Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek

7.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61046

⸱

14 czerwca 2020

 ,  ,  , 
1Estructura de Recerca Interdisciplinar en Biotecnología y Biomedicina (ERI BIOTECMED), Departamento de Biología Celular, Biología Funcional y Antropología Física, Universidad de Valencia

W tym artykule

Podsumowanie

Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.

Streszczenie

Elektroporacja in utero to technika transferu DNA in vivo, szeroko stosowana do badania molekularnych i komórkowych mechanizmów leżących u podstaw kortykogenezy ssaków. Procedura ta wykorzystuje komory mózgu, aby umożliwić wprowadzenie interesującego DNA i wykorzystuje parę elektrod do kierowania wejściem materiału genetycznego do komórek wyściełających komorę, nerwowych komórek macierzystych. Metoda ta pozwala naukowcom na znakowanie pożądanych komórek i/lub manipulowanie ekspresją genów będących przedmiotem zainteresowania w tych komórkach. Ma wiele zastosowań, w tym testy ukierunkowane na migrację neuronów, śledzenie linii i znajdowanie ścieżek aksonalnych. Ważną cechą tej metody jest jej kontrola czasowa i regionalna, pozwalająca na obejście potencjalnych problemów związanych ze śmiertelnością zarodkową lub brakiem specyficznych myszy kierowców CRE. Innym istotnym aspektem tej techniki jest to, że pomaga ona znacznie zmniejszyć ograniczenia ekonomiczne i czasowe, które wiążą się z generowaniem nowych linii myszy, co staje się szczególnie ważne w badaniu interakcji między typami komórek, które pochodzą z odległych obszarów mózgu w różnym wieku rozwojowym. W tym miejscu opisujemy strategię podwójnej elektroporacji, która umożliwia celowanie w populacje komórek, które są oddzielone przestrzennie i czasowo. Dzięki takiemu podejściu możemy oznaczać różne podtypy komórek w różnych lokalizacjach za pomocą wybranych białek fluorescencyjnych, aby je uwidocznić, i/lub możemy manipulować interesującymi genami wyrażanymi przez te różne komórki w odpowiednim czasie. Strategia ta zwiększa potencjał elektroporacji in utero i zapewnia potężne narzędzie do badania zachowania czasowo i przestrzennie oddzielonych populacji komórek, które migrują w celu nawiązania bliskich kontaktów, a także interakcji dalekiego zasięgu poprzez projekcje aksonalne, zmniejszając koszty czasowe i ekonomiczne.

Wprowadzenie

Kora mózgowa to bardzo złożona i misternie zorganizowana struktura. Aby osiągnąć taki stopień organizacji, neurony projekcyjne kory przechodzą przez złożone procesy rozwojowe, które wymagają ich czasowego generowania, migracji do miejsca docelowego w płytce korowej oraz ustanowienia połączeń krótkiego i dalekiego zasięgu1,2. Przez długi czas klasyczny sposób badania kortykogenezy opierał się na wykorzystaniu mysich modeli nokautujących lub knock-in genów będących przedmiotem zainteresowania. Jednak ta strategia, a w szczególności wykorzystanie myszy z warunkowym nokautem, jest czasochłonna i kosztowna, a czasami stwarza dodatkowe problemy związane między innymi z istnieniem redundancji genetycznej lub brakiem określonych czynników CRE. Jednym z podejść, które powstało w celu rozwiązania tych problemów i które jest obecnie szeroko stosowane do badania rozwoju kory mózgowej, jest elektroporacja in utero3,4. Elektroporacja in utero jest techniką stosowaną w transgenezie somatycznej, umożliwiającą celowanie in vivo w nerwowe komórki macierzyste i ich potomstwo. Metoda ta może być używana do oznaczania komórek według ekspresji białek fluorescencyjnych5,6, do manipulacji genami in vivo (tj. testy zysku lub utraty funkcji)7,8,9, do izolowania elektroporowanych kory mózgowej in vitro i hodowli komórek8,10. Co więcej, elektroporacja in utero pozwala na czasową i regionalną kontrolę docelowego obszaru. Technika ta ma wiele zastosowań i jest szeroko stosowana do badania migracji neuronów, podziału komórek macierzystych, połączeń neuronalnych i innych tematów8,9,11,12.

