Jednoczesna kwantyfikacja wybranych kinurenin analizowanych metodą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas w pożywce pobranej z kultur komórek nowotworowych

Summary

Opisany tutaj jest protokół oznaczania czterech różnych metabolitów tryptofanu generowanych w szlaku kinureniny (kynurenina, 3-hydroksykinurenina, kwas ksanturonowy, kwas 3-hydroksyantranilowy) w pożywce pobranej z kultur komórek nowotworowych analizowanych za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z pojedynczą kwadrupolową spektrometrią mas

.

Abstract

Szlak kinureninowy i katabolity tryptofanu zwane kinureninami zyskały większą uwagę ze względu na ich udział w regulacji immunologicznej i biologii raka. Test hodowli komórkowej in vitro jest często wykorzystywany do poznania udziału różnych katabolitów tryptofanu w mechanizmie chorobowym oraz do testowania strategii terapeutycznych. Pożywka do hodowli komórkowej, która jest bogata w wydzielane metabolity i cząsteczki sygnałowe, odzwierciedla stan metabolizmu tryptofanu i innych zdarzeń komórkowych. Pożądane są nowe protokoły wiarygodnego oznaczania ilościowego wielu kinurenin w złożonym pożywce do hodowli komórkowych, aby umożliwić wiarygodną i szybką analizę wielu próbek. Można to osiągnąć za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas. Ta potężna technika jest stosowana w wielu laboratoriach klinicznych i badawczych do oznaczania ilościowego metabolitów i może być stosowana do pomiaru kinurenin.

Przedstawione tutaj jest użycie chromatografii cieczowej sprzężonej z pojedynczą kwadrupolową spektrometrią mas (LC-SQ) do jednoczesnego oznaczania czterech kinureniny, tj. kynureniny, 3-hydroksykinureniny, 3-hydroksyantranilu i kwasu ksantrinowego w pożywce pobranej z komórek rakowych hodowanych in vitro. Detektor SQ jest prosty w użyciu i tańszy w porównaniu z innymi spektrometrami masowymi. W analizie SQ-MS wiele jonów z próbki jest generowanych i rozdzielanych zgodnie z ich właściwym stosunkiem masy do ładunku (m/z), a następnie wykrywane w trybie monitorowania pojedynczych jonów (SIM).

Ten artykuł zwraca uwagę na zalety opisanej metody i wskazuje na kilka słabych punktów. Koncentruje się na krytycznych elementach analizy LC-SQ, w tym przygotowaniu próbki wraz z chromatografią i analizą spektrometrii mas. Omówiono również kwestie związane z kontrolą jakości, warunkami kalibracji metody oraz kwestiami związanymi z efektem matrycy. Opisaliśmy proste zastosowanie 3-nitrotyrozyny jako jednego wzorca analogowego dla wszystkich docelowych analitów. Jak potwierdzono w eksperymentach na ludzkich komórkach raka jajnika i piersi, proponowana metoda LC-SQ daje wiarygodne wyniki i może być dalej stosowana do innych modeli komórkowych in vitro.

Introduction

Szlak kinureninowy (KP) jest główną drogą katabolizmu tryptofanu (Trp) w komórkach ludzkich. Indoloamino-2,3-dioksygenaza (IDO-1) w komórkach pozawątrobowych jest pierwszym i ograniczającym enzymem KP i przekształca Trp w N-formylkynureninę¹. Dalsze etapy w KP generują inne metabolity wtórne, a mianowicie kinureniny, które wykazują różne właściwości biologiczne. Kynurenina (Kyn) jest pierwszym stabilnym katabolitem Trp wykazującym właściwości toksyczne i regulującym zdarzenia komórkowe po związaniu się z receptorem węglowodorów arylowych (AhR)². Następnie Kyn jest przekształcany w kilka cząsteczek spontanicznie lub w pro....

Protocol

1. Przygotowanie standardowych roztworów podstawowych 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA

1. Odczynniki należy odważyć w fiolce z najwyższą dokładnością (0,3 mg każdy). Aby uzyskać lepszą dokładność, zwiększ skalę odczynników, dostosowując objętość rozpuszczalnika zgodnie z krokiem 1.2.
2. Rozpuścić odczynniki w 300 μl rozpuszczalnika, aby otrzymać roztwór podstawowy 1 g/l. Rozpuścić 3NT w 1% (v/v) kwasie mrówkowym (FA) w wodzie; Kyn, 3HAA i XA w dimetylosulfotlenku (DMSO); 3HKyn w wodzie zakwaszonej do pH 2,5 kwasem solnym (HCl).
   UWAGA: 3HAA działa drażniąco na oczy, nos, gardło i płuca. Jest szkodliwy w przypadku wdychania, kontaktu ze skórą i po połkni....

Results

LC-MS prezentuje niezaprzeczalne zalety w kwantyfikacji biologicznie aktywnych cząsteczek, mimo że niektóre składniki złożonych próbek powodują tzw. efekty matrycowe i utrudniają jonizację analitów. Prowadzi to do supresji jonów lub ich wzmocnienia, znacznie zmniejszając dokładność i wpływając na granicę wykrywalności/kwantyfikacji LC-MS, która jest uważana za "słaby" punkt metody. W naszym protokole jony są generowane przez jonizację elektronrozpylania (ESI) w trybie dodatnim, który został również wykorzystany w innych .......

