Prezentowany jest tutaj protokół testu chemotaksji in situ, niedawno opracowanego urządzenia mikroprzepływowego, które umożliwia badanie zachowania mikroorganizmów bezpośrednio w środowisku.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test chemotaksji in situ w celu zbadania zachowania mikroorganizmów w ekosystemach wodnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zachowania mikrobiologiczne, takie jak ruchliwość i chemotaksja (zdolność komórki do zmiany swojego ruchu w odpowiedzi na gradient chemiczny), są szeroko rozpowszechnione w domenach bakteryjnych i archeonowych. Chemotaksja może przynieść znaczne korzyści w pozyskiwaniu zasobów w środowiskach heterogenicznych. Odgrywa również kluczową rolę w interakcjach symbiotycznych, chorobach i procesach globalnych, takich jak cykle biogeochemiczne. Jednak obecne techniki ograniczają badania chemotaksji do laboratorium i nie są łatwe do zastosowania w tej dziedzinie. Przedstawiono tutaj protokół krok po kroku dotyczący wdrożenia testu chemotaksji in situ (ISCA), urządzenia, które umożliwia rzetelne badanie chemotaksji mikrobiologicznej bezpośrednio w środowisku naturalnym. ISCA jest urządzeniem mikroprzepływowym składającym się z 20-dołkowego układu, do którego można załadować interesujące go substancje chemiczne. Po umieszczeniu w środowisku wodnym chemikalia dyfundują ze studni, tworząc gradienty stężeń, które mikroorganizmy wyczuwają i reagują, wpływając do studni za pośrednictwem chemotaksji. Zawartość studzienki można następnie pobrać i wykorzystać do (1) ilościowego określenia siły odpowiedzi chemotaktycznych na określone związki za pomocą cytometrii przepływowej, (2) wyizolowania i hodowli mikroorganizmów reagujących oraz (3) scharakteryzowania tożsamości i potencjału genomowego odpowiadających populacji za pomocą technik molekularnych. ISCA to elastyczna platforma, którą można wdrożyć w dowolnym systemie z fazą wodną, w tym w środowisku morskim, słodkowodnym i glebowym.
Wprowadzenie
Różnorodne mikroorganizmy wykorzystują ruchliwość i chemotaksję, aby wykorzystać niejednolite środowiska odżywcze, znaleźć gospodarzy lub uniknąć szkodliwych warunków1,2,3. Te zachowania mikrobiologiczne mogą z kolei wpływać na tempo przemian chemicznych4 i promować symbiotyczne partnerstwa między ekosystemami lądowymi, słodkowodnymi i morskimi2,5.
Chemotaxis była intensywnie badana w warunkach laboratoryjnych przez ostatnie 60 lat6. Pierwsza ilościowa metoda badania chemotaksji, test kapilarny, obejmuje rurkę kapilarną wypełnioną domniemanym chemoatraktantem zanurzonym w zawiesinie bakterii6. Dyfuzja substancji chemicznej z probówki tworzy gradient chemiczny, a bakterie chemotaktyczne reagują na ten gradient, migrując do probówki7. Od czasu opracowania testu kapilarnego, który jest nadal szeroko stosowany, opracowano wiele innych technik do badania chemotaksji w coraz bardziej kontrolowanych warunkach fizyczno-chemicznych, z których najnowsza obejmuje użycie mikrofluidyki8,9,10.
Mikrofluidyka, wraz z szybką mikroskopią wideo, umożliwia śledzenie zachowania pojedynczych komórek w odpowiedzi na starannie kontrolowane gradienty. Chociaż techniki te znacznie poszerzyły naszą wiedzę na temat chemotaksji, zostały one ograniczone do użytku laboratoryjnego i nie przekładają się łatwo na zastosowanie w terenie w systemach środowiskowych. W związku z tym nie zbadano zdolności naturalnych zbiorowisk bakterii do wykorzystywania chemotaksji w naturalnych ekosystemach; W związku z tym obecna wiedza na temat potencjalnego ekologicznego znaczenia chemotaksji jest skłaniająca się ku sztucznym warunkom laboratoryjnym i ograniczonej liczbie izolatów bakteryjnych hodowanych w laboratorium. Niedawno opracowana biblioteka ISCA pokonuje te ograniczenia11.
