Artykuł metodologiczny

Znormalizowane metody pomiaru indukcji reakcji na szok cieplny u Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/61030

⸱

3 lipca 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical and Chemical Engineering and Sciences, Florida Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiono standardowe protokoły do oceny indukcji reakcji na szok cieplny (HSR) u Caenorhabditis elegans za pomocą RT-qPCR na poziomie molekularnym, fluorescencyjnych reporterów na poziomie komórkowym i termoregeneracji na poziomie organizmu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reakcja na szok cieplny (HSR) to komórkowa reakcja na stres wywołana przez nieprawidłowe fałdowanie białek cytozolowych, które działają w celu przywrócenia homeostazy fałdowania białek, czyli proteostazy. Caenorhabditis elegans zajmuje wyjątkową i potężną niszę dla badań nad HSR, ponieważ HSR można ocenić na poziomie molekularnym, komórkowym i organizmowym. W związku z tym zmiany na poziomie molekularnym można uwidocznić na poziomie komórkowym, a ich wpływ na fizjologię można określić ilościowo na poziomie organizmu. Chociaż testy do pomiaru HSR są proste, różnice w czasie, temperaturze i metodologii opisane w literaturze utrudniają porównywanie wyników między badaniami. Co więcej, kwestie te stanowią barierę dla każdego, kto chce włączyć analizę HSR do swoich badań. W tym miejscu przedstawiono szereg protokołów pomiaru indukcji HSR w solidny i powtarzalny sposób za pomocą RT-qPCR, fluorescencyjnych reporterów i testu termoregeneracji organizmów. Ponadto pokazujemy, że szeroko stosowany test termotolerancji nie jest zależny od dobrze ugruntowanego głównego regulatora HSR, HSF-1, a zatem nie powinien być stosowany do badań HSR. Na koniec omówiono różnice w tych testach znalezionych w literaturze i zaproponowano najlepsze praktyki, które pomogą ustandaryzować wyniki w całej dziedzinie, ostatecznie ułatwiając badania nad chorobami neurodegeneracyjnymi, starzeniem się i HSR.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reakcja na szok cieplny (HSR) jest uniwersalną reakcją na stres komórkowy wywołaną przez nieprawidłowe fałdowanie białek cytozolowych spowodowane wzrostem temperatury i innymi stresami proteotoksycznymi. Aktywacja HSR w Caenorhabditis elegans prowadzi do regulacji transkrypcji w górę genów szoku cieplnego, takich jak hsp-70 i hsp-16.2. Wiele białek szoku cieplnego (HSP) funkcjonuje jako molekularne białka opiekuńcze, które przywracają homeostazę fałdowania białek lub proteostazę poprzez bezpośrednią interakcję z nieprawidłowo sfałdowanymi lub uszkodzonymi białkami. Głównym regulatorem HSR jest czynnik transkrypcyjny Heat Shock Factor 1 (HSF-1), którego aktywacja jest elegancko kontrolowana przez wiele mechanizmów1.

Rola HSF-1 nie ogranicza się do stresu. HSF-1 jest niezbędny do prawidłowego wzrostu i rozwoju, ponieważ usunięcie HSF-1 prowadzi do zatrzymania larw2. HSF-1 jest również ważny podczas starzenia się i chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem, charakteryzujących się akumulacją agregatów białkowych i niezdolnością do utrzymania proteostazy. Knockdown hsf-1 powoduje akumulację agregatów białkowych i skrócenie żywotności, podczas gdy nadekspresja hsf-1 zmniejsza agregację białek i wydłuża żywotność3,4. Dlatego regulacja HSF-1 na poziomie molekularnym ma szerokie implikacje dla fizjologii i chorób organizmu.

C. elegans jest potężnym organizmem modelowym do badań nad HSR, ponieważ HSR może być mierzony na poziomie molekularnym, komórkowym i organizmu4,5,6. Podkreślając moc tego modelu, odkryto kluczowe postępy w wytyczaniu szlaku HSR, takie jak specyficzne tkankowo różnice w regulacji HSR, w C. elegans7,8. Co więcej, C. elegans jest szeroko stosowany w badaniach nad starzeniem się i jest nowym systemem modelowania chorób związanych z zaburzeniem proteostazy.

Chociaż eksperymenty z C. elegans mogą być szybkie i powtarzalne, przed rozpoczęciem jest kilka pytań, które należy rozważyć. Na przykład, jaka temperatura powinna być użyta do indukcji KDP i jak długo robaki powinny być wystawione na działanie promieni słonecznych? Czy lepiej jest używać suchego inkubatora czy łaźni wodnej? Który etap rozwojowy należy zastosować? Niestety, metodologie stosowane do badania HSR różnią się znacznie w zależności od laboratorium, co powoduje zamieszanie przy wyborze najlepszych metodologii i utrudnia porównywanie wyników w różnych dziedzinach.

