Artykuł metodologiczny

W pełni zautomatyzowane śledzenie nóg u swobodnie poruszających się owadów przy użyciu funkcji segmentacji i śledzenia nóg (FLLIT)

DOI:

10.3791/61012

⸱

23 kwietnia 2020

 ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Cell Biology, Agency for Science, Technology and Research, 2Bioinformatics Institute, Agency for Science, Technology and Research, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of Alberta

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy szczegółowe protokoły korzystania z FLLIT, w pełni zautomatyzowanej metody uczenia maszynowego do śledzenia ruchów pazurów nóg u swobodnie poruszających się Drosophila melanogaster i innych owadów. Protokoły te mogą być używane do ilościowego pomiaru subtelnych ruchów chodu u much dzikich typów, zmutowanych much i modeli neurodegeneracji much.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model Drosophila był nieoceniony dla badania funkcji neurologicznych oraz dla zrozumienia molekularnych i komórkowych mechanizmów leżących u podstaw neurodegeneracji. Podczas gdy techniki manipulacji i badania podzbiorów neuronalnych na muchy stają się coraz bardziej wyrafinowane, bogactwo powstałych fenotypów behawioralnych nie zostało uchwycone w podobny sposób. Możliwość badania subtelnych ruchów nóg muchy w celu porównania między mutantami wymaga zdolności do automatycznego pomiaru i ilościowego określania szybkich i szybkich ruchów nóg. W związku z tym opracowaliśmy algorytm uczenia maszynowego do automatycznego śledzenia pazurów nóg u swobodnie chodzących much, segmentacji i śledzenia kończyn opartej na uczeniu się funkcji (FLLIT). W przeciwieństwie do większości metod głębokiego uczenia, FLLIT jest w pełni zautomatyzowany i generuje własne zestawy treningowe bez konieczności adnotacji użytkownika, wykorzystując parametry morfologiczne wbudowane w algorytm uczenia. W tym artykule opisano szczegółowy protokół przeprowadzania analizy chodu przy użyciu FLLIT. Szczegółowo opisuje procedury konfiguracji kamery, budowy areny, nagrywania wideo, segmentacji nóg i śledzenia pazurów nóg. Daje również przegląd danych generowanych przez FLLIT, który obejmuje surowe śledzone pozycje ciała i nóg w każdej klatce wideo, 20 parametrów chodu, 5 wykresów i śledzone wideo. Aby zademonstrować zastosowanie FLLIT, określamy ilościowo odpowiednie parametry chodu chorego w modelu muchy ataksji rdzeniowo-móżdżkowej 3.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich kilku dekad, choroby neurodegeneracyjne i zaburzenia ruchowe stały się bardziej powszechne w naszych starzejących się populacjach. Chociaż nasza wiedza na temat wielu chorób neurodegeneracyjnych poczyniła postępy na poziomie molekularnym i komórkowym, podstawowe cechy dotkniętych obwodów neuronalnych leżące u podstaw choroby pozostają słabo poznane. Niedawno opracowane narzędzia do śledzenia zachowań1,2,3,4 pozwalają nam teraz badać nieprawidłowości ruchowe w modelach chorób zwierzęcych w celu zidentyfikowania choroby leżącej u podstaw dysregulacji molekularnej, komórkowej i obwodowej.

Szlaki molekularne związane z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi są zachowane u muszki owocowej Drosophila melanogaster, a modele choroby Drosophila pomogły wyjaśnić podstawowe mechanizmy leżące u podstaw neurodegeneracji5,6. Niedawno wykazaliśmy, że modele muchowe choroby Parkinsona (PD) i ataksji rdzeniowo-móżdżkowej 3 (SCA3) wykazują wyraźne, konserwatywne sygnatury chodu, które przypominają te z odpowiednich chorób ludzkich1, co pokazuje, że model muchy może być wykorzystany do zrozumienia mechanizmów obwodowych leżących u podstaw dysfunkcji ruchowej w określonych zaburzeniach ruchowych. Bogaty i stale rosnący arsenał narzędzi w modelu muchy do ukierunkowanej manipulacji i wizualizacji neuronów na poziomie pojedynczego genu i pojedynczej komórki7,8,9,10 sprawia, że mucha jest idealnym modelem do badania związku między szlakami chorobowymi, obwodami neuronalnymi i behawioralnymi manifestacjami fenotypowymi in vivo. Aby umożliwić precyzyjną, zautomatyzowaną analizę chodu owadów, opracowaliśmy niedawno metodę uczenia maszynowego, segmentację LImb opartą na zarobkach Feature Li regały T(FLLIT)1.

