Ten protokół opisuje skuteczne podejście do hybrydyzacji in situ w celu wykrycia poziomów ekspresji mRNA i wzorców przestrzennych docelowych genów w płynie celomicznym Sipunculus nudus.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Hybrydyzacja in situ dla Sipunculus nudus Płyn celomiczny
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Hybrydyzacja in situ (ISH) jest bardzo pouczającą techniką prezentowania wzorców dystrybucji komórkowej określonych genów (np. mRNA i ncRNA) w tkankach. Sipunculus nudus jest kluczowym zasobem rybnym, ponieważ ma wysokie wartości odżywcze i lecznicze. Obecnie badania nad biologią molekularną Sipunculus nudus są wciąż w powijakach. Celem artykułu jest opracowanie czułej metody lokalizacji specyficznego mRNA w płynie celomicznym Sipunculus nudus. Protokół zawiera szczegółowe etapy ISH, w tym przygotowanie antysensowności i rybosondy znakowanej digoksygeniną, pobieranie płynu celomicznego i przygotowanie sekcji, hybrydyzację specyficznej rybosondy, inkubację przeciwciał, barwienie i zabiegi po barwieniu. Przedstawiono reprezentatywne wyniki uzyskane z udanego eksperymentu przy użyciu tej metody. Protokół powinien mieć zastosowanie również do innych gatunków Sipuncula.
Wprowadzenie
ISH, wykorzystując znakowaną sondę kwasu nukleinowego do wykrywania interesującej nas sekwencji DNA lub RNA, jest użyteczną metodą do opisu przestrzennego wzorca ekspresji docelowych genów w morfologicznie zachowanych tkankach1,2,3. Zwykle sekwencja docelowa jest generowana przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), a następnie wykorzystywana jako matryca do syntezy sondy antysensownego / sensownego RNA znakowanej digoksygeniną urydyno-5'-trifosforanem. Próbki są utrwalane i przepuszczalne przed inkubacją za pomocą rybosondy. Po zmyciu nadmiaru sondy, hybrydyzacja jest wizual....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedura dotycząca zwierząt została zatwierdzona przez Komitet ds. Opieki i Dobrostanu Zwierząt Uniwersytetu Huaqiao.
1. Przygotowanie rybosondy
- Wzór podkładu
- Otwórz program Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Skopiuj sekwencję dmrt1 (GenBank: MK182259) do okna sekwencji.
- Ustaw długość podkładu (23-25 pz), temperaturę topnienia (55-60 °C) i zawartość G/C (40-60%). Kliknij opcję Pobierz podkłady.
UWAGA: Minimalny rozmiar wymagany dla sondy RNA to około 500 pz. Dłuższe sondy mają zwykle wyższą specyficzność. - Dodaj sekwencję promotora polimeraz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Podsumowanie etapów przeprowadzania ISH przedstawiono na Rysunku 1. Antysensowne i odpowiadające im sensowne sondy rybo- dla dmrt1 zsyntezowano z produktów PCR amplifikowanych z cDNA płynu w jamie ciała. Autentyczność produktów PCR zweryfikowano poprzez sekwencjonowanie bezpośrednie. Sondy rybo- zsyntezowano przy użyciu polimeraz RNA T7 zgodnie z protokołami producenta oraz wcześniejszym raportem4 z niewielkimi modyfikacjami. Reprezentatywne sygnały ISH przed.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wcześniejsze badania wykazały, że ISH nadaje się do wykrywania wielu docelowych RNA 16,17,18. W tym protokole opisaliśmy metodę ISH o wysokiej rozdzielczości do wykrywania mRNA w płynie celomicznym i podkreślenia zoptymalizowanych warunków hybrydyzacji w Sipunculus nudus. Oczywiste sygnały dmrt1, które zaobserwowaliśmy, wykazały skuteczne zastosowanie tego protokołu w wykrywaniu ekspresji genów (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Fundusz Młodych Naukowców Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 31801034), Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Fujian, Chiny (2016J01161), Fundusze Badań Naukowych Uniwersytetu Huaqiao (15BS306) oraz Fundusz Innowacyjnych Studiów Podyplomowych Uniwersytetu Huaqiao.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anty-digoksygenina-AP Fragmenty Fab Roche | 11093274910 | ||
| zestaw do rozwoju koloru fosfatazy alkalicznej BCIP/NBT | Beyotime | C3206 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma | B2064 | |
| Wirówka | Eppendorf | 5415R | |
| Kwas | cytrynowySinopharm Odczynnik chemiczny Co. | 5949-29-1 | |
| Kwas cytrynowy trisodowy | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Szkiełka nakrywkowe | Beyotime | FCGF60 | |
| Dejonizowany formamid | Amresco | 7.12.1975 | |
| Pirowęglan dietylu, DEPC | Sigma | D5758 | Substancja szkodliwa |
| Digoxigenina (DIG) Mieszanka do znakowania RNA Roche | 11277073910 | ||
| DNase I, bez RNaz | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Obrazowanie żelowe do elektroforezy | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Etanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Zestawy do ekstrakcji żelu | Omega | D2500 | |
| Aparat do elektroforezy żelowej | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glicerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glicyna | Sigma | G5417 | |
| Heparyna | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Odczynnik chemiczny Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Kwas maleinowy | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Metanol | Sinopharm Odczynnik chemiczny Co. | 67-56-1 | Szkodliwa substancja |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | |
| folia parafinowa | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyd, PFA | Sigma | 158127 | Szkodliwa substancja |
| Instrument PCR Life | Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipeta | Eppendorf | plus G | |
| Szkiełka mikroskopowe poddane działaniu poli-D-lizyny | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinaza K | Sigma | ||
| Woda wolna od RNaz | HyClone | SH30538. 02 | |
| Inhibitor RNazy | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Surowica owcza | Beyotime | C0265 | |
| Słoik do barwienia szkiełek | Beyotime | FG010 | |
| Pudełko do przechowywania szkiełek | Beyotime | FBX011 | |
| Małe autoklawizowane nożyczki | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spektrofotometry | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 Polimerazy RNA | Roche | 10881767001 | |
| Taq Mieszanka polimeraz DNA (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Łaźnia wodna | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
Bibliografia
- Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
