Protokół obrazowania i charakterystyki terahercowej dla świeżo wyciętych guzów raka piersi

Summary

Świeżo wycięte ludzkie nowotwory raka piersi są charakteryzowane za pomocą terahercowej spektroskopii i obrazowania zgodnie z protokołami postępowania z nowymi tkankami. Pozycjonowanie tkanek jest brane pod uwagę, aby umożliwić skuteczną charakterystykę przy jednoczesnym zapewnieniu analizy w odpowiednim czasie dla przyszłych zastosowań śródoperacyjnych.

Abstract

Ten manuskrypt przedstawia protokół postępowania, charakteryzowania i obrazowania świeżo wyciętych ludzkich guzów piersi za pomocą pulsacyjnego obrazowania terahercowego i technik spektroskopii. Protokół obejmuje tryb transmisji terahercowej przy normalnym padaniu i tryb odbicia terahercowego pod kątem 30°. Zebrane dane doświadczalne reprezentują impulsy pola elektrycznego w dziedzinie czasu. Sygnał terahercowego pola elektrycznego przesyłany przez stały punkt na wycinanej tkance jest przetwarzany za pomocą modelu analitycznego w celu wyodrębnienia współczynnika załamania światła i współczynnika absorpcji tkanki. Wykorzystując skaner silnika krokowego, emitowany impuls terahercowy jest odbijany od każdego piksela guza, zapewniając płaski obraz różnych obszarów tkanki. Obraz może być prezentowany w dziedzinie czasu lub częstotliwości. Ponadto wyodrębnione dane dotyczące indeksu załamania światła i współczynnika absorpcji w każdym pikselu są wykorzystywane do zapewnienia tomograficznego terahercowego obrazu guza. Protokół wykazuje wyraźne rozróżnienie między tkankami nowotworowymi i zdrowymi. Z drugiej strony, nieprzestrzeganie protokołu może skutkować zaszumionymi lub niedokładnymi obrazami ze względu na obecność pęcherzyków powietrza i resztek płynu na powierzchni guza. Protokół zawiera metodę oceny marginesów chirurgicznych guzów piersi.

Introduction

Terahercowe (THz) obrazowanie i spektroskopia były szybko rozwijającym się obszarem badań w ciągu ostatniej dekady. Ciągły rozwój bardziej wydajnych i spójnych emiterów THz w zakresie 0,1–4 THz sprawił, że ich zastosowania znacznie wzrosły¹. Jednym z obszarów, w którym THz okazał się obiecujący i znacznie się rozwinął, jest dziedzina biomedyczna². Wykazano, że promieniowanie THz jest niejonizujące i biologicznie bezpieczne na poziomach mocy powszechnie stosowanych do analizy tkanek utrwalonych³. W rezultacie, obrazowanie i spektroskopia THz zostały wykorzystane do klasyfikacji i różnicowania różnych cech tkanek, takich jak zawartość wody w celu wskazania uszkodzenia oparzenia i gojenia⁴, marskość wątroby⁵ i rak w wyciętych tkankach6^,7. Ocena nowotworów w szczególności obejmuje szeroki zakres potencjalnych zastosowań klinicznych i chirurgicznych i została zbadana pod kątem nowotworów mózgu⁸, liver⁹, ovaries¹⁰, gastrointestinal tract¹¹, and breast7^{,12,13,14,15,16,17,18,19}.

THz aplikacje na raka piersi koncentrują się głównie na wspieraniu operacji oszczędzającej pierś, czyli lumpektomii, poprzez ocenę marginesu. Celem lumpektomii jest usunięcie guza i niewielkiej warstwy otaczającej zdrowej tkanki, w przeciwieństwie do pełnej mastektomii, która usuwa całą pierś. Margines chirurgiczny wyciętej tkanki jest następnie oceniany za pomocą patologii po utrwaleniu próbki w formalinie, pocięciu, zatopieniu w parafinie i umieszczeniu w plasterkach 4 μm–5 μm na szkiełkach mikroskopowych. Proces ten może być czasochłonny i wymaga wtórnego zabiegu chirurgicznego w późniejszym czasie, jeśli zaobserwuje się dodatni margines²⁰. Aktualne wytyczne Amerykańskiego Towarzystwa Radioterapii Onkologicznej definiują ten dodatni margines jako kontakt komórek rakowych z marginesem na powierzchni ink²¹. Obrazowanie THz w przypadku uwodnionych tkanek o wysokiej absorpcji ogranicza się przede wszystkim do obrazowania powierzchni z pewną różną penetracją w zależności od typu tkanki, co jest wystarczające do zaspokojenia potrzeb chirurgicznych w zakresie szybkiej oceny marginesu. Szybka analiza warunków marginesu podczas zabiegu chirurgicznego znacznie obniżyłaby koszty operacji i wskaźnik zabiegów kontrolnych. Do tej pory THz okazał się skuteczny w różnicowaniu między rakiem a zdrową tkanką w tkankach utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE), ale potrzebne są dodatkowe badania, aby zapewnić wiarygodne wykrywanie raka w świeżo wyciętych tkankach⁷.

