Immunolokalizacja fluorescencyjna białek i pektyn arabinogalaktanu w ścianie komórkowej tkanek roślinnych

Podsumowanie

Ten protokół opisuje szczegółowo, w jaki sposób materiał roślinny do immunolokalizacji białek i pektyn Arabinogalaktanu jest utrwalony, osadzony w hydrofilowej żywicy akrylowej, podzielony na sekcje i zamontowany na szkiełkach podstawowych. Pokazujemy, że epitopy związane ze ścianą komórkową zostaną wykryte za pomocą specyficznych przeciwciał.

Streszczenie

Rozwój roślin polega na ciągłym dostosowywaniu składu i struktury ściany komórkowej w odpowiedzi na bodźce zarówno wewnętrzne, jak i zewnętrzne. Ściany komórkowe składają się z polisacharydów celulozowych i niecelulozowych wraz z białkami, związkami fenolowymi i wodą. 90% ściany komórkowej składa się z polisacharydów (np. pektyn) i białek arabinogalaktanu (AGP). Immunolokalizacja fluorescencyjna specyficznych epitopów glikanów w przekrojach histologicznych roślin pozostaje kluczowym narzędziem do odkrycia przebudowy ściennych sieci polisacharydowych, struktury i składników.

Tutaj opisujemy zoptymalizowaną procedurę immunolokalizacji fluorescencyjnej do wykrywania epitopów glikanów z AGP i pektyn w tkankach roślinnych. Zastosowano utrwalanie paraformaldehydu/aldehydu glutarowego wraz z zatapianiem próbek roślinnych LR-White, co pozwoliło na lepsze zachowanie struktury i składu tkanki. Cienkie skrawki osadzonych próbek uzyskanych za pomocą ultramikrotomu wykorzystano do immunolokalizacji za pomocą specyficznych przeciwciał. Technika ta oferuje doskonałą rozdzielczość, wysoką specyficzność i szansę na wykrycie wielu epitopów glikanów w tej samej próbce. Technika ta umożliwia subkomórkową lokalizację glikanów i wykrywa poziom ich akumulacji w ścianie komórkowej. Pozwala również na określenie czasoprzestrzennych wzorców dystrybucji AGP i pektyn podczas procesów rozwojowych. Zastosowanie tego narzędzia może ostatecznie wskazać kierunki badań i powiązać glikany z określonymi funkcjami w roślinach. Ponadto uzyskane informacje mogą stanowić uzupełnienie badań biochemicznych i badań nad ekspresją genów.

Wprowadzenie

Ściany komórkowe roślin to złożone struktury złożone z polisacharydów i glikoprotein. Ściany komórkowe są niezwykle dynamicznymi strukturami, których architektura, organizacja i skład różnią się w zależności od typu komórki, lokalizacji, etapu rozwoju, bodźców zewnętrznych i wewnętrznych¹. Białka arabinogalaktanu (AGP) i pektyny są ważnymi składnikami ściany komórkowej rośliny. AGP są silnie glikozylowanymi białkami, a pektyny są polisacharydami homogalakturonowymi, których skład, ilość i struktura różnią się znacznie w różnych fazach rozwoju rośliny^2,3,4. Badania AGP i pektyn wykazały ich udział w kilku procesach roślinnych, takich jak programowana śmierć komórki, reakcja na stresy abiotyczne, rozmnażanie płciowe roślin i wiele innych⁵. Większość z tych badań rozpoczęto od informacji uzyskanych z badań immunolokalizacyjnych.

Biorąc pod uwagę jego złożoność, badanie ścian komórkowych wymaga wielu różnych narzędzi. Wykrywanie epitopów glikanów za pomocą przeciwciał monoklonalnych (mAb) jest cennym podejściem do rozwiązania dystrybucji polisacharydów i glikoprotein wzdłuż tej struktury. Dostępna jest duża kolekcja mAb do wykrywania epitopów glikanów, a swoistość każdego mAb jest również stale ulepszana⁶. Opisana tu technika ma zastosowanie do wszystkich gatunków roślin i jest doskonałym narzędziem do wyznaczania przyszłych kierunków badań, które mogą obejmować bardziej kosztowne i złożone techniki.

