Artykuł metodologiczny

Ilościowe określanie cząstek wirusopodobnych do ludzkiego norowirusa wiążących się z bakteriami komensalnymi za pomocą cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/61048

⸱

29 kwietnia 2020

 , 
1Microbiology and Cell Science Department, University of Florida

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest ilościowe określenie wiązania eukariotycznego patogenu ludzkiego norowirusa z bakteriami. Po wykonaniu wstępnego testu przyłączenia wirusa-bakterii, cytometria przepływowa jest stosowana do wykrywania bakterii związanych z wirusem w populacji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterie komensalne są dobrze przystosowane do wpływania na infekcję wirusami eukariotycznymi. Bezpośrednie wiązanie między patogenem a mikrobiomem gospodarza jest odpowiedzialne za zmianę infekcji wielu z tych wirusów. Tak więc scharakteryzowanie natury wiązania wirus-bakteria jest podstawowym krokiem potrzebnym do wyjaśnienia mechanizmu (mechanizmów), za pomocą którego bakterie zmieniają infekcję wirusową. W przypadku ludzkiego norowirusa bakterie komensalne nasilają infekcję komórkami B. Wirus bezpośrednio wiąże się z tymi bakteriami, co wskazuje, że ta bezpośrednia interakcja jest zaangażowana w mechanizm nasilania infekcji. Do ilościowego określenia interakcji między bakteriami i wirusami można wykorzystać różne techniki, w tym zliczanie scyntylacyjne wirusów znakowanych radioaktywnie i reakcję łańcuchową polimerazy (PCR). Obie metody wymagają użycia żywego wirusa, który może wymagać wytworzenia w laboratorium. Obecnie żaden z istniejących systemów hodowli in vitro dostępnych dla ludzkiego norowirusa nie jest wystarczająco solidny, aby umożliwić wytwarzanie wysoce skoncentrowanych stad wirusa. Zamiast żywego wirusa, do scharakteryzowania interakcji między norowirusem a bakteriami użyto cząstek wirusopodobnych (VLP). W niniejszym artykule opisano metodę cytometrii przepływowej, w której wykorzystuje się przeciwciała specyficzne dla wirusa do ilościowego określenia wiązania VLP z bakteriami Gram-ujemnymi i Gram-dodatnimi. Włączenie zarówno samych bakterii, jak i kontroli izotypów pozwoliło na optymalizację testu w celu zmniejszenia wiązania przeciwciał w tle i dokładnego określenia ilościowego przyłączenia VLP do badanych bakterii. Wysokie proporcje VLP do bakterii powodują, że VLP wiążą się z dużym odsetkiem populacji bakterii. Jednak gdy ilości VLP są zmniejszane, zmniejsza się również procent związanych bakterii. Ostatecznie metoda ta może zostać zastosowana w przyszłych eksperymentach wyjaśniających specyficzne warunki i składniki strukturalne, które regulują interakcje norowirusa-bakterii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie norowirusy (HuNoVs) są główną przyczyną chorób przewodu pokarmowego na całym świecie, odpowiedzialne za 685 milionów infekcji i ponad 200 000 zgonów rocznie1. Podobnie jak w przypadku innych wirusów jelitowych, wykazano, że obecność bakterii komensalnych nasila infekcję tym patogenem, a także jego zastępczym wirusem, mysim norowirusem2,3. Istnieją również sprzeczne doniesienia, że bakterie mogą hamować infekcję ludzkim norowirusem4,5,6. W przypadku kilku wirusów bezpośrednia interakcja między wirusem a bakterią wydaje się leżeć u podstaw mechanizmów wpływających na infekcję wirusową2,7,8,9,10, a mikroskopia elektronowa wykazała, że ludzkie norowirusy wiążą się bezpośrednio z powierzchniami bakterii11,12. Dlatego scharakteryzowanie tych interakcji stało się kluczowe dla określenia mechanizmów, za pomocą których bakterie wpływają na infekcję wirusową. Ta charakterystyka klasycznie rozpoczęła się od ilościowego określenia wiązania wirusa z szeregiem gatunków bakterii, które są składnikami mikrobiomu gospodarza7,12,13. Te testy przyłączenia nie tylko ujawniają ilość wirusa związanego z bakteriami, ale także pomagają w określeniu wpływu tej interakcji na sprawność i przeżycie wirusa.

