Wykorzystanie cytometrii przepływowej do wykrywania i ilościowego określania zmienionego tworzenia się krwi u rozwijającego się danio pręgowanego

Podsumowanie

Ten test jest prostą metodą do ilościowego oznaczania komórek krwiotwórczych w rozwoju embrionalnej danio pręgowanego. Komórki krwi od zdysocjowanego danio pręgowanego poddawane są analizie cytometrii przepływowej. Pozwala to na wykrycie wad krwi u zwierząt zmutowanych oraz po modyfikacji genetycznej.

Streszczenie

Różnorodność linii komórkowych, które składają się na dojrzałą krew u kręgowców, wynika z różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC). Jest to krytyczny proces, który zachodzi przez całe życie organizmów, a zakłócenie szlaków molekularnych zaangażowanych podczas embriogenezy może mieć katastrofalne długoterminowe konsekwencje. Z wielu powodów danio pręgowany (Danio rerio) stał się organizmem modelowym do badania hematopoezy. Zarodki danio pręgowanego rozwijają się zewnętrznie i po 7 dniach od zapłodnienia (dpf) wytwarzają większość podtypów ostatecznych komórek krwi, które przetrwają przez całe życie. Opracowano testy do oceny liczby komórek krwiotwórczych, głównie przy użyciu specyficznych barwień histologicznych, technik hybrydyzacji in situ i mikroskopii zwierząt transgenicznych, które wykorzystują promotory specyficzne dla komórek krwi napędzające ekspresję białek fluorescencyjnych. Jednak większość testów barwienia i technik hybrydyzacji in situ nie określa dokładnie liczby obecnych komórek krwi; Tylko duże różnice w numerach komórek są łatwe do wizualizacji. Można przeprowadzić wykorzystanie zwierząt transgenicznych i analizę osobników za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej, ale kwantyfikacja tych testów opiera się na ręcznym liczeniu lub użyciu drogiego oprogramowania do obrazowania, z których oba mogą powodować błędy. Opracowanie dodatkowych metod oceny liczby krwinek byłoby ekonomiczne, szybsze, a nawet mogłoby zostać zautomatyzowane w celu szybkiej oceny wpływu modyfikacji genetycznej za pośrednictwem CRISPR, redukcji transkryptu za pośrednictwem morfoliny oraz wpływu związków leków, które wpływają na hematopoezę na dużą skalę. Ten nowatorski test do ilościowego oznaczania komórek krwi polega na dysocjacji całych zarodków danio pręgowanego i analizie ilości obecnych fluorescencyjnie znakowanych komórek krwi. Testy te powinny pozwolić na wyjaśnienie szlaków molekularnych odpowiedzialnych za wytwarzanie, ekspansję i regulację komórek krwi podczas embriogenezy, co pozwoli naukowcom na dalsze odkrywanie nowych czynników zmienianych podczas chorób krwi, a także szlaków niezbędnych podczas ewolucji hematopoezy kręgowców.

Wprowadzenie

Produkcja krwi (hematopoeza) jest niezbędnym procesem rozwojowym, który zaczyna się we wczesnym stadium zarodka. Proces ten rozpoczyna się od wytworzenia prymitywnych czerwonych krwinek i makrofagów bezpośrednio z mezodermy, a następnie przechodzi w produkcję hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC). Te komórki macierzyste, które są multipotencjalne, wytwarzają wszystkie odmiany dojrzałych komórek krwi w organizmie. System jest zdolny do samoodnawiania i jest stale uzupełniany za pośrednictwem tych modułów HSPC. Chociaż proces ten rozpoczyna się na wczesnym etapie rozwoju, hematopoeza trwa przez całe życie zwierzęcia, zapewniając zdolność do transportu tlenu do odległych miejsc ciała, zatrzymywania krwawienia po urazie i ochrony organizmu przed infekcją. Rozwój tego złożonego systemu jest kontrolowany czasowo i przestrzennie podczas rozwoju, a wszelkie zaburzenia w produkcji komórek krwi mogą być katastrofalne dla organizmu, powodując niedokrwistość, małopłytkowość, leukopenię i białaczkę.