W tej technice, specyficzne przeciwciała są chemicznie sprzężone z barwnikami fluorescencyjnymi, takimi jak FITC (izotiocyjanian fluoresceiny), TRITC (tetrametylorodamino-5-(i 6)-izotiocyjanian) lub kilka barwników Alexa Fluor. Immunofluorescencja ma kilka zalet, umożliwiając wyraźną i szybką subkomórkową lokalizację glikanów, którą można bezpośrednio zaobserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym. Jest wysoce specyficzny i wrażliwy, ponieważ przygotowanie próbki może skutecznie chronić naturalną strukturę antygenu, nawet jeśli występuje w mniejszych ilościach. Pozwala na wykrycie wielu antygenów w tej samej próbce, a co najważniejsze, oferuje wysoką jakość i piękne wizualnie wyniki. Pomimo ogromnej mocy, jaką oferują badania immunolokalizacji fluorescencji, często są one uważane za trudne do wykonania i wdrożenia, najprawdopodobniej ze względu na brak szczegółowych protokołów pozwalających na wizualizację poszczególnych etapów zabiegu. Tutaj podajemy kilka prostych wskazówek, jak wykonać tę technikę i jak uzyskać obrazy wysokiej jakości.

Dla przedstawionego tutaj protokołu, próbki muszą najpierw zostać naprawione i osadzone przy użyciu najbardziej odpowiedniego utrwalacza. Chociaż uważa się, że jest to technika czasochłonna i stosunkowo żmudna, właściwe utrwalenie i osadzenie próbki rośliny jest kluczem do zapewnienia udanego testu immunolokalizacyjnego. W tym celu najczęściej stosuje się utrwalanie chemiczne za pomocą utrwalaczy sieciujących, takich jak aldehydy. Utrwalacze sieciujące tworzą wiązania chemiczne między cząsteczkami tkanki, stabilizując i utwardzając próbkę. Formaldehyd i aldehyd glutarowy są utrwalaczami sieciującymi, a czasami stosuje się mieszankę obu utrwalaczy⁷. Formaldehyd zapewnia doskonałą ochronę strukturalną tkanek przez dłuższy czas, powodując niewielkie retrakcje tkanek i będąc kompatybilnym z barwieniem immunologicznym. Aldehyd glutarowy jest silniejszym i stabilniejszym utrwalaczem, zwykle stosowanym w połączeniu z formaldehydem. Stosowanie aldehydu glutarowego ma pewne wady, które należy wziąć pod uwagę, ponieważ wprowadza on pewne wolne grupy aldehydowe do utrwalonej tkanki, co może powodować niespecyficzne znakowanie. Również sieciowanie między białkami i innymi cząsteczkami czasami może sprawić, że niektóre docelowe epitopy staną się niedostępne dla przeciwciał. Aby tego uniknąć, należy dokładnie określić ilość i czas trwania utrwalenia.

Po utrwaleniu, próbki są zatapiane w odpowiedniej żywicy, aby utwardzić się przed uzyskaniem sekcji. Żywica akrylowa London Resin (LR-White) jest żywicą z wyboru do badań immunolokalizacyjnych. W przeciwieństwie do innych żywic, LR-White jest hydrofilowa, dzięki czemu przeciwciała docierają do swoich antygenów, bez potrzeby jakiejkolwiek obróbki, aby to ułatwić. LR-White ma również tę zaletę, że oferuje niską autofluorescencję, co pozwala na redukcję szumów tła podczas obrazowania immunofluorescencyjnego.

Istnieje wiele dostępnych technik barwienia do wykrywania różnych składników ściany komórkowej, takich jak barwienie błękitem alcyjskim, barwienie błękitem toluidynowym lub barwienie kwasem okresowym-Schiffem (PAS). Żadna z tych metod nie oferuje takiej mocy jak analizy immunolokalizacyjne⁸. Takie podejście zapewnia większą szczegółowość w wykrywaniu glikanów, oferując szersze informacje na temat składu i struktury ściany komórkowej.