Obecny manuskrypt opisuje użycie wariantu elektroporacji in utero, określanego jako podwójna elektroporacja in utero, do analizy interakcji komórek w korze mózgowej o różnym pochodzeniu czasowym i przestrzennym. Badania te są niezwykle skomplikowane do wykonania przy użyciu modeli mysich, ponieważ wymagają łącznego użycia kilku linii transgenicznych. Niektóre z zastosowań protokołu opisanych w tym artykule obejmują badanie bliskich interakcji między sąsiednimi komórkami, a także interakcji między odległymi komórkami poprzez projekcje dalekiego zasięgu. Metoda wymaga wykonania dwóch niezależnych operacji elektroporacji in utero, oddzielonych czasowo i przestrzennie, na tych samych zarodkach w celu celowania w różne populacje komórek będących przedmiotem zainteresowania. Zaletą tego podejścia jest możliwość manipulowania funkcją genów w jednym lub obu typach neuronów przy użyciu zwierząt typu dzikiego. Ponadto te eksperymenty funkcjonalne można połączyć z ekspresją cytoplazmatycznych lub znakowanych błoną białek fluorescencyjnych, aby uwidocznić dokładną morfologię docelowych komórek, w tym dendrytów i aksonów, oraz przeanalizować możliwe różnice w interakcjach komórkowych w porównaniu z kontrolą (tj. komórkami znakowanymi tylko białkiem fluorescencyjnym).

Opisany tutaj protokół koncentruje się na badaniu interakcji komórkowych wewnątrz kory nowej, ale ta strategia może być również wykorzystana do zbadania interakcji z obszarami pozakorowymi, które mogą być celem za pomocą elektroporacji in utero, takich jak subpallium lub wzgórze13,14, lub interakcji komórka-komórka w innych strukturach, takich jak móżdżek15. Celowanie w różne obszary opiera się na orientacji elektrod i komorze, do której wstrzykiwane jest DNA (boczne, trzecie lub czwarte). Dzięki opisanej tutaj strategii możemy oznaczyć znaczną liczbę komórek, co jest przydatne do oceny ogólnych zmian w połączeniu/unerwieniu w eksperymentach funkcjonalnych. Niemniej jednak, aby zbadać drobne zmiany w połączeniu, można użyć zmodyfikowanych wersji elektroporacji in utero, aby uzyskać rzadsze etykietowanie i zidentyfikować pojedyncze komórki16. Podsumowując, podwójna elektroporacja in utero jest wszechstronną metodą, która pozwala na celowanie w czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek i szczegółowe badanie ich interakcji, zarówno w warunkach kontrolnych, jak i w połączeniu z eksperymentami funkcjonalnymi, znacznie zmniejszając koszty czasowe i ekonomiczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedura opisana tutaj została zatwierdzona przez komisję etyczną odpowiedzialną za eksperymenty, dobrostan zwierząt Universidad de Valencia i Conselleria de Agricultura, Desarrollo Rural, Emergencia Climática y Transición Ecológica Comunidad Valenciana, i przestrzega wytycznych Międzynarodowej Rady Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (ICLAS), które zostały zweryfikowane w Real Decreto 53/2013 hiszpańskiego ustawodawstwa, jak również w dyrektywy Parlamentu Europejskiego i Rady 2010/63/UE.

UWAGA: Ten protokół ma dwa różne cele: 1) pierwsze badanie, określane jako "strategia A", pozwala na analizę interakcji między komórkami Cajal-Retzius (komórkami CR) a wcześnie urodzonymi neuronami projekcyjnymi kory mózgowej w tej samej półkuli mózgu; 2) drugie badanie, "strategia B", jest przeprowadzane w celu zbadania unerwienia neuronów projekcyjnych górnej warstwy modzeli do przeciwległej strony kory nowej.

