Method Article

Jednoczesna kwantyfikacja wybranych kinurenin analizowanych metodą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas w pożywce pobranej z kultur komórek nowotworowych

DOI:

10.3791/61031

⸱

May 9th, 2020

 ,  , 
1Laboratory of Separation and Spectroscopic Method Applications, Centre for Interdisciplinary Research, The John Paul II Catholic University of Lublin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj jest protokół oznaczania czterech różnych metabolitów tryptofanu generowanych w szlaku kinureniny (kynurenina, 3-hydroksykinurenina, kwas ksanturonowy, kwas 3-hydroksyantranilowy) w pożywce pobranej z kultur komórek nowotworowych analizowanych za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z pojedynczą kwadrupolową spektrometrią mas

.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szlak kinureninowy i katabolity tryptofanu zwane kinureninami zyskały większą uwagę ze względu na ich udział w regulacji immunologicznej i biologii raka. Test hodowli komórkowej in vitro jest często wykorzystywany do poznania udziału różnych katabolitów tryptofanu w mechanizmie chorobowym oraz do testowania strategii terapeutycznych. Pożywka do hodowli komórkowej, która jest bogata w wydzielane metabolity i cząsteczki sygnałowe, odzwierciedla stan metabolizmu tryptofanu i innych zdarzeń komórkowych. Pożądane są nowe protokoły wiarygodnego oznaczania ilościowego wielu kinurenin w złożonym pożywce do hodowli komórkowych, aby umożliwić wiarygodną i szybką analizę wielu próbek. Można to osiągnąć za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas. Ta potężna technika jest stosowana w wielu laboratoriach klinicznych i badawczych do oznaczania ilościowego metabolitów i może być stosowana do pomiaru kinurenin.

Przedstawione tutaj jest użycie chromatografii cieczowej sprzężonej z pojedynczą kwadrupolową spektrometrią mas (LC-SQ) do jednoczesnego oznaczania czterech kinureniny, tj. kynureniny, 3-hydroksykinureniny, 3-hydroksyantranilu i kwasu ksantrinowego w pożywce pobranej z komórek rakowych hodowanych in vitro. Detektor SQ jest prosty w użyciu i tańszy w porównaniu z innymi spektrometrami masowymi. W analizie SQ-MS wiele jonów z próbki jest generowanych i rozdzielanych zgodnie z ich właściwym stosunkiem masy do ładunku (m/z), a następnie wykrywane w trybie monitorowania pojedynczych jonów (SIM).

Ten artykuł zwraca uwagę na zalety opisanej metody i wskazuje na kilka słabych punktów. Koncentruje się na krytycznych elementach analizy LC-SQ, w tym przygotowaniu próbki wraz z chromatografią i analizą spektrometrii mas. Omówiono również kwestie związane z kontrolą jakości, warunkami kalibracji metody oraz kwestiami związanymi z efektem matrycy. Opisaliśmy proste zastosowanie 3-nitrotyrozyny jako jednego wzorca analogowego dla wszystkich docelowych analitów. Jak potwierdzono w eksperymentach na ludzkich komórkach raka jajnika i piersi, proponowana metoda LC-SQ daje wiarygodne wyniki i może być dalej stosowana do innych modeli komórkowych in vitro.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szlak kinureninowy (KP) jest główną drogą katabolizmu tryptofanu (Trp) w komórkach ludzkich. Indoloamino-2,3-dioksygenaza (IDO-1) w komórkach pozawątrobowych jest pierwszym i ograniczającym enzymem KP i przekształca Trp w N-formylkynureninę1. Dalsze etapy w KP generują inne metabolity wtórne, a mianowicie kinureniny, które wykazują różne właściwości biologiczne. Kynurenina (Kyn) jest pierwszym stabilnym katabolitem Trp wykazującym właściwości toksyczne i regulującym zdarzenia komórkowe po związaniu się z receptorem węglowodorów arylowych (AhR)2. Następnie Kyn jest przekształcany w kilka cząsteczek spontanicznie lub w procesach enzymatycznych, wytwarzając takie metabolity, jak 3-hydroksykinurenina (3HKyn), kwas antranilowy (AA), kwas 3-hydroksyantranilowy (3-HAA), kwas kynureninowy (Kyna) i kwas ksanturynowy (XA). Inny dalszy metabolit, kwas 2-amino-3-karboksymukonowy-6-semialdehyd (ACMS), ulega cyklizacji nieenzymatycznej do kwasu chinolinowego (QA) lub kwasu pikolinowego (PA)1. Wreszcie, QA jest dalej przekształcany w dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD+)3, metabolit punktu końcowego KP, który jest ważnym kofaktorem enzymu. Niektóre kinureniny mają właściwości neuroprotekcyjne, takie jak Kyna i PA, podczas gdy inne, tj. 3HAA i 3HKyn, są toksyczne4. Kwas ksanturenowy, który powstaje z 3HKyn, wykazuje właściwości przeciwutleniające i wazorelaksacyjne5. XA kumuluje się w starzejących się soczewkach i prowadzi do apoptozy komórek nabłonkowych6. KP, opisana w połowieXX wieku, zyskała większą uwagę, gdy wykazano jej udział w różnych zaburzeniach. Zwiększona aktywność tego szlaku metabolicznego i akumulacja niektórych kinureninów modulują odpowiedź immunologiczną i są związane z różnymi stanami patologicznymi, takimi jak depresja, schizofrenia, encefalopatia, HIV, demencja, stwardnienie zanikowe boczne, malaria, choroba Alzheimera, choroba Huntingtona i rak4,7. Pewne zmiany w metabolizmie Trp obserwuje się w mikrośrodowiskach nowotworowych i komórkach nowotworowych2,8. Ponadto kynureniny są uważane za obiecujące markery choroby9. W badaniach nad rakiem modele hodowli komórkowych in vitro są dobrze ugruntowane i szeroko stosowane do przedklinicznej oceny odpowiedzi na leki przeciwnowotworowe10. Metabolity Trp są wydzielane przez komórki do pożywki hodowlanej i mogą być mierzone w celu oceny stanu szlaku kinureniny. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania odpowiednich metod jednoczesnego wykrywania jak największej liczby metabolitów KP w różnych próbkach biologicznych za pomocą łatwego, elastycznego i niezawodnego protokołu.