Aby określić ilościowo przyczepienie wirusa, tradycyjnie stosowane metody obejmują testy oparte na PCR, które określają ilościowo genomy wirusów12 lub generowanie wirusa znakowanego radioaktywnie oraz wykorzystanie zliczania scyntylacyjnego do ilościowego oznaczania cząsteczek wirusa7,8,9,13. Stosowanie tych metod na ogół wymaga dostępu do zasobów wirusów o wysokim mianie i technik hodowli in vitro, za pomocą których można je wygenerować. Chociaż obecnie istnieje kilka systemów hodowli ludzkiego norowirusa2,14,15, żaden z nich nie obsługuje solidnej replikacji wymaganej do wygenerowania tych wysoce skoncentrowanych zasobów, co ogranicza lub eliminuje stosowanie PCR i zliczania scyntylacyjnego do ilościowego określania interakcji ludzkiego norowirusa z bakterią.

Aby obejść ten problem, cząsteczki wirusopodobne (VLP) mogą być używane jako substytut żywego wirusa do badania interakcji między ludzkim norowirusem a bakteriami16,17. VLP to niezakaźne cząstki, które bardzo przypominają wirusa, z którego pochodzą. W przypadku ludzkiego norowirusa cząsteczki te są generowane z ekspresji białka VP1 (a czasami VP2), które samoorganizują się, tworząc nienaruszone kapsydy wirusowe pozbawione materiału genetycznego (tj. RNA w przypadku norowirusów). Te VLP zostały dobrze scharakteryzowane, są strukturalnie i antygenowo podobne do wirusów typu dzikiego, z których pochodzą18,19,20,21,22,23. Dlatego VLP służą jako idealny substytut do badania interakcji powierzchniowych między ludzkim norowirusem a bakteriami komensalnymi. Biorąc pod uwagę, że VLP nie mają materiału genetycznego, testy oparte na PCR nie mogą być stosowane do ilościowego określenia wiązania wirusa. Wcześniej opisano metodę cytometrii przepływowej opartej na przeciwciałach, która jest w stanie wykryć niskie poziomy wiązania VLP z bakteriami w sposób półilościowy16. Metoda ta została zoptymalizowana, aby umożliwić dokładne określenie ilościowe wiązania VLP ludzkiego norowirusa zarówno z bakteriami komensalnymi Gram-ujemnymi, jak i Gram-dodatnimi16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Warunki wzrostu bakterii opisane w protokole są standardowymi warunkami hodowli dla Enterobacter cloacae i Lactobacillus gasseri. Aby przeprowadzić test przyłączenia wirusa-bakterii z innymi gatunkami bakterii, wybrane bakterie należy hodować w standardowych warunkach odpowiednich dla bakterii.

1. Przygotowanie pożywki do wzrostu bakterii

  1. Pożywka wzrostowa Enterobacter cloacae
    1. Przygotować płynne podłoże, rozpuszczając 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego i 10 g chlorku sodu (NaCl) w 1 l wody dejonizowanej (DI) (patrz tabela materiałów). Dokładnie wymieszaj wszystkie podłoża i sterylizuj w autoklawie przez 30 minut.
    2. Przygotować stałe podłoże, rozpuszczając 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g NaCl i 15 g agaru w 1 l wody detonowanej. Dokładnie wymieszaj wszystkie podłoża i sterylizuj w autoklawie przez 30 minut.
  2. Pożywki wzrostowe Lactobacillus gasseri
    1. Przygotować płynne podłoże, rozpuszczając 55 g proszku De Man, Rogosa i Sharpe (MRS; patrz tabela materiałów) w 1 l wody demineralizowanej. Pożywkę zużyć w ciągu miesiąca od przygotowania. Aby wysterylizować, podgrzewaj podłoże przez 15 minut, aż do wrzenia, a następnie autoklawuj przez 15 minut.
    2. Przygotować stałe podłoże, rozpuszczając 55 g proszku MRS i 15 g agaru w 1 l wody demineralizowanej. Aby wysterylizować, podgrzewaj podłoże przez 15 minut, aż do wrzenia, a następnie autoklawuj przez 15 minut.