Prezentujemy solidne i ustandaryzowane protokoły do pomiaru RT-qPCR, fluorescencyjnych reporterów i termoodzysku. Chociaż te trzy podejścia są komplementarne, każde z nich ma unikalne zalety i wady. Na przykład RT-qPCR jest najbardziej bezpośrednim i ilościowym pomiarem HSR, a test ten można łatwo rozszerzyć o wiele różnych genów indukowanych szokiem cieplnym. RT-qPCR jest jednak najdroższy, może być trudny technicznie i wymaga użycia specjalistycznego sprzętu. W przeciwieństwie do tego, reportery fluorescencyjne mają tę zaletę, że mierzą specyficzne tkankowo różnice w indukcji HSR. Są one jednak trudne do dokładnego określenia ilościowego, mogą mierzyć indukcję tylko powyżej pewnego progu i wymagają użycia mikroskopu fluorescencyjnego. Dodatkowo, opisane tutaj szczepy reporterowe są opóźnione w rozwoju w porównaniu ze standardowym szczepem N2. Chociaż dostępne są nowsze szczepy reporterowe zawierające transgeny z pojedynczą kopią, nie zostały one przetestowane tutaj9. Trzeci test, termoregeneracja, ma tę zaletę, że zapewnia fizjologicznie istotny odczyt na poziomie organizmu. Jednak ten test jest prawdopodobnie najmniej czuły i najbardziej pośredni. Na koniec omawiamy niektóre typowe warianty występujące w tych testach i proponujemy zestaw najlepszych praktyk ułatwiających badania w tej dziedzinie.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Utrzymanie i synchronizacja C. elegans

  1. Utrzymuj robaki w temperaturze 20 °C na płytkach pożywki do wzrostu nicieni (NGM) obsianej bakteriami OP50 Escherichia coli, przenosząc kilka dorosłych osobników na świeże płytki około 2 razy w tygodniu10. Należy zachować ostrożność, aby robakom nie zabrakło pożywienia, ponieważ może to wpłynąć na ich fizjologię11.
    1. Przygotowanie płyt NGM.
      1. Zmieszać 3 g NaCl, 2,5 g baktopeptonu, 20 g agaru i dejonizowanego (DI)H2Odo 1 l w kolbie.
      2. Autoklaw mieszaniny do sterylizacji.
      3. Pozostawić mieszaninę do ostygnięcia do temperatury ~50 °C.
      4. Dodać 25 ml 1 M KH2PO4 (pH = 6), 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 MMgSO4 i 1 ml cholesterolu (5 mg / ml w 100% etanolu).
      5. Stosując sterylną technikę, wlej mieszaninę do 6 cm talerzy, aby uzyskać około 100 płytek. Wlewanie płytek jest łatwiejsze, jeśli mieszanina zostanie najpierw przeniesiona do sterylnej zlewki o pojemności 300 ml.
      6. Odczekać 1 dzień do zestalenia się w temperaturze pokojowej (RT) przed wysiewem z bakteriami lub przechowywaniem w temperaturze 4 °C.
    2. Wysiew bakterii OP50 na płytki NGM.
      1. Wyhodować nasyconą przez noc kulturę bakterii OP50 w LB w temperaturze 30 °C lub 37 °C.
      2. Umieść około 300 μl kultury na środku płytki NGM o średnicy 6 cm.
      3. Pozostaw talerze do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 1-3 dni, w razie potrzeby, aby trawnik bakteryjny przylegał do płytki. Talerze mogą być następnie używane lub przechowywane w temperaturze 4 °C.
  2. Hoduj robaki synchronicznie, izolując świeżo złożone jaja (opisane tutaj) lub alternatywnie, zbierając jaja po rozpuszczeniu robaków za pomocą wybielacza.
    1. Przenieś około 10 grawitacyjnych dorosłych robaków na świeży talerz za pomocą platynowego drucianego szpikulca. Synchronizacja składania jaj działa najlepiej, jeśli dorosłe osobniki są w pierwszym dniu dorosłości.
    2. Po około 1 godzinie usuń robaki z płytki. Powinno to dać 40-60 jaj na talerzu, w zależności od warunków i szczepu.

2. Obrazowanie fluorescencyjne reporterów HSR

  1. Zsynchronizować robaki (sekcja 1.2) i utrzymywać w temperaturze 20 °C do pożądanego stadium rozwojowego. W przypadku fluorescencyjnych szczepów reporterowych AM446 (hsp-70p::gfp) i CL2070 (hsp-16.2p::gfp) młode dorosłe robaki, które nie osiągnęły jeszcze dojrzałości reprodukcyjnej, są generowane 64 godziny po synchronizacji składania jaj.
    UWAGA: Czas rozwoju różni się w zależności od szczepu i temperatury, w której robaki są hodowane. Oba szczepy reporterowe HSR wykazują niewielkie opóźnienie rozwojowe w stosunku do N2. Co ważne, wielkość indukcji HSR zmniejsza się około 2-4 razy po osiągnięciu dojrzałości rozrodczej (patrz Dyskusja).
  2. Robaki należy poddać szokowi cieplnemu poprzez owinięcie płytek folią parafinową i zanurzenie w łaźni wodnej o temperaturze 33 °C na 1 godzinę. Cienki pasek folii parafinowej należy owinąć 2x wokół płytki, aby uszczelnić krawędzie. Nie zakrywaj dolnej części płyty, ponieważ może to zakłócać przenoszenie ciepła. Zanurz płytki do góry nogami za pomocą stojaka na probówki i ołowianego obciążnika. Pamiętaj, aby w razie potrzeby dołączyć ujemną próbkę kontrolną (bez szoku cieplnego).
    UWAGA: Jeśli folia parafinowa nie jest zabezpieczona, woda dostanie się do płytki i płytka nie powinna być używana do zbierania danych.
  3. Odzyskaj robaki, wyjmując płytki z łaźni wodnej i osuszając ręcznikiem papierowym. Usunąć folię parafinową i inkubować robaki w temperaturze 20 °C przez 6-24 godziny. Ten okres rekonwalescencji zapewnia wystarczającą ilość czasu na syntezę i fałdowanie GFP przed obrazowaniem.
  4. Przygotuj preparaty do obrazowania. Preparaty powinny być przygotowywane świeże do każdego użycia.
    1. Przygotuj 3% roztwór agarozy w wodzie i podgrzewaj za pomocą kuchenki mikrofalowej, aż agaroza się rozpuści.
    2. Umieść szkiełko mikroskopowe do obrazowania między dwoma innymi szkiełkami mikroskopowymi, na których znajduje się pasek taśmy laboratoryjnej, aby utworzyć przekładkę dla podkładki agarozowej.
    3. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl umieść kroplę (~150 μl) podgrzanej 3% agarozy na środku szkiełka mikroskopowego.
    4. Natychmiast przykryj szkiełko mikroskopowe pustym szkiełkiem mikroskopowym prostopadłym do pierwszego szkiełka podstawowego, tak aby górne szkiełko spoczywało na taśmie laboratoryjnej na sąsiednich szkiełkach. To rozprowadza kroplę agarozy, tworząc podkładkę o jednolitej szerokości.
    5. Ostrożnie zdejmij górny suwak.
  5. Unieruchomić robaki za pomocą pipety o pojemności 200 μl, aby dodać małą kroplę (~5 μl) 1 mM lewamizolu w buforze M9 do środka podkładki agarozowej. Następnie przenieś 10 robaków do kropli lewamizolu za pomocą platynowego drucianego szpikulca. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Uszczelnianie szkiełka nakrywkowego nie jest konieczne w przypadku mikroskopu pionowego. Opcjonalnie robaki można wyrównać, gdy zostaną sparaliżowane, rozprowadzając lewamizol na zewnątrz podkładki agarozowej i wyrównując robaki za pomocą platynowego drucianego szpikulca. Alternatywnie, lewamizol można wchłonąć za pomocą chusteczki laboratoryjnej.
    UWAGA: Obraz tak szybko, jak to możliwe, ponieważ długotrwała inkubacja w lewamizolu może zmienić fluorescencję.
  6. Zobrazuj robaki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Szczegóły przechwytywania obrazu różnią się w zależności od mikroskopu i oprogramowania.
    UWAGA: Aby bezpośrednio porównać intensywność obrazu, należy użyć identycznych ustawień mikroskopu podczas jednej sesji obrazowania. Unikaj przesycenia obrazu.