Popularnym modelem zwierzęcym używanym do badań hematopoetycznych jest danio pręgowany (Danio rerio), ponieważ mają one podobny rozwój krwi w porównaniu do ludzi. W rzeczywistości wiele genów i szlaków molekularnych wykorzystywanych podczas hematopoezy jest zachowanych podczas ewolucji kręgowców, co pozwala nam dowiedzieć się więcej o ludzkich genach poprzez badanie danio pręgowanego. Co ważne, zarodki danio pręgowanego rozwijają się poza organizmem i w ciągu 7 dni wytworzyły większość dojrzałych typów krwinek, co pozwala na bezpośrednią wizualizację układu krwiotwórczego w krótkim czasie. Danio pręgowany jest również niezwykle płodny, co pozwala naukowcom obserwować większą liczbę próbek w krótkim czasie, co jest również ważne dla generowania powtarzalnych danych. Krótki czas generacji danio pręgowanego i jego rozwój zewnętrzny zapewniają łatwiejszą manipulację i obserwację podczas badań mutagenezy^1,2,3,4,5 i badanie przesiewowe leków^6,7,8,9,10. Pozwala to na szybkie i skuteczne przetestowanie panelu obiecujących związków terapeutycznych stosowanych w chorobach krwi u ludzi.

Co ważne, danio pręgowany jest również genetycznie podatny, a genom jest sekwencjonowany i opisywany. Ta wykonalność pozwala na wykonanie technik genetyki odwrotnej, takich jak knockdown za pośrednictwem morfoliny (MO-) i ablacja genetyczna za pośrednictwem CRISPR. Danio pręgowany udowodnił również swoją przydatność jako model do przeprowadzania badań genetycznych; W ten sposób odkryto wiele istotnych genów i szlaków zaangażowanych w tworzenie krwi kręgowców. Liczne metody obserwacji komórek krwi zostały również opracowane u danio pręgowanego. Chociaż istnieją tradycyjne techniki barwienia histologicznego, możliwe jest również przeprowadzenie hybrydyzacji in situ dla transkryptów specyficznych dla krwi. Co ważne, istnieją również liczne transgeniczne linie ryb, w których białka fluorescencyjne są wyrażane przez promotory specyficzne dla linii, co pozwala na znakowanie określonych komórek krwi białkami fluorescencyjnymi¹¹. Dzięki temu naukowcy mogą prowadzić obserwację z dokładnością co do minuty genezy, ekspansji i regulacji komórek krwi w żywym organizmie w czasie.

Ogólnie rzecz biorąc, zachowanie układu krwiotwórczego, obecność i łatwy rozwój linii transgenicznych, łatwa wizualizacja i krótki czas generacji sprawiły, że danio pręgowany stał się ekonomicznym, szybkim i elastycznym modelem hematopoezy. Aby udoskonalić zestaw technik dostępnych dla badaczy danio pręgowanego, opracowaliśmy ten test, aby solidnie określić ilościowo liczbę komórek krwi w zarodkach. Metoda polega na trawieniu zwierząt transgenicznych i wykonywaniu cytometrii przepływowej dla fluorescencyjnych komórek krwi. W ten sposób komórki krwi zmutowanych zwierząt, efekt modyfikacji MO i CRISPR oraz wpływ małych cząsteczek mogą być analizowane ilościowo w szybki i powtarzalny sposób. Testy te są przyjaznymi dla użytkownika i ekonomicznymi sposobami liczenia komórek krwi, umożliwiającymi badanie ich powstawania, proliferacji i utrzymania w czasie.

Protokół

Rada doradcza Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Stanowym Kalifornii, Chico, zatwierdziła wszystkie opisane poniżej metody.