W tym artykule opisujemy protokół jednoczesnego oznaczania czterech metabolitów szlaku kynureniny: Kyn, 3HKyn, 3HAA i XA przez LC-SQ w pożywce po hodowli pobranej z komórek nowotworowych. W nowoczesnym podejściu analitycznym chromatografia cieczowa13,14,15,16 jest preferowany do jednoczesnego wykrywania i oznaczania ilościowego poszczególnych katabolitów tryptofanu, w przeciwieństwie do biochemicznych testów niespecyficznych wykorzystujących odczynnik Ehrlicha11,12. Obecnie dostępnych jest wiele metod oznaczania kinureninów w próbkach ludzkich, głównie opartych na chromatografii cieczowej z detektorami ultrafioletu lub fluorescencji13,17,18,19. Chromatografia cieczowa sprzężona z detektorem spektrometrii mas (LC-MS) wydaje się bardziej odpowiednia do tego typu analiz, ze względu na ich wyższą czułość (dolne granice wykrywalności), selektywność i powtarzalność.  

Metabolity Trp zostały już określone w ludzkiej surowicy, osoczu i moczu13,20,21,22,23, jednak pożądane są również metody dla innych próbek biologicznych, takich jak pożywka do hodowli komórkowych. Wcześniej LC-MS był używany do związków pochodzących z Trp w pożywce pobranej po wyhodowaniu ludzkich komórek glejaka, monocytów, komórek dendrytycznych lub astrocytów traktowanych interferonem gamma (IFN-γ)24,25,26. Obecnie istnieje zapotrzebowanie na nowe zwalidowane protokoły, które mogą umożliwić ocenę kilku metabolitów w różnych pożywkach hodowlanych, komórkach i terapiach stosowanych w modelach nowotworowych.

Celem opracowanej metody jest ilościowe określenie (w ramach jednego cyklu analitycznego) czterech głównych kinurenin, które mogą wskazywać na nieprawidłowości w KP. Poniżej przedstawiono kluczowe etapy naszego niedawno opublikowanego protokołu ilościowej analizy LC-SQ wybranych znaczących kynurenin przy użyciu jednego wzorca wewnętrznego (3-nitrotyrozyna, 3NT) w pożywce pobranej z ludzkich komórek nowotworowych hodowanych in vitro27. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, jest to pierwszy protokół LC-SQ do jednoczesnego oznaczania ilościowego 3HKyn, 3HAA, Kyn i XA w pożywce hodowlanej uzyskanej z komórek wyhodowanych in vitro. Po pewnych modyfikacjach metoda może być dalej stosowana do badania zmian w metabolizmie Trp w szerszym zakresie modeli hodowli komórkowych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie standardowych roztworów podstawowych 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA

  1. Odczynniki należy odważyć w fiolce z najwyższą dokładnością (0,3 mg każdy). Aby uzyskać lepszą dokładność, zwiększ skalę odczynników, dostosowując objętość rozpuszczalnika zgodnie z krokiem 1.2.
  2. Rozpuścić odczynniki w 300 μl rozpuszczalnika, aby otrzymać roztwór podstawowy 1 g/l. Rozpuścić 3NT w 1% (v/v) kwasie mrówkowym (FA) w wodzie; Kyn, 3HAA i XA w dimetylosulfotlenku (DMSO); 3HKyn w wodzie zakwaszonej do pH 2,5 kwasem solnym (HCl).
    UWAGA: 3HAA działa drażniąco na oczy, nos, gardło i płuca. Jest szkodliwy w przypadku wdychania, kontaktu ze skórą i po połknięciu. Nosić odpowiednią ochronę, tj. rękawiczki i maskę.
  3. Szczelnie zamknąć fiolkę i umieścić ją w kąpieli ultradźwiękowej na 1 minutę w celu przyspieszenia rozpuszczania.
    UWAGA: Roztwory podstawowe należy przechowywać w temperaturze -20 °C i zminimalizować zamrażanie/rozmrażanie (maksymalnie 3 cykle) ze względu na niestabilność roztworów podstawowych.

