Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Optymalizacja sekwencjonowania i analizy zdegradowanych próbek FFPE-RNA

11.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61060

⸱

8 czerwca 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1NCI CCR Sequencing Facility, Frederick National Laboratory for Cancer Research, 2Advanced Biomedical and Computational Sciences, Frederick National Laboratory for Cancer Research

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ta metoda opisuje kroki mające na celu poprawę jakości i ilości danych sekwencyjnych, które można uzyskać z próbek RNA zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie. Opisujemy metodologię dokładniejszej oceny jakości próbek FFPE-RNA, przygotowania bibliotek sekwencjonowania i analizy danych z próbek FFPE-RNA.

Streszczenie

Analiza ekspresji genów za pomocą sekwencjonowania RNA (sekwencjonowanie RNA) umożliwia unikalny wgląd w próbki kliniczne, które mogą potencjalnie prowadzić do mechanistycznego zrozumienia podstaw różnych chorób, jak również mechanizmów oporności i/lub podatności. Jednak tkanki FFPE, które stanowią najpowszechniejszą metodę zachowania morfologii tkanek w próbkach klinicznych, nie są najlepszymi źródłami do analizy profilowania ekspresji genów. RNA uzyskane z takich próbek jest często zdegradowane, rozdrobnione i modyfikowane chemicznie, co prowadzi do nieoptymalnych bibliotek sekwencjonowania. To z kolei generuje niskiej jakości dane sekwencyjne, które mogą nie być wiarygodne dla analizy ekspresji genów i odkrywania mutacji. Aby jak najlepiej wykorzystać próbki FFPE i uzyskać jak najlepsze dane z próbek niskiej jakości, ważne jest podjęcie pewnych środków ostrożności podczas planowania projektu eksperymentu, przygotowywania bibliotek sekwencjonowania oraz podczas analizy danych. Obejmuje to stosowanie odpowiednich wskaźników do precyzyjnej kontroli jakości próbki (QC), identyfikowanie najlepszych metod dla różnych etapów podczas generowania biblioteki sekwencjonowania oraz staranną kontrolę jakości biblioteki. Ponadto zastosowanie odpowiednich narzędzi programowych i parametrów do analizy danych sekwencji ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji artefaktów w danych sekwencyjnych RNA, odfiltrowania zanieczyszczeń i niskiej jakości odczytów, oceny jednorodności pokrycia genów i pomiaru odtwarzalności profili ekspresji genów wśród kontrprób biologicznych. Etapy te mogą zapewnić wysoką dokładność i powtarzalność profilowania bardzo niejednorodnych próbek RNA. W tym miejscu opisujemy różne etapy kontroli jakości próbki, przygotowania biblioteki i kontroli jakości, sekwencjonowania i analizy danych, które mogą pomóc w zwiększeniu ilości użytecznych danych uzyskanych z RNA niskiej jakości, takich jak te uzyskane z tkanek FFPE-RNA.

Wprowadzenie

Wykorzystanie metod sekwencjonowania nowej generacji umożliwiło nam zebranie bogactwa informacji z różnych typów próbek. Jednak stare i słabo zachowane próbki pozostają nienadające się do wykorzystania w powszechnie stosowanych metodach generowania danych sekwencyjnych i często wymagają modyfikacji dobrze ugruntowanych protokołów. Tkanki FFPE reprezentują taki typ próbki, który jest szeroko stosowany do próbek klinicznych1,2,3. Podczas gdy zachowanie FFPE utrzymuje morfologię tkanek, kwasy nukleinowe w tkankach FFPE zwykle wykazują szeroki zakres uszkodzeń i degradacji, co utrudnia odzyskanie informacji genomicznych, które mogą prowadzić do ważnych spostrzeżeń na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw różnych zaburzeń.