Ten protokół szczegółowo opisuje etapy wykonywania obrazowania i spektroskopii THz na świeżo wyciętych próbkach tkanek ludzkich uzyskanych z biobanku. Aplikacje THz zbudowane na świeżo wyciętych tkankach ludzkiego raka piersi rzadko były używane w opublikowanych badaniach^7,18,22,23, zwłaszcza przez grupy badawcze niezintegrowane ze szpitalem. Użycie świeżo wyciętych tkanek jest również rzadkie w przypadku innych zastosowań związanych z rakiem, przy czym większość przykładów raka jelita grubego niezwiązanego z rakiem piersi jest zgłaszana w przypadku raka okrężnicy^24,25. Jednym z powodów takiego stanu rzeczy jest to, że bloki tkankowe FFPE są znacznie łatwiej dostępne i łatwiejsze w obsłudze niż świeżo wycięte tkanki, chyba że system THz używany w badaniu jest częścią chirurgicznego przepływu pracy. Podobnie, większość komercyjnych laboratoryjnych systemów THz nie jest przygotowana do pracy ze świeżymi tkankami, a te, które to robią, są nadal na etapie wykorzystania wzrostu linii komórkowych lub dopiero zaczęły przyglądać się tkankom wyciętym z modeli zwierzęcych. Zastosowanie THz w warunkach śródoperacyjnych wymaga wcześniejszego opracowania etapów obrazowania i charakterystyki dla świeżej tkanki, tak aby analiza nie kolidowała ze zdolnością do wykonania standardowej patologii. W przypadku zastosowań, które z natury nie są przeznaczone do zastosowań śródoperacyjnych, charakterystyka świeżej tkanki jest nadal trudnym krokiem, który należy wykonać, aby pracować nad zastosowaniami in vivo i różnicowaniem.

Celem tej pracy jest dostarczenie wytycznych do stosowania THz dla świeżo wyciętych tkanek przy użyciu komercyjnego systemu THz. Protokół został opracowany w systemie obrazowania i spektroskopii THz²⁶ dla mysich guzów raka piersi^13,17,19 i został rozszerzony na ludzką tkankę chirurgiczną uzyskaną z biobanks^7,18. Chociaż protokół został opracowany dla raka piersi, te same koncepcje można zastosować do podobnych systemów obrazowania THz i innych typów nowotworów litych, które są leczone chirurgicznie, gdzie sukces zależy od oceny marginesu²⁷. Ze względu na stosunkowo niewielką liczbę opublikowanych wyników THz na świeżo wyciętych tkankach, jest to pierwsza praca, o której wiedzą autorzy, która koncentruje się na protokole postępowania ze świeżymi tkankami w celu obrazowania i charakterystyki THz.

Protocol

Ten protokół spełnia wszystkie wymagania określone przez Departament Zdrowia i Bezpieczeństwa Środowiskowego Uniwersytetu Arkansas.

1. Ustawianie obszaru obsługi tkanek

1. Weź metalową tacę ze stali nierdzewnej i przykryj ją torbą na zagrożenie biologiczne, jak pokazano na Rysunek 1. Wszelkie czynności związane z tkankami biologicznymi będą wykonywane w obszarze tacki (tj. w obszarze postępowania z tkankami).
2. Przygotuj pęsetę laboratoryjną, chusteczki higieniczne, ręczniki papierowe, opakowanie bibuły filtracyjnej, butelki z barwnikiem do bibułek, butelkę z wybielaczem i butelkę etanolu wokół tacy, aby mieć do niej łatwy dostęp w razie potrzeby. Wszelkie zużyte chusteczki higieniczne, chusteczki i rękawiczki należy przechowywać na powierzchni materiału stanowiącego zagrożenie biologiczne w celu wyrzucenia po zakończeniu protokołu.
3. Napełnij probówkę wirówkową o pojemności 50 ml do 45 ml 10% neutralnego buforowanego formaliny i umieść ją na tacy do przechowywania wirówki w pobliżu tacki do przenoszenia chusteczek.

Rysunek 1: Konfiguracja obszaru obsługi tkanek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Postępowanie ze świeżym nowotworem raka piersi w spektroskopii transmisyjnej THz

UWAGA: Zanim zaczniesz dotykać jakichkolwiek żywych tkanek, załóż nitrylowe rękawice, okulary ochronne, maskę na twarz i fartuch laboratoryjny. Zawsze używaj pęsety laboratoryjnej do dotykania chusteczek i unikaj dotykania ich bezpośrednio rękami. Wszystkie prace ze świeżą tkanką poza szczelnie zamkniętym pojemnikiem lub etapem skanowania powinny być wykonywane w obszarze obchodzenia się z tkankami określonym w kroku 1.1.

UWAGA: Wszystkie tkanki użyte w tej pracy zostały wysłane w pożywce Modified Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco i roztworze antybiotyku z biobanku.

1. Usuń masowy guz z roztworu DMEM i umieść go na szalce Petriego w obszarze obsługi tkanek (patrz Rysunek 2A).
2. Na podstawie ogólnych oględzin zidentyfikuj wyraźne obszary guza, z których należy pokroić małe kawałki w celu scharakteryzowania transmisji. Wytnij segment guza o grubości 0,5 mm ze zidentyfikowanych punktów za pomocą niskoprofilowego ostrza ze stali nierdzewnej, jak pokazano na Rysunek 2B. Umieść ten pokrojony fragment między dwoma oknami kwarcowymi z przekładką o grubości 0,1 mm w uchwycie na próbkę cieczy, jak pokazano na Rysunek 2C.