2. Przygotowanie pożywki hodowlanej poddanej działaniu węgla drzewnego

  1. W probówce odważyć 280 mg węgla aktywowanego i dodać 5 ml płynnej pożywki przygotowanej do hodowli interesujących komórek.
  2. Potrząsaj rurką z podłożem i węglem drzewnym na bujaku piły przez 2 godziny, w temperaturze pokojowej (ustaw prędkość na 50 oscylacji/min). Następnie odwirować probówki o sile 6000 x g przez 15 minut.
  3. Wyjąć probówkę z wirówki i ostrożnie zebrać supernatant, nie naruszając osadu. W razie potrzeby powtórzyć wirowanie, aby usunąć wszystkie pozostałości węgla drzewnego.
  4. Przefiltrować supernatant za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm.
  5. Upewnij się, że pożywka hodowlana poddana wstępnej obróbce węglem drzewnym jest pozbawiona śladów kinurenin, przeprowadzając próbkę pilotażową na LC-MS, jak opisano w kroku 6.3.2. W przeciwnym razie powtórz kroki 2.1-2.4.
    UWAGA: Jeśli kompletna pożywka hodowlana początkowo nie zawiera kinurenin, można pominąć etap oczyszczania przy użyciu węgla drzewnego. W takim przypadku należy przygotować wzorce kalibracyjne i próbki kontroli jakości, używając kompletnego podłoża zwykle przygotowanego do hodowli komórek.
  6. Przechowywać przygotowane podłoże w temperaturze 4 °C do czasu analizy.

3. Sporządzanie roztworów kalibracyjnych i krzywych kalibracyjnych

  1. Do pożywki hodowlanej poddanej wstępnej obróbce węglem drzewnym należy dodać 0,75 μl roztworu 3NT o stężeniu 0,1 g/l i dodać cztery wzorce (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) w co najmniej sześciu różnych stężeniach, aby pokryć zakresy kalibracji. Utrzymać końcową objętość każdej próbki na poziomie 150 μl. Dobrze zawirować. Do przygotowania próbki należy użyć probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Sugerowane punkty kalibracji dla 3HKyn: 0,018, 0,045, 0,22, 1,12, 2,23, 4,46 μmol/L; dla Kyn: 0,0096, 0,048, 0,24, 1,20, 2,40, 3,84 μmol/L; dla 3HAA: 0,033, 0,16, 0,65, 3,27, 6,53, 13,06 μmol/L; dla XA: 0,019, 0,13, 0,49, 1,22, 3,65, 4,87 μmol/L.
  2. Dodać 150 μl zimnego metanolu (utrzymywanego w temperaturze -20 °C) zawierającego 1% (v/v) kwasu mrówkowego do każdej probówki w celu odbiałczania próbki. Szczelnie zamknij rurki i dobrze wywiruj.
  3. Próbki inkubować w temperaturze -20 °C przez 40 minut.
  4. Odwirować próbki o masie 14 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Wyjąć probówki z wirówki. Zebrać supernatanty do nowych probówek. Nie naruszaj osadu.
  5. Przenieść 270 μl supernatantu do szklanej fiolki za pomocą pipety automatycznej. Umieścić fiolki w parowniku i delikatnie odparować aż do wyschnięcia. Użyj odpowiedniego programu dla frakcji woda/metanol do odparowania składników lotnych. Nie stosować temperatury wyższej niż 40 °C i unikać przesuszenia.
    UWAGA: Fiolki szklane z płaskim dnem, tj. fiolki chromatograficzne, ułatwiają szybsze odparowywanie i wyższy odzysk w porównaniu z probówkami stożkowymi z tworzywa sztucznego.
  6. Po 30 minutach sprawdź stan parowania. W razie potrzeby kontynuuj odparowywanie (np. dodaj dodatkowe 10 minut). Unikaj przesuszenia.
  7. Wyjąć fiolki z parownika. Każdą próbkę należy rozpuścić w 60 μl 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego w wodzie. Dodać rozpuszczalnik do fiolki zawierającej pozostałości materiału. Szczelnie zamknąć fiolki i zawirować.
  8. Przenieść próbkę do probówki o pojemności 1,5 ml i wirować w temperaturze 14 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu oddzielenia wytrąconego białka.
  9. Nie naruszając osadu białkowego, przenieść supernatanty do fiolek chromatograficznych ze stożkowymi wkładkami szklanymi z automatyczną pipetą. Szczelnie zamknąć fiolki.
  10. Sprawdzić, czy we wkładce nie ma pęcherzyków powietrza i usunąć je w razie potrzeby (np. przez wirowanie).
  11. Przenieść fiolki chromatograficzne zawierające próbki do automatycznego podajnika próbek LC. Zapisz położenie próbek umieszczonych w tacy automatycznego podajnika próbek.