Dane dotyczące ekspresji genów generowane przez sekwencjonowanie RNA są często pomocne w badaniu mechanizmów choroby i oporności oraz uzupełniają analizę mutacji DNA. Jednak RNA jest bardziej podatne na degradację, co utrudnia generowanie dokładnych danych dotyczących ekspresji genów z tkanek FFPE. Ponadto, ze względu na to, że sekwencjonowanie jest stosunkowo mało dostępne, starsze próbki często nie były przechowywane w warunkach wymaganych do zachowania integralności RNA. Niektóre z problemów związanych z próbkami FFPE obejmują degradację RNA spowodowaną zatopieniem w parafinie, chemiczną modyfikację RNA prowadzącą do fragmentacji lub ogniotrwałości procesów enzymatycznych wymaganych do sekwencjonowania oraz utratę ogonów poli-A, co ogranicza możliwość zastosowania oligo-dT jako startera dla odwrotnej transkryptazy4. Kolejnym wyzwaniem jest obchodzenie się/przechowywanie próbek FFPE w nieoptymalnych warunkach, co może prowadzić do dalszej degradacji labilnych cząsteczek, takich jak RNA w tkankach5. Jest to szczególnie istotne w przypadku starszych próbek, które mogły zostać pobrane w czasie, gdy analiza ekspresji genów za pomocą sekwencjonowania RNA nie była przewidziana dla tych próbek. Wszystko to prowadzi do obniżenia jakości i ilości wyekstrahowanego RNA dostępnego do generowania użytecznych danych sekwencyjnych. Niskie prawdopodobieństwo sukcesu w połączeniu z wysokimi kosztami sekwencjonowania zniechęciło wielu badaczy do prób generowania i analizowania danych dotyczących ekspresji genów z potencjalnie użytecznych próbek FFPE. Niektóre badania przeprowadzone w ostatnich latach wykazały przydatność tkanek FFPE do analizy ekspresji genów2,6,7,8,9, aczkolwiek dla mniejszej liczby i/lub nowszych próbek.

Jako studium wykonalności, użyliśmy RNA wyekstrahowanego z próbek tkanek nowotworowych FFPE z trzech repozytoriów tkanek resztkowych z rejestrów nowotworów nadzoru, epidemiologii i wyników końcowych (SEER) do sekwencjonowania RNA i analizy ekspresji genów10. Pobrane z klinicznych laboratoriów patologicznych tkanki FFPE z surowiczych gruczolakoraków jajników o wysokim stopniu złośliwości przechowywano przez 7–32 lata w różnych warunkach przed ekstrakcją RNA. Ponieważ w większości przypadków bloki te były przechowywane w różnych miejscach przez lata, bez oczekiwania jakiejkolwiek czułej analizy genetycznej w przyszłości, nie podjęto zbyt wielu starań, aby zachować kwasy nukleinowe. W związku z tym większość próbek wykazywała RNA złej jakości, przy czym duża część próbek była zanieczyszczona bakteriami. Niemniej jednak byliśmy w stanie przeprowadzić kwantyfikację genów, zmierzyć jednorodność i ciągłość pokrycia genów oraz przeprowadzić analizę korelacji Pearsona między powtórzeniami biologicznymi w celu zmierzenia odtwarzalności. Opierając się na zestawie kluczowych sygnatur panelu genów, porównaliśmy próbki w naszym badaniu z danymi The Cancer Genome Atlas (TCGA) i potwierdziliśmy, że około 60% próbek miało porównywalne profile ekspresji genów11. Opierając się na korelacji między różnymi wynikami kontroli jakości a metadanymi próbki, zidentyfikowaliśmy kluczowe wskaźniki kontroli jakości, które mają dobrą wartość predykcyjną do identyfikacji próbek, które z większym prawdopodobieństwem wygenerują użyteczne dane sekwencji11.

Tutaj opisujemy metodologię używaną do oceny jakości FFPE-RNA, generowania bibliotek sekwencjonowania zaczynając od pobranych próbek RNA oraz bioinformatycznej analizy danych sekwencjonowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ocena ilości i jakości RNA