Protokół

1. Przygotowanie próbki: utrwalanie, odwadnianie i zatapianie LR-White

1. Utrwalenie i odwodnienie
   UWAGA: Proces utrwalania ma kluczowe znaczenie dla zachowania próbki; Poprzez sieciowanie cząsteczek metabolizm komórkowy zostaje zatrzymany, zapewniając integralność komórkową i zapobiegając dyfuzji molekularnej. Utrwalacze i stosowane stężenie muszą być dostosowane do tego celu, pozostawiając antygeny wystarczająco narażone, aby mogły oddziaływać z przeciwciałami. Poniższy protokół łączy łagodną zdolność utrwalania paraformaldehydu z silniejszym działaniem aldehydu glutarowego. Ich proporcje zostały zoptymalizowane pod kątem AGP i składników ściany komórkowej, ale nadaje się do innych białek i struktur komórkowych. Późniejszy proces odwadniania przygotuje próbki do zatopienia LR-White. W tym eksperymencie wykorzystano tkanki roślinne z kilku gatunków roślin. Próbki Quercus suber pobrano z drzew rosnących na polu. Próbki Trithuria submersa zostały nam uprzejmie udostępnione przez Paulę Rudall (Kew Gardens, Londyn, Wielka Brytania).
   1. Wysiewaj wszystkie rośliny rzodkiewnika bezpośrednio na glebę i uprawiaj w pomieszczeniu o wilgotności względnej 60% i cyklu dzień/noc z 16-godzinnym światłem w temperaturze 21 °C i 8-godzinnym zaciemnieniem w temperaturze 18 °C. Wybierz tkanki roślinne do analizy i przycinaj próbki tak, aby nie przekraczały 16^mm2.
   2. Natychmiast przenieść próbkę do szklanej fiolki uprzednio wypełnionej wystarczającą ilością zimnego roztworu utrwalającego (2% formaldehydu (w/v), 2,5% aldehydu glutarowego (w/v), 25 mM RURY pH 7 i 0,001% Tween-20 (v/v)) aby całkowicie zanurzyć próbki (Rysunek 1A).
      UWAGA: Formaldehyd i aldehyd glutarowy są środkami utrwalającymi, które mogą być szkodliwe przez wdychanie i kontakt. Wykonać etap mocowania na dygestorium i nosić odpowiednią odzież ochronną oraz rękawice nitrylowe. Wszystkie roztwory począwszy od tego etapu, w tym serie alkoholowe do 70%, powinny być przechowywane w celu późniejszej dekontaminacji przez wyspecjalizowany personel.
   3. Po zebraniu wszystkich próbek odświeżyć utrwalacz.
   4. Przenieść fiolki do komory próżniowej i powoli stosować podciśnienie. Po osiągnięciu -60 kPa unoszący się materiał zacznie opadać na dno fiolki (Rysunek 1B).
   5. Przechowywać w próżni nie wyższej niż -80 kPa przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
   6. Powoli uwolnić próżnię, zamknąć szklaną fiolkę i umieścić na noc w temperaturze 4 °C.
   7. Wyrzuć wszystkie próbki, które nie zatonęły podczas utrwalania przez noc. Przemywać pozostałe próbki 25 mM PBS o pH 7 przez 10 minut, a następnie przemywać przez 20 minut w 25 mM PIPES buforze o pH 7,2.
   8. Odwodnić próbki w serii etanolu (25%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90% i 3 x 100% etanolu) przez 20 minut każda. Natychmiast przenieś odwodnione próbki do oznakowanych szklanych fiolek w celu zatopienia (Rysunek 1C).
      UWAGA: Proces odwadniania można wstrzymać na etapie 70% etanolu.
2. LR-White zatapianie żywicy
   UWAGA: LR-white to niehydrofobowa żywica akrylowa o niskiej lepkości, dzięki czemu idealnie nadaje się do penetracji tkanek z wieloma grubymi warstwami ścian komórkowych. LR-White jest również dostępny w kilku klasach twardości kompatybilnych z cięciem większości próbek roślin. Upewnij się, że zużyta żywica jest już dostarczona z domieszką odpowiedniego katalizatora lub postępuj zgodnie z instrukcjami dostawcy, aby przygotować żywicę. Następujący proces osadzania jest powolny, ale wyniki w znacznym stopniu uzasadniają środki.
   1. Próbki należy przetapiać przez inkubację z żywicą LR-White w serii półksiężycowych zatężeń żywicy (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) w etanolu, inkubując przez 24 godziny w temperaturze 4 °C na każdym etapie.
      UWAGA: Żywica LR-White jest żywicą akrylową o niskiej toksyczności; Może jednak działać drażniąco na skórę przez kontakt i wdychanie. Zdecydowanie zaleca się pracę w dobrze wentylowanym pomieszczeniu lub pod wyciągiem z odpowiednią odzieżą ochronną i rękawicami nitrylowymi.
   2. Odświeżyć białą żywicę LR i inkubować przez dodatkowe 12 godzin w temperaturze 4 °C.
   3. Przygotuj kapsułki żelatynowe o odpowiednim rozmiarze (rozmiar 1 (0,5 ml) dla próbek do 3 mm, 2 x 0,37 ml dla próbek do 5 mm lub 3 x 0,3 ml dla próbek do 8 mm oraz etykiety papierowe (Rysunek 1D).
      UWAGA: Wybierz rozmiar kapsułki tak, aby był nieco większy niż próbka, tak aby próbka mogła być całkowicie zamknięta w żywicy. Pamiętaj również, aby oznaczyć metki ołówkiem, ponieważ długopis lub drukowane atramenty zanieczyszczą żywicę, niszcząc próbkę.
   4. Nałóż jedną kroplę świeżej żywicy LR-white na dno każdej kapsułki.
   5. Umieścić próbkę w każdej kapsułki żelatynowej i napełnić do maksymalnej pojemności świeżą żywicą. Umieść nakrętkę kapsułki i delikatnie dociśnij, aby utworzyć hermetyczne uszczelnienie (Rysunek 1E).
   6. Polimeryzować żywicę przez 24 do 48 godzin w temperaturze 58 °C lub do całkowitego stwardnienia.
   7. Próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Żywica LR-white po polimeryzacji jest obojętna.