3. Pomiar ekspresji genu HSR za pomocą RT-qPCR

  1. Zsynchronizować robaki (sekcja 1.2) i utrzymywać w temperaturze 20 °C do pożądanego stadium rozwojowego. W przypadku robaków N2 młode dorosłe robaki, które nie osiągnęły jeszcze dojrzałości reprodukcyjnej, są generowane 60 godzin po synchronizacji składania jaj.
    UWAGA: Czas rozwoju różni się w zależności od szczepu i temperatury, w której robaki są hodowane. Co ważne, wielkość indukcji HSR zmniejsza się około 2-4 razy po osiągnięciu dojrzałości rozrodczej (patrz Dyskusja).
  2. Robaki szoku cieplnego zgodnie z opisem w kroku 2.2.
  3. Wyjmij płytki z łaźni wodnej, usuń film parafinowy i natychmiast zbierz robaki. Robaki można zebrać, delikatnie myjąc płytki 1 ml M9, zbierając płyn do probówki mikrowirówkowej, a następnie usuwając M9 po odwirowaniu przy 400 x g przez 1 min.
  4. Zlizuj robaki i oczyść RNA za pomocą ekstrakcji organicznej.
    1. Dodać 250 μl odczynnika do izolacji RNA (patrz tabela materiałów).
    2. Rurki wirowe ręcznie przez 30 s.
    3. Wirować probówki przez 20 minut w temperaturze 4 °C za pomocą nasadki do probówki do mikrowirówki (patrz tabela materiałów).
    4. Dodać 50 μl chloroformu.
    5. Wir przez 30 s.
    6. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
    7. Wirować w temperaturze 14 000 x g ≥ przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    8. Przenieść warstwę wodną (tj. warstwę górną, ~125 μl) do nowej probówki do mikrowirówki.
      UWAGA: Unikaj warstwy organicznej i materiału w interfejsie.
    9. Dodać 50 μl chloroformu.
    10. Wir przez 30 s.
    11. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
    12. Wirować przy ≥14 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    13. Przenieść warstwę wodną (~100 μL) do nowej probówki do mikrowirówki.
      UWAGA: Unikaj warstwy organicznej i materiału w interfejsie.
    14. Wytrącić RNA o równej objętości (tj. 100 μl) izopropanolu.
    15. Inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 30 minut, ale najlepiej przez noc.
      UWAGA: W tym miejscu eksperyment można przerwać, a RNA można przechowywać w temperaturze -20 °C.
    16. Osadzać RNA przez odwirowanie w temperaturze ≥14 000 x g przez ≥30 min w temperaturze 4 °C.
    17. Usunąć jak najwięcej supernatantu, nie naruszając osadu.
      UWAGA: Granulka będzie mała i może nie być widoczna. Granulka może nie przylegać ściśle do boku tuby, dlatego należy zachować ostrożność, aby uniknąć jej przemieszczenia.
    18. Umyj granulat 250 μl 70% lodowatego etanolu wykonanego z H2O wolnego od RNaz.
    19. Wirować w temperaturze 14 000 x g ≥ przez ≥5 min w temperaturze 4 °C.
    20. Usunąć jak najwięcej supernatantu, nie naruszając osadu.
    21. Wykonaj szybki obrót w RT, aby usunąć pozostałe 70% etanolu.
    22. Wysuszyć granulki, pozostawiając probówki otwarte w temperaturze pokojowej tak długo, jak to konieczne; zwykle co najmniej 20 minut. Probówki można przykryć niestrzępiącą się chusteczką lub folią aluminiową, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
    23. Zawiesić osad w 20 μl H2O wolnego od RNaz.
    24. Oznaczyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru o małej objętości (2 μl).
      UWAGA: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać, a RNA może być tymczasowo przechowywane w temperaturze -20 °C lub niższej.
  5. Usuń resztki DNA przez inkubację z DNazą I. Zaleca się korzystanie z dostępnego w handlu zestawu (patrz Tabela materiałów) i postępowanie zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Za pomocą tego zestawu przygotuj 20 μl reakcji z 500 ng RNA i 1 μl DNazy I w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    2. Dodać 2,5 μl odczynnika do inaktywacji DNazy (dołączonego do zestawu) do każdej próbki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut z okazjonalnym miskiwaniem/wirowaniem.
    3. Wiruj z prędkością 14 000 x g przez 2 minuty.
    4. Nie naruszając białego osadu, przenieś 15 μl supernatantu do świeżej mikroprobówki w celu syntezy cDNA.
  6. Przeprowadź syntezę cDNA. Zaleca się korzystanie z dostępnego w handlu zestawu (patrz Tabela materiałów) i postępowanie zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Za pomocą zestawu przygotuj reakcję 20 μl z 15 μl RNA potraktowanego DNazą I z poprzedniego etapu i 1 μl odwrotnej transkryptazy.
    2. Użyj następującego programu do syntezy cDNA: 25 °C przez 5 min, 46 °C przez 20 min, 95 °C przez 1 min, 4 °C trzymanie.
    3. Rozcieńczyć cDNA, dodając 80 μl H2O wolnego od RNaz bezpośrednio do próbki.
    4. Krótko zwirować, a następnie odwirować i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie potrzebny.
  7. Wykonaj qPCR. Zaleca się korzystanie z dostępnego w handlu zestawu (patrz Tabela materiałów) i postępowanie zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Za pomocą zestawu przygotuj 25 μl reakcji zawierającej 2 μl cDNA i 200 nM (każdy) starterów do przodu i do tyłu w jednym dołku na 96-dołkowej płytce.
    2. Sekwencje starterów do pomiaru genów szoku cieplnego, hsp-70 i hsp-16.2 oraz 18S rRNA (do kontroli normalizacji) są wymienione w tabeli materiałów. W razie potrzeby można użyć wielu kontrolek normalizacji.
    3. Rozcieńczyć próbki cDNA 50 razy przed pomiarem 18S, aby upewnić się, że test mieści się w zakresie liniowym. Odpowiednie warunki qPCR różnią się w zależności od użytego zestawu i starterów (patrz Reprezentatywne wyniki).
    4. Użyj systemu wykrywania PCR w czasie rzeczywistym (patrz tabela materiałów) dla qPCR z 40 cyklami 95 °C dla 5 s denaturacji, 58 °C dla 30 s wyżarzania i 72 °C dla przedłużenia 30 s.
      UWAGA: Optymalne temperatury wyżarzania mogą się różnić w zależności od podkładów i warunków.
    5. Określ ilościowo za pomocą metody ΔΔCt lub krzywej standardowej12.

4. Test termoodzysku do pomiaru HSR na poziomie organizmu

  1. Zsynchronizować robaki (sekcja 1.2) i utrzymywać w temperaturze 20 °C do pożądanego stadium rozwojowego. W przypadku robaków N2 młode dorosłe robaki, które nie osiągnęły jeszcze dojrzałości reprodukcyjnej, są generowane 60 godzin po synchronizacji składania jaj.
    UWAGA: Czas rozwoju różni się w zależności od szczepu i temperatury, w której robaki są hodowane. Co ważne, wielkość indukcji HSR zmniejsza się około 2-4 razy po osiągnięciu dojrzałości rozrodczej (patrz Dyskusja).
  2. Szok cieplny robaków zgodnie z opisem w kroku 2.2 przez 6 godzin.
  3. Wyjąć płytki z łaźni wodnej, usunąć film parafinowy i pozostawić robaki do odzyskania sprawności przez inkubację w temperaturze 20 °C przez 48 godzin.
  4. Policz liczbę robaków, które mogą natychmiast odczołgać się po mechanicznej stymulacji bez gwałtownych ruchów lub paraliżu.
    UWAGA: 6-godzinna inkubacja jest optymalna do badania warunków, które zmniejszają termoregenerację, ale mogą być potrzebne dłuższe czasy ekspozycji, aby znaleźć warunki, które poprawiają termoregenerację.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z protokołów opisanych w tym manuskrypcie, indukcja HSR została zmierzona za pomocą fluorescencyjnych reporterów, RT-qPCR i testów termoregeneracji. W każdym przypadku procedurę opisaną w sekcji 1.2 zastosowano w celu wygenerowania zsynchronizowanych, młodych dorosłych robaków, które nie osiągnęły dojrzałości reprodukcyjnej.

Aby zobrazować indukcję HSR na poziomie komórkowym, przeanalizowano fluorescencyjne szczepy reporterowe AM446 (hsp-70p::gfp) i CL2070 (hsp-16.2p::gfp) zgodnie z sekcją 2 protokołu. W ujemnych próbkach kontrolnych bez szoku cieplnego reporter hsp-16.2 wykazywał tylko normalną autofluorescencję, ale reporter hsp-70 miał konstytutywną fluorescencję w mięśniu depresyjnym odbytu, jak wcześniej zgłoszono4 (Rysunek 1A). Po 1 godzinie szoku cieplnego w temperaturze 33 °C zaobserwowano silną fluorescencję w obu reporterach; jednak wzorzec wyrażenia był różny w zależności od tego, który reporter został użyty (Rysunek 1B). Reporter hsp-70 był najjaśniejszy w jelicie i spermatece, podczas gdy reporter hsp-16,2 był najjaśniejszy w gardle. Dodatkowo, reporter hsp-16.2 miał wysoki stopień zmienności między robakami w ilości indukcji, jak opisano wcześniej, ale reporter hsp-70 nie13.

Powszechnie używaną odmianą sekcji 2 jest przeprowadzenie szoku cieplnego w suchym inkubatorze zamiast w kąpieli wodnej w obiegu. W związku z tym przetestowano również różnicę między tymi dwiema metodologiami. Stwierdzono, że oba protokoły skutkowały solidną indukcją dwóch fluorescencyjnych reporterów przy użyciu naszych warunków, chociaż kąpiel w wodzie cyrkulacyjnej jest zalecana jako najlepsza praktyka (patrz Dyskusja) (Rysunek 1B).

Aby przetestować zależność reporterów od czynnika transkrypcyjnego HSF-1, podawanie RNAi zostało użyte do wyeliminowania hsf-1 przed pomiarem indukcji reporterowej. Stwierdzono, że fluorescencja obu szczepów została poważnie zmniejszona po knockdown HSF-1, co wskazuje, że te reportery są zależne od HSF-1, jak opisano w literaturze4 (Rysunek 2). Jednak zaobserwowano również, że fluorescencja gardła utrzymywała się u obu reporterów po knockdown hsf-1, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami, że mięsień gardłowy jest odporny na RNAi przez karmienie14.

Aby określić ilościowo indukcję całego robaka HSR na poziomie molekularnym, zmierzono dwa endogenne HSP za pomocą RT-qPCR przy użyciu sekcji 3 protokołu. Próbki mierzono w trzech egzemplarzach, dla każdego ze starterów wygenerowano krzywą standardową, a dla każdej próbki analizowano krzywą topnienia w celu kontroli jakości. Stwierdzono, że szok cieplny o temperaturze 33 °C przez 1 godzinę spowodował ponad 2000-krotny wzrost względnej ekspresji dla dwóch genów szoku cieplnego, hsp-70 i hsp-16.2 (Rysunek 3). Wyniki te pokazują, że oba endogenne geny są odpowiednie do pomiaru indukcji HSR i że szok termiczny o temperaturze 33 °C przez 1 godzinę jest wystarczający do wytworzenia znacznej odpowiedzi. Należy jednak zachować ostrożność przy interpretacji bezwzględnego stopnia indukcji szoku cieplnego, ponieważ poziomy mRNA przy braku szoku cieplnego są bardzo niskie.

Aby przeanalizować fizjologiczną reakcję na szok cieplny, przetestowano test termoregeneracji organizmu przy użyciu sekcji 4 protokołu. Stwierdzono, że narażenie robaków na 6-godzinny szok termiczny w temperaturze 33 °C doprowadziło do 20% spadku liczby robaków przy normalnym ruchu po 48 godzinach rekonwalescencji (Rysunek 4A). Zależność tego testu od czynnika transkrypcyjnego HSF-1 została przetestowana przy użyciu podawania RNAi w celu powalenia hsf-1 przed wystawieniem robaków na stres. Stwierdzono, że powalenie hsf-1 spowodowało dramatyczny spadek normalnego ruchu, przy czym >95% robaków wykazywało gwałtowny ruch lub paraliż po szturchnięciu platynowym druciakiem.

Porównaliśmy ten test termoodzyskiwania z szeroko stosowanym alternatywnym testem organizmu, powszechnie nazywanym termotolerancją. W teście termotolerancji robaki są wystawiane na ciągłe działanie temperatury 35 °C za pomocą suchego inkubatora, a procent żywych robaków jest mierzony w różnych punktach czasowych. Korzystając z tego testu, stwierdzono, że robaki kontrolne stale wystawione na działanie temperatury 35 °C zmarły po około 8 godzinach ekspozycji (Rysunek 4B). Jednakże, gdy zależność tego testu od HSF-1 została przetestowana za pomocą knockdownu RNAi, stwierdzono, że hamowanie hsf-1 nie spowodowało spadku termotolerancji. Podobne wyniki zostały wcześniej wykazane przy użyciu mutacji HSF-1 (patrz Dyskusja). W związku z tym nie zaleca się stosowania testu termotolerancji do pomiaru HSR, a preferowaną metodą badania HSR na poziomie organizmu jest termoodzysk.

figure-results-1
Rysunek 1: Indukcja HSR mierzona za pomocą reporterów fluorescencyjnych. (A) Podstawowa i (B) indukowana ciepłem ekspresja szczepów reporterowych hsp-70p::gfp i hsp-16.2p::gfp po 1 godzinie szoku cieplnego w temperaturze 33 °C w łaźni wodnej lub inkubatorze. Robaki hodowano na bakteriach OP50 przez 64 godziny, szokowano termicznie, a następnie odzyskiwano w temperaturze 20 °C przez 8 godzin przed obrazowaniem. Dla porównania, robaki bez szoku cieplnego w (A) zostały zrenormalizowane w (B), aby dopasować zakres i nasycenie robaków zszokowanych cieplnie. Pokazano reprezentatywne obrazy dwóch replik eksperymentalnych. Podziałka = 250 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: indukcja HSR mierzona za pomocą reporterów fluorescencyjnych jest zależna od HSF-1. Szczepy zawierające reportery hsp-70p::gfp i hsp-16.2p::gfp hodowano na płytkach kontrolnych (pusty wektor L4440) lub hsf-1 RNAi przez 64 godziny, wystawiono na 1-godzinny szok cieplny w temperaturze 33 °C w łaźni wodnej, a następnie odzyskano w temperaturze 20 °C przez 8 godzin przed obrazowaniem. Pokazano reprezentatywne obrazy dwóch replik eksperymentalnych. Podziałka = 250 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Indukcja HSR mierzona za pomocą RT-qPCR. Robaki N2 hodowano na bakteriach HT115 przez 60 godzin, a następnie szokowano cieplnie przez 1 godzinę w łaźni wodnej o temperaturze 33 °C. Względne poziomy mRNA hsp-70 (C12C8.1) i hsp-16.2 są pokazane znormalizowane do kontroli bez szoku cieplnego. Wykreślone wartości są średnią z czterech kontrprób biologicznych, a słupki błędów reprezentują ± SEM. Istotność statystyczna została obliczona przy użyciu niesparowanego testu t-Studenta. **p < 0,01. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Termoodzysk, ale nie tolerancja termiczna, jest zależny od HSF-1. Robaki N2 hodowano na płytkach kontrolnych (L4440) lub RNAi hsf-1 przez 60 godzin, a następnie przenoszono do: (A) łaźni wodnej o temperaturze 33 °C przez 6 godzin i odzyskiwano w temperaturze 20 °C przez 48 godzin przed nacięciem do normalnego ruchu (termoodzysk), lub (B) suchego inkubatora o temperaturze 35 °C i usuwano co 2 godziny aż do śmierci (termotolerancja). Każdy test przeprowadzono na n ≥ 30 osobnikach przez 2 niezależne dni. Pokazana jest średnia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W literaturze do oznaczania HSR wykorzystano szeroką gamę temperatur, czasów i urządzeń, co wprowadziło niepotrzebne zastrzeżenia i doprowadziło do trudności w porównywaniu wyników między laboratoriami. Na przykład do wywołania HSR15 użyto temperatur w zakresie od 32 do 37 °C i czasu od 15 minut do kilku godzin. Podaje się jednak, że śmiertelność występuje już po 3 godzinach w temperaturze 37 °C dla wszystkich stadiów i 1,5 godziny u dorosłych w 1. dniu15. Ponadto wykazaliśmy, że narażenie robaków na działanie temperatury 35 °C powoduje śmiertelność, która nie jest zależna od HSF-1, co sprawia, że warunki te nie nadają się do analizy HSR. Natomiast szok cieplny o temperaturze 33 °C przez 1 godzinę jest wystarczająco silny, aby wywołać silną indukcję genów szoku cieplnego, a jednocześnie wystarczająco łagodny, aby nie wpływać na żywotność robaków. Rzeczywiście, wystawienie na działanie temperatury 33 °C nawet przez 6 godzin powoduje, że tylko 20% robaków wykazuje nieprawidłowy ruch. Dlatego proponujemy zastosowanie temperatury 33 °C i czasu 1 h jako znormalizowanego warunku dla testów RT-qPCR i fluorescencyjnych reporterowych.