2. Ustalanie krzywej standardowej korelującej gęstość optyczną (OD) i stężenie bakterii

  1. Zaszczepić 5 ml odpowiedniej płynnej pożywki pojedynczą, wyizolowaną kolonią z płytki agarowej (E. cloacae) lub bezpośrednio z zamrożonego bulionu glicerolowego (L. gasseri).
  2. Hodować bakterię przez noc, w odpowiednich warunkach atmosferycznych (Enterobacter cloacae: 37 °C z wytrząsaniem tlenowym przy 200 obr./min; L. gasseri: łaźnia wodna o temperaturze 37 °C bez wstrząsania w hermetycznym pojemniku).
  3. Przenieś 2 porcje po 1,3 ml hodowli przez noc do dwóch oddzielnych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i odwiruj bakterie przy 10 000 x g przez 5 minut.
  4. Usunąć supernatant i przemyć próbki 1 ml sterylnego 1x buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS). Powtórz ten krok prania, w sumie 2 prania.
  5. Ponownie odwirować próbki przy 10 000 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 1,3 ml sterylnego 1x PBS.
  6. Zaczynając od 0,5 ml umytej kultury, seryjnie rozcieńczaj bakterie w 1x PBS od 10-1 do 10-4.
  7. Za pomocą spektrofotometru zmierzyć gęstość optyczną przemytej, nierozcieńczonej kultury i każdego z czterech rozcieńczeń przy 600 nm (OD600).
  8. Wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia w 1x PBS dla każdego rozcieńczenia z kroku 2.6. Rozprowadzić płytkę 100 μl ostatnich 3 rozcieńczeń dla każdej serii na odpowiednim podłożu stałym, aby określić liczbę jednostek tworzących kolonie na mililitr (CFU/ml) każdej próbki. Każde rozcieńczenie należy rozłożyć trzykrotnie.
  9. Pozostawić płytki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odwrócić płytki i inkubować w odpowiednich warunkach atmosferycznych (E. cloacae: tlenowy w temperaturze 37 °C, inkubować płytki przez noc; L. gasseri: beztlenowy w temperaturze 37 °C, inkubować płytki przez 48 godzin w hermetycznym pojemniku z beztlenowymi saszetkami powietrznymi (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Stosować 1 saszetkę z powietrzem beztlenowym na słoik o pojemności 2,5 l lub 3 saszetki na słoik o pojemności 7,0 l (patrz tabela materiałów).
  10. Użyj liczby płytek, aby oznaczyć jtk/ml dla każdej z 5 próbek (tj. nierozcieńczonych, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4). Wygeneruj krzywą wzorcową porównującą OD600 i CFU/ml. Równanie dla tej linii zostanie wykorzystane w testach przyłączania bakterii VLP do określenia CFU / ml na podstawie OD600.

3. Test przyłączenia bakterii VLP

UWAGA: VLP ludzkiego norowirusa stanowią zagrożenie na poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL)-2 i wszystkie prace związane z VLP powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przygotowanie kultur bakteryjnych przed przystąpieniem do próby przyłączania powinno być przeprowadzone w warunkach bezpieczeństwa odpowiednich dla organizmu.