2. Przygotowanie slajdów

UWAGA: Szkiełka muszą być czyste, wolne od kurzu, tłuszczu czy innych zanieczyszczeń. Nawet nowe prowadnice muszą być czyszczone, ponieważ niektórzy dostawcy używają olejów i detergentów, aby zapobiec sklejaniu się prowadnic. Jakikolwiek smar lub detergent będzie zakłócał przyleganie sekcji do prowadnicy, nawet jeśli zostanie potraktowany poli-L-lizyną. Kłaczki i kurz wpłyną na obserwacje okazu i bardzo możliwe, że zrujnują eksperyment. Do tego zadania doskonale nadają się szkiełka pokryte teflonem z dołkami reakcyjnymi. Są niedrogie, wielokrotnego użytku i drastycznie zmniejszają ilość potrzebnego roztworu przeciwciał. Przy odpowiednim czyszczeniu można przeprowadzić doskonałej jakości immunolokalizację fluorescencyjną w bardzo przystępnej cenie.

1. Mycie szkiełek
   1. Umieść szkiełka w stojaku do barwienia i przykryj roztworem czyszczącym (0.1% SDS (w/v), 1% kwas octowy (v/v), 10% etanol (v/v)).
   2. Utrzymywać łagodne pobudzenie przez 20 min.
   3. Przenieść ruszty barwiące do łaźni ddH₂O z łagodnym mieszaniem przez 10 minut. Powtórzyć 4 razy.
   4. Ostrożnie opróżnij stojaki przed zanurzeniem na krótko w 100% etanolu i pozostaw szkiełka do wyschnięcia w środowisku wolnym od kurzu.
   5. Przechowywać do czasu użycia.
2. Powłoka poli-L-lizynowa (opcjonalnie)
   UWAGA: Małe sekcje zwykle bardzo dobrze przylegają do czystych szkiełek szkiełkowych. Ten krok jest zalecany tylko w przypadku większych przekrojów (>2 mm²). Większe sekcje mają tendencję do fałdowania się i marszczenia i nie są wskazane. Niemniej jednak, w razie potrzeby, należy stosować szkiełka reakcyjne z większymi otworami. Wyczyść je jak powyżej i postępuj w następujący sposób.
   1. Umieść czyste szkiełka na kwadratowej szalce Petriego. Odpipetować 0,001% roztwór poli-L-lizyny (w/v), aby zakryć otwory szkiełek, bez przelewania.
   2. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia przez noc w temperaturze 40 °C na zamkniętych szalkach Petriego.
      UWAGA: Powlekane szkiełka są gotowe do natychmiastowego użycia i mogą być przechowywane w środowisku wolnym od kurzu w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.