ISCA opiera się na ogólnej zasadzie testu kapilarnego; jednak wykorzystuje nowoczesne techniki mikrofabrykacji, aby dostarczyć wysoce replikowaną, łatwą do wdrożenia platformę eksperymentalną do ilościowego oznaczania chemotaksji w kierunku związków interesujących w środowisku naturalnym. Umożliwia również identyfikację i charakterystykę mikroorganizmów chemotaktycznych za pomocą bezpośredniej izolacji lub technik molekularnych. Podczas gdy pierwsze działające urządzenie zostało wykonane samodzielnie i zbudowane ze szkła i PDMS11, najnowsza wersja formowana wtryskowo składa się z poliwęglanu, przy użyciu wysoce ustandaryzowanej procedury produkcyjnej (w celu zainteresowania najnowszą wersją urządzenia można skontaktować się z odpowiednimi autorami).
ISCA jest wielkości karty kredytowej i składa się z 20 odwiertów rozmieszczonych w układzie 5 x 4 odwierty, z których każdy jest połączony z zewnętrznym środowiskiem wodnym za pomocą małego portu (o średnicy 800 μm; Rysunek 1). Przypuszczalne chemoatraktanty załadowane do studni dyfundują do środowiska przez port, a mikroorganizmy chemotaktyczne reagują, przepływając przez port do studni. Ponieważ wiele czynników może mieć wpływ na wynik eksperymentu ISCA w środowisku naturalnym, ten protokół krok po kroku pomoże nowym użytkownikom pokonać potencjalne przeszkody i ułatwi skuteczne wdrożenia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Zalecamy wykonanie sekcji 1 przed eksperymentami terenowymi, aby zoptymalizować wyniki.
1. Optymalizacja laboratorium
UWAGA: Objętości opisane w procedurze optymalizacji są wystarczające dla pojedynczego ISCA (składającego się z 20 odwiertów).
- Przygotowanie substancji chemicznej będącej przedmiotem zainteresowania
UWAGA: Optymalne stężenie dla każdego chemoatraktantu często musi być określone w warunkach laboratoryjnych przed wdrożeniem w terenie. Pole koncentracji chemicznej będzie zmniejszać się wraz z odległością od źródła (odwiert ISCA), co oznacza, że stężenie doświadczane przez mikroorganizmy w środowisku będzie niższe niż obecne wewnątrz urządzenia. Optymalne stężenie do zastosowania w studni ISCA zależy od szybkości dyfuzji chemoatraktantu. Jeśli stężenie w studni jest zbyt niskie (bliskie granicy wykrywalności drobnoustrojów), nie zaobserwuje się dodatniej chemotaksji. I odwrotnie, jeśli stężenie w odwiercie jest zbyt wysokie, stężenie będzie również wysokie w bezpośrednim otoczeniu, a akumulacja drobnoustrojów nastąpi nad odwiertami ISCA, a nie wewnątrz. W związku z tym serie rozcieńczeń powinny być przeprowadzane w warunkach laboratoryjnych dla każdego związku w celu określenia optymalnego stężenia do zastosowań w terenie. Idealnie byłoby, gdyby zakres stężeń został również przetestowany w terenie, aby potwierdzić wyniki laboratoryjne.- Przygotować 2,5 l odpowiedniej pożywki zawierającej sól o odpowiednim stężeniu (np. soli fizjologicznej buforowanej fosforanami [PBS] lub sztucznej wody morskiej). Przefiltrować medium za pomocą filtra 0,2 μm za pomocą pompy perystaltycznej lub próżniowej i autoklawu.
