Prezentowany jest tutaj protokół testu chemotaksji in situ, niedawno opracowanego urządzenia mikroprzepływowego, które umożliwia badanie zachowania mikroorganizmów bezpośrednio w środowisku.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test chemotaksji in situ w celu zbadania zachowania mikroorganizmów w ekosystemach wodnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zachowania mikrobiologiczne, takie jak ruchliwość i chemotaksja (zdolność komórki do zmiany swojego ruchu w odpowiedzi na gradient chemiczny), są szeroko rozpowszechnione w domenach bakteryjnych i archeonowych. Chemotaksja może przynieść znaczne korzyści w pozyskiwaniu zasobów w środowiskach heterogenicznych. Odgrywa również kluczową rolę w interakcjach symbiotycznych, chorobach i procesach globalnych, takich jak cykle biogeochemiczne. Jednak obecne techniki ograniczają badania chemotaksji do laboratorium i nie są łatwe do zastosowania w tej dziedzinie. Przedstawiono tutaj protokół krok po kroku dotyczący wdrożenia testu chemotaksji in situ (ISCA), urządzenia, które umożliwia rzetelne badanie chemotaksji mikrobiologicznej bezpośrednio w środowisku naturalnym. ISCA jest urządzeniem mikroprzepływowym składającym się z 20-dołkowego układu, do którego można załadować interesujące go substancje chemiczne. Po umieszczeniu w środowisku wodnym chemikalia dyfundują ze studni, tworząc gradienty stężeń, które mikroorganizmy wyczuwają i reagują, wpływając do studni za pośrednictwem chemotaksji. Zawartość studzienki można następnie pobrać i wykorzystać do (1) ilościowego określenia siły odpowiedzi chemotaktycznych na określone związki za pomocą cytometrii przepływowej, (2) wyizolowania i hodowli mikroorganizmów reagujących oraz (3) scharakteryzowania tożsamości i potencjału genomowego odpowiadających populacji za pomocą technik molekularnych. ISCA to elastyczna platforma, którą można wdrożyć w dowolnym systemie z fazą wodną, w tym w środowisku morskim, słodkowodnym i glebowym.
Wprowadzenie
Różnorodne mikroorganizmy wykorzystują ruchliwość i chemotaksję, aby wykorzystać niejednolite środowiska odżywcze, znaleźć gospodarzy lub uniknąć szkodliwych warunków1,2,3. Te zachowania mikrobiologiczne mogą z kolei wpływać na tempo przemian chemicznych4 i promować symbiotyczne partnerstwa między ekosystemami lądowymi, słodkowodnymi i morskimi2,5.
Chemotaxis była intensywnie badana w warunkach laboratoryjnych przez ostatnie 60 lat6. Pierwsza ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Zalecamy wykonanie sekcji 1 przed eksperymentami terenowymi, aby zoptymalizować wyniki.
1. Optymalizacja laboratorium
UWAGA: Objętości opisane w procedurze optymalizacji są wystarczające dla pojedynczego ISCA (składającego się z 20 odwiertów).
- Przygotowanie substancji chemicznej będącej przedmiotem zainteresowania
UWAGA: Optymalne stężenie dla każdego chemoatraktantu często musi być określone w warunkach laboratoryjnych przed wdrożeniem w terenie. Pole koncentracji chemicznej będzie zmniejszać się wraz z odległością od źródła (odwiert ISCA), co oznacza, że stężenie doświadczane przez mikroorgan....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W tej sekcji przedstawiono wyniki badań laboratoryjnych wykorzystujących ISCA do badania odpowiedzi chemicznej morskich mikroorganizmów na zakres stężeń glutaminy, aminokwasu znanego z przyciągania bakterii glebowych14. Stężenie glutaminy, które wywołało najsilniejszą odpowiedź chemiczną w testach laboratoryjnych, użyto do przeprowadzenia testu chemotaksji w środowisku morskim.
