Wykrywanie S-acylacji białek za pomocą wychwytywania wspomaganego żywicą acylową

Podsumowanie

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) to wysoce czuła, niezawodna i łatwa do wykonania metoda wykrywania odwracalnej modyfikacji lipidów reszt cysteiny (S-acylacji) w różnych próbkach biologicznych.

Streszczenie

S-acylacja białek, zwana również S-palmitoilacją, jest odwracalną potranslacyjną modyfikacją reszt cysteiny z długołańcuchowymi kwasami tłuszczowymi za pomocą labilnego wiązania tioestrowego. S-acylacja, która staje się powszechnym mechanizmem regulacyjnym, może modulować prawie wszystkie aspekty aktywności biologicznej białek, od tworzenia kompleksów po transport białek i stabilność białek. Niedawny postęp w zrozumieniu biologicznej funkcji acylacji białka S został osiągnięty w dużej mierze dzięki opracowaniu nowych narzędzi biochemicznych umożliwiających solidne i czułe wykrywanie acylacji białka S w różnych próbkach biologicznych. W tym miejscu opisujemy wychwytywanie wspomagane żywicą acylową (Acyl-RAC), niedawno opracowaną metodę opartą na selektywnym wychwytywaniu endogennych białek S-acylowanych przez reaktywne tiolowo kulki sefarozy. W porównaniu z istniejącymi podejściami, Acyl-RAC wymaga mniejszej liczby kroków i może dać bardziej wiarygodne wyniki w połączeniu ze spektrometrią mas w celu identyfikacji nowych celów acylacji S. Głównym ograniczeniem w tej technice jest brak możliwości rozróżnienia między gatunkami kwasów tłuszczowych przyłączonymi do cystein za pomocą tego samego wiązania tioestrowego.

Wprowadzenie

S-acylacja to odwracalna modyfikacja potranslacyjna, polegająca na dodaniu tłuszczowego łańcucha acylowego do wewnętrznej reszty cysteiny na docelowym białku za pomocą labilnego wiązania tioestrowego¹. Po raz pierwszy doniesiono o tym, że jest to modyfikacja białek z palmitynianem, nasyconym 16-węglowym kwasem tłuszczowym², i dlatego ta modyfikacja jest często określana jako S-palmitoilacja. Oprócz palmitynianu, białka mogą być odwracalnie modyfikowane przez różne dłuższe i krótsze nasycone (mirystynian i stearynian), jednonienasycone (oleinian) i wielonienasycone (arachidonian i eikozapentanian) kwasy tłuszczowe^3,4,5^,6,7. W komórkach eukariotycznych acylacja S jest katalizowana przez rodzinę enzymów znanych jako acylotransferazy białek DHHC, a odwrotna reakcja deacylacji cysteiny jest katalizowana przez tioesterazy białkowe, z których większość nadal pozostaje enigmatyczna⁸.

Labilność wiązania tioestrowego sprawia, że ta modyfikacja lipidów jest odwracalna, co pozwala na dynamiczną regulację grupowania białek, lokalizacji błony plazmatycznej, transportu wewnątrzkomórkowego, interakcji białko-białko i stabilności białka9^,10. W związku z tym S-acylacja została powiązana z kilkoma zaburzeniami, w tym z chorobą Huntingtona, chorobą Alzheimera i kilkoma rodzajami raka (prostata, żołądek, pęcherz moczowy, płuca, jelito grube), co wymaga opracowania niezawodnych metod wykrywania tej potranslacyjnej modyfikacji białka¹¹.

