Opisujemy iniekcję domostkową, która wykorzystuje igłę zgiętą na końcu, która może być stabilizowana do czaszki, eliminując w ten sposób ryzyko uszkodzenia leżącego pod spodem miąższu. Podejście to może być wykorzystane do genetycznego mapowania losów i manipulacji komórkami opon mózgowo-rdzeniowych oraz do śledzenia ruchów płynu mózgowo-rdzeniowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Indukcja modyfikacji komórek opon mózgowo-rdzeniowych poprzez wstrzyknięcie domostkowe
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Protokół opisany tutaj opisuje, jak bezpiecznie i ręcznie wstrzykiwać roztwory przez cisterna magna, eliminując ryzyko uszkodzenia leżącego pod spodem miąższu. Wcześniej opublikowane protokoły zalecają stosowanie prostych igieł, które należy obniżyć maksymalnie do 1-2 mm od powierzchni opony twardej. Nagły spadek oporu po przebiciu membrany opony twardej utrudnia utrzymanie igły w stabilnej pozycji. Nasza metoda zamiast tego wykorzystuje igłę zgiętą na końcu, którą można ustabilizować na kości potylicznej czaszki, zapobiegając w ten sposób wnikaniu strzykawki w tkankę po perforacji błony opony twardej. Zabieg jest prosty, powtarzalny i nie powoduje długotrwałego dyskomfortu u operowanych zwierząt. Opisano strategię iniekcji intracisternalnej w kontekście genetycznego mapowania losów naczyniowych komórek opon mózgowo-rdzeniowych. Ta sama technika może być ponadto wykorzystana do rozwiązania szerokiego zakresu pytań badawczych, takich jak badanie roli opon mózgowo-rdzeniowych w rozwoju neurologicznym i rozprzestrzenianiu się bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, poprzez genetyczną ablację genów przypuszczalnie związanych z tymi zjawiskami. Dodatkowo procedura może być połączona ze zautomatyzowanym systemem infuzyjnym w celu ciągłego dostarczania i wykorzystywana do śledzenia ruchu płynu mózgowo-rdzeniowego poprzez wstrzykiwanie fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek.
Wprowadzenie
Komórki opon mózgowo-rdzeniowych to podobna do fibroblastów populacja komórek zorganizowanych w cienką warstwę pokrywającą mózg i wyrażającą geny zaangażowane w sieciowanie kolagenu (np. Dcn i Lum) oraz w tworzenie bariery mózgowo-rdzeniowej (np. Cldn11)1,2. Komórki oponowo-rdzeniowe są zaangażowane w szeroki zakres funkcji fizjologicznych, od ścisłej kontroli nad drenażem płynu mózgowo-rdzeniowego3 po wskazówki neuronalnych komórek progenitorowych w rozwijającym się mózgu4,5. Niedawne badania sugerują....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Przedstawione tu procedury chirurgiczne zostały zatwierdzone przez Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd i przeprowadzone zgodnie ze specyfikacjami dostarczonymi przez instytut badawczy (Instytut Karolinska, Szwecja).
UWAGA: Iniekcja domostkowa może być elastycznie dostosowana do wielu celów badawczych. Poniżej przedstawiamy procedurę opracowaną w celu skutecznego znakowania komórek opon mózgowo-rdzeniowych do mapowania losu w oparciu o wstrzyknięcie endooksyfenu do transgenicznej linii myszy przenoszącej R26R-tdTomato12 i CreER, ten ostatni w klasie Cx30 promoter13. Znakowanie t....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wstrzyknięcie endoksyfenu do cysterny u myszy transgenicznych wykazujących ekspresję CreER pod promotorem Cx3013 oraz indukowalnego reportera fluorescencyjnego umożliwia specyficzną rekombinację komórek opon miękkich bez znakowania sąsiadujących astrocytów powierzchniowych i parenchymalnych wykazujących ekspresję Cx30 w korze (Rysunek 1). Aby uzyskać dostęp do cysterny wielkiej, znieczulone zwierzę ustawia się tak, aby ciało i głowa tw.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół przedstawia prostą i powtarzalną procedurę oznaczania komórek opon mózgowo-rdzeniowych w celu mapowania losu. Stosujemy wstrzyknięcie doglebowo-mostkowe endoksyfenu, aktywnego metabolitu tamoksyfenu, w celu wywołania ekspresji reportera fluorescencyjnego tdTomato w Cx30-CreER; R26R-tdMyszy pomidorowe12,13.
W porównaniu z innymi protokołami stosowanymi do uzyskiwania dostępu do płynu mózgowo-rdzeniowego prze.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez granty ze Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych, Szwedzkiego Towarzystwa Onkologicznego, Szwedzkiej Fundacji Badań Strategicznych, Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse oraz Strategicznego Programu Badawczego w Komórkach Macierzystych i Medycynie Regeneracyjnej w Karolinska Institutet (StratRegen).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Jednostka anestezjologiczna | Univentor 410 | 8323102 | W komplecie z parownikiem, komorą i rurką, która łączy się z komorą i uchwytem na głowę myszy |
| Znieczulenie (izofluran) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Nazwa handlowa Rymadil |
| Klej cyjanoakrylowy | Carl Roth | 0258.1 | Użyj jedwabnych szwów 5-0, w alternatywie |
| Klej tkankowy Medbond | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Etanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Strzykawka Hamilton (igła skośna 30 G) | Hamilton | 80300 | |
| Lidokaina | Aspen Nordic | 520455 | |
| Uchwyt na głowę myszy | Narishige International | SGM-4 | Z ustnikiem do znieczuleń wziewnych. Alternatywnie użyj ramy stereotaktycznej |
| Nożyczki | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Golarka | Aesculap | GT420 | |
| Sterylne włócznie absorpcyjne | Fine Science Tools | 18105-01 | Dobrym rozwiązaniem są również sterylne waciki bawełniane |
| Separator chirurgiczny | World Precision Instrument | 501897 | |
| Pęseta | Dumont | 11251-35 | |
| Viscotears | Bausch& Lomb Nordic AB | 541760 |
Bibliografia
- Vanlandewijck, M., et al. A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature. Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).
- Whish, S., et al. The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to t....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