Aby przeprowadzić badania laboratoryjne, społeczności morskie pobrane z wód przybrzeżnych w S.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W skali mikroorganizmów wodnych środowisko jest dalekie od jednorodności i często charakteryzuje się gradientami fizykochemicznymi, które strukturyzują zbiorowiska drobnoustrojów 1,15. Zdolność ruchliwych mikroorganizmów do wykorzystywania zachowania (tj. chemotaksji) ułatwia żerowanie w tych heterogenicznych mikrośrodowiskach1. Badanie chemotaksji bezpośrednio w środowisku może potencjalnie zidentyfikować ważne interakcje międzygatunkowe .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
To badanie zostało częściowo sfinansowane przez Inicjatywę Mikrobiologii Morskiej Fundacji Gordona i Betty Moore, poprzez GBMF3801 grantów dla J.R.S. i R.S., oraz Investigator Award (GBMF3783) dla R.S., a także Stypendium Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych (DE160100636) dla J.B.R., nagrodę od Fundacji Simons dla B.S.L. (594111) oraz grant od Fundacji Simonsa (542395) dla R.S. w ramach Principles of Microbial Ecosystems (PriME) Collaborative.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Klej akrylowy | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Arkusz akrylowy | McMaster-Carr | 8505K725 | Lub inna firma |
| Taśma klejąca | Scotch | 3M 810 | Scotch Magiczna taśma |
| Autoklaw | Systec | D-200 | Lub inna firma |
| Wirówka stołowa | Fisher Scientific | 75002451 | Lub inna firma |
| Linka bungee | Paracord Planet | 667569184000 | Lub innej firmy |
| Probówka wirówkowa - 2 ml | Probówka Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf |
| Stożkowa probówka wirówkowa - 15 ml | Fisher Scientific 11507411 | Probówka Falcon | |
| Stożkowa probówka wirówkowa - 50 ml | Fisher Scientific | 10788561 | Probówka Falcon |
| Ramię rozruchowe | Irwin | 1964719 | Lub inna firma |
| Wtyczka obudowy Fisher | Scientific | 21-236-4 | Zobacz alternatywy w rękopisie |
| Wycieraczki jednorazowe | Kimtech - Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Cytometr przepływowy | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Aldehyd glutarowy 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Lub inna firma |
| Zielony barwnik fluorescencyjny | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I - 1:10 000 końcowe rozcieńczenie |
| Hydrofilowy wkład filtracyjny GP - 0,2 i mikro; m | Merck | C3235 | Filtr Sterivex |
| Test chemotaksji in situ (ISCA) | - | Skontaktuj się z autorami korespondencyjnymi | |
| Wycinarka laserowa | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Lub inna firma |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Lub inna firma |
| Bulion morski 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon z płaskim z rowkiem | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 & razy; 4 & razy; 8 mm |
| Zestaw pipet | Fisher Scientific | 05-403-151 | Lub innej firmy |
| Końcówki do pipet - 1 ml | Fisher Scientific | 21-236-2A | Lub innej firmy |
| Końcówki do pipet - 20 &mikro; L | Fisher Scientific | 21-236-4 | Lub innej firmy |
| Końcówki do pipet - 200 i mikro; L | Fisher Scientific | 21-236-1 | Lub inna firma |
| Sól morska | Sigma Aldrich | S9883 | Do sztucznej wody morskiej |
| Pipeta serologiczna - 50 ml | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Lub inna firma |
| Filtr strzykawkowy - 0,02 i mikro; m | Filtr Whatman | WHA68091002 | Anatop |
| Filtr strzykawkowy - 0,2 &mikro; m | Fisher Scientific | 10695211 | Lub innej firmy |
| Igła do strzykawki 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0,4 i razy; 12 mm |
| Strzykawki - 1 ml | Codau | 329650 | Insulina Luer U-100 |
| Strzykawki - 10 ml | BD | 303134 | Lub innej firmy |
| Strzykawki - 50 ml | BD | 15899152 | Lub inna firma |
| Rurka stojak - 15 ml | Thomas Scientific | 1159V80 | Lub inna firma |
| Stojak na probówki - 50 ml | Thomas Scientific | 1159V80 | Lub inna firma |
| Niepowlekany kran ogólnego przeznaczenia ze stali szybkotnącej | McMaster-Carr | 8305A77 | Lub inna firma |
| Filtr próżniowy - 0,2 i mikro; m | Filtr Merck | SCGPS05RE | Steritop |
Bibliografia
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
- Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
- Chet, I., A....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