  1. Przygotowanie odczynnika
    1. 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)
      1. Przygotuj 1 l 10x PBS, rozpuszczając całe opakowanie w 1 l wody DI.
      2. Roztwór w autoklawie przez 30 min.
      3. Przygotuj 1x roztwór, rozcieńczając powyższy roztwór w stosunku 1:10 w wodzie DI.
      4. Filtr: wysterylizuj roztwór, przepuszczając go przez filtr 0,22 μm i przechowuj w temperaturze pokojowej.
    2. 5% BSA
      1. Dodać 5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w proszku do 100 ml PBS, aby uzyskać 5% (w/v) roztwór.
      2. Wymieszaj roztwór, wirując lub na płytce mieszającej za pomocą metalowego mieszadła, aż grudki się rozpuszczą.
      3. Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm.
      4. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
    3. Bufor barwiący cytometrii przepływowej (FCSB)
      1. Przefiltruj zakupiony FCSB (patrz tabela materiałów) przez filtr 0,22 μm.
      2. Pozostały roztwór przechowywać w temperaturze 4 °C.
    4. 5% bufor blokujący (BB)
      UWAGA: Za każdym razem przygotuj świeże.
      1. Dodać 0,5 g BSA do 10 ml sterylnego FCSB.
      2. Wirować, aby całkowicie wymieszać próbkę i pozostawić na lodzie do użycia.
  2. Koniugacja przeciwciał
    1. Sprzęż ludzkie przeciwciało GII przeciwko norowirusowi (patrz tabela materiałów) z r-fikoerytryną (PE) za pomocą zestawu do znakowania przeciwciał R-PE zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
    2. Sprzężone przeciwciało należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości w teście przyłączania bakterii VLP.
      UWAGA: Przeciwciało pierwszorzędowe należy miareczkować przed użyciem w teście przyłączania bakterii VLP w celu określenia właściwego stężenia niezbędnego do analizy cytometrii przepływowej. Miareczkowanie przeciwciał należy wykonywać za każdym razem, gdy przeprowadzana jest reakcja koniugacji i dla każdej bakterii użytej w teście przyłączania.
  3. Miareczkowanie przeciwciał
    1. Rozcieńczyć sprzężone przeciwciało GII przeciwko ludzkiemu norowirusowi 100-krotnie, z początkowym rozcieńczeniem 1:100 i końcowym 1:600 (w sumie sześć rozcieńczeń).
    2. Wykonać test przyłączenia wirusa zgodnie z poniższym opisem z następującym wyjątkiem: w kroku 3.5.7 ponownie zawiesić osad bakteryjny w 350 μl 5% BB.
    3. Podzielić próbkę na siedem podwielokrotności o objętości 50 μl.
    4. Dodać 50 μl każdego rozcieńczenia przeciwciała do jednej probówki.
    5. Dodaj 50 μl 5% BB do siódmej probówki jako niebarwioną kontrolę.
    6. Przeprowadzić cytometrię przepływową na wszystkich próbkach zgodnie z poniższym opisem.
    7. Porównaj rozcieńczone próbki przeciwciał z niebarwionymi kontrolami i ze sobą nawzajem. Najniższe stężenie przeciwciał, które nie powoduje spadku lub utraty sygnału dodatniego, powinno być wybrane do stosowania w kolejnych testach.
  4. Przygotowanie bakterii
    1. Hoduj bakterie w 40 ml odpowiedniej płynnej pożywki w odpowiednich warunkach atmosferycznych, aż bakterie znajdą się w fazie stacjonarnej.
      1. Kultury E. cloacae hodować tlenowo przez noc w bulionie Luria w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min, aby osiągnąć fazę stacjonarną.
      2. Hodować kultury L. gasseri w bulionie MRS w czarnych probówkach z nakrętką bez wstrząsania w łaźni wodnej ustawionej na 37 °C przez 18 godzin, aby osiągnąć fazę stacjonarną.
    2. Przenieść kultury w fazie stacjonarnej do oczyszczenia stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować próbki o masie 2 288 x g przez 10 minut w celu osadzenia bakterii.
    3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 13 ml sterylnego 1x PBS. Powtórz ten krok prania, w sumie dwa prania.
    4. Ponownie odwirować próbki, usunąć supernatant i ponownie zawiesić próbki w 20 ml 1x PBS.
      UWAGA: Jeśli osad komórek jest mały, objętość ponownego zawieszenia można zmniejszyć.