UWAGA: Zaleca się leczenie zarodków 1-fenylo 2-tiomoczkiem (PTU; Tabela 1) po 24 godzinach od zapłodnienia (HPF), aby zapobiec pigmentacji, która negatywnie wpływa na dyskryminację fluorescencji za pomocą cytometrii przepływowej. Wszystkie wymienione poniżej procedury są dopuszczalne w przypadku cytometrii przepływowej i sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Jeśli jednak celem jest hodowla komórek krwiotwórczych po FACS, należy przestrzegać sterylnych praktyk podczas przetwarzania próbek. Protokół wybielania i przygotowania próbek zarodków w sterylny sposób został opisany wcześniej¹².

1. Dechorionacja 48 zarodków zebry zebry hpf

1. Z zarodkami (co najmniej 5, ale nie więcej niż 200 zarodkami) na plastikowej szalce Petriego o średnicy 10 cm, przechylić szalkę tak, aby zarodki opadły do dolnej krawędzi.
   UWAGA: Naczynie można łatwo przechylić, zdejmując jego pokrywkę i umieszczając pokrywkę pod jedną krawędzią szalki Petriego.
2. Usunąć i wyrzucić jak najwięcej pożywki E3 (Tabela 1) i dodać 500 μl proteazy dekorionacyjnej (10 mg/ml). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
3. Po 5 minutach podnieś szalkę Petriego (trzymając wszystkie zarodki na dolnej krawędzi płytki) i delikatnie postukaj w bok szalki Petriego, pozwalając zarodkom delikatnie ocierać się o spód płytki, aby całkowicie usunąć kosmówkę.
4. Za pomocą wyciskanej butelki dodaj ~20 ml pożywki E3, aby rozcieńczyć proteazę. Pozwolić zarodkom na osiadanie i usunąć pożywkę E3 przez dekantację.
5. Powtórz krok 1.4 3x, aby usunąć wszystkie ślady proteazy dechorionacyjnej.
   UWAGA: Do każdej pojedynczej próbki do analizy wymaganych jest co najmniej 5 zarodków. Ta procedura dechorionacji może pomieścić do 200 zarodków na szalce Petriego. Na tym etapie próbki można grupować i w razie potrzeby rozdzielać później. Alternatywnie, manualną dechorionację można wykonać poprzez delikatne rozdarcie pasm płciowych kleszczami zegarmistrzowskimi. Jest to korzystne, gdy liczba zarodków jest niewielka. Zwykle danio pręgowany wykluwa się z kosmówki przez 72 hpf. Poważnie zniekształcone zarodki nie mogą jednak i po tym czasie będą wymagały dechorionacji (manualnej lub chemicznej).

2. Przygotowanie próbek zarodków do dysocjacji

1. Za pomocą pipety P1000 umieść 5-10 zarodków w jednej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
2. Usunąć pożywkę E3 za pomocą pipety i wyrzucić.
   UWAGA: Pipetę należy ostrożnie odpipetować, ponieważ zarodki można łatwo wyrzucić podczas wykonywania poniższych czynności.
3. Dodaj 1 ml 10 mM ditiotreitolu (DTT) do podłoża E3, aby usunąć powłokę śluzową otaczającą embrionalny danio pręgowany^11,12,13,14. Ułóż probówkę do mikrowirówki poziomo i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

