Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Elektroporacja in utero to technika transferu DNA in vivo, szeroko stosowana do badania molekularnych i komórkowych mechanizmów leżących u podstaw kortykogenezy ssaków. Procedura ta wykorzystuje komory mózgu, aby umożliwić wprowadzenie interesującego DNA i wykorzystuje parę elektrod do kierowania wejściem materiału genetycznego do komórek wyściełających komorę, nerwowych komórek macierzystych. Metoda ta pozwala naukowcom na znakowanie pożądanych komórek i/lub manipulowanie ekspresją genów będących przedmiotem zainteresowania w tych komórkach. Ma wiele zastosowań, w tym testy ukierunkowane na migrację neuronów, śledzenie linii i znajdowanie ścieżek aksonalnych. Ważną cechą tej metody jest jej kontrola czasowa i regionalna, pozwalająca na obejście potencjalnych problemów związanych ze śmiertelnością zarodkową lub brakiem specyficznych myszy kierowców CRE. Innym istotnym aspektem tej techniki jest to, że pomaga ona znacznie zmniejszyć ograniczenia ekonomiczne i czasowe, które wiążą się z generowaniem nowych linii myszy, co staje się szczególnie ważne w badaniu interakcji między typami komórek, które pochodzą z odległych obszarów mózgu w różnym wieku rozwojowym. W tym miejscu opisujemy strategię podwójnej elektroporacji, która umożliwia celowanie w populacje komórek, które są oddzielone przestrzennie i czasowo. Dzięki takiemu podejściu możemy oznaczać różne podtypy komórek w różnych lokalizacjach za pomocą wybranych białek fluorescencyjnych, aby je uwidocznić, i/lub możemy manipulować interesującymi genami wyrażanymi przez te różne komórki w odpowiednim czasie. Strategia ta zwiększa potencjał elektroporacji in utero i zapewnia potężne narzędzie do badania zachowania czasowo i przestrzennie oddzielonych populacji komórek, które migrują w celu nawiązania bliskich kontaktów, a także interakcji dalekiego zasięgu poprzez projekcje aksonalne, zmniejszając koszty czasowe i ekonomiczne.
Wprowadzenie
Kora mózgowa to bardzo złożona i misternie zorganizowana struktura. Aby osiągnąć taki stopień organizacji, neurony projekcyjne kory przechodzą przez złożone procesy rozwojowe, które wymagają ich czasowego generowania, migracji do miejsca docelowego w płytce korowej oraz ustanowienia połączeń krótkiego i dalekiego zasięgu1,2. Przez długi czas klasyczny sposób badania kortykogenezy opierał się na wykorzystaniu mysich modeli nokautujących lub knock-in genów będących przedmiotem zainteresowania. Jednak ta strategia, a w szczególności wykorzystanie myszy z warunkowym nokautem, jest czasochłonna i kosztowna, a czasa....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedura opisana tutaj została zatwierdzona przez komisję etyczną odpowiedzialną za eksperymenty, dobrostan zwierząt Universidad de Valencia i Conselleria de Agricultura, Desarrollo Rural, Emergencia Climática y Transición Ecológica Comunidad Valenciana, i przestrzega wytycznych Międzynarodowej Rady Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (ICLAS), które zostały zweryfikowane w Real Decreto 53/2013 hiszpańskiego ustawodawstwa, jak również w dyrektywy Parlamentu Europejskiego i Rady 2010/63/UE.
