Opisujemy iniekcję domostkową, która wykorzystuje igłę zgiętą na końcu, która może być stabilizowana do czaszki, eliminując w ten sposób ryzyko uszkodzenia leżącego pod spodem miąższu. Podejście to może być wykorzystane do genetycznego mapowania losów i manipulacji komórkami opon mózgowo-rdzeniowych oraz do śledzenia ruchów płynu mózgowo-rdzeniowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Indukcja modyfikacji komórek opon mózgowo-rdzeniowych poprzez wstrzyknięcie domostkowe
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Protokół opisany tutaj opisuje, jak bezpiecznie i ręcznie wstrzykiwać roztwory przez cisterna magna, eliminując ryzyko uszkodzenia leżącego pod spodem miąższu. Wcześniej opublikowane protokoły zalecają stosowanie prostych igieł, które należy obniżyć maksymalnie do 1-2 mm od powierzchni opony twardej. Nagły spadek oporu po przebiciu membrany opony twardej utrudnia utrzymanie igły w stabilnej pozycji. Nasza metoda zamiast tego wykorzystuje igłę zgiętą na końcu, którą można ustabilizować na kości potylicznej czaszki, zapobiegając w ten sposób wnikaniu strzykawki w tkankę po perforacji błony opony twardej. Zabieg jest prosty, powtarzalny i nie powoduje długotrwałego dyskomfortu u operowanych zwierząt. Opisano strategię iniekcji intracisternalnej w kontekście genetycznego mapowania losów naczyniowych komórek opon mózgowo-rdzeniowych. Ta sama technika może być ponadto wykorzystana do rozwiązania szerokiego zakresu pytań badawczych, takich jak badanie roli opon mózgowo-rdzeniowych w rozwoju neurologicznym i rozprzestrzenianiu się bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, poprzez genetyczną ablację genów przypuszczalnie związanych z tymi zjawiskami. Dodatkowo procedura może być połączona ze zautomatyzowanym systemem infuzyjnym w celu ciągłego dostarczania i wykorzystywana do śledzenia ruchu płynu mózgowo-rdzeniowego poprzez wstrzykiwanie fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek.
Wprowadzenie
Komórki opon mózgowo-rdzeniowych to podobna do fibroblastów populacja komórek zorganizowanych w cienką warstwę pokrywającą mózg i wyrażającą geny zaangażowane w sieciowanie kolagenu (np. Dcn i Lum) oraz w tworzenie bariery mózgowo-rdzeniowej (np. Cldn11)1,2. Komórki oponowo-rdzeniowe są zaangażowane w szeroki zakres funkcji fizjologicznych, od ścisłej kontroli nad drenażem płynu mózgowo-rdzeniowego3 po wskazówki neuronalnych komórek progenitorowych w rozwijającym się mózgu4,5. Niedawne badania sugerują również, że opony mózgowe u noworodków mogą zawierać promieniste komórki glejowe, które migrują do miąższu mózgu i przekształcają się w funkcjonalne neurony korowe6.
Komórki opon mózgowo-rdzeniowych znajdują się w bliskim sąsiedztwie astrocytów powierzchniowych i dzielą z nimi, jak również innymi astroglejami miąższowymi, ekspresję koneksyny-30 (Cx30)7. Opisana poniżej procedura chirurgiczna pozwala na powszechne i specyficzne znakowanie tych komórek oponowych poprzez jednorazowe dostarczenie endoksyfenu do cisterna magna myszy transgenicznych warunkowo eksprymujących tdTomato w komórkach Cx30+ (tj. przy użyciu systemu CreER-loxP do mapowania losu). Endooksyfen jest czynnym metabolitem tamoksyfenu i indukuje rekombinację komórek wykazujących ekspresję CreER w taki sam sposób jak tamoksyfen. Jest to jednak zalecane rozwiązanie do stosowania miejscowego, ponieważ rozpuszcza się w 5-10% DMSO, zamiast w wysokich stężeniach etanolu. Ponadto endooksyfen nie przenika przez barierę mózgowo-oponową, umożliwiając w ten sposób specyficzną rekombinację komórek opon mózgowo-rdzeniowych, bez znakowania podstawowej populacji astrogleju Cx30+ (patrz wyniki reprezentatywne).