- Przygotować 10 mM roztwór chemoatraktantu w 1 ml sterylnego podłoża. Przefiltruj roztwór chemoatraktantu za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm, aby usunąć cząstki i potencjalne zanieczyszczenia.
UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby w roztworze końcowym nie było żadnych związków organicznych innych niż chemoatraktant.
- Zakres stężeń według serii rozcieńczeń
- Rozcieńczyć przefiltrowany roztwór podstawowy chemoatraktantu szeregowo, w zakresie (na przykład) od 10 mM do 100 μM.
UWAGA: Potrzebna jest co najmniej 0,7 ml objętości końcowej na badane stężenie.
- Rozcieńczyć przefiltrowany roztwór podstawowy chemoatraktantu szeregowo, w zakresie (na przykład) od 10 mM do 100 μM.
- Wczytywanie ISCA
- Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml przefiltrowanym chemoatraktantem i podłącz ją do strzykawki o pojemności 27 g. Trzymając ISCA z portem skierowanym do góry, powoli wstrzykiwać substancję, aż na górze portu pojawi się mała kropelka.
UWAGA: 1) Każde rozcieńczenie lub substancję należy wstrzyknąć za pomocą oddzielnej strzykawki i igły, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. 2) Ta mała kropla jest ważna, ponieważ zapewnia, że w porcie nie zostaną uwięzione pęcherzyki powietrza, które mogłyby osłabić zdolność drobnoustrojów do migracji przez port. 3) Zaleca się wypełnienie całego rzędu dla każdej substancji lub stężenia (pięć studzienek), aby zapewnić odpowiednią minimalną objętość do dalszych analiz. 4) Jeden rząd na ISCA powinien pełnić funkcję kontroli ujemnej i powinien być wypełniony przefiltrowanym podłożem, w którym drobnoustroje zostaną zawieszone. Zabieg ten uwzględnia efekt losowej ruchliwości drobnoustrojów w studzienkach ISCA i powinien być stosowany w celu normalizacji zabiegów zawierających chemoatraktant.
- Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml przefiltrowanym chemoatraktantem i podłącz ją do strzykawki o pojemności 27 g. Trzymając ISCA z portem skierowanym do góry, powoli wstrzykiwać substancję, aż na górze portu pojawi się mała kropelka.
- Wdrożenie w laboratorium
- Przez noc inkubuj 5 ml kultury wzbogaconej 1% bulionem morskim (dla bakterii morskich) lub 1% bulionem lizogenicznym (LB, dla bakterii słodkowodnych).
UWAGA: Molekularne izolaty bakteryjne lub naturalne zbiorowiska bakteryjne mogą być używane do zastosowań laboratoryjnych. - Inkubować kulturę przez 12 godzin w temperaturze pokojowej (RT) i 180 obr./min. Po 12 godzinach należy upewnić się, że zbiorowiska drobnoustrojów są ruchliwe poprzez bezpośrednią obserwację pod mikroskopem.
- Odwirować kulturę w temperaturze 1 500 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić 1/100 w 150 ml odpowiedniego podłoża (np. przefiltrowanej wody morskiej, przefiltrowanej wody słodkiej).
- Umieść dwa małe kawałki dwustronnej taśmy klejącej na płaskiej powierzchni tacki o pojemności 200 ml (pokrywki pojemników z końcówkami o pojemności 1 ml mają do tego celu idealne wymiary i można je łatwo sterylizować w autoklawie). Umieść jedną ISCA na górze, upewniając się, że jest bezpiecznie przymocowana do taśmy. Powoli napełnić tackę wprowadzania roztworem bakteryjnym za pomocą pipety serologicznej o pojemności 50 ml.