Metaboliczne znakowanie radioaktywnym ([³H], [¹⁴C] lub [¹²⁵I]) palmitynianem było jednym z pierwszych podejść opracowanych do oznaczania białka S-acylation^12,13,14. Jednak metody oparte na radioznakowaniu stwarzają problemy zdrowotne, nie są zbyt czułe, czasochłonne i wykrywają lipidację tylko bardzo obfitych białek¹⁵. Szybszą i nieradioaktywną alternatywą dla znakowania radioaktywnego jest znakowanie metaboliczne za pomocą bioortogonalnych sond kwasów tłuszczowych, które jest rutynowo stosowane do oznaczania dynamiki białka S-acylation¹⁶. W tej metodzie kwas tłuszczowy z reporterem chemicznym (grupa alkinowa lub azydkowa) jest włączany do białka S-acylowanego przez acylotransferazę białkową. Reakcja cykloaddycji azydowo-alkinowej Huisgen (chemia kliknięć) może być następnie wykorzystana do przyłączenia funkcjonalizowanej grupy, takiej jak fluorofor lub biotyna, do zintegrowanego kwasu tłuszczowego, co pozwala na wykrycie białka S-acylowanego ^17,18,19.

Wymiana acylo-biotyny (ABE) jest jedną z szeroko stosowanych metod biochemicznych do wychwytywania i identyfikacji białek S-acylowanych, która omija niektóre niedociągnięcia etykietowania metabolicznego, takie jak nieprzydatność dla próbek tkanek¹⁵. Metoda ta może być stosowana do analizy acylacji S-acylacji w różnorodnym zakresie próbek biologicznych, w tym tkanek i próbek zamrożonych komórek^20,21. Metoda ta opiera się na selektywnym rozszczepieniu wiązania tioestrowego między grupą acylową a resztą cysteiny przez obojętną hydroksyloaminę. Uwolnione grupy tiolowe są następnie wychwytywane za pomocą reaktywnej tiolowo-pochodnej biotyny. Wygenerowane biotynylowane białka są następnie oczyszczane pod względem powinowactwa za pomocą agarozy streptawidyny i analizowane za pomocą immunoblottingu.

Alternatywne podejście zwane wychwytywaniem wspomaganym żywicą acylową (Acyl-RAC) zostało później wprowadzone w celu zastąpienia etapu biotynylacji bezpośrednią koniugacją wolnych cystein przez żywicę reagującą z tiolem^22,23. Ta metoda składa się z mniejszej liczby etapów w porównaniu do ABE i podobnie może być stosowana do wykrywania S-acylacji białek w szerokim zakresie próbek¹.

Acyl-RAC składa się z 4 głównych etapów (Rysunek 1),
1. Blokowanie wolnych grup tiolowych;
2. Selektywne rozszczepienie wiązania cysteina-acyl tioester z obojętną hydroksyloaminą (HAM) w celu odsłonięcia grup tiolowych cysteiny;
3. Wychwytywanie lipidowanych cystein za pomocą żywicy reagującej z tiolami;
4. Selektywne wzbogacanie białek S-acylowanych po elucji buforem redukującym.

Uchwycone białka mogą być następnie analizowane za pomocą immunoblottingu lub poddawane proteomice opartej na spektrometrii mas (MS) w celu oceny proteomu S-acylowanego w różnych gatunkach i tkankach^22,24,25. Poszczególne miejsca acylacji S można również zidentyfikować poprzez trawienie trypsyną wychwyconych białek i analizę powstałych peptydów za pomocą LC-MS/MS²². W tym miejscu pokazujemy, w jaki sposób acyl-RAC może być używany do jednoczesnego wykrywania S-acylacji wielu białek zarówno w linii komórkowej, jak i w próbce tkanki.

Protokół

Myszy użyte w tym protokole zostały poddane eutanazji zgodnie z wytycznymi NIH. Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Teksańskiego w Houston zatwierdził wszystkie prace związane ze zwierzętami.