Przedstawiona tutaj technika ma na celu ręczne i bezpieczne wstrzykiwanie związku do płynu mózgowo-rdzeniowego, poprzez bezpośredni dostęp do cisterna magna. W przeciwieństwie do innych, bardziej inwazyjnych zabiegów wymagających kraniotomii, takie podejście pozwala na podawanie związków bez powodowania uszkodzeń czaszki czy miąższu mózgu. Nie jest to więc związane z indukcją reakcji zapalnych wywołanych aktywacją miąższowych komórek glejowych. Podobnie jak w przypadku innych strategii iniekcji opisanych wcześniej8,9,10, obecne podejście opiera się na chirurgicznym odsłonięciu błony opony twardej atlanto-potylicznej pokrywającej cisterna magna, po rozwarstwieniu nakładających się mięśni szyi. Jednak w przeciwieństwie do innych zabiegów, zalecamy użycie igły wygiętej na końcu, która podczas podawania może być stabilizowana na kości potylicznej. Zapobiegnie to ryzyku, że igła wbije się zbyt głęboko i uszkodzi leżący pod spodem móżdżek i rdzeń.
Ten zabieg chirurgiczny jest zgodny z badaniami nad śledzeniem linii, które mają na celu mapowanie zmian w tożsamości komórek i trasach migracji przez warstwy miąższowe. Można go również dostosować do badań ablacji genetycznej, które mają na celu zbadanie roli komórek opon mózgowo-rdzeniowych w zdrowiu i chorobie, takich jak ich wkład w rozwój kory mózgowej5 lub rozprzestrzenianie się bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych3,11. Wreszcie, może być wykorzystany do śledzenia ruchu płynu mózgowo-rdzeniowego w połączeniu z dostarczaniem fluorescencyjnych znaczników u zwierząt typu dzikiego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Przedstawione tu procedury chirurgiczne zostały zatwierdzone przez Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd i przeprowadzone zgodnie ze specyfikacjami dostarczonymi przez instytut badawczy (Instytut Karolinska, Szwecja).
UWAGA: Iniekcja domostkowa może być elastycznie dostosowana do wielu celów badawczych. Poniżej przedstawiamy procedurę opracowaną w celu skutecznego znakowania komórek opon mózgowo-rdzeniowych do mapowania losu w oparciu o wstrzyknięcie endooksyfenu do transgenicznej linii myszy przenoszącej R26R-tdTomato12 i CreER, ten ostatni w klasie Cx30 promoter13. Znakowanie tej populacji komórek można osiągnąć poprzez wstrzyknięcie konstruktów wirusowych przy użyciu tej samej procedury opisanej poniżej. Wreszcie, podejście to można zastosować do śledzenia przepływu płynu mózgowo-rdzeniowego poprzez infuzję znaczników fluorescencyjnych.
1. Przygotowanie systemu wtryskowego
UWAGA: Zalecamy przeprowadzenie zabiegu w odpowiedniej sali operacyjnej i w warunkach aseptycznych. Narzędzia chirurgiczne można sterylizować za pomocą ciepła (autoklaw, sterylizator z kulkami szklanymi) lub odkażać za pomocą wysokiej jakości chemicznego środka dezynfekującego, jeśli są wrażliwe na ciepło. Wypłucz narzędzia przed użyciem podczas dezynfekcji chemicznej lub pozwól im ostygnąć po zdezynfekowaniu ciepłem.
- Za pomocą kleszczy zgiąć igłę strzykawki iniekcyjnej pod kątem 30° w odległości 3 mm od końcówki.
nuta: Należy używać strzykawek Hamilton ze igłą ze skosem 30 G. - Przygotować 1 mg/ml roztworu endooksyfenu, rozcieńczonego w 10% DMSO i wypełnić strzykawkę wygiętą igłą.
