Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hybrydyzacja in situ dla Sipunculus nudus Płyn celomiczny

5.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61022

⸱

1 maja 2020

 ,  , 
1Key Laboratory of Xiamen Marine and Gene Drugs, School of Biomedical Sciences, Huaqiao University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje skuteczne podejście do hybrydyzacji in situ w celu wykrycia poziomów ekspresji mRNA i wzorców przestrzennych docelowych genów w płynie celomicznym Sipunculus nudus.

Streszczenie

Hybrydyzacja in situ (ISH) jest bardzo pouczającą techniką prezentowania wzorców dystrybucji komórkowej określonych genów (np. mRNA i ncRNA) w tkankach. Sipunculus nudus jest kluczowym zasobem rybnym, ponieważ ma wysokie wartości odżywcze i lecznicze. Obecnie badania nad biologią molekularną Sipunculus nudus są wciąż w powijakach. Celem artykułu jest opracowanie czułej metody lokalizacji specyficznego mRNA w płynie celomicznym Sipunculus nudus. Protokół zawiera szczegółowe etapy ISH, w tym przygotowanie antysensowności i rybosondy znakowanej digoksygeniną, pobieranie płynu celomicznego i przygotowanie sekcji, hybrydyzację specyficznej rybosondy, inkubację przeciwciał, barwienie i zabiegi po barwieniu. Przedstawiono reprezentatywne wyniki uzyskane z udanego eksperymentu przy użyciu tej metody. Protokół powinien mieć zastosowanie również do innych gatunków Sipuncula.

Wprowadzenie

ISH, wykorzystując znakowaną sondę kwasu nukleinowego do wykrywania interesującej nas sekwencji DNA lub RNA, jest użyteczną metodą do opisu przestrzennego wzorca ekspresji docelowych genów w morfologicznie zachowanych tkankach1,2,3. Zwykle sekwencja docelowa jest generowana przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), a następnie wykorzystywana jako matryca do syntezy sondy antysensownego / sensownego RNA znakowanej digoksygeniną urydyno-5'-trifosforanem. Próbki są utrwalane i przepuszczalne przed inkubacją za pomocą rybosondy. Po zmyciu nadmiaru sondy, hybrydyzacja jest wizualizowana za pomocą immunohistochemii przy użyciu przeciwciała anty-digoksygeninowego, które jest sprzężone z fosfatazą alkaliczną3,4,5,6.

Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; rząd Sipunculida: Sipunculidae) to niesegmentowany, celomatowy i obustronnie symetryczny robak morski7,8. Sipunculus nudus to kosmopolityczny gatunek szeroko rozpowszechniony w tropikalnych i umiarkowanych wodach przybrzeżnych. Jest to również ważny morski zasób rybny w południowych Chinach ze względu na wysokie wartości odżywcze i lecznicze9,10. Jednak Sipunculus nudus w biologii molekularnej jest wciąż w powijakach. Aby w pełni zrozumieć biologiczną rolę genów, bardzo interesujące jest badanie wzorców ekspresji genów w rozdzielczości komórkowej. W niemodelowym organizmie Sipunculus nudus metoda ISH, która jest idealną metodą wykrywania wzorców ekspresji genów, nie została jeszcze ustalona. Jego płyn celomiczny zawiera kilka typów komórek, w tym granulocyty, komórki urnowe, komórki pęcherzykowe, komórki rozrodcze, erytrocyty itp11. Czynnik transkrypcyjny 1 związany z podwójną płcią/mab-3 (dmrt1), używany jako gen reprezentatywny w tej metodzie, jest wysoce konserwatywnym regulatorem transkrypcji determinacji i różnicowania płci u większości gatunków, od bezkręgowców po ssaki12,13. W wielu gatunkach (np. porgy itp.)14, dmrt1 został wyrażony w komórkach Sertoliego, otaczających komórki rozrodcze, których funkcja jest podobna do komórek trofoblastu Sipunculus nudus. Dlatego postawiliśmy hipotezę, że dmrt1 Sipunculus nudus ulega ekspresji w komórkach trofoblastu plemników, a wynik metody ISH jednoznacznie potwierdził hipotezę.