1. Przygotowanie przedoperacyjne

  1. Przygotowanie DNA
    1. Przekształć chemicznie lub elektrokompetentnie komórki DH5α E. coli z interesującymi plazmidami, umieść je na płytkach agarowych LB z odpowiednim antybiotykiem i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Wszystkie plazmidy użyte tutaj zawierają ogólny promotor β-aktyny kurczaka (CAG) napędzający ekspresję białka fluorescencyjno-reporterowego (CAG-mCherry i CAG-EGFP dla strategii A oraz CAG-BFP i CAG-nEGFP-2A-mtdTomato dla strategii B). Wszystkie z nich zawierają oporność na ampicylinę (AMP).
    2. Pobrać pojedyncze kolonie z każdej transformacji plazmidu i zainicjować starterową płynną kulturę w 2 ml bulionu Luria + ampicyliny (LB+AMP) w probówkach do hodowli bakteryjnych przez 3-4 godziny w temperaturze 37 °C z energicznym wstrząsaniem (200 obr./min). Następnie umieść większą kulturę bakteryjną w kolbie Erlenmeyera o pojemności 500 ml, dodając 200 ml LB+AMP i 1 ml kultury starterowej. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 200 obr./min.
    3. Użyj wolnego od endotoksyn zestawu maxi-prep (tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać czyste i skoncentrowane plazmidowe DNA z płynnych kultur. Ponownie zawiesić DNA w ~50−100 μL wolnego od endotoksyn buforu Tris-EDTA (TE), aby uzyskać stężenie co najmniej 5 μg/μL.
    4. Dla każdego zabiegu należy przygotować roztwór o końcowej objętości 10 μl zawierający 1 μl szybkiego zielonego barwnika, interesujący nas roztwór plazmidowego DNA o końcowym stężeniu 1 μg/μl dla każdego plazmidu oraz bufor TE wolny od endotoksyn. Na przykład zmieszaj 1 μl szybko zielonego barwnika, 2 μl 5 μg/μl roztworu plazmidowego DNA i 7 μl buforu TE.
  2. Ciągnięcie pipet
    1. Pociągnij kapilary ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna/wewnętrzna 1/0,58 mm) w pionowym ściągaczu do mikropipet, aż końcówka osiągnie długość 1−1,5 cm i przytnij ją za pomocą kleszczy preparacyjnych pod kątem około 30° pod lunetą sekcyjną.
  3. Konfiguracja sali operacyjnej
    1. Połóż cały sprzęt na stole operacyjnym (tj. pęsetę, nożyczki, kleszcze, mikropipety, igłę i uchwyt na igłę). Włącz poduszkę grzewczą i przykryj ją sterylnym absorbentem chirurgicznym. Upewnij się, że zbiornik w urządzeniu do znieczulenia wziewnego jest wypełniony izofluranem, zbiornik tlenu zawiera wystarczającą ilość tlenu, a system działa prawidłowo.
      UWAGA: Sala operacyjna i odporny materiał muszą być utrzymywane w jak największej sterylności (tj. cały materiał musi być autoklawowany przed operacją, a powierzchnie muszą być zdezynfekowane 70% etanolem). Elektrody platynowe należy przed zabiegiem dokładnie zdezynfekować najpierw mydłem bakteriobójczym, a następnie 70% etanolem.
    2. Przygotować 100 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej o stężeniu 0,9% (w/v) zawierającego penicylinę-streptomycynę w stosunku 1:100 i napełnić 10 cm szalkę Petriego. Umieść płytkę na podgrzanej podkładce, aby podgrzać roztwór.
    3. Napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml 150 μl roztworu przeciwbólowego (np. 0,1 mg/kg buprenorfiny).
    4. Załadować do wyciągniętej pipety 5 μl końcowego roztworu plazmidowego DNA przygotowanego w kroku 1.1.4. Podłącz kapilar do rurki aspiratora sterowanej ustami.