  1. Pobrać próbki FFPE zgodnie z wcześniej zdefiniowanymi kryteriami i wyekstrahować RNA przy użyciu odpowiedniej metody (np. zestaw do ekstrakcji kwasami jądrowymi FFPE, tabela materiałów).
    UWAGA: Dostępnych jest kilka różnych metod ekstrakcji FFPE-RNA, w tym nowsze metody mikrodysekcji, które mogą działać z bardzo małą ilością tkanki i ekstrahować dobrej jakości RNA12,13,14.
  2. Należy dołożyć wszelkich starań, aby zachować integralność RNA na wszystkich etapach. Obejmuje to pracę z wodą dejonizowaną wolną od RNazy, używanie plastikowych naczyń wolnych od RNaz oraz czyszczenie wszystkich instrumentów, które mają kontakt z blokami FFPE, za pomocą odczynników do odkażania RNazy.
  3. Z RNA należy zawsze obchodzić się ostrożnie i przechowywać je w lodzie, chyba że określono inaczej, aby zminimalizować degradację podczas obchodzenia się z RNA.
  4. Jeśli dostępna jest wystarczająca ilość materiału, wyekstrahuj RNA z więcej niż jednego regionu w bloku FFPE, aby wygenerować kontrpróby biologiczne z jak największej liczby próbek. W przypadku niektórych próbek o dużej wydajności RNA należy podzielić wyekstrahowany RNA na dwie części, aby przetworzyć je jako kontrpróby techniczne.
  5. Jeśli to możliwe, należy pobrać niewielką ilość próbki oddzielnie po ekstrakcji w celu zapewnienia jakości (tj. podwielokrotności kontroli jakości), aby uniknąć powtarzających się procesów przenoszenia i zamrażania i rozmrażania próbki, które prawdopodobnie doprowadzą do degradacji RNA.
  6. Sprawdź jakość RNA (najlepiej z podwielokrotności QC), uruchamiając go w systemie kontroli jakości RNA (np. systemie Agilent Bioanalyzer wykorzystującym chip RNA Nano, Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Analizuj rozkład fragmentów RNA w próbkach (np. za pomocą oprogramowania Bioanalyzer 2100 Expert), obliczając wartości DV200 i DV100 jako procent fragmentów o wielkości większej niż 200 nt (DV200) lub 100 nt (DV100).
  8. Wśród DV200 i DV100 zidentyfikuj metrykę, która ma większy rozpiętość wartości dla danego zestawu próbek, i wybierz ją do grupowania próbek według ich stopnia nienaruszoności.
    UWAGA: W przypadku zestawów próbek z większą liczbą nienaruszonych cząsteczek RNA (tj. Wysokie wartości DV200, wszystkie lub większość z DV200 > 40%), DV200 prawdopodobnie będzie przydatną metryką QC. Jednak w przypadku zestawów próbek z bardziej zdegradowanymi transkryptami (tj. niskimi wartościami DV200, wszystkie lub większość z DV200 < 40%), DV100 jest bardziej prawdopodobne, że będzie przydatny.
  9. Na podstawie wskaźników kontroli jakości zidentyfikuj próbki, które mają DV100 < 40%. Ze względu na to, że istnieje duże prawdopodobieństwo, że ten stopień degradacji nie wygeneruje użytecznych danych sekwencjonowania11, zaleca się unikanie przetwarzania takich próbek. Jeśli dostępne są zamienniki takich próbek, należy sprawdzić ich jakość, aby w idealnym przypadku uwzględnić tylko próbki o DV100 > 50%.

2. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania

  1. Na podstawie jakości próbek ocenionej w sekcji 1 należy określić odpowiednią metodę generowania bibliotek sekwencjonowania.
    1. W przypadku zestawów próbek o bardzo niskiej degradacji i wysokich wartościach DV200 należy zastosować sekwencjonowanie mRNA (tj. wychwytywanie poliadenylowanych transkryptów), ukierunkowane sekwencjonowanie RNA (tj. użycie sond wychwytujących dla określonych genów będących przedmiotem zainteresowania), sekwencjonowanie egzomu RNA (tj. użycie sond wychwytujących w celu wzbogacenia transkryptomu kodującego) lub sekwencjonowanie całkowitego RNA (tj. użycie losowych starterów do odwrotnej transkrypcji w celu zsekwencjonowania całej populacji RNA po usunięciu rybosomalnego RNA z próbek). Należy jednak pamiętać, że proces utrwalania może wprowadzać stronniczość w wyekstrahowanym RNA. W związku z tym metody przechwytywania mogą nie działać dobrze we wszystkich przypadkach, nawet przy wysokich wartościach DV200.
    2. Jeśli zestaw próbek zawiera próbki o wysokiej degradacji (DV200 < 30%), należy użyć metody przygotowania całej biblioteki RNA, a nie takiej, która zależy od wychwycenia określonych regionów transkryptów, ponieważ tych konkretnych regionów może brakować w próbkach zdegradowanych. Zastosowanie losowych starterów do generowania cDNA prowadzi do wyższej reprezentacji użytecznego RNA w bibliotece końcowej, a zatem jest bardziej odpowiednie dla próbek FFPE-RNA.
    3. W przypadku zubożenia rybosomalnego RNA dla zestawów próbek o wysokiej degradacji należy zastosować metody oparte na RNazieH. Są to metody, w których sondy DNA specyficzne dla rRNA wiążą się z rRNA, dwuniciowe cząsteczki są trawione przez RNazę, a pozostałe sondy są czyszczone przez DNazę (np. Zestaw do zubożania rRNA NEBNext, tabela materiałów). Te metody działają lepiej w przypadku zdegradowanych próbek niż niektóre inne metody8.
  2. Do generowania bibliotek sekwencjonowania należy używać większych ilości wejściowych (jeśli to możliwe) dla próbek, które mają bardziej zdegradowane RNA (DV100 < 60%). Podczas gdy próbki z dość dobrej jakości RNA (DV100 > 60%) mogą dawać dobre dane sekwencyjne nawet przy niższych ilościach wejściowych (najniższa testowana dla tego protokołu z FFPE-RNA wynosiła ~20 ng), dla bardziej zdegradowanego RNA (DV100 < 60%) lepiej jest zacząć od wyższych ilości wejściowych (np. >100 ng).
    UWAGA: Jeśli dostępna jest wystarczająca ilość próbki (np. >500 ng), zaleca się zachowanie co najmniej połowy próbki do powtórzenia przygotowania biblioteki, jeśli zajdzie taka potrzeba. W przypadku próbek o niskim wkładzie (np. <100 ng) zwykle lepiej jest wykorzystać całą ilość i wygenerować bibliotekę o wystarczającej różnorodności.
  3. Po wybraniu odpowiedniego zestawu do przygotowania biblioteki do generowania całkowitych bibliotek sekwencyjnych RNA z próbek o wysokiej degradacji (np. NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina, patrz Tabela materiałów), postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby wygenerować biblioteki.
    UWAGA: Podczas przygotowywania biblioteki ważne jest, aby pominąć etap fragmentacji RNA dla próbek zdegradowanych i zapewnić użycie losowych starterów do syntezy pierwszej nici cDNA.
  4. W celu poprawy wydajności i szybkości, szczególnie w przypadku próbek o niskim wkładzie wejściowym, należy użyć odpowiednich stojaków magnetycznych z silnymi magnesami stałymi do etapów oczyszczania i wyboru wielkości na podstawie kulek (patrz Tabela materiałów).
  5. W przypadku wzbogacania PCR w zligowane DNA adapterowe, dostosuj liczbę cykli amplifikacji w oparciu o ilość wejściowego DNA, aby zapewnić maksymalną reprezentację, unikając jednocześnie niepotrzebnej duplikacji cząsteczek z biblioteki. W przypadku próbek FFPE-RNA o niskim wejściu (<100 ng) zalecamy 16–18 cykli amplifikacji, podczas gdy próbki o wysokiej mocy wejściowej (1,000 ng) zwykle generują wystarczającą ilość bibliotek w 12–14 rundach amplifikacji.
  6. Po amplifikacji i oczyszczeniu PCR zgodnie z instrukcjami producenta, oceń jakość biblioteki, analizując stężenie biblioteki i rozkład cząsteczek na odpowiedniej platformie (np. Agilent Bioanalyzer DNA Chip, patrz Tabela materiałów). W przypadku próbek z pikami startera (~80 pz) lub pikami dimerów adapterowych (~128 pz) powtórz czyszczenie, aby usunąć te piki.
  7. Oblicz średni rozmiar biblioteki dla każdej biblioteki (np. za pomocą oprogramowania Bioanalyzer 2100 Expert).