UWAGA: Napełnij tackę, aż ISCA zostanie zanurzona pod około 1–2 cm płynu. W przypadku korzystania z wielu tac należy używać tego samego woluminu we wszystkich. - Pozostawić ISCA do inkubacji przez 1 godzinę, aby umożliwić chemotaksję bakteryjną. Po 1 godzinie bardzo delikatnie usunąć pożywkę za pomocą pipety serologicznej o pojemności 50 ml, aby zminimalizować przepływ turbulentny.
- Wyjmij ISCA z zasobnika wysuwanego bez dotykania górnej powierzchni. Użyj pipety i jednorazowych wycieraczek, aby usunąć pozostały płyn z powierzchni ISCA.
UWAGA: Ważne jest, aby unikać dotykania portów podczas tego procesu, ponieważ wynikające z tego zmiany ciśnienia mogą usunąć lub dodać bakterie ze środowiska zewnętrznego do studni, a tym samym wpłynąć na gęstość i skład bakterii wewnątrz studni.
- Przez noc inkubuj 5 ml kultury wzbogaconej 1% bulionem morskim (dla bakterii morskich) lub 1% bulionem lizogenicznym (LB, dla bakterii słodkowodnych).
- Pobieranie próbek
- Trzymając ISCA z portem skierowanym w dół, pobierz objętość studzienek za pomocą sterylnej igły strzykawkowej 27 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml.
UWAGA: Każdy rząd (jeśli zawiera tę samą substancję) można połączyć, aby uzyskać próbkę roboczą o objętości około 550 μl. Próbka ta może być następnie podzielona na porcje do różnych probówek w zależności od wymaganych dalszych zastosowań. - Określ liczbę bakterii przyciąganych do każdego stężenia chemoatraktantu, analizując próbki za pomocą cytometrii przepływowej12. Wybierz stężenie chemoatraktantu, które maksymalizuje chemotaksję dla kolejnych wdrożeń w terenie.
- Trzymając ISCA z portem skierowanym w dół, pobierz objętość studzienek za pomocą sterylnej igły strzykawkowej 27 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml.
2. Przygotowanie do wdrożenia w terenie
UWAGA: Przygotowanie materiału i konstrukcja obudowy tłumiącej przepływ (sekcja 2) musi być przeprowadzona przed wdrożeniem.
- Przygotowanie materiałów
- Przygotuj wszystkie materiały wymienione w tabeli 1.
UWAGA: Ilości materiałów są podane dla jednego ISCA.
- Przygotuj wszystkie materiały wymienione w tabeli 1.
- Budowa i przygotowanie obudowy tłumiącej przepływ
UWAGA: Obudowa tłumiąca przepływ minimalizuje niepożądane turbulencje, które w przeciwnym razie zapobiegają powstawaniu gradientów chemicznych pochodzących z ISCA.- Wytnij elementy obudowy stanowiska za pomocą wycinarki laserowej z arkusza akrylowego o grubości 3 mm.
UWAGA: Plik z elementami można znaleźć pod następującym linkiem: . - Złóż elementy wycięte laserowo, jak pokazano w Rysunek 2 za pomocą kleju akrylowego.
UWAGA: Zmontuj elementy ostrożnie. lub niewspółosiowość mogą powodować wycieki podczas wdrażania, co bezpośrednio wpływa na jakość danych. - Zmontowaną obudowę pozostaw do wyschnięcia na noc.
- Umyj obudowę wodą dejonizowaną.
- Zidentyfikuj potencjalny wyciek, wlewając dejonizowaną wodę do obudowy. Napraw wszelkie potencjalne nieszczelne połączenia, dodając więcej kleju akrylowego, a następnie powtórz kroki 2.2.3–2.2.5.
- Wytnij gwinty w akrylowym elemencie, który będzie używany do mocowania ISCA. Można to osiągnąć za pomocą kranu o średnicy i skoku pasującym do mocujących.