FLLIT składa się z w pełni zautomatyzowanego, wieloetapowego algorytmu, który najpierw segmentuje piksele nóg, które następnie są wykorzystywane do lokalizowania i śledzenia odpowiadających im pazurów nóg. FLLIT wykorzystuje algorytm zwiększający do segmentacji, w przeciwieństwie do algorytmów głębokiego uczenia używanych w ostatnich pracach2,3. Istnieją pewne podobieństwa z konwolucyjnymi sieciami neuronowymi w tym, że w obu frameworkach ekstrakcja cech odbywa się automatycznie poprzez uczenie się jąder konwolucyjnych. Pierwszy krok w FLLIT polega na wykorzystaniu operacji morfologicznych (krawędź i szkieletyzacja) w celu automatycznego generowania dodatnich (piksele na nogach) i ujemnych (tło lub piksele na ciele muchy) próbek treningowych z dużą pewnością. W związku z tym FLLIT jest w pełni zautomatyzowany i nie wymaga próbek treningowych z adnotacjami użytkownika. Korzystając z powyższych próbek treningowych, klasyfikator jest następnie trenowany w ramach algorytmu podbijania. Zespół słabych klasyfikatorów jest nauczany iteracyjnie, z których każdy składa się z zestawu jąder konwolucyjnych do ekstrakcji cech i drzewa decyzyjnego. Ostateczny wyuczony klasyfikator jest następnie używany do segmentacji nóg i jest w stanie lepiej rozróżnić trudne obszary/twarde próbki niż operacje morfologiczne, tworząc ogólnie znacznie dokładniejszą segmentację do śledzenia1. Z segmentowych nóg lokalizujemy końcówki i śledzimy je za pomocą węgierskiego algorytmu: dopasowując końcówki w poprzek ramek tak, aby suma odległości przebytej przez każdą końcówkę była zminimalizowana. FLLIT może radzić sobie z przypadkami okluzji, zapamiętując ostatnio widzianą lokalizację (we współrzędnych wyśrodkowanych w locie), dzięki czemu końcówka nogi jest odzyskiwana, gdy nie jest już pod okluzją.

Wcześniej pokazaliśmy, że FLLIT może automatycznie i dokładnie śledzić ruchy nóg i analizować chód nieoznakowanej, swobodnie poruszającej się muchy lub pająka z szybkiego wideo1; FLLIT powinien być zatem szeroko stosowany do śledzenia nóg stawonogów. Wyodrębniając zestawy treningowe uczenia maszynowego przy użyciu parametrów morfologicznych, FLLIT automatycznie szkoli się w segmentacji i śledzeniu odnóży owadów bez konieczności pracochłonnego ręcznego opisywania, które jest wymagane w przypadku większości metod głębokiego uczenia. Dzięki temu FLLIT jest w pełni zautomatyzowany. Po segmentacji i śledzeniu nóg, FLLIT automatycznie tworzy surowe śledzone pozycje ciała i nóg w każdej klatce wideo, 20 parametrów chodu, 5 wykresów i śledzone wideo do analizy chodu i wizualizacji ruchów chodu. Ten protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący korzystania z FLLIT.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ustawienia systemu

  1. Upewnij się, że stacja nagrywająca jest wyposażona w kamerę o dużej prędkości i scenę nad nią, na której znajduje się komora areny (Rysunek 1). Dostosuj aparat tak, aby nagrywał z prędkością co najmniej 250 klatek na sekundę (kl./s), z odpowiednio krótkim czasem otwarcia migawki (w tym przypadku nagrywanie odbywa się z prędkością 1000 kl./s przy czasie otwarcia migawki 1 ms).
    UWAGA: Sprawdź, czy film nadaje się do śledzenia, upewniając się, że rozmycie ruchu poruszających się nóg jest minimalne lub nie ma go wcale. Jeśli ruchoma noga jest tak rozmyta, że osoba adnotująca nie może jej śledzić, należy zwiększyć szybkość nagrywania i/lub czas otwarcia migawki aparatu.
  2. Umieść diody LED na podczerwień w górnej części stolika z dyfuzorem (półprzezroczystym arkuszem) między kamerą a próbką (Rysunek 1A,B).
  3. Wykonaj komorę nagraniową, wycinając arkusz akrylowy o grubości 1,6 mm. W tym eksperymencie użyj pola widzenia 11 mm x 11 mm. Umieść komorę między dwoma szklanymi szkiełkami (Rysunek 1C).

2. Przygotowanie much do nagrywania

  1. Przenieść muchy, które mają być zarejestrowane, do nowej fiolki z pokarmem na 24 godziny przed zapisem.
    UWAGA: Nie używaj CO2 (zwykle używanego do znieczulania much po pierwszym pobraniu) na muchach mniej niż 24 godziny przed nagraniem.
  2. Około 40 minut przed nagraniem przenieś muchy do pustych fiolek i trzymaj na lodzie przez 5-7 minut.
  3. W międzyczasie przetrzyj arenę i przezroczyste szkiełka wodą i chusteczką.
    UWAGA: Nie używaj etanolu do czyszczenia komór i szkiełek.
  4. Przygotować komorę nagraniową. Przymocuj jeden z mikroskopijnych szkiełek pod komorą za pomocą taśmy.
  5. Gdy muchy zostaną znieczulone na lodzie, przenieś po jednej muchy do każdej komory za pomocą czystej szczotki.
    UWAGA: W tej konfiguracji można używać zarówno samców, jak i samic much, a w miarę możliwości muchy obu płci powinny być analizowane, aby uniknąć uprzedzeń związanych z płcią.
  6. Zabezpiecz komorę innym mikroskopijnym szkiełkiem podstawowym z taśmą (Rysunek 1C).
  7. Muchy w komorze należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez 15 - 20 minut w celu aklimatyzacji.

3. Generowanie filmów do analizy FLLIT

UWAGA: Ten krok jest specyficzny dla używanej kamery wideo. W takim przypadku używana jest dostępna na rynku kamera wideo (patrz tabela materiałów).