3. Dysocjacja zarodków

1. Przemyj zarodki 3x 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco z Ca²⁺ i Mg²⁺, aby usunąć ślady DTT. Po ostatnim przepłukaniu dodać 500 μl DPBS z Ca²⁺ i Mg²⁺ oraz 5 μl proteazy dysocjacyjnej 5 mg/ml (26 U/ml).
   UWAGA: Można stosować inne izotoniczne roztwory buforowe, ale muszą one zawierać Ca²⁺ i Mg²⁺, aby enzym dysocjacyjny działał prawidłowo.
2. Próbki inkubować w temperaturze 37 °C na poziomej wytrząsarce orbitalnej z prędkością 185 obr./min przez 60 minut. Rozcierać zarodki za pomocą pipety P1000 aż do całkowitego dysocjacji próbek.
   UWAGA: Uważaj, aby nie przetrawić zarodków; Powinna być obecna pewna tkanka stała i nie powinna być całkowicie jednorodna. Możliwe jest nadmierne trawienie, które niszczy docelowe komórki krwi, które można zaobserwować na cytometrze przepływowym (rysunek uzupełniający 1).
   UWAGA: Ta procedura działa najlepiej w przypadku zarodków 48−72 hpf. Późniejsze etapy mogą wymagać dłuższej inkubacji z proteazą dysocjacyjną. Czas dla różnych etapów musi być określony empirycznie. Istnieją szybsze alternatywne metody dysocjacji tkanki embrionalnej, ale empirycznie stwierdzono, że metoda ta, choć trwa 60 minut, jest na tyle delikatna i dokładna, że umożliwia skuteczną izolację żywych komórek krwiotwórczych.

4. Przygotowanie zdysocjowanych zarodków do cytometrii przepływowej

1. Odpipetować 5 zdysocjowanych zarodków do górnego zbiornika polistyrenowej probówki o okrągłym dnie o pojemności 5 ml z nasadką sitową 35 μmM.
2. Przepłukać komórki, dodając 4 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) bez Ca²⁺ lub Mg²⁺ do nasadki sitka w probówce polistyrenowej o pojemności 5 ml zawierającej przefiltrowane komórki.
   UWAGA: Można również stosować inne izotoniczne roztwory buforowe, ale powinno w nich brakować Ca²⁺ lub Mg²⁺, aby rozcieńczyć i uczynić enzym dysocjacyjny nieskutecznym.
3. Probówki wirować w temperaturze 4 °C i 300 x g przez 5 minut w celu osadzania komórek. Za pomocą pipety usunąć i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl PBS (bez Ca²⁺ lub Mg²⁺).