3. Przycinanie i dzielenie próbek na sekcje

1. Przycinanie próbki
   1. Ostrą żyletką przyciąć bloki LR-White pod mikroskopem stereoskopowym, aby utworzyć strukturę w kształcie piramidy, w której wierzchołek jest prostopadły do obszaru zainteresowania próbki (rysunek uzupełniający 1A).
      UWAGA: Ultra-mikrotomowy uchwyt na próbki jest doskonałym narzędziem do zabezpieczenia bloku. Jeśli urządzenie nie jest wyposażone w uniwersalny uchwyt na próbki, użyj tego, który najbardziej pasuje do okrągłych bloków.
   2. Przytnij strukturę piramidalną, usuwając drobne plasterki nadmiaru żywicy prostopadle do głównej osi piramidy.
   3. Kontynuuj, aż próbka zostanie osiągnięta, tworząc powierzchnię cięcia. Próbka docelowa powinna być idealnie zamknięta w kształcie trapezu w obrębie powierzchni cięcia.
      UWAGA: Blok żywicy można dodatkowo przyciąć pod kątem szczeliny, aby zmniejszyć powierzchnię przekroju za pomocą ostrego ostrza ( Rysunek 1F).
2. Przekroje półcienkie
   UWAGA: Zostanie użyty mikrotom ze szklanymi nożami. Zdolność przeciwciała do wiązania się z epitopem będzie warunkować powodzenie reakcji znakowania immunologicznego. Hydrofilowy charakter żywicy LR-White pozwoli na dobry kontakt przeciwciał z sekcjami próbki. Cieńsze skrawki będą wykazywać słabsze zabarwienie kalkofluoru, które zostanie wykorzystane do zlokalizowania skrawków i wspomagają proces obrazowania. To samo dotyczy innych plam, które można później nałożyć. Również nadmierna grubość wpłynie na jakość akwizycji obrazu. Dobrym kompromisem dla grubości przekroju jest zakres od 200 do 700 nm, w zależności od charakterystyki tkanki. Zamontuj bloki szczelnie na uchwycie próbki ultramikrotomu.
   1. Za pomocą ultramikrotomu wykonaj sekcje o grubości od 200 do 700 nm (Rysunek 1G).
   2. Sprawdź obszar przekroju, przenosząc niektóre sekcje do kropli ddH₂O na szkiełku podstawowym. Umieść szkiełko na płycie grzejnej o temperaturze 50 °C, aż woda odparuje. Barwienie: umieszczając kroplę 1% błękitu toluidynowego O (w/v) w 1% roztworze kwasu borowego (w/v) na sekcjach przez 30 s. Spłucz i obserwuj pod mikroskopem.
   3. Po znalezieniu pożądanej struktury przenieść jedną lub dwie sekcje do każdej kropli ddH₂O uprzednio umieszczonej na każdym studzienku czystego szkiełka reakcyjnego.
   4. Umieść każde szkiełko w zamkniętej, czystej szalce Petriego o powierzchni 10 cm i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze 50 °C.
   5. Przechowuj slajdy w czystym pudełku archiwum do czasu użycia.

4. Immunolokalizacja

UWAGA: Procedura immunolokalizacji fluorescencyjnej opiera się na sekwencyjnym użyciu dwóch przeciwciał. Przeciwciało pierwszorzędowe jest podnoszone przeciwko specyficznemu antygenowi docelowemu. Przeciwciało drugorzędowe jest wywoływane specyficznie przeciwko przeciwciału pierwszorzędowemu, a w przypadku technik fluorescencyjnych jest sprzężone z fluoroforem (FITC w tym konkretnym protokole). Przeciwciało pierwszorzędowe zostanie użyte do wykrycia antygenu docelowego w próbce, a przeciwciało drugorzędowe zostanie użyte do oznaczenia miejsca, w którym przeciwciało pierwszorzędowe połączyło się z próbką po zmyciu nadmiaru przeciwciała pierwszorzędowego. Kontrole są ważną częścią tego testu i zawsze muszą być przeprowadzane w celu zapewnienia dokładności obserwacji. Jedna studzienka na szkiełku powinna być zarezerwowana do użycia jako kontrola ujemna, w której podstawowe leczenie przeciwciałami zostanie pominięte, a zatem pod koniec eksperymentu nie należy zaobserwować żadnego sygnału. Do doświadczenia musi zostać włączona kontrola pozytywna poprzez potraktowanie jednego studzienka przeciwciałem, którego oznakowanie jest już znane i pewne. Kontrolę dodatnią stosuje się w celu potwierdzenia skuteczności znakowania przeciwciał drugorzędowych i warunków reakcji, natomiast kontrolę ujemną bada się swoistość przeciwciał drugorzędowych.

