fluid Pressure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (4), 2070-2078 (2017).
  28. Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. Journal of Neurobiology. 59 (1), 162-180 (2004).
  29. Kermer, P., Klocker, N., Bahr, M. Neuronal death after brain injury. Models, mechanisms, and therapeutic strategies in vivo. Cell and Tissue Research. 298 (3), 383-395 (1999).
  30. Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125 (4), 903-920 (2004).
  31. Kipnis, J., et al. Neuronal survival after CNS insult is determined by a genetically encoded autoimmune response. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (13), 4564-4571 (2001).
  32. Isenmann, S., Wahl, C., Krajewski, S., Reed, J. C., Bahr, M. Up-regulation of Bax protein in degenerating retinal ganglion cells precedes apoptotic cell death after optic nerve lesion in the rat. The European Journal of Neuroscience. 9 (8), 1763-1772 (1997).
  33. Kermer, P., et al. Caspase-9: involvement in secondary death of axotomized rat retinal ganglion cells in vivo. Brain research. Molecular Brain Research. 85 (1-2), 144-150 (2000).
  34. Kermer, P., Klocker, N., Labes, M., Bahr, M. Inhibition of CPP32-like proteases rescues axotomized retinal ganglion cells from secondary cell death in vivo. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 18 (12), 4656-4662 (1998).
  35. Kikuchi, M., Tenneti, L., Lipton, S. A. Role of p38 mitogen-activated protein kinase in axotomy-induced apoptosis of rat retinal ganglion cells. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (13), 5037-5044 (2000).
  36. Barron, K. D., Dentinger, M. P., Krohel, G., Easton, S. K., Mankes, R. Qualitative and quantitative ultrastructural observations on retinal ganglion cell layer of rat after intraorbital optic nerve crush. Journal of Neurocytology. 15 (3), 345-362 (1986).
  37. Misantone, L. J., Gershenbaum, M., Murray, M. Viability of retinal ganglion cells after optic nerve crush in adult rats. Journal of Neurocytology. 13 (3), 449-465 (1984).
  38. Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends in Neurosciences. 23 (10), 483-490 (2000).
  39. Klocker, N., Zerfowski, M., Gellrich, N. C., Bahr, M. Morphological and functional analysis of an incomplete CNS fiber tract lesion: graded crush of the rat optic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 110 (12), 147-153 (2001).
  40. Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
  41. Rousou, C., et al. A technical protocol for an experimental ex vivo model using arterially perfused porcine eyes. Experimental Eye Research. 181, 171-177 (2019).
  42. Vézina, M. Assessing Ocular Toxicology in Laboratory Animals. , Humana Press. 1-21 (2012).
  43. de Boo, J., Hendriksen, C. Reduction strategies in animal research: a review of scientific approaches at the intra-experimental, supra-experimental and extra-experimental levels. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (4), 369-377 (2005).
  44. Kirk, R. G. W. Recovering The Principles of Humane Experimental Technique: The 3Rs and the Human Essence of Animal Research. Science, Technology, & Human Values. 43 (4), 622-648 (2018).
  45. Burden, N., Chapman, K., Sewell, F., Robinson, V. Pioneering better science through the 3Rs: an introduction to the national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research (NC3Rs). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 198-208 (2015).
  46. Singh, J. The national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 3 (1), 87-89 (2012).
  47. White, K., et al. Effect of Postmortem Interval and Years in Storage on RNA Quality of Tissue at a Repository of the NIH NeuroBioBank. Biopreservation and Biobanking. 16 (2), 148-157 (2018).
  48. Ervin, J. F., et al. Postmortem delay has minimal effect on brain RNA integrity. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (12), 1093-1099 (2007).
  49. Heinrich, M., Matt, K., Lutz-Bonengel, S., Schmidt, U. Successful RNA extraction from various human postmortem tissues. International Journal of Legal Medicine. 121 (2), 136-142 (2007).
  50. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
  51. Gottanka, J., Chan, D., Eichhorn, M., Lutjen-Drecoll, E., Ethier, C. R. Effects of TGF-beta2 in perfused human eyes. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (1), 153-158 (2004).
  52. Pang, I. H., McCartney, M. D., Steely, H. T., Clark, A. F. Human ocular perfusion organ culture: a versatile ex vivo model for glaucoma research. Journal of Glaucoma. 9 (6), 468-479 (2000).
  53. Aryee, M. J., Gutierrez-Pabello, J. A., Kramnik, I., Maiti, T., Quackenbush, J. An improved empirical bayes approach to estimating differential gene expression in microarray time-course data: BETR (Bayesian Estimation of Temporal Regulation). BMC Bioinformatics. 10, 409(2009).
  54. Feola, A. J., et al. Finite Element Modeling of Factors Influencing Optic Nerve Head Deformation Due to Intracranial Pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (4), 1901-1911 (2016).
  55. Downs, J. C. Optic nerve head biomechanics in aging and disease. Experimental Eye Research. 133, 19-29 (2015).
  56. Downs, J. C., Roberts, M. D., Burgoyne, C. F. Mechanical environment of the optic nerve head in glaucoma. Optometry and Vision Science. 85 (6), 425-435 (2008).
  57. Downs, J. C., et al. Viscoelastic characterization of peripapillary sclera: material properties by quadrant in rabbit and monkey eyes. Journal of Biomechanical Engineering. 125 (1), 124-131 (2003).
  58. Wagner, A. H., et al. Exon-level expression profiling of ocular tissues. Experimental Eye Research. 111, 105-111 (2013).
  59. Pels, E., Beele, H., Claerhout, I. Eye bank issues: II. Preservation techniques: warm versus cold storage. International Ophthalmology. 28 (3), 155-163 (2008).
  60. Reinhard, K., et al. Hypothermia Promotes Survival of Ischemic Retinal Ganglion Cells. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (2), 658-663 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Translamanar Autonomous SystemIntraocular Pressure RegulationIntracranial Pressure ControlHuman Posterior SegmentOptic Nerve HeadPressure Gradient ModelingEx Vivo Ocular ModelHydrostatic Pressure TransducersPerfusion Fluid SetupData Acquisition System

Powiązane artykuły