Ten protokół po raz pierwszy opisuje ISH, z sondami mRNA znakowanymi digoksygeniną, w celu określenia wzorców ekspresji mRNA w rozmazie płynu celomicznego. Zapewnione są optymalne warunki reakcji, które pozwalają na bardzo czułą wizualizację ekspresji mRNA w wysokiej rozdzielczości. Opracowana metoda ISH może być potencjalnie zastosowana u większej liczby gatunków Sipunculida innych niż Sipunculus nudus.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedura dotycząca zwierząt została zatwierdzona przez Komitet ds. Opieki i Dobrostanu Zwierząt Uniwersytetu Huaqiao.

1. Przygotowanie rybosondy

  1. Wzór podkładu
    1. Otwórz program Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Skopiuj sekwencję dmrt1 (GenBank: MK182259) do okna sekwencji.
    2. Ustaw długość podkładu (23-25 pz), temperaturę topnienia (55-60 °C) i zawartość G/C (40-60%). Kliknij opcję Pobierz podkłady.
      UWAGA: Minimalny rozmiar wymagany dla sondy RNA to około 500 pz. Dłuższe sondy mają zwykle wyższą specyficzność.
    3. Dodaj sekwencję promotora polimerazy RNA T7 (5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3,) do jednego z wybranych starterów. Sekwencje starterów dmrt1 dla ISH przedstawiono w tabeli 1.
      UWAGA: W przypadku sond sensownych promotor polimerazy RNA T7 znajduje się na końcu 5' starterów do przodu. W przypadku sond antysensownych promotor polimerazy RNA T7 znajduje się na końcu 5' starterów odwrotnych.
  2. Amplifikacja PCR
    1. Umieść probówki do mikrofuge na lodzie i przygotuj następującą mieszaninę reakcyjną (dla reakcji 50 μl): 1x mieszanina polimerazy DNA Taq, 1 μg cDNA (który jest przygotowywany ze 100 μl płynu celomicznego), 1 μM starter do przodu, 1 μM starter do tyłu i woda wolna od nukleaz.
    2. Wymieszać reakcję PCR przez pipetowanie i krótko odwirować.
    3. Umieścić probówkę reakcyjną w termocyklerze i uruchomić PCR w następujących warunkach: początkowa denaturacja w temperaturze 95 °C przez 2 minuty, a następnie 36 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 30 s, wyżarzanie w temperaturze 55–60 °C przez 30 s, przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 30 s i końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 7 minut
      UWAGA: Temperaturę wyżarzania należy zoptymalizować zgodnie z podkładami.
  3. Oczyszczanie i weryfikacja produktu metodą PCR
    1. Załaduj 50 μl mieszaniny PCR bezpośrednio na 1% żel agarozowy. Uruchom żel agarozowy pod napięciem 150-180 V przez 10 minut w 0,5x TBE. Wyizolować określone fragmenty DNA z 1% żelu agarozowego.
      UWAGA: DNA powinno pojawiać się jako pojedynczy prążek, a nie jako rozmaz.
    2. Oczyść fragmenty DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta. Oznaczyć ilościowo oczyszczone produkty za pomocą spektrofotometrii o długości fali 260 nm.
    3. Zweryfikuj autentyczność produktów PCR przez sekwencjonowanie.
      UWAGA: (Punkt pauzy) Oczyszczone produkty PCR mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
  4. Synteza rybosondy
    1. Umieść probówki do mikrofug bez RNaz na lodzie i dodaj następujące składniki do probówki do mikrofuge (dla reakcji 10 μl): 1x mieszanka do znakowania RNA digoksygeniny, 1x bufor transkrypcyjny, 0,5 μl inhibitorów RNazy, 1 μl polimeraz RNA T7, 1 μg produktu PCR i woda wolna od RNaz. Wymieszać reakcję przez pipetowanie i krótko odwirować. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
    2. Dodać 2 μl DNazy I, wolnej od RNaz. Wymieszać reakcję przez pipetowanie i krótko odwirować. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Dodać 2 μl 0,2 M EDTA (pH 8,0). Wymieszać reakcję przez pipetowanie i krótko odwirować.
    4. Do powyższej reakcji dodać 2,5 μl 4 M LiCl i 75 μl wstępnie schłodzonego etanolu. Dobrze wymieszaj. Pozostawić na 30 minut w temperaturze -70 °C.
    5. Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować etanol. Dodać 1 ml wstępnie schłodzonego 70% etanolu (v/v) i przepłukać osad, delikatnie mieszając.
    6. Wirować przy 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować 70% etanol i krótko wysuszyć osad w pobliżu lampy alkoholowej. Rozpuścić osad, dodając 30 μl wody wolnej od RNaz i delikatnie wymieszać.
    7. Załaduj 2 μl zsyntetyzowanego RNA na 1% żel agarozowy. Uruchom żel agarozowy pod napięciem 180 V przez 5-10 minut w 0,5x TBE. Zmierzyć stężenie znakowanego RNA za pomocą spektrofotometru o długości fali 260 nm.
      1. Używaj probówek do mikrofuge i końcówek filtrujących bez RNaz, aby uniknąć zanieczyszczenia RNazą.
        UWAGA: (Punkt pauzy) Sondy znakowane digoksygeniną mogą być przechowywane w temperaturze -70 °C przez kilka miesięcy.