  1. Włącz źródło zasilania. Poczekaj, aż zielona dioda LED zasilania i pomarańczowa dioda LED połączenia interfejsu Ethernet ustabilizują się. Włącz zasilanie diody LED na podczerwień. Upewnij się, że voltage pozostaje na poziomie 12.5 V.
  2. Otwórz aplikację Viewer w podłączonym systemie komputerowym.
  3. Zmień liczbę klatek na sekundę nagrywania na 1000 kl./s. Ustaw czas otwarcia migawki na 1/1000 s (1 ms).
  4. Umieść komorę z muchą na arenie nagrywającej i wybierz przycisk LIVE. Upewnij się, że kamera jest skupiona na końcach nóg, gdy mucha chodzi pionowo po podłodze komory; Końcówki nóg powinny być ostre.
  5. Kliknij przycisk Nagraj (Rysunek 2).
  6. Nagraj chodzenie muchy, upewniając się, że:
    Mucha poruszała się po stosunkowo prostej trajektorii, nie dotykając krawędzi areny.
    Mucha przeszła co najmniej trzy kroki na nogę.
    Mucha nie zatrzymuje się podczas spaceru.
    Przebyty dystans odpowiada co najmniej jednej długości ciała.

    UWAGA: Czyste odjęcie tła ma kluczowe znaczenie dla dokładnej segmentacji. Algorytm automatycznego odejmowania tła zastosowany przez FLLIT wymaga, aby obrazowana mucha przesunęła się na odległość co najmniej jednej długości ciała.
  7. Kliknij Rec Done, aby zatrzymać nagrywanie (Rysunek 2).
  8. Przytnij wideo, aby upewnić się, że nagranie obejmuje tylko prosty chód muchy (zgodnie z opisem w kroku 3.6).
  9. Kliknij Zapisz (Rysunek 2). Zapisz pliki w formacie ".mraw" lub ".tiff" w odpowiednich folderach.
    UWAGA: Format ".mraw" zapewnia większą elastyczność w zakresie zmiany nazwy pliku (jeśli jest to wymagane) i przechowywania filmów w porównaniu z formatem pliku ".tiff".

4. Instalacja programu FLLIT

UWAGA: Aktualne instrukcje można znaleźć pod adresem: https://github.com/BII-wushuang/FLLIT/blob/master/Compiled/Readme.pdf

  1. Pobierz FLLIT na dowolny system operacyjny
    1. Pobierz FLLIT z następującego linku Github: https://github.com/BII-wushuang/FLLIT/archive/master.zip. Wyodrębnij zawartość pliku zip.
    2. Pobierz przykładowe zestawy danych z poniższego linku do Dysku Google: https://bit.ly/2EibvNY. Utwórz folder Data w obszarze FLLIT-master/Compiled i umieść foldery zestawu danych w tym katalogu Dane.
  2. Zainstaluj FLLIT w Ubuntu
    1. Przejdź do katalogu FLLIT/Compiled.
    2. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Otwórz w Terminal.
    3. Wydaj następujące polecenie, aby pobrać i zainstalować biblioteki wykonawcze MATLAB w celu $HOME/MCR:
      bash MCR_2016a.sh
    4. Po zakończeniu instalacji bibliotek wykonawczych MATLAB wydaj następujące polecenie, aby upewnić się, że FLLIT ma prawa do pliku wykonywalnego:
      chmod +x FLLIT
    5. Otwórz terminal w katalogu FLLIT/Compiled i wydaj następujące polecenie, aby wykonać FLLIT:
      bash run_FLLIT.sh $HOME/MCR/v901
  3. Zainstaluj FLLIT w systemie Windows
    1. W przypadku wersji 7 i 10 Home Edition zainstaluj program Docker Toolbox pod adresem:
      (https://github.com/docker/toolbox/releases/download/v19.03.1/DockerToolbox-19.03.1.exe).
    2. W przypadku systemu Windows 10 Pro lub Enterprise Edition zainstaluj program Docker Desktop dla systemu Windows pod adresem: (https://download.docker.com/win/stable/Docker\ Desktop\ Installer.exe).
    3. Aby umożliwić wykonywanie aplikacji GUI w kontenerze platformy Docker w systemie Windows, najpierw zainstaluj VcXSrV (https://sourceforge.net/projects/vcxsrv). Po uruchomieniu VcXsrv skonfiguruj ustawienia, jak pokazano na rysunku S1.
      UWAGA: Upewnij się, że Docker i VcXsrv są uruchomione przed uruchomieniem FLLIT.
    4. Kliknij dwukrotnie FLLIT.bat, aby uruchomić FLLIT.
      UWAGA: Podczas wykonywania po raz pierwszy pobranie obrazu platformy Docker z usługi Docker Hub zajmie trochę czasu.
  4. Zainstaluj FLLIT w systemie MacOS
    1. Pobierz program Docker Desktop dla systemu MacOS pod adresem https://download.docker.com/mac/stable/Docker.dmg
    2. Zainstaluj socat, otwierając terminal i wydając następujące polecenie:
      Napar Zainstaluj Socat
    3. Rozpocznij socat od:
      socat TCP-LISTEN:6000,reuseaddr,fork UNIX-CLIENT:\"$DISPLAY\" & disware
    4. Zainstaluj XQuartz (https://www.xquartz.org), aby umożliwić wykonywanie aplikacji GUI w kontenerze Docker w systemie MacOS. Uruchom XQuartz i zmień preferencje, zaznaczając opcję Zezwalaj na połączenia od klientów sieciowych na karcie Zabezpieczenia, jak pokazano na rysunku S2.
      UWAGA: Upewnij się, że Docker, socat i XQuartz są uruchomione przed uruchomieniem FLLIT.
    5. Otwórz terminal w katalogu FLLIT/Compiled i uruchom FLLIT za pomocą następującego polecenia:
      bash FLLIT_Mac.sh
      UWAGA: Podczas wykonywania po raz pierwszy pobranie obrazu platformy Docker z usługi Docker Hub zajmie trochę czasu.