- Najpierw przymocuj kran do klucza do gwintowników, a następnie zabezpiecz element akrylowy, który ma być gwintowany w imadle stołowym. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, upewnij się, że element akrylowy jest tak równy, jak to możliwe. Upewnij się, że kran jest prostopadły do elementu akrylowego i zacznij obracać klucz do kranu (zgodnie z ruchem wskazówek zegara), lekko dociskając kran.
- Po kilku pełnych obrotach w elemencie akrylowym odwróć obrót kranu (w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara) o jedną czwartą obrotu, aby usunąć akryl z kranu. Powtarzaj proces, aż cała głębokość elementu akrylowego zostanie stuknięta.
- Na koniec zdejmij kran (obracając w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara) i przetestuj gwinty za pomocą.
- Wytnij elementy obudowy stanowiska za pomocą wycinarki laserowej z arkusza akrylowego o grubości 3 mm.
3. Procedura w terenie
- Filtracja wody
- Zbierz wodę z terenu, gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia eksperymentu. Przefiltrować 5 ml wody na ISCA przez filtr strzykawkowy 0,2 μm (ze strzykawką o pojemności 50 ml) do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
UWAGA: Do napełnienia wszystkich studni ISCA potrzeba około 3 ml przefiltrowanej wody; jednak zaleca się, aby 1) przefiltrować 5 ml na urządzenie w celu uwzględnienia strat podczas procesu poczwórnej filtracji oraz 2) zachować podwielokrotności filtratów jako kontrole ujemne zarówno dla cytometrii przepływowej, jak i procedur molekularnych. - Przefiltrować filtrat dwukrotnie przez hydrofilowy wkład filtracyjny GP o wielkości 0,2 μm (za każdym razem używając tego samego) za pomocą nowej strzykawki o pojemności 50 ml do nowej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Przefiltrować filtrat przez filtr strzykawkowy 0,02 μm (z nową strzykawką 50 ml) do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
UWAGA: Ta poczwórna filtracja powinna usunąć z wody prawie wszystkie mikroorganizmy i cząsteczki. Końcowy filtrat należy trzymać z dala od wszelkich źródeł ciepła do czasu użycia. Woda ta będzie wykorzystywana do ponownego zawieszenia wszystkich chemikaliów używanych w ISCA i powinna być utrzymywana w tej samej temperaturze, co woda w miejscu rozmieszczenia. W przeciwnym razie mogą wystąpić przepływy konwekcyjne wywołane różnicami temperatur między odwiertami ISCA a środowiskiem zewnętrznym. - Użyć podwielokrotności filtratu do ponownego zawieszenia wszystkich interesujących nas chemoatraktantów (zwykle suchych) do pożądanych stężeń w stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml.
- Przefiltruj ponownie zawieszone chemoatraktanty przez filtr strzykawkowy 0,2 μm ze strzykawką o pojemności 10 ml do sterylnych stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml w celu usunięcia niepożądanych cząstek lub związków nierozpuszczalnych w wodzie (w przypadku stosowania ekstraktów).
UWAGA: Filtruj delikatnie, aby zapobiec przedostawaniu się cząstek przez filtr. Ważne jest, aby ponownie zawiesić chemoatraktanty w ultrafiltrowanej wodzie z terenu i nie rozpuszczać ich w innych roztworach. Korzystanie z wody z terenu polowego jest konieczne, aby (1) uzyskać takie samo stężenie soli wewnątrz studni, jak w masowej wodzie środowiskowej, aby zapobiec przepływowi zależnemu od gęstości, oraz (2) zagwarantować, że poziomy składników odżywczych w tle są równe wewnątrz i na zewnątrz studni.
- Zbierz wodę z terenu, gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia eksperymentu. Przefiltrować 5 ml wody na ISCA przez filtr strzykawkowy 0,2 μm (ze strzykawką o pojemności 50 ml) do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
- Wypełnienie ISCA
- Wykonać sekcję 1.3, aby wypełnić ISCA.