2. Pierwsza operacja elektroporacji in utero

  1. Umieść ciężarną mysz E11.5 (strategia A) lub E13.5 (strategia B) C57BL/6 w zamkniętej komorze indukcyjnej z 2,5% (v/v) izofluranem w tempie 0,8 l/min i poczekaj, aż zostanie znieczulona. Przenieś mysz na poduszkę grzewczą i włóż jej nos do maski, aby zapewnić ciągłe dostarczanie izofluranu. Sprawdź, czy nie ma odruchu pedałowania jako wskaźnika prawidłowego znieczulenia.
    UWAGA: Wiek E. mbryoniczny określa się na podstawie dnia, w którym zaobserwowano czop pochwowy (E0,5).
  2. Ciężarnej kobiecie należy wstrzyknąć podskórnie roztwór przeciwbólowy (0,1 mg/kg buprenorfiny). Aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas zabiegu, nałóż jedną kroplę maści do oczu na każde oko za pomocą bawełnianego wacika.
  3. Ogol okolice brzucha myszy elektryczną maszynką do golenia i umyj je 2x chusteczkami z etanolu o stężeniu 70% (v/v), raz chusteczkami jodowymi, a po raz ostatni chusteczką z etanolu.
  4. Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie o długości 30 mm przez skórę po prawej stronie zwierzęcia i ostrożnie oddziel sąsiednią skórę od mięśnia szpatułką. Następnie wykonaj drugie nacięcie w ścianie brzucha.
  5. Przykryj brzuch kawałkiem złożonej bibuły, uprzednio zdezynfekowanej 70% etanolem, zawierającej w środku szczelinę o długości 40 mm. Ostrożnie wyciągnij macicę z jamy brzusznej za pomocą kleszczy pierścieniowych.
    UWAGA: Macica musi być utrzymywana w stanie mokrym ciepłym roztworem soli fizjologicznej przygotowanym w kroku 1.3.2 podczas całego zabiegu.
  6. Wstępnie naładować wyciągnięte pipety roztworem DNA przygotowanym w kroku 1.1.4. Wstrzyknąć ~0,5 μl roztworu DNA na zarodek do bocznej komory wybranej półkuli za pomocą rurki aspiratora sterowanej ustami, aż do momentu, gdy w komorze będzie zauważalny szybki zielony barwnik.
  7. Umieść platynowe elektrody typu kleszczykowego bocznie wokół głowy wstrzykiwanego zarodka (jak pokazano na Rysunek 1A i Rysunek 2A). Ustaw elektrody tak, aby celowały w żądany obszar mózgu. Skieruj biegun dodatni w kierunku ściany przyśrodkowej, aby naelektryzować rąbek kory mózgowej (strategia A) lub w kierunku kory bocznej (strategia B), aby oznaczyć komórki generowane w tym obszarze.
    UWAGA: We wszystkich przypadkach należy unikać serca i łożyska, aby zapewnić przeżycie zarodka.
  8. Zastosować określoną sekwencję impulsów elektrycznych za pomocą elektroporatora o fali prostokątnej zgodnie ze wskazaniami przedstawionymi w tabeli 1 (strategia A E11.5 zarodki: cztery impulsy 25 V i 40 ms, oddalone od siebie o 950 ms; strategia B E13.5 zarodki: pięć impulsów 35 V i 60 ms, w odstępach 950 ms).
  9. Ostrożnie umieść macicę z powrotem w jamie brzusznej za pomocą kleszczy, napełnij ją ciepłym roztworem soli fizjologicznej i zamknij ścianę brzucha szwem igłowym 6-0. Połącz obie strony początkowego nacięcia wykonanego w skórze za pomocą szwu igłowego 6-0 lub klipsów do szwów.
  10. Utrzymuj zwierzę na poduszce grzewczej i monitoruj je, aż dojdzie do siebie po znieczuleniu. Zapewnij dodatkową dawkę środka przeciwbólowego (150 μL) w roztworze hydrożelu umieszczonym w jego domowej klatce.
  11. 24 godziny po zabiegu należy podać dodatkową dawkę środka przeciwbólowego (150 μL). Kontynuuj codzienne monitorowanie poprzez oględziny pod kątem możliwego bólu i niepokoju. Obserwuj zachowanie zwierzęcia, przetestuj jego normalne odruchy kończyn tylnych i sprawdź szew pod kątem ewentualnych oznak uszkodzenia w wyniku lizania lub drapania rany.