1. Przygotowanie lizatów komórkowych

1. Przygotować bufor do lizy zgodnie z opisem w Tabeli 1. Do 10 ml PBS dodać 0,1 g detergentu n-dodecyl β-D-maltozydu (DDM) i obrócić do rozpuszczenia. Dodać 100 μl koktajlu inhibitorów fosfatazy 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM) i koktajlu inhibitorów proteazy (1x) i schłodzić bufor na lodzie przed użyciem.
2. Przenieść wymagane podłoże zawierające komórki z inkubatora do stożkowych probówek o pojemności 15 ml lub 50 ml i wirować komórki przy 350 x g przez 5 minut i aspirować, aby pozbyć się wszelkich resztek komórek.
   UWAGA: Użyliśmy 1 x 10⁷ komórek do każdej reakcji acyl-RAC, która miała zostać przeprowadzona.
3. Umyj granulkę, ponownie zawieszając ją w 5 ml PBS i wirując w temperaturze 350 x g przez 5 min.
   UWAGA: Wykonaj szybko krok 1.3, aby uniknąć lizy komórek z powodu przedłużonej inkubacji w PBS.
4. Dodać 600 μl buforu do lizy przygotowanego w kroku 1.1 do osadu i poddać go lizie przez wytrząsanie z prędkością 1500 obr./min w wytrząsarce termicznej przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
5. Klarowne lizaty przez odwirowanie w temperaturze 20 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut w celu granulowania materiałów nierozpuszczalnych w detergentach. Zbierz oczyszczony lizat we wstępnie schłodzonych probówkach do mikrofuge o pojemności 1,5 ml i trzymaj je na lodzie.
6. Wykonaj test Bradforda/BCA, aby oszacować stężenie białka. Bardzo ważne jest, aby przed przeprowadzeniem eksperymentu zapewnić taką samą ilość białka w różnych próbkach. Zalecamy stosowanie co najmniej 500 μg białka na reakcję.
   UWAGA: W opisanych eksperymentach wykorzystaliśmy hodowane komórki (Jurkat) i pierwotne splenocyty z tkanek myszy. Opisana powyżej metoda lizy może być również zastosowana do innych typów komórek. Średnie stężenie białka uzyskane dla wyżej wymienionych typów komórek wynosi około 500 μg na 1 x 10⁷ komórek. Komórki Jurkata utrzymywano w pożywce RPMI-1640 zmodyfikowanej tak, aby zawierała 2 mM L-glutaminy, 10 mM HEPES, 1 mM pirogronianu sodu, 4500 mg/L glukozy i 1500 mg/L wodorowęglanu sodu uzupełnionego 10% FBS w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ . Użyliśmy 1 x 10⁷ komórek Jurkata na reakcję. Pierwotne splenocyty wyizolowano z tkanki śledziony myszy zgodnie z opisem²⁶. Krótko mówiąc, tkankę śledziony macerowano na lodzie, a następnie lizowano erytrocyty w roztworze hipotonicznym i oddzielano od limfocytów przez wirowanie. Użyliśmy 1 x 10⁷ komórek pierwotnych na reakcję.

2. Acyl-RAC: Blokowanie wolnych grup tiolowych

UWAGA: Wszystkie kolejne kroki można wykonać w temperaturze pokojowej (RT).