Rysunek 2: Cięcie guza do pomiarów spektroskopii transmisyjnej THz. (A) Zdjęcie guza masowego. (B) Fotografia małych odcinków (0,5 mm) guza wyciętego z guza masywnego. (C) Pokrojony w plasterki wycinek guza umieszczony w uchwycie na ciekłą próbkę między dwoma okienkami kwarcowymi z 0,1 mm przekładką z politetrafluoroetylenu do pomiaru spektroskopiowego. Rysunek przedrukowany za T. Bowman et al.¹⁸ za zgodą SPIE. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Pomiary spektroskopii transmisyjnej THz

1. Ustaw moduł spektroskopii transmisyjnej w komorze rdzenia THz, wyrównując uchwyty modułu nad słupkami montażowymi w systemie rdzenia i wsuwając stolik w dół do systemu. Dokręć dwie mocujące w prawym górnym i lewym dolnym rogu modułu, jak pokazano na Rysunek 3A.
2. Podczas całej procedury spektroskopii należy przepłukać system suchym azotem gazowym o natężeniu 5 l/min (l/min) w celu usunięcia pary wodnej z przestrzeni próbki.
3. Otwórz oprogramowanie pomiarowe spektroskopii transmisyjnej THz z pulpitu podłączonego do systemu THz. Otworzy się okno główne.
4. Kliknij kartę Skanowanie w górnej części okna. Pojawi się okno Spectra Scan Setup (Ustawienia programu Spectra Scan). Z menu rozwijanego zakładki Measurement Mode (Tryb pomiaru) w prawym górnym rogu okna wybierz opcję Transmission (Transmisja), aby skonfigurować spektroskopię transmisyjną. Jeśli szczyt nie jest automatycznie widoczny, zaznacz opcję Włącz na karcie Ręczne wyszukiwanie pików i ręcznie zwiększ opóźnienie optyczne, aby wyświetlić szczyt.
5. Po 30 minutach przedmuchiwania nagraj sygnał odniesienia powietrza, wykonując poniższe czynności.
   1. Na karcie Scan Settings (Ustawienia skanowania) w oknie ustawień skanowania spectra wprowadź odpowiednią nazwę pliku referencyjnego, ustaw Num Scans na 1,800 i ustaw Opóźnienie rozpoczęcia (s) na 0. Pozostaw inne ustawienia jako wartości domyślne.
   2. Kliknij Measure Reference (Odniesienie do pomiaru) w oknie ustawień skanowania, aby wykonać pomiar referencyjny powietrza. Następnie kliknij Zmierz próbkę, aby zmierzyć sygnał transmisji drogą powietrzną jako próbkę średnio 1,800 sygnałów w ciągu ~1 minuty.

Rysunek 3: Konfiguracja modułu spektroskopii transmisyjnej THz. (A) Komora rdzenia THz z zamontowanym na niej modułem transmisyjnym. (B) Fotografia uchwytu na próbkę cieczy. (C) Uchwyt na próbkę umieszczony w komorze rdzeniowej do pomiarów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Zmierz dwa okienka kwarcowe w uchwycie na próbkę cieczy, jak pokazano na Rysunek 3B.
   1. Umieść dwa okienka kwarcowe w uchwycie na ciecz bez przekładki pomiędzy nimi.
   2. Otwórz komorę rdzenia THz. Zamontuj uchwyt próbki cieczy na module spektroskopii transmisyjnej, jak pokazano na Rysunek 3C. Zamknij komorę.
   3. Kliknij kartę Skanowanie w oknie głównym. Powtórz kroki 3.5.1–3.5.2 dla próbki kwarcu, ale zaktualizuj opóźnienie rozpoczęcia (s) do 900. Daje to czas na usunięcie pary wodnej przed pomiarem.
   4. Jeśli kwarc jest pożądany jako odniesienie dla dodatkowych próbek, kliknij kartę Wyczyść odniesienie w ustawieniach skanowania. Spowoduje to usunięcie odniesienia do powietrza. Następnie kliknij kartę Odniesienie do pomiaru, aby zapisać pomiary kwarcu jako nowe odniesienie.
7. Umieść pokrojony fragment guza między dwoma okienkami kwarcowymi wewnątrz uchwytu na próbkę cieczy i umieść uchwyt w komorze w celu jednopunktowego pomiaru transmisji tkanki. Aby zarejestrować pomiar, powtórz krok 3.6.3.
8. Po zakończeniu pomiarów wyjąć uchwyt na płynną próbkę z komory i przenieść go do miejsca przeznaczonego do obchodzenia się z tkankami. Zdemontuj uchwyt na płynną próbkę, wytrzyj część guza z okien kwarcowych chusteczkami do tkanek i umieść zużyte chusteczki higieniczne na tej samej tacy, aby wyrzucić je do torby na wypadek zagrożenia biologicznego wraz z innymi odpadami stanowiącymi zagrożenie biologiczne.
9. W razie potrzeby powtórz kroki 2.2, 3.7 i 3.8, aby scharakteryzować dodatkowe plastry guza. Po zakończeniu pomiarów przejdź do okna głównego i kliknij zakładkę Plik, aby zapisać dane pomiarowe. Zamknij okno oprogramowania.