3. Druga elektroporacja in utero

  1. Dwa dni po pierwszym zabiegu powtórz kroki 2.1−2.3. Chociaż rekonwalescencja ciężarnych samic po operacji jest bardzo dobra, przed wykonaniem drugiej operacji sprawdź, czy wykazują one normalne zachowanie i nie wykazują żadnych oznak bólu lub niepokoju (zarodki E13.5 dla strategii A i E15.5 dla strategii B).
  2. Wykonać nacięcie skóry o długości 30 mm, jak w kroku 2.4, a następnie drugie nacięcie na ścianie brzucha, tym razem po lewej stronie zwierzęcia. Ostrożnie umieść macicę na zdezynfekowanej tkance, jak opisano w kroku 2.5.
    UWAGA: Uważaj, aby nie kolidować z nacięciem wykonanym wcześniej po drugiej stronie.
  3. Wstrzyknąć około 0,5 μl roztworu DNA na zarodek do bocznej komory mózgu półkuli uprzednio elektroporowanej w przypadku strategii A oraz do bocznej komory mózgu półkuli przeciwległej w przypadku strategii B.
    UWAGA: Należy używać tylko zarodków wykazujących prawidłowy rozwój i bez oznak reabsorpcji.
  4. Umieścić elektrody wokół głowy zarodka zgodnie z opisem w kroku 2.7, kierując elektrodę dodatnią w stronę kory bocznej i zastosować odpowiednie impulsy zgodnie ze wskazówkami przedstawionymi w Tabeli 1 (strategia A E13.5 zarodki: pięć impulsów 35 V i 60 ms oddzielonych odstępami 950 ms; strategia B E15.5 zarodki: pięć impulsów 50 V i 80 ms oddzielonych odstępami 950 ms).
  5. Kontynuuj i zakończ operację zgodnie z opisem w krokach 2.8−2.10.