    5. Zmierz OD600 kultury.
    6. Korzystając z wcześniej przygotowanej krzywej wzorcowej, oznacz jtk na ml przemytej kultury.
    7. Rozcieńczyć bakterie w razie potrzeby 1x PBS, aby dostosować stężenie kultury do 1 x 108 CFU/ml.
    8. Przenieść 1 ml kultury bakteryjnej 1 x 108 jtk/ml do wymaganej liczby probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
    9. Odwirować probówki o stężeniu 10 000 x g przez 5 minut.
    10. Zawiesić osad bakteryjny w 1 ml sterylnego 5% BSA.
    11. Inkubować probówki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C ze stałym obrotem.
  5. Załącznik wirusa
    1. Pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL-2, dodaj 10 μg VLP HuNoV (patrz Tabela materiałów) do każdej probówki zawierającej bakterie zawieszone w PBS i dokładnie wymieszaj, pipetując.
      UWAGA: Stężenie VLP różni się w zależności od preparatu VLP. W związku z tym objętość dodawana do bakterii będzie się różnić w zależności od partii preparatu i powinna być odpowiednio dostosowana, tak aby 10 μg było dodawane do każdej probówki w eksperymencie. W przypadku kontroli tylko bakterii (np. próbek bez VLP) dodać objętość PBS równą objętości VLP dodanej do próbek eksperymentalnych.
    2. Inkubować probówki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C ze stałą rotacją.
      UWAGA: Podczas inkubacji używany jest rewolwer rurowy (patrz Tabela materiałów) ustawiony na 40 obr./min.
    3. Po inkubacji odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 5 minut.
    4. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny w 1 ml PBS.
    5. Powtórzyć kroki prania 3.5.3 i 3.5.4.
    6. Odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 5 minut.
    7. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad bakteryjny w 150 μl 5% BB.
  6. Barwienie przeciwciałami
    1. Przygotuj świeże 5% BB.
      UWAGA: Wszystkie prace z użyciem przeciwciała znakowanego fluorescencyjnie powinny być wykonywane w ciemności, a przeciwciało, BB i FCSB powinno być trzymane na lodzie.
    2. Rozcieńczyć ludzkie przeciwciało GII przeciwko norowirusowi w stosunku 1:125 dla próbek E. cloacae i 1:150 dla próbek L. gasseri w 5% BB, przygotowując 50 μl rozcieńczonego przeciwciała na próbkę.
    3. Rozcieńczyć przeciwciało izotypu w taki sam sposób, w jaki ludzkie przeciwciało GII norowirusa rozcieńczono dla każdej bakterii w 5% BB, przygotowując 50 μl rozcieńczonej kontroli izotypu na próbkę.
    4. Podzielić każdą próbkę testową z etapu 3.3.7 na trzy podwielokrotności o pojemności 50 μl, przenosząc je do czystych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
    5. Do pierwszego zestawu próbek dodać 50 μl BB. Ten zestaw będzie zawierał niesplamione (Uns) kontrolki.
    6. Do drugiego zestawu dodać 50 μl rozcieńczenia przeciwciała GII. Daje to końcowe stężenie przeciwciał 1:250 dla E. cloacae i 1:300 dla L. gasseri. Ten zestaw próbek będzie zawierał próbki barwione (AB).
    7. Do trzeciego zestawu dodać 50 μl rozcieńczonego przeciwciała izotypowego. Ten zestaw będzie kontrolkami izotypu (IC). Dobrze wymieszać przez pipetowanie. Próbki należy inkubować na lodzie i w ciemności przez 30 minut.
    8. Odwirować wszystkie próbki o masie 10 000 x g przez 5 minut.
    9. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić próbki w 100 μl FCSB.
    10. Odwirować wszystkie próbki o masie 10 000 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić próbki w 100 μl FCSB.
    11. Odwirować wszystkie próbki o masie 10 000 x g przez 5 minut.
    12. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić próbki w 150 μl FCSB.
    13. Przenieść każdą próbkę do probówki FCSB zawierającej 400 μl buforu FCSB o całkowitej objętości 550 μl.
    14. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu ich analizy metodą cytometrii przepływowej.
      UWAGA: Cytometrię przepływową wykonuje się w ciągu 4 godzin od barwienia przeciwciał.