4. Postępowanie ze świeżym guzem raka piersi w obrazowaniu w trybie odbicia THz

1. Usuń świeżą próbkę guza z roztworu DMEM i antybiotyków i umieść ją na szalce Petriego. Korzystając z oględzin ogólnych, wybierz stronę guza do obrazowania, która jest wystarczająco płaska i ma mało krwi i niewiele naczyń krwionośnych. Jeśli to możliwe, unikaj obrazowania tkanek z krwią lub naczyniami krwionośnymi.
2. Umieść guz stroną, która ma być obrazowana, na bibule filtracyjnej stopnia 1, aby wysuszyć nadmiar DMEM i oczyścić tkankę z płynu lub wydzielin z guza, jak pokazano na Rysunek 4A. Umieść guz na bibule filtracyjnej w suchym miejscu, gdy bibuła się nasyca. Suszyć guz przez ~5 min.

Rycina 4: Przygotowanie świeżej próbki guza do obrazowania THz. (A) Guz umieszczony na bibule filtracyjnej do wyschnięcia. (B) Guz umieszczony na płytce polistyrenowej nad okienkiem obrazowania z podkładkami do wycierania tkanek w celu wchłonięcia nadmiaru płynów. (C) Guz oglądany od dołu w celu śledzenia orientacji i sprawdzenia, czy nie ma pęcherzyków powietrza. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Odmontuj moduł spektroskopii transmisyjnej i ustaw podstawę lustra modułu obrazowania odbiciowego (RIM) na systemie rdzenia THz, jak pokazano na Rysunek 5A. Po ustawieniu lusterek zamontuj stolik skanujący RIM nad podstawą lustra i przykręć go do systemu głównego (patrz Rysunek 5B).
4. Przed procedurą obrazowania należy przepłukać system suchym azotem gazowym o stężeniu 5 l/min przez 30 minut w celu usunięcia pary wodnej z komory próbki. Po 30 minutach zmniejsz ilość suchego azotu gazowego do 3 l/min na pozostałą część czasu użytkowania systemu.
5. Umieść płytkę styropianową o grubości ~1,2 mm na okienku skanowania o średnicy ~37 mm. Wyśrodkuj okienko skanowania wraz z płytką polistyrenową na stoliku na próbkę.

Rysunek 5: Konfiguracja systemu do obrazowania odbicia. (A) Podstawa lustra modułu obrazowania odbicia. (B) Etap skanowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

UWAGA: Inne grubości i materiały płyt są odpowiednie dla kroku 4.5, ale powinny mieć jednolitą grubość i być na tyle mało chłonne, aby nie zakłócać sygnału THz.

6. Otwórz oprogramowanie do pomiaru odbicia THz z pulpitu podłączonego do systemu THz. Pojawi się okno z kilkoma ikonami okien dialogowych dla określonych funkcji i dwoma podoknami dla wykresów pól THz (dowolne jednostki a.u.) odpowiednio w odniesieniu do czasu i częstotliwości.
7. Aby ustawić parametry konfiguracji RIM, kliknij ikonę okna dialogowego Image Parameter (Okno dialogowe parametrów obrazu) w górnej części okna. Pojawi się okno Parametry akwizycji obrazu. Wybierz RIM z menu rozwijanego na karcie Szablon do konfiguracji obrazowania odbicia. Naciśnij OK i wróć do głównego okna oprogramowania.
8. W oknie głównym kliknij ikonę Skanowanie punktu stałego. Spowoduje to aktywację anten THz, aby rozpocząć wysyłanie padającego sygnału THz i odbieranie odbitego sygnału THz z jednego punktu na płycie styropianowej.
9. Kliknij ikonę Motor Stage Dialog w górnej części okna głównego. Otworzy się okno sterowania silnikiem. Dostosuj oś opóźnienia optycznego, klikając strzałki kierunku do przodu/do tyłu, aby wyśrodkować odbity impuls od polistyrenu w oknie głównym.
   nuta: Po wyregulowaniu osi opóźnienia optycznego, na okienku powinny pojawić się dwa impulsy, jak pokazano na rysunku Rysunek 6: jeden z dolnego interfejsu płyty styropianowej (odbicie pierwotne) i jeden z górnego interfejsu płyty styropianowej (odbicie wtórne).
10. Odsuń pierwotne odbicie od płytki polistyrenowej i utrzymuj wtórne odbicie w okienku, co przyczyni się do odbić od tkanki podczas procedury obrazowania. Odbywa się to w dwóch krokach.
    1. Najpierw kliknij przycisk Ustawienia DAQ w górnej części okna głównego, aby otworzyć okno dialogowe Ustawienia DAQ. Zmień wartość opóźnienia optycznego z 5 V (domyślnie) na 4 V.
    2. Po drugie, dostosuj pionowe położenie stolika skanującego za pomocą skali mikrometrycznej na stoliku skanującym, aż minima impulsu wtórnego będą najsilniejsze. Dostosuj opóźnienie optyczne osi w oknie sterowania silnikiem, aby umieścić pierwotne odbicie poza zakresem mierzonego odbitego sygnału.
       nuta: W przypadku płyty polistyrenowej o grubości 1,2 mm odbicie pierwotne jest wygaszane, gdy minimalny pik odbicia wtórnego wynosi około -0,3 mm na osi opóźnienia optycznego okna w dziedzinie czasu.