UWAGA: Zaleca się napełnianie jednego rzędu (pięć studzienek) na każdą substancję (tj. trzy różne substancje na ISCA i jedną kontrolną ultrafiltrowaną wodę morską).
- Wykonać sekcję 1.3, aby wypełnić ISCA.
- Rozmieszczenie w terenie
- Przykręć ISCA (Rysunek 3A) do elementu 9 obudowy (Rysunek 2K i Rysunek 3B).
UWAGA: Opisana powyżej obudowa tłumiąca przepływ może zawierać dwa ISCA obok siebie lub jeden ISCA umieszczony w jej środku. - Zamknij obudowę (Rysunek 3C) i uszczelnij ją taśmą klejącą (Rysunek 3D).
UWAGA: Należy unikać zmarszczek, aby zapewnić doskonałe uszczelnienie. Najpierw uszczelnij wszystkie strony, a następnie (w drugim kroku) uszczelnij boczne otwory, które posłużą do spuszczenia wody z obudowy po zakończeniu pobierania próbek. Nie uszczelniaj górnych i dolnych otworów. Nie należy umieszczać ISCA do góry nogami, ponieważ przepływ zależny od gęstości może wystąpić w studzienkach zawierających chemoatraktanty, co wpłynie na liczbę komórek w studzienkach. - Ponieważ obudowa musi pozostać stabilna podczas rozkładania, zaleca się przymocowanie jej do konstrukcji wykonanych przez człowieka (np. pontonu, drabiny) za pomocą linek bungee.
UWAGA: Obudowę można przymocować do ramienia rozkładającego (tutaj zmodyfikowany zacisk z prostopadłą platformą) za pomocą linek bungee przed zanurzeniem w wodzie. Alternatywnie obudowę można wypełnić i zabezpieczyć niewielkim ciężarkiem na płytkim podłożu. Jeśli planowane jest rozmieszczenie w oceanie pelagicznym, wybieg można przymocować do siatki z boją po jednej stronie i basą nurkową po drugiej. - Całkowicie zanurz obudowę, aby rozpocząć napełnianie. Podczas napełniania mocno trzymaj obudowę, aby zapobiec nadmiernemu przemieszczaniu się wody w środku. Gdy poziom wody osiągnie górną część obudowy, upewnij się, że w środku nie jest uwięzione powietrze.
UWAGA: W przypadku uwięzienia pęcherzyków powietrza, delikatnie przechyl obudowę z otworem wentylacyjnym skierowanym do góry, co umożliwi ucieczkę pęcherzyków. - Po całkowitym napełnieniu uszczelnij dolny i górny otwór dwoma zatyczkami, które mogą być wykonane z silikonu lub gumy lub poprzez uszczelnienie końcówek do pipet o pojemności 20 μl (Rysunek 4).
UWAGA: Ten krok zapobiega przepływowi wewnątrz obudowy podczas pobierania próbek. - Pozostawić ISCA na miejscu do pobierania próbek przez 1–3 godz.
UWAGA: Idealny czas wdrożenia jest podyktowany przede wszystkim temperaturą wody i czasem podwojenia społeczności bakteryjnej. Gdy temperatura wody przekracza 20 °C, nie zaleca się rozmieszczania ISCA na dłużej niż 1 godzinę, ponieważ podział komórek w studniach zawierających chemoatraktanty może nastąpić po 1,5–2,0 godzinach. Jednak optymalny czas wdrożenia można przetestować przed eksperymentem ISCA, zmieniając naturalne zbiorowiska za pomocą załadowanych substancji chemicznych i określając ilościowo liczbę komórek w czasie. - Wyjmij obudowę z wody. Umieść go nad pojemnikiem umożliwiającym spuszczenie wody z obudowy.
- Bardzo delikatnie usuń górną część taśmy samoprzylepnej z przednich otworów.