UWAGA: Należy podać 5 μl związku, aby zapewnić powszechną ekspozycję komórek opon mózgowych u dorosłej myszy C57Bl/6j (ok. 25-30 g), chociaż w przypadku leczenia zwierząt w różnym wieku i szczepów mogą być konieczne eksperymenty pilotażowe, które testują różne stężenia i objętości iniekcji. - Wyreguluj uchwyt główki myszy tak, aby ustnik znajdował się pod kątem około 30° od powierzchni stołu operacyjnego.
nuta: Do tej procedury można również użyć ramy stereotaktycznej z trzypunktowym mocowaniem (tj. uszy i usta). W tym przypadku jednak zwierzę zostanie unieruchomione tylko za pomocą ustnika, podczas gdy nauszniki mogą być wysunięte pod przednie kończyny zwierzęcia i służyć do podtrzymywania ciała zwierzęcia podczas zabiegu.
2. Indukcja znieczulenia
- W przypadku środków znieczulających do wstrzykiwań należy stosować stężenia i sposoby podawania zalecane przez jednostkę weterynaryjną w lokalnej placówce.
- W przypadku wziewnych środków znieczulających, takich jak izofluran, należy przygotować jednostkę do podawania zgodnie ze specyfikacją producenta.
- W przypadku izofluranu należy ustawić stężenie związku na 4% w celu indukcji znieczulenia.
- Dostarczyć powietrze z prędkością 400 ml/min.
- Pozwól jednostce anestezjologicznej napełnić komorę środkiem znieczulającym przez kilka minut, a następnie umieść mysz w komorze.
nuta: Do obecnych eksperymentów wykorzystaliśmy dorosłe (>2 miesiące i około 30 g) samce i samice myszy transgenicznych będących nosicielami Cx30-CreER i R26R-tdTomato, hodowane na tle C57Bl/6j. - Monitoruj zwierzę podczas indukcji znieczulenia. Wzorzec oddychania powinien zwolnić, gdy mysz jest pod pełną narkozą.
- Wyjmij zwierzę z komory i sprawdź, czy odruch łapy nie został stłumiony, delikatnie szczypiąc tylne łapy.
nuta: Odruch może być nadal obecny, ale opóźniony o kilka sekund. W takim przypadku należy umieścić zwierzę z powrotem w komorze, aż do całkowitego stłumienia odruchu łapy. - Podawać leki przeciwbólowe (np. karprofen, 5 mg/kg we wstrzyknięciu podskórnym) w celu wspomagania leczenia bólu pooperacyjnego.
3. Ułożenie zwierzęcia do zabiegu
- Przymocuj głowę zwierzęcia do uchwytu na głowę. Aby poprawić dostęp do cisterna magna, ustaw ciało zwierzęcia pod kątem około 30° od powierzchni stołu, a głowę skierowaną w dół, aby ustalić kąt 120° z resztą ciała i wysuń tył szyi, aby ułatwić dostęp do cisterna magna (Rysunek 1A).
- Dodaj ręczniki papierowe pod spodem zwierzęcia, aby podeprzeć jego ciało przez cały zabieg.
- Bezpieczne podawanie znieczulenia przez ustnik i zmniejszenie stężenia izofluranu do 2,5% oraz dostarczania powietrza do 200 ml/min.
- Zastosuj maść okulistyczną.
4. Odsłonięcie Cisterna Magna
- Ogol tył szyi zwierzęcia i zdezynfekuj obszar za pomocą 70% etanolu i betadyny.
- Za pomocą nożyczek chirurgicznych należy wykonać nacięcie w linii środkowej (o długości ok. 7 mm) zaczynając od poziomu kości potylicznej i przedłużając ją ku tyłowi .
- Delikatnie oddziel powierzchowną tkankę łączną i mięśnie szyi ciągnące się na boki od linii środkowej za pomocą pęsety z cienką końcówką. Spowoduje to odsłonięcie membrany opony twardej pokrywającej cisterna magna, w kształcie odwróconego trójkąta.