Discussion

W artykule przedstawiono szczegółowy protokół LC-SQ do jednoczesnej kwantyfikacji czterech głównych metabolitów Trp (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA), które są mierzone w pożywce z ludzkich komórek nowotworowych hodowanych in vitro . Szczególną uwagę zwrócono na przygotowanie próbki, procedurę chromatografii/spektrometrii mas oraz interpretację danych, które są najważniejszymi punktami analizy.

Ogólnie rzecz biorąc, analiza LC-MS, ze względu na wysoką czułość, wymaga najwyższych standardów rygor.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-hydroksy-DL-kynurenina	Sigma-Aldrich	H1771
Kwas 3-hydroksyantranilowy	Sigma-Aldrich	148776	97%
3-nitro-L-tyrozyna	Sigma-Aldrich	N7389
Acetonitryl	Supelco	1.00029	hypergrade dla LC-MS LiChrosolv
Węgiel aktywny	Supelco	05105	w proszku
Waga analityczna	Ohaus
Kolumna analityczna	Agilent Technologies	959764-902	Zorbax Eclipse Plus C18 szybka rozdzielczość HT (2,1 x 100 mm, 1,8 i mikro; m)
Mrówczan amonu	Supelco	7022	dodatek eluentowy do LC-MS, LiChropur, ≥ 99,0%
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	1001887398
Nakrętki do fiolek chromatograficznych	Agilent Technologies	5185-5820	niebieskie nakrętki, PTFE / czerwony sil sepa
Naczynie do hodowli komórkowych	Gniazdo	704004	polistyren, niepirogenny, sterylny
Płytka do hodowli komórkowych	Biologix	07-6012	12-dołkowa, niepirogenna, niecytoksyczna, sterylna
Inkubator komórkowy	Thermo Fisher Scientific		HERAcell 150i
Cu Wirówka	Eppendorf		model 5415R
Wirówka	Eppendorf		model 5428
Probówki wirówkowe	Bionovo	B-2278	typ Eppendorf, 1,5 ml
Probówki wirówkowe	Bionovo	B-3693	Typ Falcon, 50 mL, PP
Dane chromatograficzne oprogramowanie do pozyskiwania i analizy	Agilent Technologies		LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
Fiolki z wkładkami chromatograficznymi	Agilent Technologies	9301-1387	100 µ L
Fiolki chromatograficzne	Agilent Technologies	5182-0714	2 mL, szkło bezbarwne
Dimetylosulfotlenek	Supelco	1.02950	Uvasol
Dubelcco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-41450
Podwójny miernik pH/przewodności	Parownik Mettler Toledo		SevenMulti
	Genevac		model EZ-2.3 Elite
Płodowa surowica bydlęca	Sigma-Aldrich	F9665
Kwas mrówkowy	Supelco	5.33002	do LC-MS LiChropur
Szklana butelka do przechowywania	odczynnikówBionovo	S-2070	50 mL, szkło bezbarwne
Kolumna ochronna	Agilent Technologies	959757-902	Zorbax Eclipse Plus-C18 Kolumna ochronna wąskootworowa (2,1 x 12,5 mm, 5 i mikro; m)
Kwas solny	Merck	1.00317.1000
L-kinurenina	Sigma-Aldrich	K8625	≥ 98% (HPLC)
Mieszadło magnetyczne	Mikrowaga Wigo		ES 21 H
	Mettler Toledo		model XP6
System Milli-Q Millipore		ZRQSVPO30	Direct-Q 3 UV z pompą
Kwadrupolowy spektrometr masowy	Agilent Technologies	G1948B	model 6120
Penicylina-Streptomycyna	Sigma-Adrich	048M4874V
Czytnik płytek	Bio Tek		Synergy 2 obsługiwany przez Gen5
Chlorek potasu	Merck	1.04936.1000
Diwodorofosforan potasu	Merck	1.05108.0500
Test białek Koncentrat odczynnika	barwnika BioRad	500-0006
Huśtawka	kołyskowa Stuart	SSL4
Pipeta serologiczna	Nest	326001	5 mL, polistyren, niepirogenny, sterylny
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Fosforan sodu dwuzasadowy	Merck	1.06346.1000
Filtr wlotowy rozpuszczalnika	Agilent Technologies	5041-2168	filtr szklany, 20 μ m wielkość porów
Zbiornik rozpuszczalnika (dla LC-MS)	Agilent Technologies	9301-6524	1 L, przezroczyste szkło
Zbiornik rozpuszczalnika (do LC-MS)	Agilent Technologies	9301-6526	1 L, szkło bursztynowe
Program do arkuszy kalkulacyjnych	Microsoft Office		Microsoft Office Excel
Stir bar	Bionovo	6-2003	pokryte teflonem Filtry
strzykawkowe do hodowli średnia	filtracja Bionovo	7-8803	celuloza regenerowana, Ø 30 mm, 0,45 &mikro; m
Filtry strzykawkowe do filtracji ruchomych komponentów fazowych	Bionovo	6-0018	nylon, Ø 30 mm, 0,22 µ m
Płytki do hodowli tkankowych	VWR	10062-900	96-dołkowe, sterylne
roztwór trypsyny-EDTA	Sigma-Aldrih	T4049-100 mL
Ultra-High High Performance Liquid Chromatography	Agilent Technologies	G1367D, G1379B, G1312B, G1316C	1200 Infinity składał się z automatycznego podajnika próbek (G1367D), odgazowywacza (G1379B), pompy binarnej (G1312B), termostatu kolumnowego (G1316C)
Kąpiel ultradźwiękowa	Polsonic	104533	model 6D
Vortex	Biosan		model V-1 plus
Kwas ksanturenowy	Sigma-Aldrich	D120804	96%