UWAGA: Przepływ wody opuszczającej obudowę musi mieć prędkość kapania. Postępuj po jednym otworze na raz, od góry obudowy do dołu. Całkowite opróżnienie obudowy powinno zająć około 10–15 minut. - Gdy linia wodna przejdzie poniżej górnej części ISCA, wyjmij dolny korek i spuść resztę wody.
- Podczas gdy ISCA są nadal przymocowane do obudowy, ostrożnie usuń wodę uwięzioną na górze ISCA za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
- Usuń ISCA bez dotykania górnej powierzchni i użyj jednorazowej chusteczki, aby usunąć pozostały płyn z powierzchni.
UWAGA: Ważne jest, aby nie dotykać portów podczas tego procesu, ponieważ wynikające z tego zmiany ciśnienia mogą usunąć lub dodać bakterie luzem do studni i zniekształcić liczbę bakterii. - Pobrać próbki z ISCA, powtarzając krok 1.5.1.
- Przykręć ISCA (Rysunek 3A) do elementu 9 obudowy (Rysunek 2K i Rysunek 3B).
4. Aplikacje podrzędne
UWAGA: Objętości są podane na podstawie próbki 550 μL (jeden rząd ISCA).
- Utrwalić 100 μl zawartości studzienki za pomocą aldehydu glutarowego (2% stężenie końcowe) do cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia chemotaksji każdego atraktantu.
UWAGA: Przechowywać na lodzie (lub w temperaturze 4 °C) i przeanalizować próbki tego samego dnia. Alternatywnie, próbki można błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie po utrwaleniu, jeśli analiza nie jest możliwa tego samego dnia. Cytometria przepływowa jest zalecaną metodą ilościowego określania liczby komórek w studzienkach ISCA, ponieważ jest prosta, szybka i dokładna12. - Błyskawiczne zamrożenie 300 μl zawartości studzienki w ciekłym azocie w celu późniejszej ekstrakcji i analizy DNA11.
UWAGA: Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy. - Dodać 90 μl zawartości studzienki do 10 μl buforu TE-glicerolu i błyskawicznie zamrozić próbki do genomiki pojedynczej komórki13.
- Rozprowadzić 10–20 μl na płytkach agarowych zawierających żądane podłoże do izolacji bakteryjnej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W tej sekcji przedstawiono wyniki badań laboratoryjnych wykorzystujących ISCA do badania odpowiedzi chemicznej morskich mikroorganizmów na zakres stężeń glutaminy, aminokwasu znanego z przyciągania bakterii glebowych14. Stężenie glutaminy, które wywołało najsilniejszą odpowiedź chemiczną w testach laboratoryjnych, użyto do przeprowadzenia testu chemotaksji w środowisku morskim.
Aby przeprowadzić badania laboratoryjne, społeczności morskie pobrane z wód przybrzeżnych w S...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W skali mikroorganizmów wodnych środowisko jest dalekie od jednorodności i często charakteryzuje się gradientami fizykochemicznymi, które strukturyzują zbiorowiska drobnoustrojów 1,15. Zdolność ruchliwych mikroorganizmów do wykorzystywania zachowania (tj. chemotaksji) ułatwia żerowanie w tych heterogenicznych mikrośrodowiskach1. Badanie chemotaksji bezpośrednio w środowisku może potencjalnie zidentyfikować ważne interakcje międzygatunkowe ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
To badanie zostało częściowo sfinansowane przez Inicjatywę Mikrobiologii Morskiej Fundacji Gordona i Betty Moore, poprzez GBMF3801 grantów dla J.R.S. i R.S., oraz Investigator Award (GBMF3783) dla R.S., a także Stypendium Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych (DE160100636) dla J.B.R., nagrodę od Fundacji Simons dla B.S.L. (594111) oraz grant od Fundacji Simonsa (542395) dla R.S. w ramach Principles of Microbial Ecosystems (PriME) Collaborative.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Klej akrylowy | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Arkusz akrylowy | McMaster-Carr | 8505K725 | Lub inna firma |
| Taśma klejąca | Scotch | 3M 810 | Scotch Magiczna taśma |
| Autoklaw | Systec | D-200 | Lub inna firma |
| Wirówka stołowa | Fisher Scientific | 75002451 | Lub inna firma |
| Linka bungee | Paracord Planet | 667569184000 | Lub innej firmy |
