Opisany tutaj jest protokół oznaczania czterech różnych metabolitów tryptofanu generowanych w szlaku kinureniny (kynurenina, 3-hydroksykinurenina, kwas ksanturonowy, kwas 3-hydroksyantranilowy) w pożywce pobranej z kultur komórek nowotworowych analizowanych za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z pojedynczą kwadrupolową spektrometrią mas
.Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Jednoczesna kwantyfikacja wybranych kinurenin analizowanych metodą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas w pożywce pobranej z kultur komórek nowotworowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Szlak kinureninowy i katabolity tryptofanu zwane kinureninami zyskały większą uwagę ze względu na ich udział w regulacji immunologicznej i biologii raka. Test hodowli komórkowej in vitro jest często wykorzystywany do poznania udziału różnych katabolitów tryptofanu w mechanizmie chorobowym oraz do testowania strategii terapeutycznych. Pożywka do hodowli komórkowej, która jest bogata w wydzielane metabolity i cząsteczki sygnałowe, odzwierciedla stan metabolizmu tryptofanu i innych zdarzeń komórkowych. Pożądane są nowe protokoły wiarygodnego oznaczania ilościowego wielu kinurenin w złożonym pożywce do hodowli komórkowych, aby umożliwić wiarygodną i szybką analizę wielu próbek. Można to osiągnąć za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas. Ta potężna technika jest stosowana w wielu laboratoriach klinicznych i badawczych do oznaczania ilościowego metabolitów i może być stosowana do pomiaru kinurenin.
Przedstawione tutaj jest użycie chromatografii cieczowej sprzężonej z pojedynczą kwadrupolową spektrometrią mas (LC-SQ) do jednoczesnego oznaczania czterech kinureniny, tj. kynureniny, 3-hydroksykinureniny, 3-hydroksyantranilu i kwasu ksantrinowego w pożywce pobranej z komórek rakowych hodowanych in vitro. Detektor SQ jest prosty w użyciu i tańszy w porównaniu z innymi spektrometrami masowymi. W analizie SQ-MS wiele jonów z próbki jest generowanych i rozdzielanych zgodnie z ich właściwym stosunkiem masy do ładunku (m/z), a następnie wykrywane w trybie monitorowania pojedynczych jonów (SIM).
Ten artykuł zwraca uwagę na zalety opisanej metody i wskazuje na kilka słabych punktów. Koncentruje się na krytycznych elementach analizy LC-SQ, w tym przygotowaniu próbki wraz z chromatografią i analizą spektrometrii mas. Omówiono również kwestie związane z kontrolą jakości, warunkami kalibracji metody oraz kwestiami związanymi z efektem matrycy. Opisaliśmy proste zastosowanie 3-nitrotyrozyny jako jednego wzorca analogowego dla wszystkich docelowych analitów. Jak potwierdzono w eksperymentach na ludzkich komórkach raka jajnika i piersi, proponowana metoda LC-SQ daje wiarygodne wyniki i może być dalej stosowana do innych modeli komórkowych in vitro.
Wprowadzenie
Szlak kinureninowy (KP) jest główną drogą katabolizmu tryptofanu (Trp) w komórkach ludzkich. Indoloamino-2,3-dioksygenaza (IDO-1) w komórkach pozawątrobowych jest pierwszym i ograniczającym enzymem KP i przekształca Trp w N-formylkynureninę1. Dalsze etapy w KP generują inne metabolity wtórne, a mianowicie kinureniny, które wykazują różne właściwości biologiczne. Kynurenina (Kyn) jest pierwszym stabilnym katabolitem Trp wykazującym właściwości toksyczne i regulującym zdarzenia komórkowe po związaniu się z receptorem węglowodorów arylowych (AhR)2. Następnie Kyn jest przekształcany w kilka cząsteczek spontanicznie lub w pro....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie standardowych roztworów podstawowych 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA
- Odczynniki należy odważyć w fiolce z najwyższą dokładnością (0,3 mg każdy). Aby uzyskać lepszą dokładność, zwiększ skalę odczynników, dostosowując objętość rozpuszczalnika zgodnie z krokiem 1.2.