3. Biblioteka sekwencjonowania QC

  1. Po upewnieniu się, że biblioteki są wolne od nadmiaru starterów i adapterów-dimerów oraz mają wystarczające stężenie do późniejszego sekwencjonowania, należy dalej określić ilościowo za pomocą qPCR.
    UWAGA: Ze względu na wrażliwość generowania klastrów na stężenie w bibliotece, dokładna kwantyfikacja jest niezbędna, aby zapobiec kosztownym przebiegom sekwencjonowania spowodowanym niską wydajnością lub przeciążeniem. Ilościowe metody PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) są przydatne do poprawy gęstości klastrów na platformach Illumina bez powodowania nadmiernego grupowania. Metoda qPCR jest bardziej precyzyjna i bardziej czuła niż metody oparte na analizie jakościowej i/lub ilościowej wszystkich cząsteczek bibliotecznych (np. Agilent Bioanalyzer), ponieważ mierzy matryce, które mają obie sekwencje adapterów na obu końcach, które utworzą klastry na komórce przepływowej. Rozmiar biblioteki musi być jednak znany z wyprzedzeniem, ponieważ do wszystkich próbek należy zastosować poprawkę rozmiaru, aby wyniki można było porównać z krzywą standardową.
    UWAGA: Podczas wykonywania qPCR należy zawsze nosić fartuchy i rękawice laboratoryjne, a procedurę należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Ustawić 96-dołkową płytkę z trzema powtórzeniami dla każdej próbki w celu zapobiegania błędom przy użyciu odpowiedniego zestawu (np. KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix dla bibliotek Illumina, część zestawu do kwantyfikacji biblioteki, patrz tabela materiałów), wraz z wzorcami, kontrolą pozytywną (np. kontrola PhiX, patrz tabela materiałów) i kontrolkę bez szablonu (NTC). NTC to mieszanina qPCR bez biblioteki DNA. Kontrolą pozytywną może być dowolna biblioteka o znanym stężeniu i wielkości fragmentu.
      1. Przygotuj co najmniej sześć rozcieńczeń wzorców zgodnie z protokołem dostawcy.
    2. Po dodaniu wszystkich składników (tj. głównej mieszanki qPCR, bibliotek, wzorców) przykryj płytkę folią uszczelniającą i użyj ściągaczki, aby upewnić się, że folia ma równy i bezpieczny kontakt z płytką.
    3. Wirować i obracać płytkę z prędkością 1,500 obr./min przez co najmniej 1 minutę. Sprawdź wzrokowo płytę, aby upewnić się, że na dnie studzienek nie ma pęcherzyków powietrza.
    4. Ustaw płytkę na termocyklerze (np. CFX96 Touch System, patrz Tabela materiałów) zgodnie z ustawieniami zalecanymi przez producenta.
    5. Zapisz folder uruchamiania, do którego można uzyskać dostęp w celu analizy danych.
    6. Podczas analizy danych należy sprawdzić, czy nachylenie mieści się w zakresie od -3,1 do -3,6, sprawność od 90% do 110%, a R2 (współczynnik korelacji uzyskany dla krzywej standardowej) nie mniejszy niż 0,98.
  2. Pooling: Po uzyskaniu stężenia qPCR w bibliotekach gotowych do sekwencjonowania, należy zgrupować równomolowe ilości każdej z bibliotek, w zależności od liczby odczytów sekwencjonowania wymaganych na próbkę i wyniku sekwencjonowania urządzenia.
  3. Kontrola jakości pul: Ponownie określ ilościowo pule bibliotek za pomocą qPCR zgodnie z tym samym protokołem, jak opisano w kroku 3.1.