5. Uruchamianie FLLIT do automatycznego śledzenia nóg

  1. segmentacja
    1. Przekonwertuj wideo na pojedyncze pliki TIFF i skopiuj je do folderu danych FLLIT.
    2. Uruchom FLLIT (w Ubuntu kliknij prawym przyciskiem myszy, aby otworzyć FLLIT w Terminalu).
    3. Wybierz folder zawierający obrazy TIFF klatka po klatce wideo, które chcesz śledzić, i kliknij przycisk Dodaj.
    4. W oknie podręcznym wybierz wartość 0, aby przeprowadzić tylko segmentację nóg, lub 1, aby uwzględnić śledzenie nóg z segmentacją nóg
      5. .
    5. Kliknij Gotowe, aby rozpocząć segmentację i śledzenie wybranego filmu.
  2. Śledzenia
    1. Aby sprawdzić dokładność śledzenia i przeprowadzić korekty błędów (jeśli występują), kliknij Wybierz folder danych. Wybierz folder, który chcesz śledzić, i kliknij przycisk Otwórz.
    2. Kliknij View Tracking.
      UWAGA: Sprawdź, czy tryb przeglądarki pozostaje wybrany podczas przeglądania śledzonych pozycji nóg. W przeciwnym razie wszelkie wcześniejsze poprawki zostaną zastąpione.
    3. Sprawdź oznaczenia wszystkich nóg w pierwszej ramce
      UWAGA: Ponieważ etykiety nóg są umieszczone zgodnie z pozycją na ekranie, jeśli mucha idzie w pozycji pionowej, PRAWA strona muchy jest oznaczona jako L1 (przednia noga), L2 (środkowa noga), L3 (tylna noga), a LEWA strona muchy jest oznaczona odpowiednio jako R1 (przednia noga), R2 (środkowa noga), R3 (tylna noga) (Rysunek 3). Jeśli mucha idzie do góry nogami, etykiety nóg zostaną poprawnie oznaczone.
    4. Jeśli noga jest błędnie oznaczona i wymagana jest korekta, kliknij przycisk Wstrzymaj wyświetlanie, a następnie Dostosuj przewidywanie (Rysunek 3).
    5. W prawym panelu zatytułowanym Noga do regulacji wybierz ramię, które wymaga korekty.
    6. Kliknij dwukrotnie odpowiednią pozycję dla tej nogi w oknie obrazu, kliknij Zapisz, a następnie Wyjdź. Aby przejść do poprzedniej lub kolejnej klatki, kliknij przycisk Wstrzymaj wyświetlanie, a następnie odpowiednio przyciski do przodu i do tyłu i I> (Rysunek 3).
    7. Aby poprawić nieprawidłowo odtworzone filmy, otwórz folder Dane filmu, który ma zostać ponownie odtworzony, i wybierz opcję Ręcznie rozpocznij śledzenie.
    8. Kliknij przycisk Śledzenie, który zmieni etykietę na Początkowy.
    9. Kliknij opcję Dostosuj przewidywanie i skoryguj etykiety ramion, klikając dwukrotnie każdą końcówkę ramienia, a następnie przypisując jej odpowiednią etykietę ramienia. Kliknij Zapisz i wyjdź.
    10. Kliknij Wznów, aby rozpocząć śledzenie.
  3. Przetwarzanie danych i generowanie wideo
    1. Kliknij na Data Process (Proces danych). W wyskakującym okienku wpisz liczbę klatek na sekundę (fps), z jaką zostały nagrane filmy (np. 1,000 fps).
    2. Użyj poniższego równania, aby obliczyć rzeczywiste pole widzenia przechwyconego wideo, tak aby parametry chodu można było mierzyć w milimetrach:

      figure-protocol-1

      UWAGA: Na przykład, jeśli rzeczywisty rozmiar komory wynosi 7 mm, szerokość ramki obrazu wynosi 137 mm, szerokość komory w ramce obrazu na ekranie komputera wynosi 81 mm, a szerokość pola widzenia wynosi 11,83 mm (rysunek S3).
    3. Aby wyświetlić wyniki śledzenia, przejdź do folderu Śledzenie w folderze Wyniki.
    4. Aby wygenerować film ze śledzoną muchą, wybierz opcję Utwórz wideo. Film zostanie zapisany w tym samym folderze Wyniki, w którym znajdują się oryginalne analizowane dane wideo.
      UWAGA: Można wybrać klatkę początkową (pierwszą) i końcową (ostatnią) filmu.
  4. Normalizacja długości ciała każdej muchy.
    UWAGA: Ponieważ każda mucha może nieznacznie różnić się rozmiarem, niektóre parametry chodu powinny być znormalizowane do długości ciała każdej muchy, aby ułatwić porównania (np. długość kroku może być dłuższa u większych much i krótsza u mniejszych).
    1. Otwórz trzy nieruchome obrazy z filmu każdej muchy (zwykle pierwszą, środkową i ostatnią klatkę) za pomocą oprogramowania do tworzenia obrazów.
    2. Powiększ każdą klatkę obrazu do 800% i oznacz najbardziej wysunięty do przodu piksel głowy i najbardziej tylny piksel brzucha na linii środkowej za pomocą jasnego koloru (np. żółtego).
    3. Otwórz obrazy oznaczone etykietami w ImageJ.
    4. Użyj opcji Ustaw skalę, aby wprowadzić odpowiednią skalę: Ustaw odległość w pikselach: 512; Znana odległość: rzeczywiste pole widzenia (mm) mierzone w kroku 5.3.2; Jednostka długości: mm.
    5. Narysuj linię prostą między oznaczonymi pikselami głowy i czubka brzucha, aby uzyskać długość ciała.
    6. Otwórz ponownie Ustaw skalę, aby uzyskać wartość w znanej odległości, która jest długością ciała w mm.
    7. Weź średnią długości określonej na każdym z trzech obrazów, aby uzyskać średni rozmiar ciała w mm.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po segmentacji nóg, śledzeniu i przetwarzaniu danych, FLLIT automatycznie generuje surowe dane dla pozycji ciała i każdego pazura nogi, 20 parametrów chodu, 5 wykresów i śledzonego wideo (Tabela 1).