4. Cytometria przepływowa

UWAGA: Ustawienia napięcia opisane poniżej są oparte na cytometrze przepływowym i oprogramowaniu wymienionym w Tabeli Materiałów i prawdopodobnie będą się różnić w zależności od różnych cytometrów przepływowych. Ustawienia powinny być zoptymalizowane dla każdej bakterii. Upewnij się, że osie wszystkich wykresów są w fazie dwuwykładniczej.

  1. Konfigurowanie workspace
    UWAGA: Ustawienia dla wykresów używanych do wyznaczania obszaru roboczego różnią się od tych używanych do bramkowania i analizy danych. Celem skonfigurowania przestrzeni roboczej jest wizualizacja populacji komórek, upewnienie się, że nie ma nadmiernego zlepiania się komórek bakteryjnych, które mogłoby mieć wpływ na dalszą analizę, oraz rozróżnienie komórek barwionych i niebarwionych podczas zbierania danych.
    1. Aby upewnić się, że bakterie nie zlepiają się ze sobą, ustaw serię wykresów gęstości.
      1. Wygeneruj obszar rozproszenia do przodu (FSC-A) w porównaniu z obszarem rozproszenia bocznego (SSC-A), aby zobrazować całkowitą populację.
      2. Skonfiguruj wykresy, aby ocenić pojedyncze komórki w porównaniu z zagęszczeniami komórek, tworząc dwa wykresy, które porównują odpowiednio szerokość rozproszenia do przodu (FSC-W) i szerokość rozproszenia bocznego (SSC-W) do przodu (FSC-H) i wysokość rozproszenia bocznego (SSC-H).
      3. Utwórz wykres, który pokazuje tylko populację z dodatnim wynikiem PE (PE-A vs. SSC-A).
    2. Ustaw napięcie podstawowe na 500 dla E. cloacae i 340 dla L. gasseri. Zostaną one później jeszcze dostosowane.
    3. Ustaw łączną liczbę zdarzeń na 10 000 zdarzeń.
  2. Uruchamianie próbek
    1. Utwórz trzy oddzielne wykresy histogramu, które pokazują liczbę wykreśloną względem SSC-A, FSC-A lub PE-A.
    2. Umieścić niebarwioną próbkę na cytometrze przepływowym i pobrać próbki ze zdarzeniami, upewniając się, że maksymalny pik na histogramie dla SSC-A mieści się w zakresie od 102 do 103, a maksymalny pik na histogramie dla FSC-A mieści się w przedziale od 10 4 do 105 na osi x. Jeśli nie, szczyty nie mieszczą się w określonych zakresach, odpowiednio dostosuj napięcia FSC i SSC.
    3. Umieścić wybarwioną próbkę (AB) na cytometrze przepływowym i wyregulować napięcie PE, aby maksymalny pik przekroczył 10:3 na osi x.
    4. Na podstawie tych pomiarów ustaw dodatnią bramkę PE i ustaw bramkę na wykresie gęstości PE-A w funkcji SSC-A.
    5. Uruchomić wszystkie próbki przy określonych ustawieniach przy niskiej lub średniej prędkości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strategie bramkowania używane do ilościowego określenia wiązania VLP ludzkiego norowirusa z bakteriami komensalnymi są pokazane w Rysunek 1. Reprezentatywna kropka gęstości zawiera przegląd tego, w jaki sposób próbki były bramkowane w celu wyeliminowania resztek komórkowych i grudek komórek, więc przywiązanie VLP określono na populacjach singletów (Rysunek 1A). Reprezentatywne histogramy wykazują niski poziom sygnału przec...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do ilościowego określenia wiązania wirusów jelitowych z bakteriami jest kluczowym pierwszym krokiem do wyjaśnienia mechanizmów, za pomocą których bakterie te zmieniają infekcję wirusową. Metody opisane w niniejszym dokumencie zostały zoptymalizowane do pomiaru interakcji ludzkiego norowirusa VLP zarówno z E. cloacae (bakteria Gram-ujemna), jak i L. gasseri (bakteria Gram-dodatnia), ale mogą być dostosowane do stosowania z dowolnym wirusem ssaków i bakterią będąc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Sutonuce Bhar i Chanel Mosby-Haundrup za ich krytyczną recenzję pisemnego manuskryptu, a także Alfonso Carrillo za pomoc w generowaniu wzorcowych krzywych bakteryjnych. Praca ta jest częściowo finansowana z grantu z Narodowego Instytutu Zdrowia (R21AI140012) oraz z grantu nasiennego z Instytutu Nauk o Żywności i Rolnictwie Uniwersytetu Florydy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5 ml probówki z okrągłym dnem Polystrene z nasadkąCorning352235Po zabarwieniu przeciwciał próbka jest przenoszona do probówek w celu analizy cytometrii przepływowej.
AgarSigmaA7002Używany do przygotowania pożywki
AnaeroPackThermo ScientificR681001Zestaw gazów beztlenowych używany do hodowli Lactobacillus gasseri
Oprogramowanie BD FacsDiva Cytometr
przepływowy LSR Fortessa
Albumina bydlęcaBioreagenty FisherBP1605Używany do cytometrii przepływowej
Bufor barwnikowy do cytometrii przepływowej (FCSB)BD Biosciences554657Używany do cytometrii przepływowej
Mysia kontrola izotypu IgG2b kappa (eBMG2b), PE, eBioscienceThermo Fisher Scientific12473281kontrola izotypu. To przeciwciało jest kupowane w postaci sprzężonej od producenta.
MRS PowderBD Biosciences288130Służy do przygotowania pożywek i hodowli Lactobacillus gasseri.
Norowirus kapsyd G2 Przeciwciało monoklonalne (L34D)Thermo Fisher ScientificMA5-18241Przeciwciało GII norowirusa. Przeciwciało to jest dostępne tylko w postaci niesprzężonej i dlatego musi być fluorescencyjnie sprzężone przed użyciem w opisanych testach cytometrii przepływowej. W tym protokole wybrano PE, jednak inne cząsteczki fluorescencyjne mogą być wybrane tak, jak najlepiej pasują do cytometru przepływowego używanego przez badacza.
Norowirus GII.4 VLPKreatywna biostrukturaCBS-V700cząsteczka podobna do ludzkiego wirusa norowirusowego, VLP zostały wygenerowane przy użyciu systemu bakulowirusa i ponownie zawieszone w buforowanym fosforanami soli fizjologicznej z 10% glicerolem. Autorzy przeprowadzili niezależną analizę śledzenia nanosightu w celu określenia stężenia cząstek w VLP. Stężenie wynosi około 1011 VLP na mililitr. W oparciu o stężenie białka w VLP, w testach przyłączania VLP dodaje się około 200 cząstek na bakterię.
PBS 10XFisher BioreagentsBP665Rozcieńczyć do 1X przed użyciem.
SiteClick R-PE Zestaw do znakowania przeciwciałThermo Fisher ScientificS10467Zestaw do koniugacji służący do oznaczania przeciwciał niesprzężonych.
Chlorek soduFisher ScientificS271Używany do przygotowania pożywki
TryptoneOxoidLP0042Używany do przygotowania pożywki
Rewolwer rurowyThermoFisher Scientific88881001Stosowany w teście przyczepiania wirusa: bakterii. Ustaw maksymalną prędkość (40 obr./min).
Ekstrakt drożdżowyBD Biosciences212750Używany do przygotowania pożywek
sitową