4. Sekwencjonowanie

  1. W zależności od parametrów pracy wyciągnij zestawy odczynników do sekwencjonowania i rozmroź je zgodnie z instrukcją obsługi. Sprawdź stronę internetową Illumina, aby uzyskać najnowsze wersje wszystkich podręczników użytkownika dotyczących sekwencjonowania na instrumentach Illumina.
  2. Upewnij się, że odczynniki są całkowicie rozmrożone i umieść tackę na odczynniki w temperaturze 4 °C. Przebieg należy rozpocząć nie później niż 2 godziny po rozmrożeniu odczynników. Niezastosowanie się do tego może wpłynąć na jakość wyników biegu.
  3. Odwróć wkład 5x, aby wymieszać odczynniki i delikatnie postukaj w ławkę, aby zredukować pęcherzyki powietrza.
  4. Odstawić nieopakowane opakowanie komory przepływowej w temperaturze pokojowej na 30 minut.
  5. Rozwiń opakowanie kuwety przepływowej i wyczyść szklaną powierzchnię komory przepływowej niestrzępiącą się chusteczką nasączoną alkoholem. Osusz szklankę chusteczką laboratoryjną o niskiej zawartości kłaczków.
  6. Otwórz aplikację Illumina "Experiment Manager". Wybierz "Utwórz arkusz próbny", a następnie wybierz sekwencer i kliknij "Dalej".
  7. Utwórz i prześlij przykładowy arkusz w oparciu o kryteria sekwencera Illumina (np. Illumina Experiment Manager, przewodnik po oprogramowaniu).
  8. Po wyświetleniu monitów zeskanuj kod kreskowy zestawu odczynników i wprowadź parametry konfiguracji przebiegu (np. dla pojedynczego cyklu indeksowanego PE 75 wprowadź 76-8-76).
  9. Dedenaturację i rozcieńczyć pulę biblioteczną w oparciu o zalecenia instrukcji obsługi sekwencera (np. przewodnik po systemie NextSeq 500 firmy Illumina, patrz Tabela materiałów).
  10. Dedenaturować i rozcieńczyć bibliotekę kontrolną PhiX (patrz tabela materiałów) do odpowiedniego stężenia (np. 1,8 pM dla NextSeq).
  11. Wymieszaj bibliotekę próbek i kontrolę PhiX, aby uzyskać 1% współczynnik głośności kontrolki PhiX.
  12. Załadować zdenaturowaną i rozcieńczoną próbkę do wkładu z odczynnikiem w przeznaczonym do tego zbiorniku.
  13. Załaduj komorę flowcell, kasetę buforową i kasetę z odczynnikiem.
  14. Wykonaj automatyczne sprawdzanie i przeglądanie, aby upewnić się, że parametry uruchamiania pomyślnie przeszły kontrolę systemu.
  15. Po zakończeniu automatycznego sprawdzania wybierz pozycję Uruchom, aby rozpocząć sekwencjonowanie.

5. Analiza danych i ocena jakości

UWAGA: Typowy przepływ pracy analizy danych sekwencyjnych RNA (Rysunek 1) obejmuje wstępne przetwarzanie i kontrolę jakości, dostosowanie do genomu i kontrolę jakości po dopasowaniu, kwantyfikację genów i transkryptów, analizę korelacji próbek, analizę różnicową między różnymi grupami próbek, warunki leczenia oraz wzbogacanie zestawu genów i analizę szlaków.