Tutaj demonstrujemy te analizy za pomocą modelu muchowego ataksji rdzeniowo-móżdżkowej 3 (SCA3). Sterownik panneuronalny Elav-GAL4 został użyty do napędzania albo pełnowymiarowego ludzkiego SCA3 typu dzikiego z 27 glutaminami w przewodzie polyQ (UAS-SCA3-flQ27), albo pełnowymiarowego zmutowanego ludzkiego SCA3 z 84 glutaminami w przewodzie polyQ (UAS-SCA3-flQ84)11. SCA3 charakteryzuje się ataksyjnym chodem z skręcaniem ciała, nieregularnym ułożeniem stopy i krótkimi, chwiejnymi krokami12,13 (Tabela 2). Aby scharakteryzować chód zmutowanych much SCA3 i zbadać, czy wykazują one chód podobny do chodu u ludzi, przeanalizowaliśmy odpowiednie parametry chodu generowane przez FLLIT, a mianowicie: liczbę obrotów ciała, regularność odcisku palca, nakładanie się domen nóg i rozmiary oraz długości kroku nóg (Tabela 2).

Odkryliśmy, że muchy SCA3-Q84 wykazywały więcej skrętów (Rysunek 4A,A'), nieregularne ułożenie stóp, co przejawia niska regularność śladu (powiększone odchylenia standardowe klasy AEP14) (Rysunek 4B), zwiększone nakładanie się domen nóg (Rysunek 4C-D), powiększone domeny nóg pod względem długości i powierzchni (Rysunek 4E,F) i zmniejszoną długość kroku (Rysunek 4G).

FLLIT generuje również film pokazujący śledzoną muchę i nogi w widokach wyśrodkowanych na arenie i wyśrodkowanych na ciele, trajektorię ciała i kierunek kierunku kierunku oraz pionowe i boczne przemieszczenia każdej nogi (Rysunek 5). Śledzone filmy umożliwiają porównanie ruchów nóg u różnych much. Reprezentatywne filmy much Elav-GAL4>SCA3-flQ27 (Wideo 1) i Elav-GAL4>SCA3-flQ84 (Wideo 2) pokazują, że w porównaniu z muchami Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ27 (Rysunek 5A), muchy Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ84 (Rysunek 5B) wykazują nieregularne, przecinające się domeny nóg o różnych rozmiarach, co wskazuje na chwiejny, ataksyjny chód.

figure-results-1
Rysunek 1. Konfiguracja stacji nagraniowej i areny. Nagrania z (A) przodu i (B) z boku. (C) Przykład areny używanej do wykonywania nagrań much do śledzenia FLLIT. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Widok aktywnego okna podczas nagrywania chodu muchowego za pomocą kamery z podwójną głowicą, która umożliwia jednoczesne nagrywanie dwóch much. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Aktywne okno FLLIT pokazujące panel przycisków i oznaczone nóżki po segmentacji i śledzeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Reprezentatywne dane wygenerowane przez FLLIT dla istotnych parametrów chodu much wykazujących ekspresję typu dzikiego (SCA3-flQ27) w porównaniu ze zmutowanym (SCA3-flQ84) SCA3. (A) Liczba zakrętów trajektorii ciała. (B) Regularność odcisków stóp w środkowej części nogi znormalizowana do długości ciała. (C-C') Przebyte domeny odnóg każdej odnogi. (D) Domeny nakładają się na siebie między odnogami. (E) Długość domeny środkowej nogi znormalizowana do długości ciała. (F) Obszar domeny środkowej nogi znormalizowany do długości ciała2. (G) Długość kroku w połowie nogi znormalizowana do długości ciała. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Migawka reprezentatywnych filmów generowanych przez FLLIT. (A) Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ27 oraz (B) Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ84 lata. Kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Wideo 1: Reprezentatywny film muchy wyrażającej pan-neuronalnego ludzkiego człowieka typu dzikiego o pełnej długości SCA3 (Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ27). Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

figure-results-7
Wideo 2: Reprezentatywne wideo muchy wykazującej ekspresję panneuronalnie zmutowanego ludzkiego SCA3 na całej długości (Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ84). Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