2. Pobieranie płynów celomicznego

  1. Zamocuj S. nudus na stole sekcyjnym za pomocą szpilek. Otwórz ciało S. nudus małymi autoklawowanymi nożyczkami. Wyizolować płyn celomiczny za pomocą pipety.
  2. Zebrać i przenieść 1 ml płynu celomicznego za pomocą pipety do szkiełek mikroskopowych poddanych działaniu poli-D-lizyny. Płyn celomiczny nanieść równomiernie za pomocą końcówki pipety. Szkiełka suszyć na powietrzu przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.

3. Hybrydyzacja in situ

  1. Dzień 1
    1. Ponownie uwodnić szkiełka w słoiku do barwienia szkiełek zawierającym 100 ml 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym poddanym pirowęglanem dietylu (DEPC-PBS). Ponownie nawodnić 3 razy za pomocą 1x DEPC-PBS, 5 minut na pranie z delikatnym mieszaniem.
    2. Rozmaz płynu celomicznego należy przesycić przez trawienie 10 μg/ml proteinazy K w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Inkubować szkiełka w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 20 minut, aby zatrzymać trawienie. Myć szkiełka w 1x DEPC-PBS z delikatnym mieszaniem przez 5 minut 3 razy.
    3. Dodać 50 μl mieszanki hybrydyzacyjnej (HM) zawierającej rybosondę sens/antysensowną na szkiełkach i dodać szkiełko nakrywkowe.
    4. Dodaj bufor mokrego pudełka do mokrego pudełka. Włóż szkiełka do mokrego pudełka i dobrze uszczelnij folią parafinową. Hybrydyzować przez noc (co najmniej 16 godzin) w temperaturze 60 °C.
  2. Dzień 2
    1. Rozgrzej bufor do płukania w temperaturze 65 °C. Zanurz szkiełko w pojemniku do barwienia szkiełek zawierającym bufor do płukania i odstaw do momentu, aż szkiełko nakrywkowe zsunie się automatycznie. Zajmuje to około 5 minut.
    2. Umyć 2 razy buforem do płukania w temperaturze 65 °C, 30 minut na pranie z delikatnym mieszaniem. Przemyć 2 razy 0,2x roztworem cytrynianu soli fizjologicznej (SSC) w temperaturze 65 °C, 30 minut na pranie z delikatnym mieszaniem. Przemyć 2 razy buforem kwasu maleinowego zawierającym Tween 20 (MABT) w temperaturze pokojowej, 30 minut na pranie z delikatnym mieszaniem.
    3. Szkiełka należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 3–4 godziny w buforze blokującym. Inkubować szkiełka w 1 ml roztworu fragmentów anty-digoksygeniny-AP Fab rozcieńczonego w stosunku 1/5000 z buforem blokującym w temperaturze 4 °C przez noc.
  3. Dzień 3
    1. Usunąć roztwór przeciwciał i krótko umyć szkiełka w MABT. Umyć 4 razy MABT w temperaturze pokojowej, 25 minut na pranie z delikatnym mieszaniem.
    2. Inkubować szkiełka z alkalicznym buforem fosfatazy w temperaturze pokojowej 3 razy po 5 minut na pranie. Usunąć bufor fosfatazy alkalicznej i dodać 1 ml roztworu barwiącego 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu (BCIP)/nitro niebieskiego tetrazolu (NBT). Trzymaj slajdy w ciemności.
    3. Okresowo obserwuj reakcję barwy pod mikroskopem optymalnym. Gdy kolor jest w pełni rozwinięty (czas reakcji w zakresie 1-4 h), umyj szkiełka 2 razy MABT w temperaturze pokojowej, po 5 minut na pranie z delikatnym mieszaniem.