4. Przygotowanie próbek kontroli jakości (QC)

  1. Do pożywki hodowlanej poddanej wstępnej obróbce węglem drzewnym (przygotowanej w probówce odśrodkowej o pojemności 1,5 ml) należy dodać 0,75 μl roztworu 3NT o stężeniu 0,1 g/l 3NT i wzorcami czterech kinurenin (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) przy jednym stężeniu wybranym z liniowego zakresu krzywych kalibracyjnych. Utrzymać końcową objętość próbki na poziomie 150 μl.
    UWAGA: W stosownych przypadkach należy przygotować kilka próbek kontroli jakości o różnych stężeniach mieszczących się w zakresie liniowym krzywej kalibracyjnej.
  2. Postępuj zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 3 (kroki 3.2-3.11).

5. Konfiguracja systemu LC-MS

  1. Przygotować rozpuszczalniki w fazie ruchomej: Rozpuszczalnik A: 20 mmol/l mrówczanu amonu w ultraczystej wodzie (pH 4,3 dostosowane kwasem mrówkowym); Rozpuszczalnik B: 100% acetonitryl.
    UWAGA: Używaj wyłącznie butelek ze szkła borokrzemianowego. Wypłucz butelki ultraczystą wodą przed ponownym napełnieniem. Nie używaj butelek oczyszczonych detergentami.
    UWAGA: Acetonitryl powoduje poważne skutki zdrowotne lub śmierć. Łatwo zapala się pod wpływem ciepła. Ciecz acetonitrylowa i para mogą podrażniać oczy, nos, gardło i płuca.
    1. Przygotować roztwór podstawowy mrówczanu amonu o stężeniu 5 mol/l, rozpuszczając krystaliczny odczynnik (15,77 g) w 50 ml ultraczystej wody w szklanej butelce. Mieszaj, aż wszystkie pozostałości się rozpuszczą. Przefiltruj przez membranę 0,45 μm, aby usunąć wszelkie pozostałości zanieczyszczeń (np. za pomocą nylonowego filtra strzykawkowego). Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować rozpuszczalnik A, dodając 4 ml mrówczanu amonu o stężeniu 5 mol/l w wodzie do 980 ml ultraczystej wody w butelce ze szkła bursztynowego i dobrze wymieszać. Zanurz mieszadło i umieść butelkę z rozpuszczalnikiem na mieszadle magnetycznym. Zanurz elektrodę pH w roztworze i kontroluj pH podczas mieszania. Dodawać kroplami roztwór podstawowy kwasu mrówkowego (98%-100%) za pomocą pipety automatycznej z końcówką 0,2 ml, aby uzyskać pH 4,3, dostosować objętość do 1 l wodą ultraczystą i dobrze wymieszać.
      UWAGA: Rozpuszczalniki należy przygotowywać co najmniej raz w tygodniu, aby zapobiec rozwojowi drobnoustrojów.
      UWAGA: Kwas mrówkowy (FA) jest toksyczny w przypadku wdychania, powoduje oparzenia skóry i uszkodzenia oczu. Praca pod wyciągiem; Nosić rękawice ochronne i płaszcz.
    3. Przefiltruj wszystkie roztwory przez membranę 0,22 μm (np. nylonowy filtr strzykawkowy), aby usunąć wszelkie resztki zanieczyszczeń. Opcjonalnie należy zastosować filtry wlotowe rozpuszczalnika przeznaczone do zbiorników rozpuszczalnika LC w celu ochrony układu przed dostającymi się cząstkami.
  2. Uruchom oprogramowanie sterujące i akwizycji danych LC-MS.
  3. Oczyść system LC fazą ruchomą, aby usunąć pęcherzyki i zalać wszystkie kanały rozpuszczalnika.
  4. Ułóż kolumnę ochronną, aby chronić kolumnę analityczną przed zatkaniem.
  5. Przepłukać osłonę i kolumnę analityczną (C18, 2,1 x 100 mm, 1,8 μm) 100% acetonitrylem przez około 30 minut, a następnie 100% rozpuszczalnikiem A, aż do uzyskania stabilnego ciśnienia w kolumnie. Kontroluj wydajność systemu za pomocą oprogramowania sterującego.
  6. Ustaw odpowiednie parametry LC w oprogramowaniu do akwizycji danych.
    1. Ustaw program gradientu: 0-8 min rozpuszczalnik B 0%; 8-17 min rozpuszczalnik B 0-2%; 17-20 min rozpuszczalnik B 2%; 20-32 min rozpuszczalnik B 10-30%; 32-45 min rozpuszczalnik B 0%.
    2. Ustawić natężenie przepływu fazy ruchomej na 0,15 ml/min, całkowity czas trwania analizy na 45 minut, temperaturę kolumny na +40 °C i objętość wtrysku na 10 μl.
  7. Ustaw parametry akwizycji detektora spektrometrii mas.
    1. Zastosuj parametry jonizacji: monitorowanie pojedynczych jonów (SIM), jonizacja dodatnia, ciśnienie nebulizatora 50 psi, temperatura gazu suszącego +350 °C, przepływ gazu suszącego 12 l/min i napięcie kapilarne 5500 V.
    2. Wybierz jony do monitorowania analitu: dla 3HKyn m/z 225.0 (okres skanowania: 2-6 min, napięcie fragmentora: 100 V); dla Kyn m/z 209.0 (okres skanowania: 6-12 min, napięcie fragmentora: 80 V); dla 3HAA m/z 154.0 (okres skanowania: 12-18 min, napięcie fragmentora: 80 V); dla 3NT m/z 227.0 (okres skanowania: 18-23 min, napięcie fragmentora: 100 V); dla XA m/z 206.0 (okres skanowania: 23-45 min, napięcie fragmentora: 100 V).
  8. Skonstruuj listę roboczą i uruchom próbki w systemie LC.
  9. Najpierw, przed analizą próbek doświadczalnych, należy przeprowadzić ślepą próbkę (rozpuszczalnik A) co najmniej w trzech egzemplarzach, a następnie jedną próbkę kontroli jakości.
  10. Otwórz oprogramowanie do analizy danych i załaduj wyniki uzyskane dla próbki kontroli jakości.
  11. Sprawdzić położenie pików analitu na chromatogramie. Gdy sygnały przesuną się poza oczekiwaną pozycję, dostosuj bramki czasowe dla odpowiedniego zbierania sygnałów analitowych. Zapoznaj się z instrukcją obsługi oprogramowania, aby uzyskać instrukcje dotyczące integracji sygnału.