5. Cytometria przepływowa

1. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek i dodaj 1:1,000 czerwonej plamy martwych komórek (tabela materiałów).
   UWAGA: Czerwone barwienie martwych komórek jest barwnikiem przepuszczalnym dla komórek, który umożliwia wykluczenie martwych komórek i zanieczyszczeń z komórek docelowych i jest doskonałym wyborem barwnika do dyskryminacji martwych komórek, ponieważ jest wzbudzany przez laser 633 nm, który różni się od lasera 488 nm używanego do wzbudzania popularnych fluoroforów, takich jak zielone białko fluorescencyjne (GFP) i DsRed. W ten sposób nie dochodzi do nakładania się widmowego martwych komórek i transgenicznych komórek krwi. Jodek propidyny (PI) w stężeniu 1 mg/ml jest niedrogą alternatywą dla czerwonego barwienia martwych komórek, ale pamiętaj, aby zarezerwować niektóre próbki barwione tylko za pomocą PI, a także próbki tylko za pomocą fluoroforu, aby ustawić kompensację instrumentu. W przeciwnym razie sygnały PI i fluoroforów, takich jak GFP, będą się nakładać, co spowoduje wyniki fałszywie dodatnie. Jeśli cytometr przepływowy ma również laser o długości fali 405 nm, inne barwniki, takie jak barwienie niebieskich komórek taty, są również doskonałym wyborem.
   UWAGA: Analizując komórki krwi, należy pamiętać, że po 30 minutach niektóre typy komórek zaczną fagocytozować czerwone zabarwienie martwych komórek. Utrzymuj komórki chronione przed światłem i na lodzie do czasu analizy i wykonaj cytometrię przepływową w ciągu 30 minut od dodania barwnika.
2. Analiza metodą cytometrii przepływowej
   UWAGA: Każdy cytometr przepływowy jest nieco inny, ale poniższe kroki pomogą w przygotowaniu próbek do analizy na większości maszyn. Użytkownicy, którzy nie mają doświadczenia w cytometrii przepływowej, powinni zasięgnąć porady kogoś, kto jest ekspertem w tej konkretnej dziedzinie sprzętu. Poniższe instrukcje dotyczą cytometru przepływowego BD FACSAria Fusion.
   1. Włącz cytometr i pozwól laserom rozgrzać się przez 20 minut. Opróżnij zbiornik na odpady, napełnij zbiornik osłonowy odpowiednim roztworem (różni się w zależności od cytometru przepływowego) i uruchom system fluidics.
      UWAGA: Zwykle istnieje określona procedura uruchamiania dla każdego typu cytometru przepływowego; Postępuj zgodnie z tą procedurą uruchamiania.
   2. W oprogramowaniu do analizy narysuj pięć wykresów (Rysunek 1A).
      1. Niech pierwszy wykres punktowy zmierzy rozproszenie do przodu (FSC) na osi x i rozproszenie boczne (SSC) na osi y. Ustaw FSC jako liniowe, a SSC jako log.
         UWAGA: FSC jest miarą wielkości komórki, a SSC jest miarą ziarnistości; Umożliwi to odróżnienie komórek od szczątków. Embrionalne populacje krwinek danio pręgowanego nie rozdzielają się według wielkości i ziarnistości w taki sam sposób, jak dorosłe komórki krwi danio pręgowanego opisane wcześniej¹⁵. Zamiast tego pojawią się w tej samej populacji ze wszystkimi innymi strawionymi komórkami embrionalnymi.
      2. Ustaw drugi wykres, aby sprawdzić wysokość FSC (H) w stosunku do szerokości FSC (W). Ustaw trzeci wykres tak, aby mierzył SSC (H) i SSC (W).
         UWAGA: Ten krok służy do wykluczania dubletów (komórek, które sklejają się ze sobą, gdy przechodzą przez laser).
      3. Ustaw czwarty wykres punktowy, aby zmierzyć czerwone barwienie martwych komórek na osi x (w zależności od cytometru jest to zwykle równoważne filtrowi używanemu do allofikocyjaniny [APC]) i SSC na osi y. Umożliwi to odróżnienie żywych komórek od martwych.
         UWAGA: Zestawy filtrów każdego cytometru mogą być różne. Upewnij się, że używasz właściwego filtra wykrywającego dla barwnika do dyskryminacji martwych komórek.
      4. Piąty wykres mierzy wybrany fluorofor. Zwizualizuj to jako histogram fluoroforu (Rysunek 1) lub użyj wykresu kropkowego (Rysunek uzupełniający 2).
         UWAGA: W przypadku badania więcej niż jednego fluoroforu u tego samego zwierzęcia zaleca się użycie wykresu punktowego, aby wyświetlić oba parametry w tym samym czasie. Jeśli istnieje jakakolwiek szansa, że fluorofory nakładają się na siebie widmowo (rysunek uzupełniający 2), zalecany jest również wykres punktowy. Użyj ustawień Obszar (A), aby obliczyć obszar pod krzywą generowaną przez impuls laserowy cytometru dla wszystkich parametrów, ponieważ są one dokładniejsze.
   3. Załadować próbkę i zmniejszyć natężenie przepływu, aby próbka nie wyczerpała się szybko. Dostosuj ustawienia FSC i SSC tak, aby większość populacji komórek była wyraźnie widoczna (Rysunek 1A).
   4. Narysuj bramkę wokół populacji komórek i oznacz ją komórkami. Upewnij się, że drugi wykres kropkowy jest bramkowany na komórkach, wyklucz dublety, najpierw bramkując na FSC, a następnie na singletach SSC.
   5. Na czwartym wykresie dostosuj ustawienia czerwonego barwienia martwych komórek, tak aby populacja była wyraźnie ujemna. Narysuj bramkę wokół tych komórek i oznacz je jako żywe komórki. Na piątym wykresie przelej żywe komórki i zbadaj komórki fluoroforowe ujemne i dodatnie. Narysuj bramkę wokół komórek dodatnich.
      UWAGA: Ta hierarchiczna strategia bramkowania bada pojedyncze komórki fluoroforowe ₊, które znajdują się w bramie żywych komórek, które również znajdują się w bramie komórkowej. Zadbaj o prawidłowe ustawienie bram. Bramy te można dostosować w zależności od eksperymentu.
   6. Uruchom każdą próbkę, zbierając co najmniej 25 000 zdarzeń komórek na żywo.
   7. Postępuj zgodnie z procedurą zamykania, aby wyłączyć płyny Fluidics. Napełnij zbiornik osłonowy i opróżnij zbiornik na odpady.
      UWAGA: Często trudno jest uwidocznić komórki fluoroforu⁺, gdy ekspresja białka jest niska lub populacja komórek jest rzadka. Aby zapewnić prawidłowe ustawienie parametrów, zarodki rodzeństwa fluoroforowego powinny być przygotowane równolegle, aby prawidłowo narysować bramki i dostosować napięcia lasera (rysunek uzupełniający 2). Jeśli docelowa populacja komórek jest rzadka, zbierz ponad 25 000 zdarzeń. Mając od 5 do 10 strawionych zwierząt, powinno być w stanie zebrać miliony zdarzeń. Na podstawie tych danych można również uzyskać całkowitą liczbę komórek fluoroforu⁺. Wystarczy policzyć całkowitą liczbę komórek w próbce za pomocą hemocytometru i pomnożyć procent komórek fluoroforu⁺, aby uzyskać bezwzględną liczbę komórek fluoroforu⁺ na rybę.