Rysunek 6: Odbicia THz od dolnego i górnego interfejsu płyty polistyrenowej. (A) Sygnał THz padający i odbity od płyty polistyrenowej o grubości 1,2 mm. (B) Zmierzone pierwotne i wtórne sygnały w dziedzinie czasu THz z polistyrenu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

11. Wypoziomować stolik na próbkę i zapisać sygnał odniesienia.
    1. Wybierz dwa punkty na każdej osi (oś A i oś B), które oznaczają lokalizacje na płycie styropianowej w pobliżu krawędzi okna próbki. Na przykład dla osi A w zakresie od -15 mm do 15 mm dwa punkty położenia mogą mieć wartości -10 mm i 10 mm; a dla osi B w zakresie od -15 mm do 15 mm dwa punkty położenia mogą wynosić -10 mm i 10 mm.
    2. Kliknij przycisk Okno dialogowe sterowania silnikiem, aby otworzyć okno sterowania silnikiem. Zmień położenie okna sterowania silnikiem i głównego okna oprogramowania tak, aby sygnał w dziedzinie czasu był widoczny podczas regulacji pozycji silnika. Ustaw zarówno oś A, jak i oś B na 0 mm.
    3. Wypoziomuj oś A, wykonując następujące czynności. Jako przykład podano zakres od -10 mm do 10 mm.
    4. W oknie sterowania silnikiem zmień wartość osi A z 0 na -10 i naciśnij Enter. Stolik przesuwa się do pozycji -10 mm na osi A i obserwuje się przesunięcie pozycji sygnału w oknie głównym.
    5. Użyj regulowanej skali mikrometrycznej na stoliku skanowania pokazanym w Rysunek 5B, aby przesunąć minimalny szczyt sygnału z powrotem do pozycji ustawionej w kroku 4.10.2.
    6. Zmień wartość osi A na +10 i naciśnij Enter. Stolik przesunie się teraz z pozycji -10 mm do pozycji +10 mm na osi A i ponownie zaobserwowane zostanie przesunięcie sygnału. Zanotuj kierunek i odległość, na jaką sygnał przesunął się z poprzedniego położenia, a następnie ponownie zmień wartość osi A na -10. Sygnał powróci do pozycji ustawionej w kroku 4.11.5.
    7. Obróć poziomującą na osi A stolika skanującego, jak pokazano na Rysunek 5B, i przesuń sygnał, aby podwoić odległość w tym samym kierunku, w którym przesunął się z pierwotnej pozycji. Użyj mikrometru na stoliku skanującym, aby przesunąć sygnał z powrotem do pierwotnej pozycji (-0.3 mm dla 1.2 mm polistyrenu).
    8. Powtarzaj kroki 4.11.6–4.11.7, aż sygnał na +10 i -10 będzie równy, a pik dla obu pozycji zostanie skupiony w pierwotnym położeniu (-0,3 mm na osi optycznej).
12. Po wypoziomowaniu osi A zmień wartość osi A na 0 i powtórz tę samą procedurę dla osi B. Zacznij od zmiany wartości osi B w oknie sterowania silnikiem z 0 na najbardziej dodatnią wartość (na przykład +10 mm). Również podczas poziomowania użyj poziomującej na osi B stolika skanującego, która jest pokazana na Rysunek 5B.
13. Po wypoziomowaniu obu osi przywróć zarówno oś A, jak i oś B do 0 mm. Zamknij okno sterowania silnikiem i sprawdź, czy sygnał jest w swoim pierwotnym położeniu na wypadek, gdyby został nieco przesunięty.
14. Zapisz ten sygnał jako odniesienie.
    1. Przejdź do okna Ustawianie właściwości języka DAQ. Zmień wartość uśrednienia na 5 i zachowaj wszystkie inne parametry jako domyślne.
    2. Kliknij Nowy odnośnik. Licznik uśredniania w prawym górnym rogu okna będzie liczył od 0 do 20. Gdy licznik osiągnie wartość 20, zmień wartość uśredniania na 1 i kliknij przycisk OK. Odbity sygnał od polistyrenu zostanie zapisany jako odniesienie dla wszelkich późniejszych skanów.
       UWAGA: Jeśli konieczne jest wykonanie tylko procedury obrazowania THz, najlepiej jest wykonać kroki 4.3–4.14 przed wyjęciem tkanki nowotworowej z roztworu DMEM.
15. Zamontuj guz na płytce polistyrenowej zakrywającej okienko etapu skanowania.
    1. Usuń okienko obrazowania ze etapu skanowania i przenieś je do obszaru obsługi tkanki. Umieść guz na płytce polistyrenowej, jak pokazano na Rysunek 4B.
    2. Upewnij się, że między płytką a guzem nie ma znaczących pęcherzyków powietrza. Jeśli zaobserwuje się pęcherzyki powietrza, dociśnij guz pęsetą lub podnieś guz i delikatnie zwiń go na polistyren, aż szczeliny powietrzne zostaną zminimalizowane.
    3. Umieść absorpcyjne przekładki w regularnych odstępach wokół badanej próbki, jak pokazano na Rysunek 4B. Umieść kolejną płytkę polistyrenową nad guzem i delikatnie dociśnij, aby powierzchnia guza była jak najbardziej płaska. Przyklej taśmą ten układ polistyren-guz-polistyren na okienku próbki.
16. Odwróć okno próbki, jak pokazano na rysunku Rysunek 4C, i zrób zdjęcia guza, aby zachować zapis jego orientacji. Przywróć okienko próbki z guzem do etapu skanowania.
17. Kliknij przycisk Okno dialogowe Parametry obrazu, aby otworzyć okno Parametry akwizycji obrazu. Ustaw wartości Axis1min, Axis1max, Axis2min i Axis2max, aby w pełni objąć położenie guza w oknie obrazowania
    UWAGA: Domyślnie oś1 jest osią A, a Oś2 jest osią B.
18. Ustaw Axis1step i Axis2step na 0,2 mm dla skanowania obrazowego.
    UWAGA: Ustawienie Axis1step i Axis2step spowoduje ustawienie rozmiaru kroku silników krokowych na przyrosty 200 μm podczas procesu skanowania. Całkowity czas skanowania można oszacować w oknie Image Acquisition Parameters (Parametry akwizycji obrazu).
19. Kliknij zakładkę Pomiar w oknie głównym i wybierz opcję Flyback 2D Scan. W oknie, które się pojawi, wskaż katalog i nazwę pliku, w którym chcesz zapisać dane skanowania.