6. Konstruowanie krzywej kalibracyjnej

  1. W oprogramowaniu do akwizycji danych dodaj wzorce kalibracyjne do listy roboczej i uruchom wzorce w trzech egzemplarzach.
  2. Zintegruj i zmierz obszar piku odpowiadający 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3BA i XA w czasie retencji wynoszącym odpowiednio około 4,4 min, 10 min, 16 min, 21 min i 30 min.
  3. Skonstruuj indywidualne krzywe kalibracyjne dla każdego metabolitu za pomocą arkusza kalkulacyjnego.
    1. Aby utworzyć tabelę kalibracji, należy wykreślić wartość stosunku powierzchni piku analitu do obszaru piku 3BA w stosunku do stężenia analitu.
    2. Przeanalizować ślepą próbkę (pożywkę hodowlaną poddaną wstępnej obróbce węglem drzewnym wzbogaconą tylko 3NT), aby upewnić się, że w pożywce nie ma śladów badanych analitów. W przeciwnym razie odejmij uzyskaną wartość od każdego punktu kalibracji.
    3. Sprawdź liniowość każdej krzywej kalibracyjnej.
      1. Indywidualnie, dla każdego analitu, utwórz równanie liniowe przecięcia nachylenia (y = ax + b), gdzie y odpowiada stosunkowi powierzchni piku analitu do powierzchni piku 3NT, a jest nachyleniem, x jest stężeniem analitu (μmol/L), a b odnosi się do punktu przecięcia krzywej. Wykreślenie wykresu "y" w stosunku do "x" spowoduje wygenerowanie krzywej kalibracyjnej.
      2. Dodaj liniową linię trendu do wykresu, wyświetl równanie krzywej kalibracyjnej i współczynnik regresji na wykresie. Upewnij się, że współczynnik regresji wynosi > 0,990. W przypadku niezgodności wzorców kalibracyjnych należy je ponownie przygotować i/lub przeanalizować. Opcjonalnie zmień zakres stężeń krzywej kalibracyjnej.
    4. Przeanalizuj próbki kontroli jakości, aby sprawdzić wydajność systemu przed analizą próbek eksperymentalnych. W przypadku niezgodności (± 20% odchylenia od wartości odniesienia) należy przygotować nowe krzywe kalibracyjne.

7. Hodowla komórkowa in vitro i pobieranie próbek do analizy

  1. Umieść badane komórki rakowe (MDA-MB-231 lub SK-OV-3) w DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) zawierającym 4,5 g/L ᴅ-glukozy, 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mmol/L ʟ-glutaminy i 1 U penicyliny/streptomycyny i posiewaj je w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w celu ich namnażania do eksperymentu. Przejdź komórki w 80% konfluencji.
  2. Oderwij komórki od naczynia hodowlanego za pomocą trypsyny, wysiej nasiona do eksperymentu na 12-dołkowych płytkach o gęstości 0,3 × 106 komórek na dołek i umieść na noc w inkubatorze.
  3. Następnego dnia należy odessać pożywkę hodowlaną i dodać świeży DMEM z dodatkiem lub bez dodatku badanych związków, w zależności od projektu eksperymentalnego.
  4. Po 48 godzinach zebrać pożywkę znad komórek (około 500 μl) do probówki o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 14 000 x g przez 5 minut, aby usunąć wszelkie resztki komórek. Zebrać supernatant i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu zakończenia analizy.
  5. Zapisz osad komórkowy z kroku 7.4 w celu oszacowania białka. Zamrażać próbki w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Wyniki uzyskane dla pożywki z różnych dołków powinny być znormalizowane do całkowitej zawartości białka, aby uwzględnić zmienność liczby komórek w poszczególnych studzienkach. Stężenie białka można ocenić zgodnie z opisem w kroku 9.