figure-results-8
Rysunek uzupełniający 1: Konfiguracje dla VcXSrv. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek uzupełniający 2: Konfiguracja dla Xquartz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rysunek uzupełniający 3: Obraz oznaczony wymiarami potrzebnymi do obliczenia pola widzenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

kategoriaParametryopisPlik/wykres (jeśli dotyczy)
Surowe danePozycja ciałaWspółrzędne pozycyjne środka ciężkości ciała w każdej klatcePierwsze dwie kolumny CoM.csv
Trajektoria ciałaKąt obrotu osi ciała w stopniach (względem osi y)Trzecia kolumna CoM.csv
Pazur na nogi skoncentrowany na arenie
Pozycji		Współrzędne pozycyjne każdego pazura nogi w każdej klatce na podstawie współrzędnych arenytrajectory.csv
Pazur na nogę skoncentrowany na ciele
Pozycji		Współrzędne pozycyjne każdego pazura nogi w każdej klatce
na podstawie współrzędnych areny		norm_trajectory.csv
Ruch ciałaDługość korpusu (mm)Długość zwierzęcia z próbki oszacowana w każdej klatce (od najbardziej wysuniętej do przodu pozycji na głowie do najbardziej tylnej
pozycja na skrzydłach)		bodylength.csv
Chwilowa prędkość ciała
(mm/s)		Chwilowa prędkość ciała (środek ciężkości) w próbce zwierzęcejBodyVelocity.csv; BodyVelocity.pdf
Punkty zwrotne ciała
tor		Aby zlokalizować punkty zwrotne, trajektoria jest redukowana do krzywej liniowej za pomocą Dougl asâASPeucker
algorytm, zgodnie z którym zdarzenie skrętu jest identyfikowane jako obejmujące kąt > 50 stopni między dwoma sąsiadującymi
odcinki liniowe stanowiące uproszczoną trajektorię		BodyTrajectory.pdf
Indywidualne parametry krokuCzas trwania kroku (ms)Czas trwania zdarzenia krokowegoStrideParameters.csv
Okres kroku (ms)Czas trwania od jednego kroku do następnego
Przemieszczenie kroku (mm)Przemieszczenie pazura nogi podczas kroku
Pokonana ścieżka kroku (mm)Całkowita ścieżka pokonana przez pazur nogi podczas kroku
Skrajne położenie przednie
(mm)		Pozycja lądowania (względem tułowia) pazura nogi na końcu kroku
Skrajne położenie tylne (mm)Pozycja startowa (w stosunku do tułowia) pazura nogi na początku kroku
Amplituda kroku (mm)Przemieszczenie wzdłuż kierunku ruchu dla zdarzenia krokowego
Liniowość postawy (mm)Zdefiniowane jako odchylenie toru kroku od krzywej wygładzonej (w odstępach 20 ms) odpowiadającej jej przedniej
i tylne skrajne pozycje kroku
Rozciąganie kroku (mm)Odległość ułożenia pazurów nóg od środka ciała w trakcie kroku
Ruch nógPrędkość nóg (mm/s)Prędkość chwilowa każdej nogiLegSpeed.csv; Gait.pdf
Wskaźnik choduMierzy to rodzaj koordynacji chodu wykazywanej przez (sześcionożną) próbkę zwierzęcia podczas jego ruchu. Chód
Indeks 1 odpowiada chodowi trójnogowemu, _1 odpowiada chodowi czworonoga, a 0 odpowiada chodowi niekanonicznemu.
W naszej implementacji wskaźnik chodu jest uzyskiwany przez średnią ruchomą z okna 120 ms		GaitIndex.csv; GaitIndex.pdf
Procent ruchuProcent czasu, w którym noga jest w ruchuLegParameters.csv
Średni czas kroku (ms)Średni czas trwania od jednego kroku do następnegoLegParameters.csv
Regularność śladu (mm)Mierzone jako odchylenia standardowe tylnego i tylnegoLegParameters.csv
skrajne pozycje przednie nogi
Obszar domeny trajektorii nóg
(mm2)		Obszar minimalnie wypukłego kadłuba, który zawiera całą trajektorię ramienia w układzie odniesienia wyśrodkowanym na cieleLegParameters.csv; LegDomain.pdf
Długość i szerokość
Domena trajektorii nóg (mm)		Uzyskiwane poprzez maksymalną rzutowaną odległość pozycji pazurów na główny (długość domeny) i minor
(szerokość domeny) osie główne		LegParameters.csv
Przecięcie/nakładanie się domen nóg
(mm2)		Przecięcie/nakładanie się na siebie każdego możliwegoLegDomainOverlap.csv
Szerokość podporu (mm)Średnia odległość między AEP i PEP lewej i środkowej nogiStanceWidth.csv

Tabela 1: Parametry chodu generowane przez FLLIT.

funkcja chodu
Cechy chodu ataksji rdzeniowo-móżdżkowej 3 (SCA3)SkręcanieNiekonsekwentne ułożenie stopy i skrzyżowanie nógChwiejne krokiKrótkie kroki
Parametr pomiaruLiczba zdarzeń skrętu ciałaRegularność śladu węglowegoRozmiar domen odnóg, stopień nakładania się domenDługość kroku
Plik FLLITBodyTrajectory.pdfLegParameters.csvLegDomainOverlap.csvStrideParameters.csv

Tabela 2: Tabela przedstawiająca charakterystyczne cechy chodu SCA3 u pacjentów z odpowiadającymi im parametrami FLLIT i plikami wyjściowymi.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym manuskrypcie szczegółowo opisujemy etapy związane z użyciem FLLIT, zautomatyzowanego programu uczenia maszynowego1, do analizy chodu u swobodnie chodzących Drosophila. Po śledzeniu i analizie danych, FLLIT automatycznie generuje surowe dane dla informacji o położeniu ciała i pazurów nóg, tworząc dwadzieścia cech ciała i chodu, a także wideo śledzonej muchy, aby umożliwić wizualizację chodu.