Wyniki

Aby zliczyć czerwone krwinki u embrionalnego danio pręgowanego, lcr:GFP¹⁶ zarodków wstrzyknięto w stadium jednokomórkowym za pomocą PBS, 7.0 ng/nL ism1 MO lub 7.0 ng/nL ism1 MO z 7.0 ng ism1 mRNA¹². W temperaturze 48 hpf zostały one strawione i poddane analizie cytometrii przepływowej. Po przeanalizowaniu procentowej zawartości czerwonych krwinek GFP⁺ w każdej próbce (każda próbka to 5 losowo wy...

Dyskusja

Danio pręgowany jest doskonałym systemem modelowym do badania hematopoezy prymitywnych i ostatecznych kręgowców. W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano i udoskonalono wiele testów, dzięki czemu danio pręgowany stał się szybkim i ekonomicznym modelem do testowania leków, generowania i testowania mutantów genetycznych oraz ogólnie umożliwiając naukowcom analizę szlaków molekularnych niezbędnych dla hematopoezy. Protokół ten wykorzystuje embrionalnego danio pręgowanego, co pozwala na szybkie gromadzenie danych, wykorzysta...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówka MCF 1,5 ml	FisherBrand	05-408-129
10 mm Polistyrenowa łatwa w obsłudze szalka Petriego	Corning Falcon	351008
5 ml Polistyrenowa probówka z okrągłym dnem z nasadką sitka	Corning Falcon	352235
BD FACSAria Cytometr przepływowy	BD Biosciences
Dithiolthreitol (DTT)	Sigma-Aldrich
DPBS (10x) z Ca2+ i Mg2+	Life Technologies	14080-055
FBS 500 mL	Gemini Bio-Products	100-108
HyClone PBS (1x)	GE Healthcare Nauki Przyrodnicze	sh30256.01
Librease	Roche Sigma-Aldrich	5401119001	proteaza
dysocjacjiPronase	Roche Sigma-Aldrich	11459643001	proteaza dechorionacyjna
SYTOX Red Dead Cell Stain	Invitrogen	S34859