4. Pobieranie i cięcie tkanek

  1. Strategia A
    1. Cztery dni po drugiej elektroporacji (E17.5) należy wykonać zwichnięcie szyjki macicy ciężarnej kobiety i ułożyć ją w pozycji leżącej.
    2. Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie brzuszne, aby usunąć rogi macicy i za pomocą kleszczy umieść je na szalce Petriego wypełnionej 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) umieszczoną na lodzie.
      UWAGA: Niska temperatura umożliwia znieczulenie zarodków.
    3. Za pomocą pęsety wyekstrahuj zarodki z worka owodniowego i przenieś je kleszczami na nową szalkę Petriego wypełnioną PBS pod lunetą sekcyjną. Ostrożnie przytrzymaj głowę zarodków za pomocą kleszczy i przeprowadź sekcję mózgu za pomocą pęsety, aby najpierw usunąć skórę nad głową, a następnie czaszkę. Użyj szpatułki, aby wyciągnąć odsłonięte mózgi.
    4. Zbierz mózgi łyżką i umieść je na 48-dołkowej płytce wypełnionej roztworem utrwalającym (4% [w/v] paraformaldehydu [PFA] w 1x PBS). Natychmiast przetestuj pomyślny wynik obu elektroporacji, badając mózgi za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego, na przykład.
    5. Utrwalić embrionalne mózgi przez noc w temperaturze 4 °C w wytrząsarce orbitalnej. Umyć 1x PBS, aby wyeliminować ślady PFA. Następnie przenieś je do PBS z przeciwgrzybiczymi środkami konserwującymi (1x PBS-0,05% (w/v) azydek sodu).
      UWAGA: PFA i azydek sodu są związkami cytotoksycznymi, które wymagają szczególnej ostrożności podczas ich stosowania.
    6. Osadź zafiksowane mózgi w 4% (w/v) agarozie o niskiej temperaturze topnienia w 1x PBS i odczekaj ~10 minut, aż zastygnie. Przyklej je do uchwytu na tkankę wibratomu za pomocą kleju cyjanoakrylowego z opuszkami węchowymi skierowanymi do góry, aby uzyskać przekroje koronalne.
    7. Zainicjuj wibratomium i wybierz żądane parametry: szerokość 100 μm, prędkość 0,60 μm/s i amplituda 0,60 mm.
    8. Zabezpiecz mózg w pojemniku na wibratom, napełnij go 1x roztworem PBS i zacznij zbierać koronalne odcinki szeregowe za pomocą pędzla w 48-dołkowej płytce wypełnionej 1x PBS-0,05% (w/v) azydkiem sodu, aby uzyskać pełny obraz mózgu (np. około siedmiu sekcji na studzienkę i sześć dołków na zarodek).
    9. Zamontuj żądane sekcje w szkiełkach mikroskopowych za pomocą cienkiej szczoteczki. Przykryj je szklanymi szkiełkami nakrywkowymi. Do długotrwałego przechowywania należy dodać podłoże montażowe, które zapobiega fotowybielaniu i fotoutlenianiu. Obserwuj szkiełka pod pionowym mikroskopem epifluorescencyjnym, aby ocenić skuteczność elektroporacji.
  2. Strategia B
    1. Pozwól młodym uprzednio poddanym elektropoturze w E13.5 i E15.5 urodzić się i poczekaj, aż P15 wykona perfuzję przezsercową przy użyciu tego samego roztworu utrwalającego, który zastosowano w kroku 4.1.4.
    2. Tuż przed perfuzją dootrzewnowo podać dawkę 75/1 mg/kg ketaminy/medetomidyny. W przypadku utraty odruchu pedałowania zabezpiecz mysz w pozycji leżącej na plecach i wykonaj brzuszne nacięcie wzdłuż środkowej linii za pomocą nożyczek, aby odsłonić zarówno klatkę piersiową, jak i przeponę.
    3. Przetnij przeponę i otwórz klatkę piersiową, aby uzyskać dostęp do serca. Przytrzymaj klatkę piersiową za pomocą hemostatu i wykonaj nacięcie w prawym przedsionku cienkimi nożyczkami.
    4. Przeniknąć do lewej komory za pomocą igły połączonej elastyczną rurką z perfuzyjną pompą perfuzyjną. Rozpocznij perfuzję przezsercową, dostarczając co najmniej 25 ml 4% PFA przy stałym strumieniu 5,5 ml / min (całkowity czas ~ 5 min).
    5. Przeprowadź sekcję mózgu zwierząt z perfuzją. Najpierw usuń skórę nad głową nożyczkami i kleszczami. Zacznij ciąć czaszkę nożyczkami i ostrożnie odrywaj fragmenty kości czaszki, aż zostaną całkowicie usunięte. Na koniec wyekstrahuj mózg za pomocą szpatułki.
    6. Przenieś mózgi na 24-dołkową płytkę i utrwal je 4% PFA przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej. Zatrzymać utrwalanie, zastępując PFA 0,05% (w/v) azydkiem sodu w PBS.
      UWAGA: Jak wskazano w kroku 4.1.5, zaleca się przeprowadzenie prania pośredniego za pomocą 1x PBS.
    7. Powtórz kroki 4.1.6−4.1.9, zmieniając parametry wibratomu dla mózgów po urodzeniu (szerokość 40 μm, prędkość 1,20 μm/s i amplituda 0,5 mm).
      UWAGA: Immunohistochemię lub immunofluorescencję można przeprowadzić w celu wykrycia określonych markerów komórkowych lub wzmocnienia sygnału białek fluorescencyjnych stosowanych w elektroporacji.