8. Przygotowanie próbek do analizy LC-MS

  1. Rozmrozić zamrożoną próbkę w temperaturze pokojowej i dobrze wymieszać. Przenieść 149,25 μl pożywki do probówki wirówkowej (1,5 ml).
  2. Dodać 0,75 μl z 0,1 g/l roztworu 3NT (wzorzec wewnętrzny). Zamknij rurki i dobrze wiruj.
  3. Dodać 150 μl schłodzonego w temperaturze -20 °C metanolu zawierającego 1% (v/v) FA w celu odbiałczenia próbki. Zamknij rurki i dobrze wiruj.
  4. Kontynuować przygotowanie próbki zgodnie z opisem w sekcji 3 (kroki 3.3-3.11).
    UWAGA: Niektóre komórki rakowe, takie jak SK-OV-3, wydzielają duże ilości Kyn do pożywki hodowlanej. Aby dopasować dane do liniowego zakresu krzywej kalibracyjnej, konieczne jest około 100-krotne rozcieńczenie próbki. W takim przypadku rozcieńczyć część próbki 0,1% (v/v) FA w wodzie i analizować dodatkowo z nierozcieńczoną próbką. Próbki referencyjne wzorców do krzywej kalibracyjnej powinny być przygotowane w 100-krotnie rozcieńczonej kompletnej pożywce hodowlanej. Alternatywnie, dodać więcej punktów w krzywej kalibracyjnej (jeśli osiągnięta jest odpowiednia rozpuszczalność i liniowość), aby dostosować ją do poziomu stężenia Kyn w próbce doświadczalnej.
  5. Analizować próbki za pomocą LC-MS zgodnie z opisem w sekcji 5. Skonstruuj listę roboczą i uruchom każdą próbkę w trzech egzemplarzach.
  6. Po zakończeniu listy roboczej zmierz powierzchnię piku analitu.
  7. Wygeneruj arkusz kalkulacyjny za pomocą dostępnego oprogramowania i uzyskaj dane numeryczne.
  8. W jednej kolumnie arkusza kalkulacyjnego oblicz stosunek powierzchni piku analitu do obszaru piku 3BA
    9. .
  9. Do obliczenia stężeń analitów obecnych w próbkach doświadczalnych należy użyć indywidualnego równania kalibracji liniowej dedykowanego dla każdego analitu (od kroku 6.3).