Dane sekwencyjne RNA mogą mieć problemy z jakością, które mogą wpływać na dokładność profilowania genów i prowadzić do błędnych wniosków. Dlatego bardzo ważne są wstępne kontrole jakości sekwencjonowania, zanieczyszczenia, odchylenia pokrycia sekwencjonowania i innych źródeł artefaktów. Stosowanie potoku kontroli jakości RNA-Seq podobnego do opisanego tutaj przepływu pracy jest zalecane w celu wykrycia artefaktów i zastosowania filtrowania lub korekcji przed dalszą analizą.

  1. Przetwarzanie wstępne
    UWAGA: Obejmuje to demultipleksowanie, ocenę jakości odczytu sekwencji, zawartość GC, obecność adapterów sekwencjonowania, nadreprezentowane k-mery i zduplikowane odczyty PCR. Informacje te pomagają w wykrywaniu błędów sekwencjonowania, artefaktów PCR lub zanieczyszczeń.
    1. Sekwencjonowanie Demultiplex Illumina przebiega przy użyciu narzędzia programowego Illumina bcl2fastq2 w celu wygenerowania surowych plików FASTQ dla każdej próbki zdefiniowanej w arkuszu próbki. Zezwalaj na jedną niezgodność w kodach kreskowych indeksu próbki, aby tolerować błędy sekwencjonowania, jeśli nie ma kolizji kodów kreskowych.
    2. Uruchom narzędzie programowe FASTQC15, aby przeprowadzić kontrolę jakości surowych plików FASTQ w celu wykrycia niskiej jakości lub nieprawidłowości w odczytach sekwencjonowania.
    3. W przypadku przycinania adapterów i podstaw niskiej jakości, przytnij adaptery sekwencjonowania i podstawy niskiej jakości za pomocą narzędzi programowych Cutadapt16 lub Trimmomatic17. Zapisz przycięte odczyty w plikach fastq na końcu pary.
    4. Ekran zanieczyszczeń
      1. Uruchom FASTQ_screen18, aby wykryć możliwe zanieczyszczenie krzyżowe z innymi gatunkami.
      2. Uruchom miniKraken of Kraken219, aby zidentyfikować taksonomie gatunków zanieczyszczających.
  2. Dopasowanie do genomu referencyjnego i kontrola jakości po wyrównaniu
    1. Przycięte odczyty można wyrównać do referencyjnej sekwencji genomu (GRCh Build hg19 lub hg38) za pomocą STAR aligner20. Zastosuj plik GTF adnotacji Gencode, aby poprowadzić wyrównanie splotu transkrypcji. Zaleca się uruchomienie STAR 2-przebiegowego w celu zwiększenia czułości na nowe złącza spawów. W drugim przebiegu wszystkie odczyty zostaną ponownie zmapowane przy użyciu adnotowanych genów i transkryptów oraz nowych połączeń z pierwszego przejścia.
    2. Wykonaj kontrolę jakości po wyrównaniu.
      1. Uruchom klasę Picard's21 MarkDuplicates, aby ocenić złożoność biblioteki, określając liczbę unikalnych lub niezduplikowanych odczytów w próbkach.
      2. Uruchom program Picard's CollectRnaSeqMetrics, aby zebrać procenty mapowania regionów kodowania, intronicznych, międzygenowych, UTR i pokrycia ciała genu.
      3. Uruchom RSeQC22, aby określić wewnętrzną odległość pary odczytu, rozkład odczytu między eksonami CDS, 5'UTR, 3'UTR, intron, TSS_up_1kb, TSS_up_5kb, TSS_up_10kb, TES_down_1kb, TES_down_5kb, TES_down_10kb, odczytać zawartość GC, nasycenie złącza i informacje o nici bibliotecznej.
      4. Uruchom multi-QC23, aby wygenerować zagregowany raport w formacie HTML.
  3. Kwantyfikacja genów i analiza korekcyjna
    1. Uruchom RSEM24, aby uzyskać surową liczbę, a także znormalizowaną liczbę odczytów genów i transkryptów. Najczęściej zgłaszanymi wartościami ekspresji genów RNA-seq są pomiary liczby odczytów, takie jak RPKM (odczyty na kilobazę modelu eksonu na milion odczytów), FPKM (fragmenty na kilobazę modelu eksonu na milion zmapowanych odczytów) i TPM (transkrypty na milion). Geny wyrażone poniżej progu szumowego (takiego jak TPM < 1 lub liczba surowa <5) mogą być filtrowane.
    2. Wykonaj kwantyfikację transkrypcji, aby zagregować nieprzetworzone liczby odczytów zmapowanych na każdą sekwencję transkryptu przy użyciu programów, takich jak HTSeq-count lub featureCounts.
    3. Uruchom analizę głównych składowych (PCA) przy użyciu skryptu języka R, aby określić efekty partii i ocenić mapę jakości danego zestawu danych25. Przykładową analizę korelacji można przeprowadzić przy użyciu korelacji Pearsona między różnymi metrykami.
  4. Różnicowa analiza ekspresji genów
    1. Wykonaj analizę różnicową genów między warunkami próbki za pomocą programu edgeR26,27 i/lub limma-Voom28 i użyj metod normalizacji, w tym TPM, TMM, DESeq lub UpperQuartile.
    2. Zaleca się uruchomienie co najmniej dwóch narzędzi programowych do analizy różnicowej w celu wywołania dwóch zestawów list stopni w celu porównania i uzyskania końcowych wskaźników w celu poprawy czułości i dokładności wykrywania.
  5. Wzbogacanie zestawu genów i analiza szlaków
    1. Wykonaj analizę wzbogacenia zestawu genów (GSEA)29,30 na podstawie rankingu transkryptów zgodnie z listą pomiarów genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG), aby określić, czy DEG wykazują statystycznie istotne, zgodne różnice między warunkami biologicznymi.
    2. Wykonuj analizę funkcji, korzystając z zasobów, takich jak Gene Ontology31, DAVID32,33 lub innych dostępnych narzędzi programowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisaną powyżej metodologię zastosowano do 67 próbek FFPE, które były przechowywane w różnych warunkach przez okres od 7 do 32 lat (mediana czasu przechowywania próbek wynosiła 17,5 roku). Zbiór danych oraz wyniki analiz przedstawione w niniejszym opracowaniu zostały wcześniej opisane i opublikowane w pracy Zhao et al.11. Podczas weryfikacji jakości próbek zgodnie z wcześniejszym opisem (np. przykładowe przebiegi na Rysunku 2), stwierdzono, że parametr DV100