1. Przenieś lizat do świeżej probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml i wykonaj wytrącanie chloroformu i metanolu (CM), jak opisano poniżej.
   1. Dodać metanol (MeOH) i chloroform (_{CHCl 3}) do lizatu w końcowym stosunku lizatu: MeOH: CHCl₃ w stosunku 2:2:1 i energicznie wstrząsnąć, aby uzyskać jednorodną zawiesinę.
   2. Wirować w temperaturze 10 000 x g przez 5 minut, aby uformować granulkę ("naleśnik") na styku faz wodnych i organicznych.
   3. Przechylić probówkę i odessać jak najwięcej rozpuszczalnika za pomocą igły lub końcówki do ładowania żelem.
   4. Wysuszyć granulkę białka na powietrzu przez kilka minut i delikatnie ją umyć, dodając 600 μl MeOH i delikatnie mieszając, aby uniknąć rozdrobnienia granulki
   5. Ostrożnie usuń pozostały MeOH i wysusz granulki białka na blacie przez około 5 minut.
   6. (Opcjonalnie) Wykonaj dodatkowy etap wirowania, aby odwirować wszelkie połamane osady po umyciu MeOH, aby uniknąć utraty próbki.
      UWAGA: Eksperyment można przerwać po etapie wytrącania CM. Po uzyskaniu osadu można go przechowywać w 500 μl MeOH w temperaturze -20 °C do tygodnia.
      1. Rozpuścić osad białkowy w 200 μl buforu 2SHB, wirując w temperaturze 42 °C/1500 obr./min w wytrząsarce termicznej, aż do rozpuszczenia osadu.
   7. (Opcjonalnie) Inkubować przez dodatkowe 5–10 minut w sonikującej łaźni wodnej w celu rozpuszczenia osadu.
      UWAGA: Długość sonikacji różni się w zależności od rozpuszczalności materiału. Jednak długotrwała sonikacja może powodować degradację białek.
2. Przygotować 0,2% metanoetyosiulfonianu metylu (MMTS) (v/v) w 2SHB, dodając 2 μl MMTS do 998 μl buforu 2SHB.
   UWAGA: Do każdego eksperymentu używaj świeżo przygotowanych 0,2% MMTS.
3. Dodaj 200 μl 0,2% MMTS w 2SHB do każdej probówki, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1% MMTS. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 42 °C z wytrząsaniem przy 1500 obr./min w wytrząsarce termicznej.

3. Acyl-RAC: Rozszczepienie hydroksyloaminy (HAM) i wychwyt białek S-acylowanych

1. Powtórz 3-4 opady CM, jak opisano powyżej, aby usunąć MMTS. Usunięcie MMTS można oszacować na podstawie braku wyraźnego zapachu MMTS. Po każdym wytrąceniu rozpuścić osad w 100 μl buforu 2SHB, wirując w temperaturze 42 °C/1500 obr./min w wytrząsarce termicznej, aż do rozpuszczenia osadu, a następnie rozcieńczyć 300 μl buforu A.
2. Po końcowym wytrąceniu rozpuścić próbki w 200 μl buforu 2SHB, jak opisano powyżej, i rozcieńczyć 240 μl buforu A.
3. W przypadku porównywania zmian w acylacji S w odpowiedzi na kilka warunków leczenia, należy ponownie zmierzyć stężenie białka i postępować z równą ilością białka dla każdego stanu.
4. Zachować 40 μl z każdej próbki jako kontrolę wejściową.
5. Podzielić próbki na dwie równe części po 200 μl i oznaczyć probówki jako "+ SZYNKA" i "- SZYNKA". Dodać 50 μl świeżo przygotowanej obojętnej 2 M HAM (pH 7,0-7,5) do końcowego stężenia 400 mM do jednej z probówek (+ szynka) i 50 μl obojętnego 2 M NaCl do drugiej probówki (- SZYNKA), która zostanie użyta jako kontrola ujemna. Przejdź do dodawania kulek tiopropylo-sefarozy (TS).
   UWAGA: Eksperyment można przerwać po dowolnym etapie wytrącania CM. Po uzyskaniu osadu można go przechowywać w 500 μl MeOH w temperaturze -20 °C do tygodnia. Neutralne pH 2 M HAM zapewnia jego selektywność dla wiązania tioestrowego acylo-cysteiny i powinno być starannie dostosowane. Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z próbkami w buforze 2SHB, aby uniknąć utraty próbki z powodu nadmiernego pienienia. Wszystkie poniższe kroki są identyczne dla próbek - HAM i + HAM.
6. Dodać 30 μl zawiesiny perełkowej TS do każdej probówki i obracać probówki przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.
7. Umyj koraliki TS 4x z 1% SDS w buforze A, aby usunąć resztki szynki.
   1. Delikatnie odwirować wszystkie próbki kulek za pomocą mikrofugi przez 1 minutę i ostrożnie odessać supernatant.
   2. Zawiesić kulki w 500 μl 1% SDS w buforze A.
   3. Powtórz kroki 3.7.1–3.7.2 trzy razy.
      UWAGA: Aktywowana tiopropylo-sefaroza (TS) jest dostarczana w postaci liofilizowanej w obecności dodatków, które przed sprzęgnięciem należy zmyć przy neutralnym pH. Do pęcznienia i mycia zalecana jest woda destylowana. Odważyć 0,1 g kulek i ponownie zawiesić w 1 ml wody destylowanej i pozostawić do spęcznienia podczas obracania przez 30 min-1 godzinę w temperaturze suchej masy. Przemyć kulki 1x buforem A i przygotować zawiesinę z buforem A, w proporcji 50% osiadłego podłoża do 50% buforu. Spuchnięty TS może być przechowywany w neutralnym pH w obecności 20% etanolu w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia. Nie należy stosować azydku sodu jako środka bakteriostatycznego, ponieważ jony azydku reagują z grupami dwusiarczkowymi 2-pirydylu. Aby uzyskać wyższą wydajność, przygotuj świeże koraliki. Podczas obchodzenia się ze kulkami końcówkę końcówki do pipet P200 można lekko przeciąć, aby zapobiec uszkodzeniom.
      UWAGA: Eksperyment można przerwać na dowolnym etapie po wytrąceniu CM. Granulat może być przechowywany w 500 μl MeOH w temperaturze -20 °C do tygodnia.