Obecnie istnieje wiele metod śledzenia ruchów nóg Drosophila i innych zwierząt 1,2,3,4,14,15,16, co daje naukowcom szeroki zakres opcji w zależności od celów eksperymentu. Niektóre z nich są oparte na odciskach stóp, które są bardzo dokładne, ale podają tylko punkty styku pazurów z powierzchnią wykrywania 4,14. Z drugiej strony, najnowsze podejścia do głębokiego uczenia 2,3,16 są bardzo wszechstronne, umożliwiając analizę zachowań, które wymagają śledzenia stawów nóg i innych części ciała u dowolnego zwierzęcia, z zastrzeżeniem, że algorytmy muszą być najpierw przeszkolone za pomocą zestawów danych z adnotacjami użytkownika. Trzeci rodzaj podejścia wykorzystuje morfologię lub metody oparte na kontraście obrazu 1,15,17 w celu znalezienia konturu każdej nogi w celu zidentyfikowania pozycji pazurów. Ogólnie rzecz biorąc, metody te słabo radzą sobie z zachowaniami, w których nogi się krzyżują (np. podczas pielęgnacji). FLLIT łączy w sobie drugie i trzecie podejście, wykorzystując parametry morfologiczne do wytrenowania algorytmu zwiększania segmentacji nóg. Dzięki temu FLLIT może ominąć pracochłonne zadanie adnotacji użytkownika w celu wygenerowania zestawu danych treningowych, jednocześnie zwiększając dokładność dzięki uczeniu maszynowemu. Przyszłe ulepszenia FLLIT będą musiały radzić sobie z przypadkami, w których nogi się krzyżują, aby umożliwić analizę bardziej złożonych zachowań.

FLLIT jest odporny na niewielkie zmiany oświetlenia, rozdzielczości nagrywania i szybkości klatek1. Jednak szybkość klatek nagranych filmów nie powinna spaść poniżej 250 kl./s, a FLLIT działa optymalnie dla filmów nagranych z szybkością 1000 kl./s. Jeśli na obrazach występuje rozmycie ruchu, które sprawia, że osoba dokonująca adnotacji ma trudności z określeniem pozycji nóg, FLLIT nie będzie w stanie dokładnie zidentyfikować końcówek nóg w tych ramkach. W związku z tym ważne jest, aby aparat był ostro ustawiony na końcówkach nóg. Aby zapobiec artefaktom segmentacji, arena powinna być dokładnie wyczyszczona i nie powinna być przesuwana podczas nagrywania. Aby uzyskać dokładne odejmowanie tła i czystą segmentację, mucha powinna przesunąć się o co najmniej jedną długość ciała podczas nagrywania, bez zatrzymywania się. Po automatycznej segmentacji i śledzeniu należy sprawdzić oznakowanie wszystkich odcinków. Jeśli chód muchy nie jest śledzony lub jest śledzony nieprawidłowo, plik powinien zostać ponownie odtworzony ręcznie za pomocą opcji Ręczne inicjowanie śledzenia (kroki 5.2.7 – 5.2.10).

Choroby neurodegeneracyjne i zaburzenia ruchowe są coraz bardziej powszechne w naszych starzejących się społeczeństwach. Modele neurodegeneracji much są badane od ponad 2 dekad, podczas których poczyniono postępy w zakresie molekularnych i komórkowych aspektów patofizjologii chorób. Jednak konkretne behawioralne konsekwencje choroby były technicznie trudne do oceny. Na przykład, podczas gdy doniesienia o drgawkach u muchy zostały wykonane18,19, nie były one badane ilościowo aż doniedawna1. Test wspinaczkowy był użytecznym i ilościowym, ale stosunkowo zgrubnym pomiarem6. Ten deficyt techniczny w podobny sposób utrudniał analizę ruchu w wysokiej rozdzielczości w innych modelach zwierzęcych. Pojawienie się nowych narzędzi do analizy behawioralnej daje nadzieję na odmłodzenie dziedziny zaburzeń ruchowych, aby umożliwić naukowcom zbadanie, w jaki sposób molekularne i komórkowe mechanizmy chorób nerwowo-mięśniowych prowadzą do określonych wyników behawioralnych w modelach zwierzęcych. W tym artykule i w naszej poprzedniej pracy1 wykazaliśmy za pomocą FLLIT, że modele muchowe SCA3 wykazują hiperkinetyczny chód ataksyjny, podczas gdy modele much PD wykazują hipokinetyczny sztywny chód, rekapitulując cechy charakterystyczne ruchu odpowiednich chorób człowieka1. Analiza chodu umożliwiła nam również zidentyfikowanie odrębnych populacji neuronów leżących u podstaw określonych dysfunkcji ruchowych. Idąc dalej, szczegółowa analiza ruchu, w połączeniu z potężnymi narzędziami obrazowania i funkcjonalnymi dostępnymi w locie, pozwoli nam uzyskać nowy wgląd w mechanizmy dysfunkcji lokomotorycznej, rzucając światło na nasze zrozumienie chorób neurodegeneracyjnych w odniesieniu do mechanizmów obwodów.