- Użyj sterylnych włóczni absorpcyjnych lub wacików, aby zatamować powstałe krwawienie.
- Umieść mały separator chirurgiczny, aby utrzymać mięśnie szyi odciągnięte na bok i umożliwić wizualizację cisterna magna przez cały zabieg.
5. Iniekcja domostkowo-mostkowa
- Aby uzyskać dostęp do cisterna magna, zidentyfikuj ogonowy koniec kości potylicznej i włóż igłę, która była wcześniej wygięta bezpośrednio pod spodem.
nuta: Nastąpi nagły spadek oporu w miarę przebijania membrany opony twardej. Jednak końcówka igły tylko nieznacznie wnika pod powierzchnię opony mózgowej, dzięki swojemu haczykowatemu kształtowi. - Po perforacji opony twardej pozwól, aby wygięta końcówka igły wniknęła pod powierzchnię opony twardej, delikatnie pociągając strzykawkę do góry i równolegle do ciała zwierzęcia, aby "zaczepić" igłę o czaszkę (patrz Rysunek 1B). Zapewni to lepszą stabilność i zapobiegnie głębszemu wnikaniu igły, unikając w ten sposób ryzyka uszkodzenia leżącego poniżej móżdżku lub rdzenia.
- Związek należy wstrzykiwać powoli, aby uniknąć zakłóceń w naturalnym przepływie płynu mózgowo-rdzeniowego.
nuta: W zależności od celu eksperymentu, szybkość infuzji może się różnić. Jeśli wymagana jest powolna i stała szybkość infuzji (np. podczas korzystania z procedury śledzenia ruchu płynu mózgowo-rdzeniowego), może być wskazane użycie automatycznego systemu mikroinfuzji w połączeniu ze strzykawką. - Po wstrzyknięciu należy pozostawić igłę na miejscu na 1 minutę i ostrożnie ją wyjąć. Użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby wspomóc wycofanie igły z pozycji haczykowatej.
nuta: Użycie cienkiej igły (np. 30 G) nie prowadzi do znacznego uszkodzenia błony oponowej, a w konsekwencji do odpływu płynu mózgowo-rdzeniowego. Jeśli wymagane są większe rozmiary igieł, zalecamy zatrzymanie wycieku płynu poprzez ucisk w miejscu wstrzyknięcia za pomocą sterylnej bawełnianej końcówki.
6. Zakończenie procedury i opieka pooperacyjna
- Usuń separator i pozwól mięśniom powrócić do swojej pierwotnej pozycji pokrywającej membranę opony twardej.
- Zamknij nacięcie skóry za pomocą kilku kropli kleju cyjanoakrylowego.
nuta: Alternatywnie należy zastosować szwy wchłanialne (np. szwy vicryl 5-0) i zamknąć nacięcie skóry przerwanymi szwami. - Zastosuj znieczulenie miejscowe (np. 100 μl 5% lidokainy) w miejscu nacięcia.
- Wyjmij zwierzę z uchwytu i umieść je w czystej klatce umieszczonej na poduszce grzewczej. Monitorować zwierzę aż do odzyskania przytomności.
nuta: Oczekuje się, że zabieg nie spowoduje długotrwałego bólu lub niepokoju u zwierzęcia. Niemniej jednak mysz powinna być ściśle monitorowana przez pierwsze dni po operacji, a środki przeciwbólowe mogą być podjęte, gdy tylko zostanie to uznane za konieczne i zgodnie z zaleceniami dostarczonymi przez jednostkę weterynaryjną w Twojej instytucji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wstrzyknięcie endoksyfenu do cysterny u myszy transgenicznych wykazujących ekspresję CreER pod promotorem Cx3013 oraz indukowalnego reportera fluorescencyjnego umożliwia specyficzną rekombinację komórek opon miękkich bez znakowania sąsiadujących astrocytów powierzchniowych i parenchymalnych wykazujących ekspresję Cx30 w korze (Rysunek 1). Aby uzyskać dostęp do cysterny wielkiej, znieczulone zwierzę ustawia się tak, aby ciało i głowa tw...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół przedstawia prostą i powtarzalną procedurę oznaczania komórek opon mózgowo-rdzeniowych w celu mapowania losu. Stosujemy wstrzyknięcie doglebowo-mostkowe endoksyfenu, aktywnego metabolitu tamoksyfenu, w celu wywołania ekspresji reportera fluorescencyjnego tdTomato w Cx30-CreER; R26R-tdMyszy pomidorowe12,13.