1. Przygotuj komorę inkubacyjną, umieszczając zwilżone ręczniki papierowe na dnie pudełka z końcówkami do pipet i owijając je folią aluminiową (Rysunek uzupełniający 1B-1E). Umieścić szkiełka w komorze inkubacyjnej.
2. Odpipetować pipetą 50 μl kropli na 8 mm dołka roztworu blokującego (5% odtłuszczonego mleka w proszku (w/v) w 1 M PBS) i inkubować przez 10 minut. Usunąć roztwór blokujący i przemyć wszystkie studzienki dwukrotnie PBS przez 10 minut.
3. Przygotować pierwszorzędowe roztwory przeciwciał (patrz Tabela Uzupełniająca 1), przeciwciało 1:5 (v/v) w roztworze blokującym; oszacować około 40 μl na 8 mm dołka.
   UWAGA: Stężenie przeciwciała należy dostosować zgodnie z protokołem producenta.
4. Wykonać końcowe płukanie ddH₂O przez 5 minut, nigdy nie dopuszczać do całkowitego wyschnięcia studzienek.
5. Odpipetować pierwotny roztwór przeciwciała do studzienek reakcyjnych. Roztwór blokujący pipety do studzienek kontrolnych.
6. Zamknąć komorę inkubacyjną i odstawić na 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie na noc w temperaturze 4 °C. Przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciała, 1% w roztworze blokującym (v/v) około 40 μl na studzienkę. Przykryj go folią aluminiową.
7. Przemyć wszystkie studzienki dwukrotnie PBS przez 10 minut, a następnie przez dodatkowe 10 minut_ddH2O. Upewnij się, że na studzienkach nie jest widoczny żaden ślad roztworu blokującego lub osadów.
8. Odpipetować wtórny roztwór przeciwciała do wszystkich studzienek. Od teraz chroń zjeżdżalnie przed światłem.
9. Inkubować przez 3–4 godziny w ciemności w temperaturze pokojowej.
10. Przemyć wszystkie studzienki dwukrotnie przez 10 minut PBS, a następnie ponownie przepłukać przez 10 minut ddH₂O.
11. Nałóż kroplę kalkofluoru (1:10 000 (w/v) świetlówka jaśniejsza 28 w PBS) do każdej studzienki. Bez mycia nałóż kroplę podłoża montażowego (patrz Tabela Materiałów) na każdą studzienkę i umieść szkiełko nakrywkowe (Rysunek 1H).
12. Obserwuj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, wyposażonego w soczewki 10x/0,45, 20x/0,75, 40x/0,95 i 100x/1,40, użyj filtrów UV (do barwienia kalkofluorem) i FITC, aby wykryć odpowiednio ścianę komórkową i immunolokalizację (Rysunek 1I). Użyj następujących długości fal: wzbudzenie/emisja (nm) 358/461 dla UV i 485/530 dla FITC.
13. Aby uzyskać lepszą wizualizację wyników, nałóż na siebie oba obrazy za pomocą ImageJ lub podobnego.

Wyniki

W przypadku pomyślnego eksperymentu przeciwciało wtórne w sposób spójny i specyficznie wskaże lokalizację konkretnego epitopu w kolorze jasnej zieleni, co pozwoli na charakterystykę składu ściany komórkowej na określonym etapie rozwoju komórki, tkanki lub organu. Na przykład przeciwciało LM6 wykazuje wysokie powinowactwo do 1,5-arabinanu, związku z rhamnogalakturonanem typu I, który obficie znakuje ścianę komórkową rozwijającego się pręcika Quercus suber (Ryc. 2A), co pozwala wywnio...