Niedawne eksperymenty wykazały, że szczególnie ważna jest ocena stopnia zaawansowania robaków w eksperymentach z HSR. Niedawno wykazano, że u C. elegans indukowalność HSR spada (tj. zapada się) o >50%, gdy hermafrodyty zaczynają składać jaja5. Prawidłowa klasyfikacja robaków ma kluczowe znaczenie, ponieważ często występują różnice w czasie rozwoju szczepów przenoszących mutacje. Jeśli używane są mutanty wrażliwe na temperaturę, wpłynie to również na wyniki, jeśli nie są one zsynchronizowane przez ich wiek rozrodczy. Dlatego zaleca się dokładne zmierzenie początku składania jaj dla każdego szczepu, aby określić, kiedy następuje zapadnięcie się. Okno czasowe po linieniu L4 i przed rozpoczęciem dojrzałości rozrodczej jest wąskie; dlatego należy zachować ostrożność, aby załamanie HSR nie spowodowało przypadkowo zmienności wyników.

Oprócz czasu rozwoju, zaskakująco małe zmiany temperatury, zaledwie 1 °C, mogą mieć znaczący wpływ na HSR. Na przykład neurony termosensoryczne u C. elegans są wrażliwe na zmiany temperatury tak małe, jak ±0,05 °C16. Dlatego konieczne jest użycie termometru, który może dokładnie zmierzyć temperaturę. Dlatego jako najlepszą praktykę proponujemy użycie skalibrowanego urządzenia do pomiaru temperatury, które jest wystarczająco precyzyjne, aby mierzyć temperatury w zakresie ±0,1 °C. Ponadto termometr z funkcją rejestrowania danych powinien być używany do pomiaru zmian temperatury w czasie. Wiele inkubatorów charakteryzuje się zmianami temperatury większymi niż 1 °C w różnych częściach inkubatora i w czasie, co może mieć znaczący wpływ na eksperymenty HSR. Jako najlepszą praktykę sugerujemy stosowanie inkubatorów, które mają wystarczającą izolację i cyrkulację, aby zminimalizować wahania temperatury. Do przeprowadzania eksperymentów z szokiem cieplnym proponujemy najlepszą praktykę kąpieli wodnej z cyrkulacją. Czas potrzebny do osiągnięcia pożądanej temperatury przez płytkę agarową wynosi około 6-7 minut w łaźni wodnej, ale znacznie dłużej w suchym inkubatorze15,17. Jeśli jednak kąpiel w wodzie obiegowej nie jest dostępna, wykazaliśmy, że silna indukcja HSR występuje również w suchym inkubatorze przy użyciu naszych warunków. W przypadku stosowania inkubatora suchego należy zminimalizować otwieranie inkubatora na czas wystąpienia stresu.

Powszechnie wiadomo, że indukcja genów szoku cieplnego jest zależna od głównego regulatora HSR, HSF-1. W tym miejscu przedstawiamy dowody na to, że dwa bardziej pośrednie testy, reportery fluorescencyjne i termoodzysk, są również zależne od HSF-1. Co istotne, stwierdziliśmy, że powszechnie stosowany alternatywny test organizmu, termotolerancja, nie jest zależny od HSF-1 przy użyciu hsf-1 RNAi (Figura 4). Podobne wyniki zostały wcześniej zgłoszone przy użyciu mutanta hsf-1 lub mutanta ttx-3, który blokuje HSR 18,19,20. Łącznie wyniki te wskazują, że test termotolerancji nie powinien być stosowany w badaniach HSR. Co więcej, sugeruje to, że najlepszą praktyką jest testowanie zależności HSF-1 dla każdego testu stosowanego do pomiaru HSR.