FLLIT powinien mieć szerokie zastosowanie w badaniu chodu u innych małych stawonogów, ponieważ wcześniej wykazano, że jest bardzo dokładny w śledzeniu ruchów nóg pająka1. Chociaż skupiamy się tutaj na wykorzystaniu szczegółowego fenotypowania ruchu do ilościowego określania chodu patogennego i jego podstawowych obwodów, postępy w śledzeniu ruchu już zrewolucjonizowały i będą miały ciągły wpływ na zrozumienie normalnej koordynacji chodu i chodu oraz jego podstawowych obwodów, zwłaszcza w niezliczonych różnych gałęziach drzewa ewolucyjnego.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Moumita Chatterjee i Alice Liu za wsparcie techniczne, a także Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana, USA) za udostępnienie szczepów Drosophila użytych w tej pracy. Prace te były wspierane przez Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej w Singapurze; Instytut Bioinformatyki w Singapurze; Organizacja Wspólnej Rady Agencji ds. Nauki, Technologii i Badań Naukowych (grant nr 15302FG149 dla SA i LC); Flagowy Program Badań Klinicznych (Choroba Parkinsona) zarządzany przez Krajową Radę ds. Badań Medycznych Ministerstwa Zdrowia Singapuru (grant nr NMRC/TCR/013-NNI/2014 dla SA), University of Alberta (grant dla start-upu dla LC) oraz grant odkrywczy Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) (numer grantu RGPIN-2019-04575 dla LC).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Arkusze akryloweDamao grubości 1,6 mm, przezroczyste arkuszeSingapur, Singapur
Przezroczyste szkło szkiełkoweBiomediaBMH 880101Singapur, Singapur
Szybka kameraPhotronFastcam MC2.1Tokio, Japonia. Czas otwarcia migawki wynoszący 1 ms lub krótszy jest idealny do zmniejszenia rozmycia ruchu na zarejestrowanych obrazach
LED na podczerwień- ogólna ze sklepu z narzędziamiTablica światła podczerwonego 940 nmSingapur, Singapur
KimberlyClark34155-01LSIrving, Teksas, USA
Dowolna dioda

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, S., et al. Fully automated leg tracking of Drosophila neurodegeneration models reveals distinct conserved movement signatures. PLoS Biology. 17 (6), 3000346(2019).
  2. Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 19, 1281-1289 (2018).
  3. Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nature Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
  4. Machado, A. S., Darmohray, D. M., Fayad, J., Marques, H. G., Carey, M. R. A quantitative framework for whole-body coordination reveals specific deficits in freely walking ataxic mice. eLife. 4, (2015).
  5. Lu, B., Vogel, H. Drosophila models of neurodegenerative diseases. Annual Reviews in Pathology. 4, 315-342 (2009).
  6. McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an In Vivo Model for Human Neurodegenerative Disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
  7. Dionne, H., Hibbard, K., Cavallaro, A., Kao, J. -C., Rubin, G. M. Genetic reagents for making split-GAL4 lines in Drosophila. bioRxiv. , (2017).
  8. Cande, J., et al. Optogenetic dissection of descending behavioral control in Drosophila. eLife. 7, (2018).
  9. Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), 2967-2976 (2015).
  10. Xie, T., et al. A Genetic Toolkit for Dissecting Dopamine Circuit Function in Drosophila. Cell Reports. 23 (2), 652-665 (2018).
  11. Warrick, J. M., et al. Ataxin-3 suppresses polyglutamine neurodegeneration in Drosophila by a ubiquitin-associated mechanism. Molecular Cell. 18 (1), 37-48 (2005).
  12. Ebersbach, G., et al. Comparative analysis of gait in Parkinson's disease, cerebellar ataxia and subcortical arteriosclerotic encephalopathy. Brain. 122 (7), 1349-1355 (1999).
  13. Stolze, H., et al. Typical features of cerebellar ataxic gait. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 73 (3), 310-312 (2002).
  14. Mendes, C. S., Bartos, I., Akay, T., Marka, S., Mann, R. S. Quantification of gait parameters in freely walking wild type and sensory deprived Drosophila melanogaster. eLife. 2, 00231(2013).
  15. DeAngelis, B. D., Zavatone-Veth, J. A., Clark, D. A. The manifold structure of limb coordination in walking Drosophila. eLife. 8, (2019).
  16. Gunel, S., et al. DeepFly3D, a deep learning-based approach for 3D limb and appendage tracking in tethered, adult Drosophila. eLife. 8, (2019).
  17. Isakov, A., et al. Recovery of locomotion after injury in Drosophila melanogaster depends on proprioception. The Journal of Experimental Biology. 219, Pt 11 1760-1771 (2016).
  18. Aw, S. S., Lim, I. K. H., Tang, M. X. M., Cohen, S. M. A Glio-Protective Role of mir-263a by Tuning Sensitivity to Glutamate. Cell Reports. 19 (9), 1783-1793 (2017).
  19. Eberl, D. F., Duyk, G. M., Perrimon, N. A genetic screen for mutations that disrupt an auditory response in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14837-14842 (1997).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza choduruchy Drosophilaautomatyczna segmentacjakamera wysokich pr dko ciataxia spinocerebellarnaledzenie pazur w odn ysk ad cia aparametry chodu

Powiązane artykuły