5. Konfokalne obrazowanie i analiza fluorescencji

  1. Włącz mikroskop konfokalny, umieść szkiełka mikroskopowe zawierające zamontowane skrawki mózgu na uchwycie szkiełek mikroskopu i wybierz kanały, w których będą wykonywane obrazy fluorescencyjne (tj. 420−460 nm dla BFP, 490−540 nm dla GFP i 570−620 nm dla mCherry i tdTomato).
  2. Wykonaj skanowanie próbki, aby uzyskać obrazy mapy każdej sekcji mózgu na dwóch różnych długościach fal, aby uzyskać ogólny widok wyjścia podwójnej elektroporacji. Po zakończeniu wybierz obiektyw 10x i tryb obserwacji poklatkowej z wieloma obszarami Z-stack. Pozwoli to na zaprogramowanie automatycznej akwizycji obrazów fluorescencyjnych w różnych lokalizacjach XYZ w obrębie wycinków mózgu.
  3. W każdym z wybranych obszarów (XY) należy ustawić odpowiednie parametry obrazowania (tj. natężenie lasera, czułość fotopowielacza oraz minimalną rozdzielczość 1 024 x 1 024), a także głębokość skanowania (Z) zgodnie z płaszczyznami próbki, na których widoczna jest fluorescencja.
  4. Uzyskaj obrazy w małym powiększeniu (10x) wszystkich wybranych obszarów i wyeksportuj je z formatu OIF do TIFF za pomocą oprogramowania do przeglądania mikroskopów.
  5. Zmień obiektyw na 60x, powtórz krok 5.3 i uchwyć obrazy w dużym powiększeniu, aby bardziej szczegółowo obserwować interakcje komórka-komórka. Wyeksportuj je zgodnie z opisem w kroku 5.4.
  6. Otwórz uzyskane obrazy za pomocą dowolnego oprogramowania do obrazowania (np. Fidżi) w celu dalszej analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Interakcje między sąsiednimi komórkami pochodzącymi z odległych miejsc i w różnym czasie: komórki Cajala-Retziusa (komórki CR) i wczesne migrujące neurony projekcyjne kory (strategia A)