5. Obróbka końcowa świeżej tkanki w ramach przygotowań do zabiegu histopatologicznego

1. Po zakończeniu procesu skanowania należy wyjąć okienko z próbką, płytki styropianowe oraz próbkę z rdzenia systemu THz i przenieść je do obszaru przeznaczonego dla odpadów niebezpiecznych. Usuń guz z płytki styropianowej i umieść go na płaskim kawałku tektury o rozmiarze porównywalnym do rozmiaru guza. Upewnij się, że orientacja guza jest taka sama, jak na polistyrenie, z powierzchnią obrazowania dotykającą kartonu.
2. Zanurz bawełniany wacik w czerwonym barwniku tkankowym i zabarwij lewą stronę guza aż do miejsca, w którym krawędź guza styka się z kartonem. Podobnie zabarwić prawą stronę guza niebieskim barwnikiem tkankowym. Zabarwić odsłoniętą powierzchnię guza linią żółtego barwnika tkankowego łączącą czerwoną plamę z niebieską plamą, aby oznaczyć tył próbki, jak pokazano na Rysunek 7A.
   nuta: Aby zapobiec zabrudzeniu roztworu formaliny przez atrament, nałóż tylko cienką warstwę na tkankę. Można to osiągnąć, przecierając bawełniany wacik na innej powierzchni przed zabarwieniem tkanki lub używając czystego bawełnianego wacika do wytarcia nadmiaru barwnika. Nie dopuszczaj do kontaktu barwnika ze skórą lub ubraniem. Ten proces barwienia guza jest przeprowadzany jako odniesienie w celu dostarczenia patologowi informacji o stronie obrazowania guza i jego orientacji.

Rycina 7: Przetwarzanie końcowe guza po obrazowaniu THz. (A) Guz umieszczony twarzą do dołu na tekturowym uchwycie i ufarbowany barwnikiem do znakowania tkanek. (B) Bibuła filtracyjna umieszczona na guzie i zaklejona taśmą, aby utrzymać kontakt. (C) Barwiony guz utrwalony na tekturze zanurzony w 10% obojętnym buforowanym roztworze formaliny i uszczelniony parafilmem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Pozostaw tusz do wyschnięcia na około 3–4 minuty. Wytnij kawałek bibuły filtracyjnej o takich samych przybliżonych wymiarach jak karton. Umieść go na guzie i owiń kawałek taśmy całkowicie wokół bibuły filtracyjnej i kartonu, jak pokazano na Rysunek 7B. Taśma i bibuła filtracyjna powinny zabezpieczyć guz przy kartonie bez wywierania znaczącego nacisku.
4. Zanurz poplamioną tkankę przyklejoną do kartonu w 10% neutralnym roztworze formaliny i zamknij probówkę wirówkową za pomocą folii parafinowej, jak pokazano na Rysunek 7C. Oznacz numer próbki, datę, typ tkanki i numer guza dla próbki na etykiecie probówki. Wyślij guz do patologa w celu dalszego przetwarzania histopatologicznego.

6. Utylizacja odpadów niebezpiecznych

1. Zbierz wszystkie odpady z tacki do przenoszenia chusteczek wraz z workiem na zagrożenia biologiczne używanym do przykrycia tacki i umieść je w nowym worku na zagrożenia biologicznego, jak pokazano na Rysunek 8. Przynieś worek do wyznaczonego obszaru odpadów niebezpiecznych biologicznie w budynku i umów się na spotkanie z działem BHP (EH&S) w celu odbioru odpadów. Wyczyść tacę do przenoszenia chusteczek higienicznych i otoczenie na stole za pomocą 10% roztworu wybielacza i etanolu.

Rysunek 8: Zdjęcie worka na odpady niebezpieczne biologicznie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Weź uchwyt na płynną próbkę z przekładkami i okienkami kwarcowymi, okienko do pobierania próbek, na którym zamontowano guz, płytki styropianowe i pęsetę laboratoryjną do obszaru mycia. Spłucz wszystkie materiały wodą, a następnie 10% roztworem wybielacza, wycierając w razie potrzeby ręcznikami papierowymi, aby usunąć resztki tkanek. Ponownie spłucz wodą, wyszoruj roztworem alconoxu i dokładnie spłucz. W przypadku szkła i wyrobów z tworzyw sztucznych opłucz w 70% alkoholu izopropylowym i odstaw do wyschnięcia.
   nuta: Gdy guz znajduje się w formalinie, a przestrzeń próbki jest czysta, przetwarzanie danych może odbywać się w tym samym czasie, co obrazowanie lub w późniejszym czasie.

7. Przetwarzanie danych w celu konstruowania obrazów THz

1. Eksportuj zapisane pliki danych .tvl z systemu THz. Pliki danych surowych uzyskane z systemu są napisane w Pythonie i najlepiej odczytać je w Pythonie przed zapisaniem jako pliki danych MATLAB.
2. Aby skonstruować obraz THz zeskanowanej świeżej tkanki, przekształć surowe dane obrazowania odbicia w dziedzinie czasu na dziedzinę częstotliwości za pomocą transformaty Fouriera na trzecim wymiarze macierzy surowych danych (tj. wymiarze czasu). Weźmy również transformację Fouriera danych referencyjnych.
   nuta: Typowe widmo w dziedzinie częstotliwości powinno dostarczać danych w zakresie od 0,1 THz do 4 THz.
3. Znormalizuj dane próbki z danymi referencyjnymi i wykonaj widma mocy w oparciu o całkowanie znormalizowanych danych w zakresie częstotliwości od f₁ = 0,5 THz do f₂ = 1,0 THz, używając następującego równania¹⁹:
   
   nuta: Tutaj _próbka E jest danymi obrazowania odbicia w dziedzinie częstotliwości próbki tkanki, a _odniesienie E jest dziedziną częstotliwości danych odbicia pojedynczego punktu sygnału odniesienia.
4. Skonstruuj dwuwymiarowy obraz, wykreślając obliczone dane widm mocy w każdym punkcie macierzy zdefiniowanej przez oś A i oś B. Jest to znane jako widmo mocy THz image.
   nuta: Metoda uzyskiwania tomograficznego obrazu THz jest szczegółowo opisana w krokach 7.5–7.7.
5. W celu scharakteryzowania należy obliczyć teoretyczne odbicie zależne od częstotliwości dla zakresu potencjalnych właściwości tkanki, korzystając z następującego równania¹⁸:
   
   UWAGA: Tutaj ρ_T,ij jest zespolonym współczynnikiem odbicia Fresnela między regionem i a regionem j; d_j jest grubością obszaru j, a θ_j jest kątem rozchodzenia się w obszarze j związanym z kątem padania według prawa Snella. to zespolony współczynnik propagacji w obszarze j, gdzie ω to częstotliwość kątowa, c to prędkość światła w próżni, n_j to rzeczywista część współczynnika załamania światła, a α_abs,j to współczynnik absorpcji18. Region 1 to powietrze, region 2 to płyta polistyrenowa, a region 3 to tkanka.
6. Oblicz odbicie w równaniu (2) dla zakresu zdefiniowanych przez użytkownika współczynników załamania światła i współczynników absorpcji dla regionu 3 (n₃ i α_abs,3) i porównaj z sygnałem zmierzonym w każdym punkcie, aby obliczyć łączny błąd średniokwadratowy dla wielkości i fazy.
   nuta: Rozwiązaniem dla indeksu refrakcji i współczynnika absorpcji jest para wartości, które dają najmniejszy błąd.
7. Skonstruuj tomograficzny obraz THz z wyodrębnionych danych o współczynniku załamania światła i współczynniku absorpcji (n₃ i α_abs,3) dla każdego piksela. Przeanalizuj obszary guza, porównując z obrazem szkiełka patologicznego uzyskanym od patologa. Reprezentatywne wyniki przedstawiono w Rysunek 9, z przykładami niewystarczającego przestrzegania protokołu w Rysunek 10 i Rysunek 11.

8. Ekstrakcja właściwości elektrycznych tkanki za pomocą danych ze spektroskopii transmisyjnej

1. W oknie głównym oprogramowania pomiarowego spektroskopii transmisyjnej THz przejdź do zakładki Plik i kliknij opcję Eksportuj. Pojawi się okno, w którym można wybrać typ danych i próbkę do wyeksportowania. Wybierz typy danych Transmitancja i Faza transmitancji dla pomiarów próbek kwarcu i tkanek.
2. Oblicz teoretyczną transmisję zależną od częstotliwości dla zakresu potencjalnych właściwości tkanki, korzystając z następującego równania¹⁵:
   
   nuta: Tutaj jest stosunkiem między współczynnikami transmisji Fresnela dla konfiguracji próbki i odniesienia; γ₁ i γ₃ są zespolonymi stałymi propagacji odpowiednio powietrza i tkanki; a d to grubość tkanki. Ogólna stała propagacji jest zdefiniowana jako . ñ jest zespolonym współczynnikiem załamania światła zdefiniowanym jako , gdzie n jest rzeczywistą częścią współczynnika załamania światła; c jest prędkością światła; ω jest częstotliwością kątową; a α_abs to współczynnik absorpcji15.
3. Obliczyć łączny błąd średniokwadratowy między wielkością a fazą przekładni w równaniu (3) a danymi pomiarowymi z układu dla zakresu zdefiniowanych przez użytkownika wartości n i α_abs.
   nuta: Rozwiązaniem dla indeksu refrakcji i współczynnika absorpcji jest para wartości, które dają najmniejszy błąd.
4. Wykreśl wyodrębnione dane dotyczące indeksu refrakcji i współczynnika absorpcji w odniesieniu do zakresu częstotliwości od 0,15 do 3,5 THz. Reprezentatywne wyniki przedstawiono na rysunku Rysunek 12.

Results

Wyniki obrazowania THz¹⁸ uzyskane zgodnie z wyżej wymienionym protokołem próbki ludzkiego nowotworu raka piersi #ND14139 otrzymanej z biobanku są przedstawione w Rysunek 9. Zgodnie z raportem patologicznym, #ND14139 guz był naciekającym rakiem przewodowym I/II stopnia (IDC) uzyskanym od 49-letniej kobiety w wyniku operacji lumpektomii lewej piersi. Zdjęcie guza jest pokazane na Rysunek 9A, obraz patologii na Rysunek 9B, a obraz widm mo...