- Rozpuścić odczynniki w 300 μl rozpuszczalnika, aby otrzymać roztwór podstawowy 1 g/l. Rozpuścić 3NT w 1% (v/v) kwasie mrówkowym (FA) w wodzie; Kyn, 3HAA i XA w dimetylosulfotlenku (DMSO); 3HKyn w wodzie zakwaszonej do pH 2,5 kwasem solnym (HCl).
UWAGA: 3HAA działa drażniąco na oczy, nos, gardło i płuca. Jest szkodliwy w przypadku wdychania, kontaktu ze skórą i po połkni....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
LC-MS wykazuje niepodważalne zalety w oznaczaniu ilościowym cząsteczek biologicznie czynnych, mimo że niektóre składniki złożonych próbek powodują tzw. efekty matrycowe i upośledzają jonizację analitów. Prowadzi to do tłumienia lub wzmacniania sygnału jonowego, co znacząco obniża dokładność i wpływa na granice wykrywalności i oznaczalności metody LC-MS, co jest uznawane za „słaby” punkt tej metody. W naszym protokole jony są generowane za pomocą jonizacji elektrorozpylnej (ESI) w trybie dodatnim, co było stosowane równie.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W artykule przedstawiono szczegółowy protokół LC-SQ do jednoczesnej kwantyfikacji czterech głównych metabolitów Trp (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA), które są mierzone w pożywce z ludzkich komórek nowotworowych hodowanych in vitro . Szczególną uwagę zwrócono na przygotowanie próbki, procedurę chromatografii/spektrometrii mas oraz interpretację danych, które są najważniejszymi punktami analizy.
Ogólnie rzecz biorąc, analiza LC-MS, ze względu na wysoką czułość, wymaga najwyższych standardów rygor.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Unię Europejską z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego w ramach Programu Operacyjnego Rozwój Polski Wschodniej 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), przez Wydział Biotechnologii i Nauk o Środowisku Katolickiego Uniwersytetu Lubelskiego Jana Pawła II (grant dla Młodych Naukowców dla Ilony Sadok), Narodowe Centrum Nauki, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 dla Magdaleny Staniszewskiej, Kierownik projektu). Autorzy dziękują prof. dr hab. Agnieszce Ścibior z Laboratorium Stresu Oksydacyjnego Centrum Badań Interdyscyplinarnych JPII CUL za udostępnienie sprzętu do hodowli komórek i kwantyfikacji białek.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 3-hydroksy-DL-kynurenina | Sigma-Aldrich | H1771 | |
| Kwas 3-hydroksyantranilowy | Sigma-Aldrich | 148776 | 97% |
| 3-nitro-L-tyrozyna | Sigma-Aldrich | N7389 | |
| Acetonitryl | Supelco | 1.00029 | hypergrade dla LC-MS LiChrosolv |
| Węgiel aktywny | Supelco | 05105 | w proszku |
| Waga analityczna | Ohaus | ||
| Kolumna analityczna | Agilent Technologies | 959764-902 | Zorbax Eclipse Plus C18 szybka rozdzielczość HT (2,1 x 100 mm, 1,8 i mikro; m) |
| Mrówczan amonu | Supelco | 7022 | dodatek eluentowy do LC-MS, LiChropur, ≥ 99,0% |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma | 1001887398 | |
| Nakrętki do fiolek chromatograficznych | Agilent Technologies | 5185-5820 | niebieskie nakrętki, PTFE / czerwony sil sepa |
| Naczynie do hodowli komórkowych | Gniazdo | 704004 | polistyren, niepirogenny, sterylny |
| Płytka do hodowli komórkowych | Biologix | 07-6012 | 12-dołkowa, niepirogenna, niecytoksyczna, sterylna |
| Inkubator komórkowy | Thermo Fisher Scientific | HERAcell 150i | |
| Cu Wirówka | Eppendorf | model 5415R | |
| Wirówka | Eppendorf | model 5428 | |