Oddziaływanie komórek CR i wczesnych neuronów projekcyjnych kory opisano wcześniej jako niezbędne do regulacji translokacji somatycznej za pośrednictwem cząsteczek adhezyjnych nektyn i kadheryn, wykorzystując strategię podwójnej elektroporacji8. Komórki CR pochodzą z neu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie interakcji komórka-komórka in vivo w regionach o dużej gęstości komórek, takich jak kora mózgowa, jest złożonym zadaniem. Tradycyjne podejścia, w tym stosowanie przeciwciał do znakowania neurytów, nie są odpowiednie ze względu na brak specyficznych markerów dla różnych populacji komórek. Wykorzystanie transgenicznych modeli mysich, w których określony typ komórki wyraża białko fluorescencyjne, jest przydatne do wizualizacji procesów neuronalnych, ale zależy to od dostępności takich modeli. Zadanie to jest jeszcze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Cristinie Andrés Carbonell i członkom Zakładu Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Walentycznego za pomoc techniczną. Dziękujemy również Isabel Fariñas i Sacramento R. Ferrón za odczynniki i podzielenie się z nami ich sprzętem. I.M.W jest finansowany z kontraktu Garantía Juvenil z Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D jest finansowany przez Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz posiada stypendium Ramón y Cajal Grant (RYC-2015-19058) hiszpańskiego Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN). Ta praca została sfinansowana RYC-2015-19058 i SAF2017-82880-R (MICINN).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sól sodowa ampicylinySigma-AldrichA9518-25G
Rurka aspiratoraSigma-AldrichA5177-5EA
Hemostat dla niemowląt (perfuzja)Fine Science Tools (FST)13013-14
Kapilara ze szkła borokrzemianowegoWPI1B100-6
Buprenorfina (BUPREX 0,3 mg/ml)Rb Pharmaceuticals Limited
Plazmid CAG-BFPUprzejmie dostarczony przez U.Mü ller Lab
CAG-EGFP plazmidUprzejmie dostarczony przez U.Mü ller Lab
CAG-mPlazmid wiśniowyUprzejmie dostarczone przez U.Mü ller Lab
CAG-mtdPlazmid Tomato-2A-nGFPUprzejmie dostarczone przez U.Mü ller Lab
Mikroskop konfokalnyOlympusFV10i
BFHCVDF
Klej cyjanoakrylowyB. Braun 1050044
chirurgiczne Luneta sekcyjnaKleszcze Zeissstemi 305
Dumont #5 Kleszcze drobnoziarnisteNarzędzia do nauki (FST)11254-20
ECM830 Kwadrat Elektroporator falowyBTX45-0052
Elektryczna maszynka do goleniaOster76998
Wolny od endotoksyn bufor TEQIAGEN1018499
Chusteczki etanoloweBFHCVDF
Ekstra drobne kleszcze GraefeNarzędzia do nauki (FST)11150-10
Maść do oczuAlcon682542.6
Szybki zielony barwnikSigma-AldrichF7252-5G
Drobne nożyczkiFine Science Tools (FST)14069-09
Fluorescencyjne diody LEDCoolLEDpE-300-W
Genopure Plasmid Maxi KitRoche3143422001
Halsted-Mosquito Hemostats (szew)Fine Science Tools (FST)91308-12
PoduszkagrzewczaUFESAAL5514
Odwrócony mikroskop epifluorescencyjnyNikonEclipse TE2000-S
Chusteczki jodoweLorsoul
Parownik izofluoranuPrzepływomierzA15B5001
IzofluranKarizoo586259
Ketamina (Anastemina)Fatro Ibé rica SL583889-2
Chusteczki precyzyjne KimtechKimberly-Clark7252
LB (Lennox) Agar GENLabkemAGLB-00P-500
LB (Lennox) bulion GENLabkemLBBR-00P-500
Agaroza o niskiej temperaturze topnieniaFisher ScientificBP165-25
Medetomidine (sedator)Dechra573749.2
Szkiełka nakrywkowe mikroskopowe-Glä ser15747592
Szkiełka mikroskopoweLabboxSLIB-F10-050
Medium montażoweMikroskopia elektronowa Sciences17984-25
Płytki wielofunkcyjne (24)SPL Nauki Biologiczne32024
Płytki Mutiwell (48)SPL Nauki Przyrodnicze32048
NaCl (do roztworu soli fizjologicznej)Fisher Scientific10112640
Igła 25 G (BD Microlance 3)Becton, Dickinson and Company300600
Inkubator orbitalny S150Stuart Scientific5133
P Inkubator SelectaJ. P. Selecta, s.a.
ParaformaldehydPanReac AppliedChemA3813
Penicylina-StreptomycynaSigma -AldrichP4333
Pompa perfuzyjnaCole-ParmerEW-07522-30
Platynowa pęseta, średnica 5 mmBtx45-0489
zamykania skóry Reflex - klipsy 7 mm, pudełko 100sztuk203-1000
Odruchowy system zamykania skóry - Clip Aplikator, 7mmAgnThos204-1000
Kleszcze pierścienioweFine Science Tools (FST)11103-09
Azydek soduPanReac AppliedChem122712-1608
Absorbent chirurgiczny (sterylny)HK SurgicalPD-M
Szew (Surgicryl PGA 6-0)SMI Materiały do szycia
Strzykawka 1ml (BD plastipak)Becton, Dickinson and Company303172
Naczynie do hodowli tkankowych 100 x 20 mmFalcon353003
Pionowy ściągacz do mikropipetSutter Instrument CoP-30
Mikroskop pionowyNikonEclipse Ni
VibratomeLeicaVT1200S
921425 Waciki bawełniane 0485472 System BYD11071512

Bibliografia

  1. Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102(2017).
  2. Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
  7. Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
  8. Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
  9. Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
  10. Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
  11. Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
  12. Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
  13. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
  14. Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
  15. Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).
  16. Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139(2017).
  17. Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
  18. Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
  19. Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
  20. Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
  21. Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
  22. Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
  23. Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
  24. Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
  25. Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
  26. Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
  27. Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36(2017).
  28. DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29(2011).
  29. Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Podwójna elektroporacjaneuronalne komórki macierzystebadanie kortykogenezymigracja neuronówśledzenie linii komórkowychprowadzenie aksonówiniekcja do embrionalnego mózguelektrody do elektroporacjiznakowanie białkami fluorescencyjnymi
Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.