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention. Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).
  2. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
  3. Baldridge, M. T., et al. Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection. Science. 347 (6219), 266-269 (2015).
  4. Lei, S., et al. Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs. Scientific reports. 6, 25017(2016).
  5. Lei, S., et al. High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs. Frontiers in Microbiology. 7, 1699(2016).
  6. Rodríguez-Díaz, J., et al. Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans. Scientific Reports. 7, 45559(2017).
  7. Erickson, A. K., et al. Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination. Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).
  8. Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
  9. Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus. Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).
  10. Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability. PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768(2017).
  11. Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).
  12. Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. PLOS One. 12 (3), (2017).
  13. Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice. Journal of Virology. , (2019).
  14. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
  15. Van Dycke, J., et al. A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae. PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009(2019).
  16. Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress. Frontiers in Microbiology. 6, 659(2015).
  17. Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands. BMC Research Notes. 12 (1), 607(2019).
  18. Debbink, K., et al. Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses. Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).
  19. Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice. Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).
  20. Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions. Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).
  21. Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape. Viruses. 11 (2), (2019).
  22. Prasad, B. V., et al. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 286 (5438), New York, N.Y. 287-290 (1999).
  23. Baric, R. S., et al. Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons. Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).
  24. Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLOS One. 9 (2), 89586(2014).
  25. Tan, M., et al. Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles. Virology. 410 (2), 345-352 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

VLP norowirusawi zanie wirusa z bakteriamistruktury powierzchniowe bakteriibarwienie przeciwcia amirozcie czenia seryjnejednostki tworz ce koloniebakterie Gram ujemne

Powiązane artykuły