| Probówki wirówkowe | Bionovo | B-2278 | typ Eppendorf, 1,5 ml |
| Probówki wirówkowe | Bionovo | B-3693 | Typ Falcon, 50 mL, PP |
| Dane chromatograficzne oprogramowanie do pozyskiwania i analizy | Agilent Technologies | LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92) | |
| Fiolki z wkładkami chromatograficznymi | Agilent Technologies | 9301-1387 | 100 µ L |
| Fiolki chromatograficzne | Agilent Technologies | 5182-0714 | 2 mL, szkło bezbarwne |
| Dimetylosulfotlenek | Supelco | 1.02950 | Uvasol |
| Dubelcco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-41450 | |
| Podwójny miernik pH/przewodności | Parownik Mettler Toledo | SevenMulti | |
| Genevac | model EZ-2.3 Elite | ||
| Płodowa surowica bydlęca | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Kwas mrówkowy | Supelco | 5.33002 | do LC-MS LiChropur |
| Szklana butelka do przechowywania | odczynnikówBionovo | S-2070 | 50 mL, szkło bezbarwne |
| Kolumna ochronna | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse Plus-C18 Kolumna ochronna wąskootworowa (2,1 x 12,5 mm, 5 i mikro; m) |
| Kwas solny | Merck | 1.00317.1000 | |
| L-kinurenina | Sigma-Aldrich | K8625 | ≥ 98% (HPLC) |
| Mieszadło magnetyczne | Mikrowaga Wigo | ES 21 H | |
| Mettler Toledo | model XP6 | ||
| System Milli-Q Millipore | ZRQSVPO30 | Direct-Q 3 UV z pompą | |
| Kwadrupolowy spektrometr masowy | Agilent Technologies | G1948B | model 6120 |
| Penicylina-Streptomycyna | Sigma-Adrich | 048M4874V | |
| Czytnik płytek | Bio Tek | Synergy 2 obsługiwany przez Gen5 | |
| Chlorek potasu | Merck | 1.04936.1000 | |
| Diwodorofosforan potasu | Merck | 1.05108.0500 | |
| Test białek Koncentrat odczynnika | barwnika BioRad | 500-0006 | |
| Huśtawka | kołyskowa Stuart | SSL4 | |
| Pipeta serologiczna | Nest | 326001 | 5 mL, polistyren, niepirogenny, sterylny |
| Chlorek sodu | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Fosforan sodu dwuzasadowy | Merck | 1.06346.1000 | |
| Filtr wlotowy rozpuszczalnika | Agilent Technologies | 5041-2168 | filtr szklany, 20 μ m wielkość porów |
| Zbiornik rozpuszczalnika (dla LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6524 | 1 L, przezroczyste szkło |
| Zbiornik rozpuszczalnika (do LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6526 | 1 L, szkło bursztynowe |
| Program do arkuszy kalkulacyjnych | Microsoft Office | Microsoft Office Excel | |
| Stir bar | Bionovo | 6-2003 | pokryte teflonem Filtry |
| strzykawkowe do hodowli średnia | filtracja Bionovo | 7-8803 | celuloza regenerowana, Ø 30 mm, 0,45 &mikro; m |
| Filtry strzykawkowe do filtracji ruchomych komponentów fazowych | Bionovo | 6-0018 | nylon, Ø 30 mm, 0,22 µ m |
| Płytki do hodowli tkankowych | VWR | 10062-900 | 96-dołkowe, sterylne |
| roztwór trypsyny-EDTA | Sigma-Aldrih | T4049-100 mL | |
| Ultra-High High Performance Liquid Chromatography | Agilent Technologies | G1367D, G1379B, G1312B, G1316C | 1200 Infinity składał się z automatycznego podajnika próbek (G1367D), odgazowywacza (G1379B), pompy binarnej (G1312B), termostatu kolumnowego (G1316C) |
| Kąpiel ultradźwiękowa | Polsonic | 104533 | model 6D |
| Vortex | Biosan | model V-1 plus | |
| Kwas ksanturenowy | Sigma-Aldrich | D120804 | 96% |
Bibliografia
- Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
- Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immun....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