Podsumowując, przedstawiamy szereg znormalizowanych protokołów i najlepszych praktyk w zakresie solidnych i powtarzalnych pomiarów indukcji HSR u C. elegans. Mamy nadzieję, że te metodologie zmniejszą zmienność w eksperymentach HSR i zwiększą odtwarzalność. Ułatwienie bezpośrednich porównań badań nad KDP między laboratoriami przyczyni się do przyspieszenia badań w dziedzinie KDP. Co więcej, standaryzacja przyniesie korzyści badaniom nad starzeniem się i chorobami neurodegeneracyjnymi, z którymi HSR jest ściśle związany.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta darowizną od Franka Leslie. Niektóre szczepy zostały dostarczone przez CGC, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
18S-forward primerTTGCGTCAACTGTGGTCGTG
18S-reverse primerCCAACAAAAAGAACCGAAGT
CCTG
AM446 rmIs223[phsp70::gfp; pRF4(rol-6(su1006))]Morimoto labhttp:// groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/
C12C8.1-forward primerGTACTACGTACTCATGTGTCG
GTATTT
em>C12C8.1-reverse primerACGGGCTTTTTGTTTTCC
CFX Connect Real-Time PCR Detection SystemBio Rad1855200
CL2070 dvIs70 [hsp-16.2p::GFP + rol-6(su1006)]Caenorhabditis Genetics Center (CGC)https://cgc.umn.edu/
Rejestrator danych sondy termistorowej EasyLog z wyświetlaczem LCDLascarEL-USB-TP-LCD
Mikroskop stereoskopowy Greenough serii S9iLeica
Hard Shell 96-dołkowe płytki do PCRBio RadHSS9601
hsp-16.2-forward starterACTTTACCACTATTTCCGTCC
AGC
hsp-16.2-reverse starterCCTTGAACCGCCTCTCTCTTTG
iScript Zestaw do syntezy cDNABio Rad1708891
iTaq Universal Sybr Green Super MixBio Rad1725121
Skaning laserowy konfokalny MikroskopNikonEclipse 90i
MultiGene OptiMax Thermo CyclerLabnetTC9610
N2 (WT)Caenorhabditis Centrum Genetyki (CGC)https://cgc.umn.edu/
Nanodrop Lite SpektrofotometrThermo ScientificND-LITE
Parafilm M RollBemis5259-04LC
Zestaw do usuwania DNA RapidOutThermo ScientificK2981
Recyrkulacyjna podgrzewana kąpiel wodnaLauda BrinkmannRE-206
Identyfikowalny platynowy ultradokładny termometr cyfrowyFisher Scientific15-081-103
Odczynnik TRIzolInvitrogen15596026izolacja RNA odczynnik
TurboMix AttachmentScientific IndustriesSI-0564
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesSI-0236
<

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guisbert, E., Morimoto, R. I. The regulation and function of the heat shock response. Protein Quality Control in Neurodegenerative Diseases. , 1-18 (2013).
  2. Li, J., Chauve, L., Phelps, G., Brielmann, R. M., Morimoto, R. I. E2F coregulates an essential HSF developmental program that is distinct from the heat-shock response. Genes and Development. 30 (18), 2062-2075 (2016).
  3. Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300 (5622), 1142-1145 (2003).
  4. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
  5. Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
  6. Link, C. D., Cypser, J. R., Johnson, C. J., Johnson, T. E. Direct observation of stress response in Caenorhabditis elegans using a reporter transgene. Cell Stress & Chaperones. 4 (4), 235(1999).
  7. Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a Tissue-Selective Heat Shock Response Regulatory Network. PLoS Genetics. 9 (4), 1-12 (2013).
  8. Ma, J., et al. Cellular Proteomes Drive Tissue-Specific Regulation of the Heat Shock Response. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (3), 1011-1018 (2017).
  9. Mendenhall, A. R., et al. Expression of a single-copy hsp-16.2 reporter predicts life span. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (7), 726-733 (2012).
  10. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. (1999), 1-11 (2006).
  11. Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-23 (2012).
  12. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  13. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  14. Shiu, P. K., Hunter, C. P. Early Developmental Exposure to dsRNA Is Critical for Initiating Efficient Nuclear RNAi in C. elegans. Cell Reports. 18 (12), 2969-2978 (2017).
  15. Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological considerations for heat shock of the nematode Caenorhabditis elegans. Methods. 68 (3), 450-457 (2014).
  16. Clark, D. A., Biron, D., Sengupta, P., Samuel, A. D. T. The AFD sensory neurons encode multiple functions underlying thermotactic behavior in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 26 (28), 7444-7451 (2006).
  17. Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the cellular heat shock response in Caenorhabditis elegans by thermosensory neurons. Science. 320 (5877), 811-814 (2008).
  18. McColl, G., et al. Insulin-like signaling determines survival during stress via posttranscriptional mechanisms in C. elegans. Cell Metabolism. 12 (3), 260-272 (2010).
  19. Douglas, P. M., et al. Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity. Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).
  20. Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Heat Shock ResponseCaenorhabditis elegansRT qPCRFluorescent ReportersThermorecovery AssayThermotolerance AssayHSF 1 KnockdownHsp 16 2 ReporterHsp 70 ReporterDevelopmental Timing

Powiązane artykuły