9. Ocena zawartości białka i normalizacja danych

  1. Zawiesić osad komórkowy z kroku 7.5 za pomocą 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w probówce o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Przygotować roztwór PBS, rozpuszczając 8 g chlorku sodu, 0,2 g chlorku potasu, 1,44 g dwuzasadowego fosforanu sodu, diwodorofosforanu potasu w 950 ml ultraczystej wody. Dobrze wymieszaj. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą kwasu solnego (kroplami). Dostosuj objętość do 1 l za pomocą ultraczystej wody. Dobrze wymieszaj do uzyskania jednorodnej konsystencji.
    UWAGA: Kwas solny jest silnie i należy się z nim obchodzić z zachowaniem odpowiednich środków ostrożności. Kontakt z ludzką skórą może powodować zaczerwienienie, ból, oparzenia skóry. Praca pod wyciągiem; Nosić rękawice ochronne i płaszcz.
  2. Próbki należy zamrozić w temperaturze -20 °C, a następnie rozmrozić na lodzie. Powtórz ten krok 3 razy.
  3. Odwirować próbki o masie 14 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatanty do nowych probówek. Nie naruszaj pelletu.
  4. Rozcieńczyć supernatanty 10x PBS.
  5. Skonstruować krzywą kalibracyjną od 0 do 2 μg białka na dołek w zakresie.
    1. Przygotować roztwór wzorcowy albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do kalibracji. Rozpuść 1,23 μg BSA w 1 ml ultraczystej wody i dobrze zawiruj.
    2. Na płytkę 96-dołkową umieścić różne ilości roztworu wzorcowego BSA (1,23 μg/ml): 0 μl, 2 μl, 4 μl, 5 μl, 7 μl, 10 μl, 15 μl, 20 μl.
    3. Napełnić studzienkę PBS do końcowej objętości 50 μl.
  6. Załaduj 10 - 15 μl lizatu komórkowego z kroku 9.4 na tę samą 96-dołkową płytkę. Napełnij studzienki PBS, aby osiągnąć końcową objętość 50 μL.
    UWAGA: W razie potrzeby dostosuj objętość podwielokrotności lizatu komórkowego w każdym dołku, aby dopasować się do liniowego zakresu krzywej kalibracyjnej. Utrzymać końcową objętość próbki na poziomie 50 μl na studzienkę.
  7. Do każdej studzienki dodać 200 μl odczynnika Bradforda (rozcieńczonego 5-krotnie ultraczystą wodą).
  8. Inkubować pasztet z 96 dołków przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej. Włożyć płytkę do czytnika mikropłytek. Zmierzyć absorbancję przy λ = 595 nm.
  9. Skonstruuj krzywą kalibracyjną za pomocą arkusza kalkulacyjnego. Wykreślić ilość BSA (μg) w funkcji absorbancji. Dodaj liniową linię trendu, wyświetl równanie krzywej kalibracyjnej i współczynnik regresji na wykresie.
  10. Równanie liniowe (y = ax + b, gdzie y odpowiada absorbancji przy λ = 595 nm, a jest nachyleniem, x jest zawartością białka (μg), a b odnosi się do punktu przecięcia krzywej), aby obliczyć ilość białka w próbce.
    UWAGA: W obliczeniach należy uwzględnić współczynnik rozcieńczenia próbki.
  11. Oszacowaną zawartość białka należy wykorzystać do normalizacji ilości kinureniny w próbce na 1 mg białka. W tym celu należy podzielić stężenie kynurenin oznaczone w kroku 8.9 przez całkowitą zawartość białka z kroku 9.10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LC-MS prezentuje niezaprzeczalne zalety w kwantyfikacji biologicznie aktywnych cząsteczek, mimo że niektóre składniki złożonych próbek powodują tzw. efekty matrycowe i utrudniają jonizację analitów. Prowadzi to do supresji jonów lub ich wzmocnienia, znacznie zmniejszając dokładność i wpływając na granicę wykrywalności/kwantyfikacji LC-MS, która jest uważana za "słaby" punkt metody. W naszym protokole jony są generowane przez jonizację elektronrozpylania (ESI) w trybie dodatnim, który został również wykorzystany w innych ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono szczegółowy protokół LC-SQ do jednoczesnej kwantyfikacji czterech głównych metabolitów Trp (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA), które są mierzone w pożywce z ludzkich komórek nowotworowych hodowanych in vitro . Szczególną uwagę zwrócono na przygotowanie próbki, procedurę chromatografii/spektrometrii mas oraz interpretację danych, które są najważniejszymi punktami analizy.