UWAGA: Ten protokół ma dwa różne cele: 1) pierwsze badanie, określane jako "strategia A", pozwala na analizę interakcji między komórkami Cajal-Retzius (ko....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Interakcje między sąsiednimi komórkami pochodzącymi z odległych miejsc i w różnym czasie: komórki Cajala-Retziusa (komórki CR) i wczesne migrujące neurony projekcyjne kory (strategia A)
Oddziaływanie komórek CR i wczesnych neuronów projekcyjnych kory opisano wcześniej jako niezbędne do regulacji translokacji somatycznej za pośrednictwem cząsteczek adhezyjnych nektyn i kadheryn, wykorzystując strategię podwójnej elektroporacji8. Komórki CR pochodzą z neu.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Badanie interakcji komórka-komórka in vivo w regionach o dużej gęstości komórek, takich jak kora mózgowa, jest złożonym zadaniem. Tradycyjne podejścia, w tym stosowanie przeciwciał do znakowania neurytów, nie są odpowiednie ze względu na brak specyficznych markerów dla różnych populacji komórek. Wykorzystanie transgenicznych modeli mysich, w których określony typ komórki wyraża białko fluorescencyjne, jest przydatne do wizualizacji procesów neuronalnych, ale zależy to od dostępności takich modeli. Zadanie to jest jeszcze.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Cristinie Andrés Carbonell i członkom Zakładu Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Walentycznego za pomoc techniczną. Dziękujemy również Isabel Fariñas i Sacramento R. Ferrón za odczynniki i podzielenie się z nami ich sprzętem. I.M.W jest finansowany z kontraktu Garantía Juvenil z Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D jest finansowany przez Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz posiada stypendium Ramón y Cajal Grant (RYC-2015-19058) hiszpańskiego Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN). Ta praca została sfinansowana RYC-2015-19058 i SAF2017-82880-R (MICIN....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sól sodowa ampicyliny | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Rurka aspiratora | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Hemostat dla niemowląt (perfuzja) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Kapilara ze szkła borokrzemianowego | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorfina (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | ||
| Plazmid CAG-BFP | Uprzejmie dostarczony przez U.Mü ller Lab | ||
| CAG-EGFP plazmid | Uprzejmie dostarczony przez U.Mü ller Lab | ||
| CAG-mPlazmid wiśniowy | Uprzejmie dostarczone przez U.Mü ller Lab | ||
| CAG-mtdPlazmid Tomato-2A-nGFP | Uprzejmie dostarczone przez U.Mü ller Lab | ||
| Mikroskop konfokalny | Olympus | FV10i | |
| BFHCVDF | |||
| Klej cyjanoakrylowy | B. Braun 1050044 | ||
| chirurgiczne Luneta sekcyjna | Kleszcze Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont #5 Kleszcze drobnoziarniste | Narzędzia do nauki (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Kwadrat Elektroporator falowy | BTX | 45-0052 | |
| Elektryczna maszynka do golenia | Oster | 76998 | |
| Wolny od endotoksyn bufor TE | QIAGEN | 1018499 | |
| Chusteczki etanolowe | BFHCVDF | ||
| Ekstra drobne kleszcze Graefe | Narzędzia do nauki (FST) | 11150-10 | |
| Maść do oczu | Alcon | 682542.6 | |
| Szybki zielony barwnik | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Drobne nożyczki | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescencyjne diody LED | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (szew) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Poduszka | grzewczaUFESA | AL5514 | |
| Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Chusteczki jodowe | Lorsoul | ||
| Parownik izofluoranu | Przepływomierz | A15B5001 | |
| Izofluran | Karizoo | 586259 | |
| Ketamina (Anastemina) | Fatro Ibé rica SL | 583889-2 | |
| Chusteczki precyzyjne Kimtech | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) bulion GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Agaroza o niskiej temperaturze topnienia | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Szkiełka nakrywkowe mikroskopowe | -Glä ser | 15747592 | |
| Szkiełka mikroskopowe | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Medium montażowe | Mikroskopia elektronowa Sciences | 17984-25 | |
| Płytki wielofunkcyjne (24) | SPL Nauki Biologiczne | 32024 | |
| Płytki Mutiwell (48) | SPL Nauki Przyrodnicze | 32048 | |
| NaCl (do roztworu soli fizjologicznej) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Igła 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Inkubator orbitalny S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Inkubator Selecta | J. P. Selecta, s.a. | ||
| Paraformaldehyd | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicylina-Streptomycyna | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Pompa perfuzyjna | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platynowa pęseta, średnica 5 mm | Btx | 45-0489 | |
| zamykania skóry Reflex - klipsy 7 mm, pudełko 100 | sztuk | 203-1000 | |
| Odruchowy system zamykania skóry - Clip Aplikator, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Kleszcze pierścieniowe | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Azydek sodu | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Absorbent chirurgiczny (sterylny) | HK Surgical | PD-M | |
| Szew (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Materiały do szycia | ||
| Strzykawka 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Naczynie do hodowli tkankowych 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Pionowy ściągacz do mikropipet | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Mikroskop pionowy | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
Bibliografia
- Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102(2017).
- Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During D....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