    4. Umyć 2 razy roztworem zatrzymującym w temperaturze pokojowej, 15 minut na pranie z delikatnym mieszaniem. Inkubować szkiełka w metanolu w celu usunięcia nadmiaru plam, w temperaturze pokojowej przez 30 minut. W zależności od koloru tła, mycie metanolem można wykonać 2 lub 3 razy, a czas odbarwiania można wydłużyć.
    5. Umyć 2 razy MABT w temperaturze pokojowej, 5 minut na pranie z delikatnym mieszaniem. Przenieś szkiełka na świeżą bibułę filtracyjną. Dodać 50 μl glicerolu. Dodaj szkiełka nakrywkowe i obserwuj pod mikroskopem.
      UWAGA: Skład roztworu przedstawiono w Tabeli 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Podsumowanie etapów przeprowadzania ISH przedstawiono na Rysunku 1. Antysensowne i odpowiadające im sensowne sondy rybo- dla dmrt1 zsyntezowano z produktów PCR amplifikowanych z cDNA płynu w jamie ciała. Autentyczność produktów PCR zweryfikowano poprzez sekwencjonowanie bezpośrednie. Sondy rybo- zsyntezowano przy użyciu polimeraz RNA T7 zgodnie z protokołami producenta oraz wcześniejszym raportem4 z niewielkimi modyfikacjami. Reprezentatywne sygnały ISH przed...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wcześniejsze badania wykazały, że ISH nadaje się do wykrywania wielu docelowych RNA 16,17,18. W tym protokole opisaliśmy metodę ISH o wysokiej rozdzielczości do wykrywania mRNA w płynie celomicznym i podkreślenia zoptymalizowanych warunków hybrydyzacji w Sipunculus nudus. Oczywiste sygnały dmrt1, które zaobserwowaliśmy, wykazały skuteczne zastosowanie tego protokołu w wykrywaniu ekspresji genów (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Fundusz Młodych Naukowców Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 31801034), Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Fujian, Chiny (2016J01161), Fundusze Badań Naukowych Uniwersytetu Huaqiao (15BS306) oraz Fundusz Innowacyjnych Studiów Podyplomowych Uniwersytetu Huaqiao.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgaroseBiowest111860
Anty-digoksygenina-AP Fragmenty Fab Roche11093274910
zestaw do rozwoju koloru fosfatazy alkalicznej BCIP/NBTBeyotimeC3206
Albumina surowicy bydlęcejSigmaB2064
WirówkaEppendorf5415R
KwascytrynowySinopharm Odczynnik chemiczny Co.5949-29-1
Kwas cytrynowy trisodowySinopharm Chemical Reagent Co.4/3/6132
Szkiełka nakrywkoweBeyotimeFCGF60
Dejonizowany formamidAmresco7.12.1975
Pirowęglan dietylu, DEPCSigmaD5758Substancja szkodliwa
Digoxigenina (DIG) Mieszanka do znakowania RNA Roche11277073910
DNase I, bez RNazInvitrogen18047019
EDTASigma431788
Obrazowanie żelowe do elektroforezyBio-RadUniversal Hood III
EtanolSinopharm Chemical Reagent Co.64-17-5
Zestawy do ekstrakcji żeluOmegaD2500
Aparat do elektroforezy żelowejBeijing Liuyi Instrument FactoryDYY-6C
GlicerolSinopharm Chemical Reagent Co.56-81-5
GlicynaSigmaG5417
HeparynaSigma8/1/9041
KClSinopharm Odczynnik chemiczny Co.7447-40-7
KH2PO4Sinopharm Chemical Reagent Co.7778-77-0
LiClSigma203637
Kwas maleinowySinopharm Chemical Reagent Co.110-16-7
MetanolSinopharm Odczynnik chemiczny Co.67-56-1Szkodliwa substancja
MgCl2Sinopharm Chemical Reagent Co.7786-30-3