| Probówka wirówkowa - 2 ml | Probówka Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf |
| Stożkowa probówka wirówkowa - 15 ml | Fisher Scientific 11507411 | Probówka Falcon | |
| Stożkowa probówka wirówkowa - 50 ml | Fisher Scientific | 10788561 | Probówka Falcon |
| Ramię rozruchowe | Irwin | 1964719 | Lub inna firma |
| Wtyczka obudowy Fisher | Scientific | 21-236-4 | Zobacz alternatywy w rękopisie |
| Wycieraczki jednorazowe | Kimtech - Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Cytometr przepływowy | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Aldehyd glutarowy 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Lub inna firma |
| Zielony barwnik fluorescencyjny | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I - 1:10 000 końcowe rozcieńczenie |
| Hydrofilowy wkład filtracyjny GP - 0,2 i mikro; m | Merck | C3235 | Filtr Sterivex |
| Test chemotaksji in situ (ISCA) | - | Skontaktuj się z autorami korespondencyjnymi | |
| Wycinarka laserowa | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Lub inna firma |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Lub inna firma |
| Bulion morski 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon z płaskim z rowkiem | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 & razy; 4 & razy; 8 mm |
| Zestaw pipet | Fisher Scientific | 05-403-151 | Lub innej firmy |
| Końcówki do pipet - 1 ml | Fisher Scientific | 21-236-2A | Lub innej firmy |
| Końcówki do pipet - 20 &mikro; L | Fisher Scientific | 21-236-4 | Lub innej firmy |
| Końcówki do pipet - 200 i mikro; L | Fisher Scientific | 21-236-1 | Lub inna firma |
| Sól morska | Sigma Aldrich | S9883 | Do sztucznej wody morskiej |
| Pipeta serologiczna - 50 ml | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Lub inna firma |
| Filtr strzykawkowy - 0,02 i mikro; m | Filtr Whatman | WHA68091002 | Anatop |
| Filtr strzykawkowy - 0,2 &mikro; m | Fisher Scientific | 10695211 | Lub innej firmy |
| Igła do strzykawki 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0,4 i razy; 12 mm |
| Strzykawki - 1 ml | Codau | 329650 | Insulina Luer U-100 |
| Strzykawki - 10 ml | BD | 303134 | Lub innej firmy |
| Strzykawki - 50 ml | BD | 15899152 | Lub inna firma |
| Rurka stojak - 15 ml | Thomas Scientific | 1159V80 | Lub inna firma |
| Stojak na probówki - 50 ml | Thomas Scientific | 1159V80 | Lub inna firma |
| Niepowlekany kran ogólnego przeznaczenia ze stali szybkotnącej | McMaster-Carr | 8305A77 | Lub inna firma |
| Filtr próżniowy - 0,2 i mikro; m | Filtr Merck | SCGPS05RE | Steritop |
Bibliografia
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
- Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
- Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. Repulsion of bacteria from marine surfaces. Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. PNAS. 113, 1576-1581 (2016).
- Matilla, M., Krell, T. The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity. FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).
- Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153, 708-716 (1966).
- Adler, J., Dahl, M. M. A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility. Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).
- Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R. Microfluidics for bacterial chemotaxis. Integrative Biology. 2, 604-629 (2010).
- Hol, F. J. H., Dekker, C. Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria. Science. 346, 1251821(2014).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Lambert, B. S., et al. A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities. Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).
- Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).
- Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. Microbiology. , (1982).
- Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. Root exudation and rhizosphere biology. Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