Dyskusja

Opisana tutaj metoda immunolokalizacji fluorescencyjnej u roślin, choć bezbłędnie prosta, opiera się na sukcesie kilku małych kroków. Pierwszym z nich jest przygotowanie i utrwalenie próbki. Podczas tego pierwszego etapu mieszanina formaldehydu i aldehydu glutarowego jest używana do sieciowania większości składników komórek. Formaldehyd w roztworze zapewnia łagodne i odwracalne utrwalenie, podczas gdy aldehyd glutarowy zapewnia silne, bardziej trwałe wiązanie; Równowaga między dwoma utrwalaczami zapewnia odpowiednią iloś...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
25% (w/v) Agar aldehydu gluterowego	Scientific	AGR1010	aq. Roztwór bez metanolu
8 dołków Można stosować szklane szkiełka reakcyjne	Marinfeld	MARI1216750	innych marek
Kwas octowy	Sigma-Aldrich	A6283
Przeciwciało anty-Rat IgG (cząsteczka wole)-FITC wytwarzane w	Sigma-Aldrich	F6258
, 24 mm x 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	Szkiełko nakrywkowe powinno zakrywać wszystkie studzienki. Mogą być używane inne marki
ddH2O	na
Absolutny etanol	na	na Rozjaśniacz
fluorescencyjny 28	Sigma-Aldrich	F-6259
Kapsułki żelatynowe	Agar	AGG29211	naukowy Rozmiar kapsułki powinien pasować do wielkości próbki.
Można			użyć wszelkich prostych, niedrogich szklanych fiolek, które można zamknąć. Po użyciu fiolki można oczyścić 96% etanolem w celu usunięcia pozostałości LR-White i użyć ponownie.
LR-white średniej jakości, żywica embdeding	Agar Scientific	AGR1281	LR-White występuje w kilku formach; średnia klasa zapewnia odpowiednie wsparcie cięcia dla większości tkanek, podczas gdy dla twardszych tkanek może być zalecana twardsza klasa LR-white. Jeśli to możliwe, użyj żywicy już zmieszanej z aktywatorem polimeracji (nadtlenek benzoilu), jeśli nie, postępuj zgodnie z instrukcjami dostawcy, aby przygotować żywicę.
Odtłuszczone mleko w proszku	Nestlé	Dowolny	odtłuszczony mleko w proszku jest odpowiedni
Piekarnik	na		ogólny piekarnik laboratoryjny
szalka Petriego, 10 cm x 10 cm kwadratowy	na
RURY	Sigma Aldrich	P1851
Sondy monoklonalne przeciwciał	roślinnych	generowane przez	Kilka przeciwciał, które rozpoznają składniki ściany komórkowej, to dostępne zarówno w centrum badań nad węglowodanami złożonymi (CCRC, Georgia University, USA), jak i Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, na Uniwersytecie Leeds w Wielkiej Brytanii). Krótka lista niektórych powszechnie używanych MABS i gdzie można je kupić znajduje się w tabeli uzupełniającej 1
Żyletki	na		zwykłe żyletki
SDS	Sigma-Aldrich	L6026
Toluidine Blue-O	Agar Scientific	AGR1727
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC7
Pionowy mikroskop epifluorescencyjny z filtrami fluorescencyjnymi UV i FITC	Komora próżniowa Leica Mycrosistems	DMLb
i
			Można zastosować inne środki zapobiegające blaknięciu. Sprawdź kompatybilność z FITC i rozjaśniaczem fluorescencyjnym 28. (Uwaga: dla niekomercyjnej alternatywy, (patrz Jonhson i in. 198218) Pożywkę zapobiegającą blaknięciu można uzyskać, mieszając 25 mg/ml 1,4-diazobicyklo-(2,2,2)oktanu (DABCO) w glicerolu 9:1 (v/v) do 1xPBS. Doprowadzić pH do 8,6 za pomocą rozcieńczonego HCl.)

szkiełkach nakrywkowych GOAT szczury na na Pompa próżniowa na Vectashield vecta Labs T-1000