4. Elucja i wykrywanie białek S-acylowanych

1. Po ostatnim praniu delikatnie odkręć kulki zgodnie z powyższym opisem i odessaj jak najwięcej supernatantu, nie naruszając kulek.
2. Odzyskaj białka z kulek za pomocą 4x buforu próbki SDS z naziemną telewizją cyfrową.
   1. Dodać 50 μl 4x buforu do próbki SDS do kulek i inkubować w temperaturze 80 °C, 1500 obr./min przez 15 minut w wytrząsarce termicznej. Niech rurki ostygną.
   2. Odwirować kulki o masie 5 000 x g przez 3 minuty, aby całkowicie zagnieździć kulki i przenieść wymyte białka do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą końcówki do ładowania żelem.
3. Uruchom SDS-PAGE i przeanalizuj S-acylację interesujących białek za pomocą western blot.

Wyniki

Zgodnie z opisanym powyżej protokołem, w pierwszej kolejności zastosowano acyl-RAC do jednoczesnego wykrywania S-acylacji kilku białek w komórkach Jurkat, unieśmiertelnionej linii komórkowej limfocytów T, pierwotnie pochodzącej z krwi obwodowej pacjenta z białaczką limfocytów T²⁷. W celu zademonstrowania użyteczności tej metody wybrano białka limfocytów T regulatorowych, które wcześniej zidentyfikowano jako S-acylowane^9,28,

Dyskusja

W tym przypadku z powodzeniem wykorzystaliśmy test acyl-RAC do wykrywania S-acylacji wybranych białek zarówno w hodowanych komórkach ludzkich, jak i komórkach pierwotnych pochodzących z tkanki myszy. Ta metoda jest prosta, czuła i może być łatwo wykonana przy minimalnych wymaganiach sprzętowych przy użyciu standardowych technik biochemicznych. Wykazano, że metoda ta z powodzeniem identyfikuje nowe białka S-acylowane, takie jak β-podjednostka systemu translokacji białek (Sec61b), białko rybosomalne S11 (Rps11) i mikrosoma...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
cOmplete Inhibitor proteazy Tabletki koktajlowe	Sigma	11836170001
Wirówka Eppendorf 5424	Eppendorf	22620444
Hydroksyloamina (HAM)	Sigma	159417
Metanetylosulfonian metylu (MMTS)	Sigma	64306
Mini rotator rurkowy	LabForce
ML211	Cayman	17630
Multi-Therm Cool-Heat-Shake	Benchmark Scientific	H5000-HC
n-dodecyl β-D-maltozyd (DDM)	Sigma	D641
Koktajl inhibitorów fosfatazy 2	Sigma	P5726
Tiopropylo-sefaroza 6B (TS)	Sigma	T8387
Ultradźwięki Quantrex Sonicator	L &; R