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda przedstawia główne kroki wymagane do uzyskania dobrych danych sekwencyjnych z próbek FFPE-RNA. Główne punkty, które należy wziąć pod uwagę przy tej metodzie, to: (1) Upewnij się, że RNA jest jak najlepiej zachowane po ekstrakcji, minimalizując obchodzenie się z próbką oraz cykle zamrażania i rozmrażania. Oddzielne podwielokrotności kontroli jakości są bardzo pomocne. (2) Użyj metryki QC, która jest najlepsza dla danego zestawu próbek. Wartości RIN i DV200 często nie są przydatne dla próbek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Praca ta została sfinansowana przez National Cancer Institute (NCI), National Institutes of Health (NIH). Leidos Biomedical Research, Inc. jest wykonawcą operacji i wsparcia technicznego dla Frederick National Laboratory for Cancer Research, które jest w pełni finansowane przez NIH. Kilku autorów (YZ, MM, KT, YL, JS, BT) jest powiązanych z Leidos Biomedical Research, Inc., ale wszyscy autorzy są w pełni finansowani przez National Cancer Institute, w tym wynagrodzenia autorów i materiały badawcze. Firma Leidos Biomedical Research, Inc. nie zapewniła wynagrodzenia dla autorów (YZ, MM, KT, YL, JS, BT) ani materiałów do badania, ani nie odegrała żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu danych, analizie, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni dr Danielle Carrick (Division of Cancer Control and Population Sciences, National Cancer Institute) za nieustającą pomoc, szczególnie za rozpoczęcie tego badania, dostarczenie nam próbek i za pomocne sugestie podczas analizy danych. Serdecznie dziękujemy wszystkim członkom Zakładu Sekwencjonowania CCR w Frederick National Laboratory for Cancer Research za ich pomoc podczas przygotowywania i sekwencjonowania próbek, w szczególności Brendzie Ho za pomoc w kontroli jakości próbek, Oksanie German za kontrolę jakości biblioteki, Tatyanie Smirnovej za uruchomienie sekwencerów. Chcielibyśmy również podziękować Tsai-wei Shen i Ashley Walton z Sequencing Facility Bioinformatics Group za pomoc w analizie danych i wdrożeniu potoku sekwencyjnego RNA. Dziękujemy również CCBR i NCBR za pomoc w opracowaniu procesu analizy RNaseq i najlepszych praktyk.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2100 BioanalizatorAgilentG2939BA
Zestaw Agilent DNA 7500Agilent5067-1506
Zestaw Agilent DNA o wysokiej czułościAgilent5067-4626
Zestaw Agilent RNA 6000 Nano ZestawAgilent5067-1511
AllPrep DNA/RNA FFPE System
CFX96Zestaw
v2-IlluminaKapaBiosystemsKK4824
NEBNext Ultra II Zestaw do przygotowania biblioteki kierunkowego RNA dla IlluminaNew England BiolabsE7765Shttps://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit
NEBNext zestaw do depletion rRNA (człowiek/mysz/szczur)Nowa Anglia System sekwencjonowania BiolabsE6310L
NextSeq 500IlluminaSY-415-1001Przewodnik po systemie NextSeq 500: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf
Zestaw kontrolny NextSeq PhiXIlluminaFC-110-3002
NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS)Illumina
10X Genomics Separator magnetyczny10X Genomics120250
Multimixer rotatorVWR13916-822
C1000 Dotykowy termocyklerBio-Rad1851197
Zestaw odczynników do sekwencjonowaniaIllumina20024907
Pakiet komórekprzepływowych Illumina20024907
Kartridż buforowy i wkład z odczynnikiemIllumina20024907
Roztwór wodorotlenku sodu (0,2N)Millipore SigmaSX0607D-6
TRIS-HCL Bufor 1,0M, pH 7,0Fisher Scientific50-151-871
dotykowy Qiagen 80234 do kwantyfikacji biblioteki Bio-Rad 1855195 20024907