W porównaniu z innymi protokołami stosowanymi do uzyskiwania dostępu do płynu mózgowo-rdzeniowego prze...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez granty ze Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych, Szwedzkiego Towarzystwa Onkologicznego, Szwedzkiej Fundacji Badań Strategicznych, Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse oraz Strategicznego Programu Badawczego w Komórkach Macierzystych i Medycynie Regeneracyjnej w Karolinska Institutet (StratRegen).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Jednostka anestezjologiczna | Univentor 410 | 8323102 | W komplecie z parownikiem, komorą i rurką, która łączy się z komorą i uchwytem na głowę myszy |
| Znieczulenie (izofluran) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Nazwa handlowa Rymadil |
| Klej cyjanoakrylowy | Carl Roth | 0258.1 | Użyj jedwabnych szwów 5-0, w alternatywie |
| Klej tkankowy Medbond | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Etanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Strzykawka Hamilton (igła skośna 30 G) | Hamilton | 80300 | |
| Lidokaina | Aspen Nordic | 520455 | |
| Uchwyt na głowę myszy | Narishige International | SGM-4 | Z ustnikiem do znieczuleń wziewnych. Alternatywnie użyj ramy stereotaktycznej |
| Nożyczki | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Golarka | Aesculap | GT420 | |
| Sterylne włócznie absorpcyjne | Fine Science Tools | 18105-01 | Dobrym rozwiązaniem są również sterylne waciki bawełniane |
| Separator chirurgiczny | World Precision Instrument | 501897 | |
| Pęseta | Dumont | 11251-35 | |
| Viscotears | Bausch& Lomb Nordic AB | 541760 |
Bibliografia
- Vanlandewijck, M., et al. A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature. Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).
- Whish, S., et al. The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to the brain via intercellular junctions. Frontiers in Neuroscience. 9, 16(2015).
- Weller, R. O., Sharp, M. M., Christodoulides, M., Carare, R. O., Mollgard, K. The meninges as barriers and facilitators for the movement of fluid, cells and pathogens related to the rodent and human CNS. Acta Neuropathologica. 135 (3), 363-385 (2018).
- Choe, Y., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. A cascade of morphogenic signaling initiated by the meninges controls corpus callosum formation. Neuron. 73 (4), 698-712 (2012).
- Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139 (3), 597-609 (2009).
- Bifari, F., et al. Neurogenic Radial Glia-like Cells in Meninges Migrate and Differentiate into Functionally Integrated Neurons in the Neonatal Cortex. Cell Stem Cell. 20 (3), 360-373 (2017).
- De Bock, M., et al. A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins? FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).
- Ramos, M., et al. Cisterna Magna Injection in Rats to Study Glymphatic Function. Methods in Molecular Biology. 1938, 97-104 (2019).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Coureuil, M., Lecuyer, H., Bourdoulous, S., Nassif, X. A journey into the brain: insight into how bacterial pathogens cross blood-brain barriers. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 149-159 (2017).
- Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
- Slezak, M., et al. Transgenic mice for conditional gene manipulation in astroglial cells. Glia. 55 (15), 1565-1576 (2007).
- Hardy, S. J., Christodoulides, M., Weller, R. O., Heckels, J. E. Interactions of Neisseria meningitidis with cells of the human meninges. Molecular Microbiology. 36 (4), 817-829 (2000).
- Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77 (9), 3578-3587 (2009).
- Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726(2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