Na2HPO4Sinopharm Chemical Reagent Co.7558-79-4
NaClBiofountJT0001
NaOHSinopharm Chemical Reagent Co.1310-73-2
folia parafinowaBemis Company, Inc.PM-996
Paraformaldehyd, PFASigma158127Szkodliwa substancja
Instrument PCR LifeTechnologyProflex
PinsDeli16
PipetaEppendorfplus G
Szkiełka mikroskopowe poddane działaniu poli-D-lizynyLiushengVER_A01
Proteinaza KSigma
Woda wolna od RNazHyCloneSH30538. 02
Inhibitor RNazyRoche3335399001
S. nudus
Surowica owczaBeyotimeC0265
Słoik do barwienia szkiełekBeyotimeFG010
Pudełko do przechowywania szkiełekBeyotimeFBX011
Małe autoklawizowane nożyczkiShuanglusku_8330
SpektrofotometryThermo FisherNanoDrop 2000/2000c
T7 Polimerazy RNARoche10881767001
Taq Mieszanka polimeraz DNA (2X)Thermo ScientificK1081
Tris HClSigmaRES3098T
tRNARoche
Tween-20SigmaP1379
Łaźnia wodnaZhengzhou Great Wall Scientific IndustrialHH-S2
SRE000510109517001

Bibliografia

  1. Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
  2. Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).
  3. Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes. Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).
  4. Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
  5. Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos. Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).
  6. Abler, L. L., et al. A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract. Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).
  7. Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences. Biochemical Genetics. 47, 884(2009).
  8. Lemer, S., et al. Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics. Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).
  9. Jiang, S., et al. Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice. Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).
  10. Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract. Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).
  11. Ying, X. P., et al. The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta. Micron. 41, 71-78 (2010).
  12. Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation. Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).
  13. Kopp, A. Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism. Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).
  14. Wu, G. C., et al. Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy. Biology of Reproduction. 86, 41(2012).
  15. Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1. Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).
  16. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  17. Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799(2015).
  18. Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361(1993).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przygotowanie sondy rybotekowejinkubacja z przeciwciałamiujawnianie barwysekcjonowanie tkanekanaliza ekspresji genówznakowanie digoksigeninąbarwienie fosfatazą alkaliczną
Hybrydyzacja in situ dla Sipunculus nudus Płyn celomiczny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.