Ogólnie rzecz biorąc, analiza LC-MS, ze względu na wysoką czułość, wymaga najwyższych standardów rygor...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Unię Europejską z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego w ramach Programu Operacyjnego Rozwój Polski Wschodniej 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), przez Wydział Biotechnologii i Nauk o Środowisku Katolickiego Uniwersytetu Lubelskiego Jana Pawła II (grant dla Młodych Naukowców dla Ilony Sadok), Narodowe Centrum Nauki, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 dla Magdaleny Staniszewskiej, Kierownik projektu). Autorzy dziękują prof. dr hab. Agnieszce Ścibior z Laboratorium Stresu Oksydacyjnego Centrum Badań Interdyscyplinarnych JPII CUL za udostępnienie sprzętu do hodowli komórek i kwantyfikacji białek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-hydroksy-DL-kynureninaSigma-AldrichH1771
Kwas 3-hydroksyantranilowySigma-Aldrich14877697%
3-nitro-L-tyrozynaSigma-AldrichN7389
AcetonitrylSupelco1.00029hypergrade dla LC-MS LiChrosolv
Węgiel aktywnySupelco05105w proszku
Waga analitycznaOhaus
Kolumna analitycznaAgilent Technologies959764-902Zorbax Eclipse Plus C18 szybka rozdzielczość HT (2,1 x 100 mm, 1,8 i mikro; m)
Mrówczan amonuSupelco7022dodatek eluentowy do LC-MS, LiChropur, ≥ 99,0%
Albumina surowicy bydlęcejSigma1001887398
Nakrętki do fiolek chromatograficznychAgilent Technologies5185-5820niebieskie nakrętki, PTFE / czerwony sil sepa
Naczynie do hodowli komórkowychGniazdo704004polistyren, niepirogenny, sterylny
Płytka do hodowli komórkowychBiologix07-601212-dołkowa, niepirogenna, niecytoksyczna, sterylna
Inkubator komórkowyThermo Fisher ScientificHERAcell 150i
Cu WirówkaEppendorfmodel 5415R
WirówkaEppendorfmodel 5428
Probówki wirówkoweBionovoB-2278typ Eppendorf, 1,5 ml
Probówki wirówkoweBionovoB-3693Typ Falcon, 50 mL, PP
Dane chromatograficzne oprogramowanie do pozyskiwania i analizyAgilent TechnologiesLC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
Fiolki z wkładkami chromatograficznymiAgilent Technologies9301-1387100 µ L
Fiolki chromatograficzneAgilent Technologies5182-07142 mL, szkło bezbarwne
DimetylosulfotlenekSupelco1.02950Uvasol
Dubelcco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM)PAN BiotechP04-41450
Podwójny miernik pH/przewodnościParownik Mettler ToledoSevenMulti
Genevacmodel EZ-2.3 Elite
Płodowa surowica bydlęcaSigma-AldrichF9665
Kwas mrówkowySupelco5.33002do LC-MS LiChropur
Szklana butelka do przechowywaniaodczynnikówBionovoS-207050 mL, szkło bezbarwne
Kolumna ochronnaAgilent Technologies959757-902Zorbax Eclipse Plus-C18 Kolumna ochronna wąskootworowa (2,1 x 12,5 mm, 5 i mikro; m)
Kwas solnyMerck1.00317.1000
L-kinureninaSigma-AldrichK8625≥ 98% (HPLC)
Mieszadło magnetyczneMikrowaga WigoES 21 H
Mettler Toledomodel XP6
System Milli-Q MilliporeZRQSVPO30Direct-Q 3 UV z pompą
Kwadrupolowy spektrometr masowyAgilent TechnologiesG1948Bmodel 6120
Penicylina-StreptomycynaSigma-Adrich048M4874V
Czytnik płytekBio TekSynergy 2 obsługiwany przez Gen5
Chlorek potasuMerck1.04936.1000
Diwodorofosforan potasuMerck1.05108.0500
Test białek Koncentrat odczynnikabarwnika BioRad500-0006
Huśtawkakołyskowa StuartSSL4
Pipeta serologicznaNest3260015 mL, polistyren, niepirogenny, sterylny
Chlorek soduSigma-Aldrich7647-14-5
Fosforan sodu dwuzasadowyMerck1.06346.1000
Filtr wlotowy rozpuszczalnikaAgilent Technologies5041-2168filtr szklany, 20 μ m wielkość porów
Zbiornik rozpuszczalnika (dla LC-MS)Agilent Technologies9301-65241 L, przezroczyste szkło
Zbiornik rozpuszczalnika (do LC-MS)Agilent Technologies9301-65261 L, szkło bursztynowe
Program do arkuszy kalkulacyjnychMicrosoft OfficeMicrosoft Office Excel
Stir barBionovo6-2003pokryte teflonem Filtry
strzykawkowe do hodowli średniafiltracja Bionovo7-8803celuloza regenerowana, Ø 30 mm, 0,45 &mikro; m
Filtry strzykawkowe do filtracji ruchomych komponentów fazowychBionovo6-0018nylon, Ø 30 mm, 0,22 µ m
Płytki do hodowli tkankowychVWR10062-90096-dołkowe, sterylne
roztwór trypsyny-EDTASigma-AldrihT4049-100 mL
Ultra-High High Performance Liquid ChromatographyAgilent TechnologiesG1367D, G1379B, G1312B, G1316C1200 Infinity składał się z automatycznego podajnika próbek (G1367D), odgazowywacza (G1379B), pompy binarnej (G1312B), termostatu kolumnowego (G1316C)
Kąpiel ultradźwiękowaPolsonic104533model 6D
VortexBiosanmodel V-1 plus
Kwas ksanturenowySigma-AldrichD12080496%
System

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
  2. Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology. Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).
  3. Badawy, A. A. B. Kynurenine pathway and human systems. Experimental Gerontology. 129, (2020).
  4. Chen, Y., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states. International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).
  5. Sathyasaikumar, K. V., et al. Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects. Neuroscience. 367, 85-97 (2017).
  6. Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid. BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).
  7. Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. 3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system. Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).
  8. Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity. Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286(2018).
  9. Tan, V. X., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis. Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).
  10. Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).
  11. Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity. Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).
  12. Park, A., et al. Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways. Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).
  13. Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M. Chromatographic analysis of tryptophan metabolites. Journal of Separation Science. 40 (15), 3020-3045 (2017).
  14. Fuertig, R., et al. LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain. Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).
  15. Marcos, J., et al. Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).
  16. Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).
  17. Lesniak, W. G., et al. Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites. Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).
  18. Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection. International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).
  19. Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection. Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).
  20. Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum. Journal of Biological Methods. 4 (3), 75(2017).
  21. Arnhard, K., et al. A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma. Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).
  22. Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).
  23. Huang, Y., et al. A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients. Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).
  24. Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).
  25. Zhu, W., et al. Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).
  26. Hashioka, S., et al. Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes. Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).
  27. Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).
  28. Annesley, T. M. Ion suppression in mass spectrometry. Clinical Chemistry. 49 (7), 1041-1044 (2003).
  29. Houée-Lévin, C., et al. Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences. Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).
  30. Wei, H., et al. Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage. Reproductive Sciences. , e1933719119833788 (2019).
  31. Liu, P., et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes. BMC Cancer. 9, 416(2009).
  32. Mailankot, M., et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Kynurenine QuantificationLiquid ChromatographyMass SpectrometryCancer Cell CultureSample PreparationCalibration CurveSingle Ion MonitoringProtein NormalizationQuality ControlInternal Standard

Related Articles