Discussion

Skuteczne obrazowanie odbiciowe THz świeżej tkanki zależy przede wszystkim od dwóch krytycznych aspektów: 1) właściwego uwzględnienia obchodzenia się z tkankami (sekcje 2 i 4.15); oraz 2) ustawienie sceny (przede wszystkim sekcja 4.11). Niewystarczające wysuszenie tkanki może skutkować zwiększonym odbiciem i niezdolnością do wizualizacji regionów z powodu wysokich odbić DMEM i innych płynów. Tymczasem słaby kontakt tkanki z okienkiem obrazowania tworzy pierścienie lub plamy o niskim współczynniku odbicia na obrazie odbic...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% alkoholu izopropylowego	VWR	89108-162	Zawiera 70% izopropanolu klasy USP i 30% wody dejonizowanej klasy USP
Detergent w proszku Alconox	VWR	21835-032	Skoncentrowany detergent do usuwania zanieczyszczeń organicznych ze szkła, metalu, stali nierdzewnej, porcelany, ceramiki, plastiku, gumy i włókna szklanego
Worki Bio Hazard	Fisher Scientific	19-033-712	Zatwierdzone przez Justrite FM worki zastępcze na odpady biologiczne
Uchwyt kartonowy	NIE	DOTYCZY	Odpad kartonowy do utrzymania nienaruszonej powierzchni obrazowania tkanek po zanurzeniu w formalinie
Probówki wirówkowe	VWR	10026-078	Probówki wirówkowe z płaskimi nakrętkami, ze stożkowym dnem, polipropylenowe, sterylne, waciki bawełniane z linii standardowej
	Walmart	551398298	Q-tips Oryginalne waciki bawełniane używane do barwienia Tkanka
Alkohol etylowy	VWR	71002-426	KOPTECH Czysty (niedenaturowany) bezwodny (200 proof/100%) alkohol etylowy
Gogle ochronne	VWR	89130-918	Profesjonalne okulary ochronne Kimberly-clark Maska
twarz Maski	VWR	95041-774	DUKAL Corporation
Bibuła filtracyjna	Sigma Aldrich	Z240087	Whatman klasy 1
Roztwór formaliny	Sigma Aldrich	HT501128-4L	10% neutralna buforowana formalina
Świeżo wycięte nowotwory ludzkie (Infiltracyjny rak przewodowy (IDC)))	National Disease Research Interchange (NDRI biobank	N/A	Protokół jest podpisany z NDRI dla wymaganego typu nowotworów
Roztwór wybielacza IRADECON	VWR	89234-816	Wstępnie rozcieńczony roztwór wybielacza podchlorynu sodu
Chusteczki KIMTECH SCIENCE	VWR	21905-026	Kimberly-clark professional Kim chusteczki
Płaszcz laboratoryjny	VWR	10141-342	Ten numer katalogowy dotyczy średniej wielkości sierści
Pęseta laboratoryjna/kleszczyki	VWR	82027-388	Można użyć dowolnej pęsety laboratoryjnej, o ile nie uszkodzi ona tkanki
Uchwyt na płynną próbkę (dwa okienka kwarcowe z teflonową przekładką 0,1 mm)	TeraView, Ltd	Nie dotyczy	Okna kwarcowe o średnicy 1 cala i grubości 0,1452 cala
Rękawice nitrylowe	VWR	82026-426	Ten numer katalogowy dotyczy rękawic średniej wielkości
Butla z azotem	Airgas	NI UHP300	AZOT UHP GR 5.0 ROZMIAR 300
Ręcznik papierowy	VWR	14222-321	Arkusze 11" x 8,78", 1-warstwowy
	Parafilm VWR	52858-076	Elastyczne tworzywo termoplastyczne. Zwijany, wodoodporny arkusz przepnięty papierem, aby zapobiec samoprzywieraniu.
Szalka Petriego	VWR	470210-568	VWR szalka Petriego, poślizgowa, mono talerz (niedzielone dno)
Polistyrenowa płyta	Home Depot	1S11143A	~ kwadratowy kawałek 10 cm x 10 cm wycięty z nieoślepiającego arkusza styrenowego o wymiarach 11" x 14" x 0,05"
Oprogramowanie ScanAcquire	TeraView, Ltd	N/A	Oprogramowanie systemowe do pomiarów odbicia THz
Niskoprofilowe ostrze ze stali nierdzewnej (#4689)	VWR	25608-964	Tissue-Tek Accu-Edge Jednorazowe ostrza mikrotomu
Metalowa taca ze stali nierdzewnej	Szybka medyczna	10F	Polar Ware Tace na instrumenty medyczne ze stali nierdzewnej
Barwniki do znakowania tkanek	Ted Pella, Inc	Żółty barwnik #27213-1 Czerwony barwnik #27213-2 Niebieski barwnik #27213-4	Służy do orientacji wyciętych próbek tkanek wysyłanych do laboratorium histopatologicznego
TPS Spectra 3000	TeraView, Ltd	N/A	System obrazowania i spektroskopii THz
Oprogramowanie TPS Spectra	TeraView, Ltd	N/A Oprogramowanie	systemowe do pomiarów spektroskopii transmisyjnej THz