Bibliografia

  1. Carrick, D. M., et al. Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue. PLoS One. 10 (7), 0127353(2015).
  2. Hedegaard, J., et al. Next-generation sequencing of RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer and normal tissue. PLoS One. 9 (5), 98187(2014).
  3. Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies. International Journal of Genomics. 2017, 1926304(2017).
  4. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  5. von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. Determinants of RNA quality from FFPE samples. PLoS One. 2 (12), 1261(2007).
  6. Esteve-Codina, A., et al. A Comparison of RNA-Seq Results from Paired Formalin-Fixed Paraffin-Embedded and Fresh-Frozen Glioblastoma Tissue Samples. PLoS One. 12 (1), 0170632(2017).
  7. Vukmirovic, M., et al. Identification and validation of differentially expressed transcripts by RNA-sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) lung tissue from patients with Idiopathic Pulmonary Fibrosis. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 15(2017).
  8. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
  9. Sinicropi, D., et al. Whole transcriptome RNA-Seq analysis of breast cancer recurrence risk using formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue. PLoS One. 7 (7), 40092(2012).
  10. Altekruse, S. F., et al. SEER cancer registry biospecimen research: yesterday and tomorrow. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 23 (12), 2681-2687 (2014).
  11. Zhao, Y., et al. Robustness of RNA sequencing on older formalin-fixed paraffin-embedded tissue from high-grade ovarian serous adenocarcinomas. PLoS One. 14 (5), 0216050(2019).
  12. Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22(2017).
  13. Amini, P., Nassiri, S., Ettlin, J., Malbon, A., Markkanen, E. Next-generation RNA sequencing of FFPE subsections reveals highly conserved stromal reprogramming between canine and human mammary carcinoma. Disease Models and Mechanisms. 12 (8), (2019).
  14. Wimmer, I., et al. Systematic evaluation of RNA quality, microarray data reliability and pathway analysis in fresh, fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples. Scientific Reports. 8 (1), 6351(2018).
  15. Babraham Bioinformatics. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2019).
  16. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  17. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  18. Babraham Bioinformatics. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/ (2019).
  19. Wood, D. E., Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology. 15 (3), 46(2014).
  20. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  21. Broad Institute. , Available from: http://broadinstitute.github.io/picard/ (2019).
  22. Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).
  23. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Kaller, M. MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
  24. Li, B., Dewey, C. N. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323(2011).
  25. Son, K., Yu, S., Shin, W., Han, K., Kang, K. A Simple Guideline to Assess the Characteristics of RNA-Seq Data. BioMed Research International. 2018, 2906292(2018).
  26. McCarthy, D. J., Chen, Y., Smyth, G. K. Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4288-4297 (2012).
  27. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  28. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), 47(2015).
  29. Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 102 (43), 15545-15550 (2005).
  30. Mootha, V. K., et al. PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes. Nature Genetics. 34 (3), 267-273 (2003).
  31. Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).
  32. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).
  33. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).
  34. Evaluating RNA Quality from FFPE Samples. Illumina. , Available from: https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sekwencjonowanie RNAkontrola jako ci pr bekprzygotowanie bibliotekianaliza danychanaliza g wnych sk adowychprzesiewanie FastQCdopasowanie STARstatystyki RSeQCraport Multi QC
Optymalizacja sekwencjonowania i analizy zdegradowanych próbek FFPE-RNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.