Szybkie, bezproblemowe generowanie rekombinowanych pokswirusów przy użyciu zakresu gospodarzy i selekcji wizualnej

Sameera Vipat; Greg Brennan; Chorong Park; Sherry  L. Haller; Stefan Rothenburg

doi:10.3791/61049

Method Article

Szybkie, bezproblemowe generowanie rekombinowanych pokswirusów przy użyciu zakresu gospodarzy i selekcji wizualnej

DOI:

10.3791/61049

⸱

May 24th, 2020

Sameera Vipat*¹ , Greg Brennan*¹ , Chorong Park¹ , Sherry L. Haller² , Stefan Rothenburg¹

¹Department of Medial Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of California Davis, ²Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch at Galveston

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To jest metoda generowania "bezbliznowatych" rekombinowanych wirusów krowianki przy użyciu wyboru zakresu gospodarzy i wizualnej identyfikacji rekombinowanych wirusów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirus krowianki (VACV) odegrał kluczową rolę w wyeliminowaniu wirusa ospy wietrznej (VARV), czynnika wywołującego ospę prawdziwą, z natury. Od czasu pierwszego zastosowania jako szczepionka, VACV został opracowany jako wektor szczepionek terapeutycznych oraz jako wirus onkolityczny. Aplikacje te wykorzystują łatwy do manipulowania genom VACV i szeroki zakres gospodarzy jako wyjątkową platformę do generowania rekombinowanych wirusów o różnorodnych zastosowaniach terapeutycznych. Opracowano kilka metod generowania rekombinowanego VACV, w tym metody selekcji markerów i przejściowej selekcji dominującej. W tym miejscu przedstawiamy udoskonalenie metody wyboru zakresu żywicieli w połączeniu z wizualną identyfikacją rekombinowanych wirusów. Nasza metoda wykorzystuje selektywne ciśnienie generowane przez przeciwwirusową kinazę białkową R gospodarza (PKR) sprzężoną z fluorescencyjnym genem fuzyjnym eksprymującym E3L znakowany mCherry, jednego z dwóch antagonistów VACV PKR. Kaseta, w tym gen będący przedmiotem zainteresowania i fuzja mCherry-E3L, jest otoczona sekwencjami pochodzącymi z genomu VACV. Pomiędzy genem będącym przedmiotem zainteresowania a mCherry-E3L znajduje się mniejszy region, który jest identyczny z pierwszymi ~150 nukleotydami ramienia 3', aby promować rekombinację homologiczną i utratę genu mCherry-E3L po selekcji. Wykazaliśmy, że metoda ta pozwala na wydajne, bezproblemowe wytwarzanie rVACV w różnych typach komórek bez konieczności wyboru leków lub szeroko zakrojonych badań przesiewowych pod kątem zmutowanych wirusów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirus krowianki (VACV) odegrał kluczową rolę w pierwszym udanym wyeliminowaniu ludzkiego patogenu, wirusa ospy wietrznej (VARV), z natury. Od czasu eksterminacji wirusa ospy wietrznej wirusy poksowe, w tym VACV, nadal są użytecznymi wirusami terapeutycznymi zarówno w medycynie ludzkiej, jak i zwierzęcej. Na przykład szczepionka przeciwko wirusowi wścieklizny oparta na wirusie wścieklizny oparta na wirusie VACV okazała się bardzo skuteczna w zapobieganiu przenoszeniu wścieklizny leśnej w Europie¹ i Stanach Zjednoczonych². Ostatnio rekombinowane pokswirusy wykazujące ekspresję różnych cząsteczek przeciwnowotworowych (np. p....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generowanie wektora rekombinacji

Zaprojektuj podkłady do generowania kasety wyboru. Zaprojektuj każdy pojedynczy amplikon z nakładającymi się sekwencjami z sąsiednimi amplikonami i wektorem, aby ułatwić izotermiczne składanie enzymatyczne cząsteczek DNA, zwane również składaniem Gibsona, korzystając z dowolnego z kilku narzędzi do projektowania starterów online.
UWAGA: Protokół ten można również wykonać przy użyciu tradycyjnych metod klonowania opartych na endonukleazie restrykcyjnej. W takim przypadku należy zaprojektować podkłady z odpowiednimi miejscami ograniczeniami, a nie z nakładającymi się sekwencjami.
Korzystając ze starterów z....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyliśmy procedury opisanej w Rysunek 1, aby wygenerować VACV pozbawiony zarówno antagonistów PKR, E3L, jak i K3L, zastępując E3L przez EGFP w wirusie już usuniętym dla K3L (vP872). Rysunek 2 pokazuje czerwone blaszki fluorescencyjne w komórkach RK13 właściwych dla PKR, wskazujące na wirusową ekspresję mCherry-E3L, a także EGFP wyrażoną w komórkach RK13+E3L+K3L, potwierdzające utratę E3L i załamanie się markera selekcyjnego mCherry-E3L. Rysunek 3

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy wariant strategii selekcji markerów przejściowych ³² w celu wygenerowania rekombinowanych wirusów krowianki bez zatrzymywania obcego DNA w końcowym rekombinowanym wirusie. Nasza strategia wykorzystuje selektywne ciśnienie za pośrednictwem białka przeciwwirusowego gospodarza PKR, a nie inne formy selektywnego nacisku, takie jak antybiotyki. Zastosowanie genów przeciwwirusowych gospodarza eliminuje możliwość chemicznie wywołanych zmian fenotypowych w komórkach lub zwiększ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt został sfinansowany przez National Institutes of Health (AI114851) dla SR.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
2X-Q5 Master Mix	NEB	M0492L	Polimeraza o wysokiej wierności stosowana w PCR
Ampicylina	ThermoFisher Scientific	11593027	Bakteryjny środek selektywny
Jednorazowe skrobaki do komórek	ThermoFisher Scientific	08-100-242	Skrobak do komórek
EVOS FL Auto 2 System obrazowania komórek	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	Mikroskop fluorescencyjny
EVOS Light Cube, GFP	ThermoFisher	AMEP4651	GFP Cube
EVOS Light Cube, RFP	ThermoFisher	AMEP4652	RFP Cube
GenJet	SignaGen Laboratories	SL100489	Odczynnik do transfekcji
Luria Bertani (LB) Bulion	Gibco	10855021	Pożywka bakteryjna
Zestaw	do ekstrakcji żelu DNA MonarchNEB	T1020L	Zestaw do oczyszczania żelu służący do oczyszczania amplikonów i wektorów linearyzowanych
Zestaw Monarch Plasmid Miniprep	NEB	T1010L	Zestaw Miniprep przeznaczony do oczyszczania plazmidów
NanoDrop One	ThermoFisher Scientific	ND-ONE-W	Spektrofotometr służący do pomiaru stężenia RNA i DNA
NEBuilder Master Mix	NEB	E2621L	Izotermiczny zestaw montażowy enzymatyczny służący do generowania wektora rekombinacji
Q500 Sonicator Qsonica		Q500-110	Sonikator do lizatów
wirusa Komórki RK13	ATCC	CCL-37	Komórki nerki królika
VWR Multiwell Płytki do hodowli komórkowych	VWR	10062-892	Płytki do hodowli komórkowych

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brochier, B., et al. Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine. Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).
Pastoret, P. P., Brochier, B. The development and ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Szybkie, bezproblemowe generowanie rekombinowanych pokswirusów przy użyciu zakresu gospodarzy i selekcji wizualnej

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles