Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wyciszanie mikroRNA na bazie wirusa ziemniaka (VbMS) w ziemniakach.

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61067

⸱

11 maja 2020

 ,  , 
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas, Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology, Texas A&M University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy szczegółowy protokół dla systemu wyciszania mikroRNA (VbMS) opartego na wirusie ziemniaka X (PVX), aby funkcjonalnie scharakteryzować endogenne mikroRNA (miRNA) u ziemniaka. Docelowe cząsteczki mimiczne (TM) interesującego nas miRNA są integrowane z wektorem PVX i przejściowo ulegają ekspresji w ziemniakach w celu wyciszenia docelowego miRNA lub rodziny miRNA.

Streszczenie

Wyciszanie mikroRNA oparte na wirusach (VbMS) jest szybkim i skutecznym narzędziem do funkcjonalnej charakterystyki mikroRNA (miRNA) u roślin. System VbMS został opracowany i zastosowany w przypadku różnych gatunków roślin, w tym Nicotiana benthamiana, pomidora, Arabidopsis, bawełny i roślin jednoliściennych, takich jak pszenica i kukurydza. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół wykorzystujący wektory VbMS oparte na PVX do wyciszania endogennych miRNA w ziemniakach. Aby obniżyć ekspresję specyficznego miRNA, projektuje się docelowe cząsteczki mimiczne (TM) interesującego miRNA, integruje się je z wektorami wirusów roślinnych i ulegają ekspresji w ziemniaku przez infiltrację Agrobacterium, aby związać się bezpośrednio z endogennym miRNA będącym przedmiotem zainteresowania i zablokować jego funkcję.

Wprowadzenie

MikroRNA roślinne (miRNA) są charakteryzowane jako RNA regulacyjne o długości 20–24 nukleotydów, kodowane jądrowo1 i odgrywają fundamentalne role w prawie każdym aspekcie procesów biologicznych roślin, w tym we wzroście i rozwoju2,3, fotosynteza i metabolizm4,5,6,7, synteza i sygnalizacja hormonów8,9, odpowiedzi biotyczne i abiotyczne10,11,12,13, oraz regulacja składników odżywczych i energii14,15. Regulacyjne role roślinnych miRNA są dobrze zaprogramowane i spełniane zazwyczaj na poziomach potranskrypcyjnych poprzez rozszczepianie lub translacyjną tłumienie docelowych mRNA.

Ogromny postęp został poczyniony w kierunku identyfikacji, profilowania transkrypcyjnego i przewidywania docelowego miRNA w potatoto16,17,18,19,20,21. Jednak funkcjonalna charakterystyka miRNA w roślinach, w tym ziemniakach, pozostaje w tyle za innymi organizmami ze względu na brak wydajnych i wysokoprzepustowych podejść genetycznych. Przeprowadzenie analizy funkcjonalnej poszczególnych miRNA za pomocą standardowej analizy utraty funkcji jest trudne, ponieważ większość miRNA należy do rodzin o znacznej redundancji genetycznej22. Ponadto pojedyncze miRNA może kontrolować wiele docelowych genów23, a kilka różnych miRNA może wspólnie modulować ten sam szlak molekularny24,25. Właściwości te utrudniają scharakteryzowanie funkcji konkretnego miRNA lub rodziny miRNA.

Znaczna część analizy funkcjonalnej miRNA opierała się głównie na podejściach opartych na wzmocnieniu funkcji, które mają oczywiste ograniczenia. Metoda sztucznego miRNA (amiRNA) wykorzystuje endogenne pierwotne transkrypty (pri-miRNA) do produkcji miRNA na wysokim poziomie, co prowadzi do zahamowania ekspresji genów docelowych26,27,28,29. Jednak znakowanie aktywacji i nadekspresja miRNA przy użyciu silnego konstytutywnego promotora 35S często prowadzą do zwiększonej ekspresji miRNA, które nie są reprezentatywne dla warunków in vivo, a zatem mogą nie odzwierciedlać endogennej funkcji miRNAs30. Opracowano alternatywne podejście polegające na ekspresji opornych na miRNA form docelowych genów, które zawierają mutacje nietryskające w miejscach wiązania i/lub cięcia31,32,33. Ale takie podejście może również potencjalnie powodować błędną interpretację fenotypu pochodzącego z opornego na miRNA docelowego transgenu z powodu artefaktów transgenicznych. Dlatego wnioski z tych badań nad wzmocnieniem funkcji powinny być wyciągane z ostrożnością34. Innym poważnym ograniczeniem wyżej opisanych podejść jest to, że wymagają one transformacji, która jest pracochłonna i czasochłonna. Co więcej, podejścia zależne od transgenu prawie nie mają zastosowania w przypadku opornych na transformację gatunków roślin. Dlatego konieczne jest opracowanie szybkiego i skutecznego podejścia do utraty funkcji, aby rozwikłać funkcję miRNA.

Aby ominąć warunek wstępny procedury transformacji, ustanowiono wyciszanie mikroRNA oparte na wirusach (VbMS) poprzez połączenie strategii naśladownictwa docelowego (TM) z wektorami pochodzącymi od wirusa. W systemie VbMS sztucznie zaprojektowane cząsteczki TM są przejściowo eksprymowane ze szkieletu wirusa, oferując potężne, wysokowydajne i oszczędzające czas narzędzie do analizy funkcji roślinnych endogennych miRNAs35,36. VbMS został początkowo opracowany u N. benthamiana i pomidora z wirusem grzechotki tytoniu (TRV)35,36,37 i został rozszerzony na Arabidopsis, bawełnę, pszenicę i kukurydzę przy użyciu różnych innych systemów ekspresji wirusa, w tym wirusa ziemniaka X (PVX)38, wirus zgniotu liści bawełny (ClCrV)39, wirus mozaiki ogórka (CMV)40,41,42, chiński wirus mozaiki pszenicy (CWMV)43, oraz wirus mozaiki prążkowanej jęczmienia (BSMV)44,45.

Ziemniak (Solanum tuberosum) jest czwartą najważniejszą rośliną spożywczą i najczęściej uprawianą rośliną niezbożową na świecie, głównie ze względu na jej wysoką wartość odżywczą, wysoką produkcję energii i stosunkowo niskie wymagania dotyczące wkładu46. Kilka cech ziemniaka sprawia, że jest to atrakcyjna roślina modelowa dwuliścienna. Jest to rozmnażana wegetatywnie roślina poliploidalna o wysokim współczynniku krzyżowania, heterozygotyczności i różnorodności genetycznej. Jednak do tej pory nie ma raportu charakteryzującego funkcję miRNA w ziemniaku za pomocą VbMS. W tym miejscu przedstawiamy podejście VbMS oparte na PVX do klonowania niezależnego od ligacji (LIC) do oceny funkcji miRNA w roślinach ziemniaka38. Wybraliśmy rodzinę miR165/166, aby zilustrować test VbMS, ponieważ rodzina miR165/166 i ich docelowe mRNA oraz czynniki transkrypcyjne homeodomeny/zamka błyskawicznego Leu klasy III (HD-ZIP III) zostały szeroko scharakteryzowane22,47,48. Geny HD-ZIP III są kluczowymi regulatorami rozwoju merystemu i polaryzacji narządów, a supresja funkcji miR165/166 prowadzi do zwiększonej ekspresji genów HD-ZIP III, co skutkuje pleotropowymi wadami rozwojowymi, takimi jak zmniejszona dominacja wierzchołkowa i nieprawidłowe wzorce polaryzacji liści22,35,38,41. Łatwe do wykrycia fenotypy rozwojowe skorelowane z wyciszeniem miRNA165/166 umożliwiają dokładną ocenę skuteczności testu VbMS opartego na PVX.

W tym badaniu wykazujemy, że system VbMS oparty na PVX może skutecznie blokować funkcję miRNA w ziemniakach. Ponieważ system wyciszania genów indukowany wirusem (VIGS) oparty na PVX został ustanowiony w wielu odmianach ziemniaka49,50,51,52, to podejście VbMS oparte na PVX może być prawdopodobnie zastosowane do szerokiego zakresu diploidalnych i tetraploidalnych gatunków ziemniaków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Uprawiaj rośliny ziemniaka.

  1. Rozmnażać rośliny ziemniaka in vitro w probówkach hodowlanych (25 x 150 mm) z pożywką Murashige i Skoog (MS) oraz witaminą Gamborga (mieszanina soli bazalnej MS, witamina Gamborga, sacharoza 30 g/l, agar 3,5 g/l, pH = 5,7). Umieść probówki w pomieszczeniu do wzrostu w temperaturze poniżej 20–22 °C, 16 godzin światła/8 godzin ciemnego fotoperiodu i natężeniu światła 120 μmol/m2∙s1,
    UWAGA: Nowe pędy i korzenie zwykle rozwijają się z roślin w ciągu 1–2 tygodni. Rozmnażaj rośliny za pomocą świeżych pożywek witaminowych MS/Gamborg co miesiąc.
  2. Cztery tygodnie później przesadzić rośliny in vitro do gleby i uprawiać je w szklarni w temperaturze 20–22 °C, 16 godzin światła / 8 godzin ciemnego fotoperiodu i natężeniu światła 120 μmol/m2∙s1,
    UWAGA: Rośliny z nowo rozwiniętymi korzeniami i liśćmi nadają się do przesadzania. Utrzymuj wilgoć dla świeżo przesadzonych roślin przez pierwsze 3-4 dni.

2. Skonstruuj wektory VbMS.

  1. Zaprojektuj i sklonuj krótkie tandemowe cząsteczki TM (STTM, Rysunek 1)22,53 dla interesującego miRNA.
    UWAGA: Pozyskaj sekwencje miRNA na podstawie danych eksperymentalnych lub z bazy danych miRbase54,55,56,57,58,59. Sekwencja miR166 użyta w tym badaniu została opisana wcześniej60.
    1. Zaprojektuj moduł TM, wstawiając sekwencję niedopasowania, zwykle 5'-CTA-3', do sekwencji odwrotnego dopełniacza miRNA w miejscu odpowiadającym 10-11 nukleotydom miRNA.
      UWAGA: Na przykład sekwencja Stu-miR160 to 5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCC-3'61, gdzie 10-ty-11 nukleotydy są pogrubione. Odwrotna sekwencja dopełniacza (w deoksynukleotydach) to 5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3', a miejsce insercji wybrzuszenia niedopasowania jest pogrubione. Sekwencja cząsteczki TM (deoksynukleotyd) powinna wynosić 5'-GGCATACAGG-CTA-G AGCCAGGCA-3'.
    2. Zaprojektuj podstawy do klonowania fragmentu STTM (Rysunek 1). Użyj oligonukleotydów DNA z sekwencją dystansową 48-nt jako matrycy do klonowania PCR. Starter do przodu składa się z łącznika LIC1 (5'-CgACgACAAgACCgT-3'), sekwencji przedniej powyższej zaprojektowanej dla cząsteczki TM oraz częściowej sekwencji 5' przekładki 48-nt (5'-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'). Odwrotny starter składa się z łącznika LIC2 (5'-gAggAgAgAgAgCCgT-3'), sekwencji odwrotnego dopełniacza cząsteczki TM i częściowego odwrotnego dopełniacza do sekwencji 3' przekładki 48-nt (5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3').
      UWAGA: Sekwencja dystansowa 48-nt to 5'-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAT-3'. Na przykład dla STTM-miR160 starter do przodu powinien mieć wartość 5'-CgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-G AGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'; starter odwrotny powinien mieć postać 5'-gAggAgAagAgCCgT-TGCCTGGCT C-TAG-C CTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3' (Rysunek 1).
    3. Amplifikować fragment STTM w objętości 50 μl metodą PCR, używając zsyntetyzowanego uniwersalnego przekładki 48-nt jako matrycy i polimerazy DNA o wysokiej wierności.
      1. Reakcję PCR należy przeprowadzić mieszając 0,5 μl każdego startera (40 μM), 0,5 μl 48-nt oligo dystansowego (40 μM), 5 μl 10x buforu PCR, 1 μl mieszaniny dNTP (po 10 mM), 0,1 μl polimerazy DNA o wysokiej wierności (10 U/μL ) i 43 μl ddH2O do całkowitej objętości 50 μL. Wykonaj standardową amplifikację PCR w następujący sposób: 94 °C przez 3 min, 32 cykle po 94 °C przez 45 s, 60 °C przez 45 s i 72 °C przez 60 s.
    4. Oczyść fragment STTM przez wytrącanie etanolu. Dodać 2,5 objętości etanolu i 1/10 objętości 3 M octanu sodu (pH = 4,0) do produktów PCR. Energicznie wymieszać i odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant i przepłukać osad 1 ml 70% etanolu. Wysuszyć osad i rozpuścić go w 20 μl ddH2O.
      UWAGA: Użyj elektroforezy DNA, aby sprawdzić amplifikację produktów STTM PCR.
    5. Ustawić reakcję polimerazy DNA T4 na lodzie, mieszając 2,5 μl oczyszczonego produktu STTM PCR, 0,5 μl 10x buforu polimerazy DNA T4, 0,05 μl 1 M ditiotreitolu (DTT), 0,25 μl 100 mM dATP, 0,1 μl polimerazy DNA T4 (3 U/μL) i 1,6 μL ddH2O do całkowitej objętości 5 μL. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 15 minut, a następnie poddawać produkty działaniu w temperaturze 75 °C przez 20 minut w celu inaktywacji polimerazy DNA T4.
  2. Przygotuj konstrukcję VbMS opartą na PVX.
    1. Trawić 5 μg plazmidu PVX-LIC 38 z 2,5 μl SmaI (20 U/μL) w objętości 100 μL.
    2. Dodać równą objętość fenolu:chloroformu:izopropanolu (25:24:1, pH = 6,7/8,0) do strawionych produktów PVX-LIC i energicznie wymieszać. Wirować przy 14 000 x g przez 10 minut i przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej. Dodać równą objętość chloroformu: izopropanolu (24:1) i energicznie mieszać. Wirować przy 14 000 x g przez 10 min.
      UWAGA: Wektor PVX-LIC zawiera kasetę LIC do klonowania. Kaseta LIC wektora PVX-LIC zawiera gen ccdB i gen oporności na chloramfenikol i musi być utrzymywana/rozmnażana w szczepie E. coli DB3.1 przy użyciu pożywki LB zawierającej kanamycynę (50 μg/l) i chloramfenikol (15 μg/l).
    3. Przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej. Dodać 2,5 objętości etanolu i 1/10 objętości 3 M octanu sodu (pH = 4,0) i energicznie wymieszać. Odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut i usunąć supernatant.
    4. Opłucz granulat 1 ml 70% etanolu i energicznie zmieszaj. Odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut i usunąć supernatant. Wysuszyć osad i rozpuścić strawiony plazmid PVX-LIC w 100 μl ddH2O.
    5. Ustawić reakcję polimerazy DNA T4 na lodzie, mieszając 2,5 μl strawionego DNA wektora PVX-LIC, 0,5 μl 10x buforu polimerazy DNA T4, 0,05 μl 1 M DTT, 0,25 μl 100 mM dTTP i 0,1 μl polimerazy DNA T4 (3 U/μL) w całkowitej objętości 5 μL. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 15 minut i poddawać działaniu produktów leczniczych w temperaturze 75 °C przez 20 minut w celu inaktywacji polimerazy DNA T4.
  3. Sklonuj sekwencję STTM do wektora PVX-LIC za pomocą reakcji LIC. Wymieszać produkty STTM PCR poddane działaniu polimerazy DNA T4 (5 μl) i plazmidy PVX-LIC poddane działaniu polimerazy DNA T4 (5 μl). Inkubować w temperaturze 70 °C przez 5 minut, schładzać do temperatury 22 °C przy narastaniu 0,1 °C/s i utrzymywać w temperaturze 22 °C przez 30 minut za pomocą maszyny do PCR.
    UWAGA: Wydłuż czas inkubacji do nocy w temperaturze 4 °C, aby osiągnąć wyższą wydajność klonowania LIC.
  4. Przekształć 5 μl produktów reakcji LIC w E. coli DH5α i wyhoduj na płytce LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny62,63. Wybierz i zweryfikuj dodatnie kolonie metodą PCR ze starterami klonującymi i uniwersalnym starterem dla wektora PVX-LIC, a następnie sekwencjonuj.
    1. Przeprowadzić PCR kolonii ze starterem do przodu dla PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') w połączeniu ze starterem odwrotnym do klonowania STTM w celu identyfikacji klonów z dodatnim wynikiem testu. Rozmiar pasma PCR powinien wynosić ~300 bp.
      UWAGA: Sprawdź sekwencje fragmentów STTM za pomocą sekwencjonowania cyklu terminatora64,65.
  5. Wyizoluj plazmidy PVX-STTM od zwalidowanych klonów i przekształć je w szczepy Agrobacterium GV3101, GV2260 lub EHA10562,63. Zweryfikuj kolonie Agrobacterium za pomocą PCR.
    UWAGA: Potwierdź kolonie Agrobacterium metodą PCR, używając startera do przodu dla PVX-LIC i startera odwrotnego do klonowania STTM.

3. Wykonaj test VbMS oparty na PVX w roślinach ziemniaka.

  1. Przeszczep 4-tygodniowe rośliny ziemniaka in vitro do gleby. Przesadzone rośliny zostaną poddane testowi VbMS 3–4 dni później.
  2. Zaszczepić rośliny ziemniaka Agrobacterium zawierającym plazmidy PVX-STTM.
    UWAGA: W przypadku testu VbMS w ziemniakach infiltracja za pośrednictwem Agrobacterium i inokulacja drapaniem wykałaczką są wykonywane jednocześnie.
    1. Pobrać i zaszczepić dodatnie transformanty zawierające wektory PVX-STTM w 50 ml płynnego LB zawierającego 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml ryfampicyny. Hodować w inkubatorze o temperaturze 28 °C przy prędkości obrotowej 220 obr./min przez 16 godzin, aż OD600 = 1,0.
    2. W tym samym czasie umieść dodatnie kolonie Agrobacterium na co najmniej dwóch nowych płytkach LB zawierających 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml ryfampicyny i rosnąć w temperaturze 28 °C przez 1 dzień. Uwzględnij wektor PVX-LIC38,66 jako kontrolę, a PVX-GFP67,68 do monitorowania rozprzestrzeniania się wirusa.
    3. Zebrać płynną kulturę Agrobacterium przez odwirowanie przy 3 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki Agrobacterium z równą objętością buforu infiltracyjnego (10 mM MgCl2, 10 mM MES i 200 μM acetosyringonu, pH = 5,6) i dostosować do OD600 = 1,0. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 6 godzin.
    4. Naciekać kulturę Agrobacterium do abaksjalnej strony w pełni rozwiniętych liści za pomocą 1 ml strzykawki bezigłowej.
      1. Odwróć i przytrzymaj liść jedną ręką, a następnie jednym palcem podeprzyj blaszkę liścia od strony adaksjalnej w miejscu infiltracji. Drugą ręką trzymać strzykawkę pionowo do powierzchni liścia i infiltrować kulturę Agrobacterium do aosialnej strony blaszki.
    5. Zeskrob kulturę Agrobacterium z płytek LB i podrap powierzchnię łodygi pierwszego lub dwóch międzywęźli naciekanych roślin ziemniaka wykałaczką. Delikatnie podrap naskórek łodygi. Unikaj przebijania łodygi, ponieważ może to spowodować poważne uszkodzenie roślin.
  3. Infiltrowane rośliny uprawiać w temperaturze 22 °C przy 16 h światła/8 h ciemnym fotoperiodzie i natężeniu światła 120 μmol/m2∙ s1 w szklarni.
    UWAGA: Fenotypy spowodowane wyciszeniem miRNA zwykle pojawiają się w ciągu 2-4 tygodni po inokulacji (Rysunek 2, Rysunek 3). Zwykle potrzeba 10-20 dni, aby fenotyp VbMS pojawił się po infiltracji. Fenotyp VbMS zależy od właściwości specyficznego miRNA i genów docelowych, warunków wzrostu i odmian ziemniaka.

4. Wykonaj analizę wyrażeń.

  1. Kiedy fenotypy pojawiają się po 2-4 tygodniach od inokulacji, zbierz nożyczkami tkanki, takie jak pędy, liście, kwiaty lub korzenie z fenotypami z roślin VbMS i tkanki z roślin kontrolnych. Wyizolować całkowite RNA z pobranych tkanek.
  2. Sprawdź jakość RNA za pomocą elektroforezy62,63 i określ ilościowo stężenie RNA, mierząc absorbancję OD260 za pomocą spektrofotometru.
  3. Użyj pętli macierzystej z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym PCR (RT-PCR) do analizy ekspresji miRNA.
    1. W przypadku określonych miRNA zaprojektuj starter odwrotnej transkrypcji w pętli macierzystej. Startery RT z pętlą macierzystą zawierają uniwersalny szkielet 5' i przedłużenie 3' 6-nt specyficznego miRNA. Zaprojektuj uniwersalny szkielet 5' (5'- GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3'), który tworzy strukturę pętli macierzystej. (Wielka litera odpowiada odwrotnej sekwencji powtórzonej, a mała litera obszarowi pętli).
    2. Część sekwencji szkieletowej 5', która tworzy pętlę, służy jako odwrotny starter do późniejszej amplifikacji PCR (sekwencja pogrubiona kursywą w sekwencji szkieletowej). Dodaj sekwencję przedłużenia 6-nt, która jest odwrotnie komplementarna do końca 3' miRNA będącego przedmiotem zainteresowania do startera pętli macierzystej, aby zapewnić swoistość dla odwrotnej transkrypcji (rysunek uzupełniający 1A).
      UWAGA: Zaprojektuj elementarz odwrotnej transkrypcji pętli rdzenia zgodnie z opisem Chen et al.69 i Erika Varkonyi-Gasic et al.70,71,72. Na przykład starter odwrotnej transkrypcji pętli macierzystej dla Stu-miR160 został zaprojektowany jako 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC, GGCATA-3'. Starter odwrotnej transkrypcji pętli macierzystej dla rodziny ziemniaków miR165/166 został zaprojektowany jako 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAGAC, GGGG(A/G)A-3'. (Pogrubione sekwencje wielkich liter zapewniają specyficzność odwrotnej transkrypcji dla określonych miRNA).
    3. Ustaw reakcję odwrotnej transkrypcji, mieszając 50–200 ng całkowitego RNA, 1 μl startera odwrotnej transkrypcji pętli macierzystej (100 μM), 2 μl buforu 10x, 0,2 μl inhibitora RNazy (40 U/μL), 0,25 μl dNTP (10 mM każdy) i 1 μl odwrotnej transkryptazy (200 U/μL) na lodzie. Dodać ddH2O bez nukleaz do całkowitej objętości 20 μl.
    4. Wykonaj odwrotną transkrypcję przy użyciu procedury pulsacyjnej odwrotnej transkrypcji. Inkubować mieszaninę reakcji odwrotnej transkrypcji w temperaturze 16 °C przez 30 minut, przeprowadzać cykl temperaturowy 30 °C przez 30 s, 42 °C przez 30 s i 50 °C przez 1 s, w sumie 60 cykli, a następnie dezaktywować odwrotną transkryptazę przez inkubację w temperaturze 85 °C przez 5 minut.
    5. W przypadku analizy ekspresji miRNA PCR w czasie rzeczywistym, zaprojektuj starter do przodu na podstawie sekwencji miRNA, ale nie uwzględniaj sekwencji, które pokrywają się z wyżej zaprojektowanym starterem odwrotnej transkrypcji pętli macierzystej. Dodaj przedłużenie 3–7-nt do 5' przedniego startera, aby zoptymalizować długość, temperaturę topnienia i zawartość GC (rysunek uzupełniający 1).
      UWAGA: Uniwersalny podkład odwrotny to 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. Na przykład starter odwrotnej transkrypcji pętli macierzystej dla Stu-miR160 został zaprojektowany jako 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'. Starter odwrotnej transkrypcji pętli macierzystej dla rodziny miR165/166 to 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'. Pogrubione sekwencje służą jako 5-calowe przedłużenia do optymalizacji podkładu. Startery odwrotnej transkrypcji pętli macierzystej i startery PCR w czasie rzeczywistym dla miRNA można zaprojektować za pomocą narzędzia do projektowania starterów miRNA73.
  4. Zsyntetyzuj cDNA docelowych mRNA za pomocą standardowej PCR Z ODWROTNĄ TRANSKRYPCJĄ (RT-PCR). Inkubować mieszaninę reakcji odwrotnej transkrypcji w temperaturze 37 °C przez 60 minut i inaktywować odwrotną transkryptazę przez ogrzewanie do 85 °C przez 5 min.
    UWAGA: (1) Przewiduj docelowe mRNA za pomocą psRNATarget program74, jeśli docelowe mRNA nie są znane. (2) Uniwersalnym starterem odwrotnej transkrypcji dla mRNA jest zakotwiczony starter 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'.
  5. Ustaw reakcję PCR w czasie rzeczywistym zarówno dla miRNA będącego przedmiotem zainteresowania, jak i docelowych mRNA. Wymieszaj 0,5 μl matrycy cDNA, 5 μl 2x buforu PCR w czasie rzeczywistym z zielenią SYBR, 0,05 μl każdego startera do przodu i do tyłu (40 μM) i 4,4 μl ddH2O w całkowitej objętości 5 μL na lodzie.
  6. Inkubować w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 3 s i w temperaturze 60 °C przez 30 s. Przeprowadzić następującą analizę krzywej topnienia w następujący sposób: Inkubować w temperaturze 95 °C przez 15 s, schładzać do temperatury 60 °C przy rampie 20 °C/s, utrzymywać w temperaturze 60 °C przez 60 s, podgrzać do 95 °C z prędkością 0,2 °C/s i utrzymywać w temperaturze 95 °C przez 15 s. Przeanalizuj wartościC t za pomocą metod ΔΔCt76,77 i wykreśl średnie z błędami standardowymi.
    UWAGA: (1) Startery PCR w czasie rzeczywistym dla docelowych mRNA można zaprojektować zgodnie z opisem75. (2) Gen poliubikwityny 10 ziemniaka może służyć jako wewnętrzna kontrola normalizacji w ziemniakach. Starterem do przodu dla genu poliubikwityny ziemniaka 10 jest 5'-ATGTTGCCTTTCTTATGTGTGGGGTTG-3', a starterem odwrotnym 5'-TTATTTATTCACATAAACGACAGTTCAACC-3'. (3) W przypadku analizy PCR w czasie rzeczywistym, zanieczyszczenie i tworzenie się dimerów starterów może generować fałszywie dodatnie wyniki. Aby monitorować niespecyficzną amplifikację i zwiększyć odpowiedzialność analizy PCR w czasie rzeczywistym, zaleca się włączenie kontroli bez matrycy i odwrotnej transkryptazy do testów PCR w czasie rzeczywistym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 2 przedstawia rośliny ziemniaka (odmiana Katahdin) PVX-STTM165/166 z ektopowym wzrostem tkanek liściowych od strony abaksjalnej blaszki liściowej wzdłuż żyłek. Zaobserwowano również cięższe fenotypy, takie jak formowanie się liści w kształcie trąbek. W przeciwieństwie do nich, w roślinach kontrolnych PVX nie zaobserwowano żadnych anomalii fenotypowych. Wyniki te pokazują, że system VbMS był skuteczny w tłumieniu funkcji endogennych miRNA w tetraploidalnych roślinach ziemniaka, a syst...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiamy system wyciszania miRNA oparty na PVX w celu scharakteryzowania funkcji endogennych miRNA w ziemniaku poprzez integrację projektu STTM z wektorem PVX. System VbMS okazał się skuteczny w wyciszaniu miRNA165/166 w ziemniakach, wysoce konserwatywnej rodzinie miRNA u różnych gatunków roślin.

Podejście TM zostało opracowane w celu zakłócania ekspresji miRNA w oparciu o sztuczną mimikę docelową miRNA, która ma na celu stworzenie pętli niedopasowania w oczekiwanym miejscu cięcia w sekwe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Dziękujemy dr Yule Liu z Uniwersytetu Tsinghua za dostarczenie wektora PVX-LIC. Prace te były wspierane przez fundusz start-upowy z Texas A&M AgriLife Research oraz Hatch Project TEX0-1-9675 z USDA National Institute of Food and Agriculture do JS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100 &mikro; M dATP oraz 100 &mikro; M dTTPOmega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USATQAC136
3 M octan sodu, pH 4,0.Teknova, Hollister, CA 95023, USA
AcetosyringoneTCI America, Portland, OR 97203, USAD2666-25G
Szczepy Agrobacterium tumefaciens: GV3101, GV2260 lub EHA105.
ChloroformVWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USAVWRV0757-950ML
Dimetylosulfotlenek Dimethyl, DMSOTCI America, Portland, OR 97203, USAD0798-25G
DTTVWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USAVWRV0281-25G
E. coli DB3.1do utrzymania PVX-LIC i pTRV2e zawierających gen ccdB
E. coli DH5αdla konstruktów docelowych generowanych przez klonowanie LIC
Nawóz: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather FeedICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USAG99260
Odczynniki do PCR o wysokiej wierności: Polimeraza DNA KAPA HiFi z dNTPSekwencjonowanie Roche i nauki przyrodnicze, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		7958960001
AlkoholizoamylowyVWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, Stany ZjednoczoneVWRV0944-1L
Koptec Czysty etanol – 200 ProofDecon Labs, Król Prus, PA 19406 , USAV1005M
MESTCI America, Portland, OR 97203, USAM0606-250G
MgCl2ThermoFisher, Waltham, MA 02451, Stany ZjednoczoneMFCD00149781
Odwrotna transkryptazaM-MuLVNew England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USAM0253L
Spektrometr nanokroplowy: NanoDrop OneC Mikroobjętościowy spektrofotometr UV-Vis z Wi-FiThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MaszynaND-ONEC-W
PCR: Bio-Rad MyCycler PCR SystemBio-Rad, Hercules, Kalifornia 94547, USA170-9703
Maszyna do PCR: Eppendorf Mastercycler proEppendorf, Hauppauge, NY 11788, Stany Zjednoczone950030010
pH-metrSper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USALaboratoryjny miernik pH / mV - 860031
Fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1), pH 6,7/8,0.VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, StanyZjednoczone VWRV0883-400ML
Fitagel: Gellan GumAlfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USAJ63423-A1
PVX Grafika wektorowa: PVX-LICZhao i wsp., 2016
Maszyna do PCR w czasie rzeczywistym: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR SystemThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA4485697
Odczynnik do REAL-TIME PCR: KAPA, SYBR® Zestaw FAST qPCR Master Mix (2x)Roche Sekwencjonowanie i nauki przyrodnicze, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		7959389001
Enzym restrykcyjny: SmaINew England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USAR0141S
Odczynniki do odwrotnej transkrypcji: qScript cDNA SuperMixQuanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877, USA95107-100
Zestaw do ekstrakcji RNA: E.Z.N.A. Roślinne RNA ZestawOmega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , Stany ZjednoczoneSKU: D3485-01
Mysi inhibitor RNazyNowa Anglia BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USAM0314L
RNAzol RTSigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USAR4533
Gleba: Metro-Mix 360Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USAMetro-Mix 360
T4 Polimeraza DNA i buforNew England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USAM0203S
#S0297

Bibliografia

  1. Axtell, M. J., Meyers, B. C. Revisiting Criteria for Plant MicroRNA Annotation in the Era of Big Data. The Plant Cell. 30 (2), 272-284 (2018).
  2. Chen, X. Small RNAs and Their Roles in Plant Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25 (1), 21-44 (2009).
  3. Rubio-Somoza, I., Weigel, D. MicroRNA networks and developmental plasticity in plants. Trends in Plant Science. 16 (5), 258-264 (2011).
  4. Zhang, J. -P., et al. MiR408 Regulates Grain Yield and Photosynthesis via a Phytocyanin Protein. Plant Physiology. 175 (3), 1175-1185 (2017).
  5. Gupta, O. P., Karkute, S. G., Banerjee, S., Meena, N. L., Dahuja, A. Contemporary Understanding of miRNA-Based Regulation of Secondary Metabolites Biosynthesis in Plants. Frontiers in Plant Science. 8 (374), (2017).
  6. May, P., et al. The effects of carbon dioxide and temperature on microRNA expression in Arabidopsis development. Nature Communications. 4 (1), 2145(2013).
  7. Krützfeldt, J., Stoffel, M. MicroRNAs: A new class of regulatory genes affecting metabolism. Cell Metabolism. 4 (1), 9-12 (2006).
  8. Damodharan, S., Corem, S., Gupta, S. K., Arazi, T. Tuning of SlARF10A dosage by sly-miR160a is critical for auxin-mediated compound leaf and flower development. The Plant Journal. 96 (4), 855-868 (2018).
  9. Nizampatnam, N. R., Schreier, S. J., Damodaran, S., Adhikari, S., Subramanian, S. microRNA160 dictates stage-specific auxin and cytokinin sensitivities and directs soybean nodule development. The Plant Journal. 84 (1), 140-153 (2015).
  10. Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -K. Cold stress regulation of gene expression in plants. Trends in Plant Science. 12 (10), 444-451 (2007).
  11. Covarrubias, A. A., Reyes, J. L. Post-transcriptional gene regulation of salinity and drought responses by plant microRNAs. Plant, Cell, Environment. 33 (4), 481-489 (2010).
  12. Wang, S., et al. Suppression of nbe-miR166h-p5 attenuates leaf yellowing symptoms of potato virus X on Nicotiana benthamiana and reduces virus accumulation. Molecular Plant Pathology. 19 (11), 2384-2396 (2018).
  13. Canto-Pastor, A., et al. Enhanced resistance to bacterial and oomycete pathogens by short tandem target mimic RNAs in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (7), 2755-2760 (2019).
  14. Chiou, T. -J., Lin, S. -I. Signaling Network in Sensing Phosphate Availability in Plants. Annual Review of Plant Biology. 62 (1), 185-206 (2011).
  15. Sunkar, R., Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -K. Small RNAs as big players in plant abiotic stress responses and nutrient deprivation. Trends in Plant Science. 12 (7), 301-309 (2007).
  16. Kwenda, S., Birch, P. R. J., Moleleki, L. N. Genome-wide identification of potato long intergenic noncoding RNAs responsive to Pectobacterium carotovorum subspecies brasiliense infection. BMC Genomics. 17 (1), 614(2016).
  17. Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6(2014).
  18. Koc, I., Filiz, E., Tombuloglu, H. Assessment of miRNA expression profile and differential expression pattern of target genes in cold-tolerant and cold-sensitive tomato cultivars. Biotechnology, Biotechnological Equipment. 29 (5), 851-860 (2015).
  19. Zhang, N., et al. Identification of Novel and Conserved MicroRNAs Related to Drought Stress in Potato by Deep Sequencing. PLoS One. 9 (4), 95489(2014).
  20. Xie, F., Frazier, T. P., Zhang, B. Identification, characterization and expression analysis of MicroRNAs and their targets in the potato (Solanum tuberosum). Gene. 473 (1), 8-22 (2011).
  21. Zhang, R., Marshall, D., Bryan, G. J., Hornyik, C. Identification and Characterization of miRNA Transcriptome in Potato by High-Throughput Sequencing. PLoS One. 8 (2), 57233(2013).
  22. Yan, J., et al. Effective Small RNA Destruction by the Expression of a Short Tandem Target Mimic in Arabidopsis. The Plant Cell. 24 (2), 415-427 (2012).
  23. Roodbarkelari, F., Groot, E. P. Regulatory function of homeodomain-leucine zipper (HD-ZIP) family proteins during embryogenesis. New Phytologist. 213 (1), 95-104 (2017).
  24. Reichel, M., Millar, A. A. Specificity of plant microRNA target MIMICs: Cross-targeting of miR159 and miR319. Journal of Plant Physiology. 180, 45-48 (2015).
  25. Taylor, R. S., Tarver, J. E., Hiscock, S. J., Donoghue, P. C. J. Evolutionary history of plant microRNAs. Trends in Plant Science. 19 (3), 175-182 (2014).
  26. Schwab, R., Ossowski, S., Riester, M., Warthmann, N., Weigel, D. Highly Specific Gene Silencing by Artificial MicroRNAs in Arabidopsis. The Plant Cell. 18 (5), 1121-1133 (2006).
  27. Martin, A., et al. Graft-transmissible induction of potato tuberization by the microRNA miR172. Development. 136 (17), 2873-2881 (2009).
  28. Yang, L., et al. Overexpression of potato miR482e enhanced plant sensitivity to Verticillium dahliae infection. Journal of Integrative Plant Biology. 57 (12), 1078-1088 (2015).
  29. Tang, Y., et al. Virus-based microRNA expression for gene functional analysis in plants. Plant Physiology. 153 (2), 632-641 (2010).
  30. Voinnet, O. Origin, Biogenesis, and Activity of Plant MicroRNAs. Cell. 136 (4), 669-687 (2009).
  31. Teotia, S., Tang, G. To Bloom or Not to Bloom: Role of MicroRNAs in Plant Flowering. Molecular Plant. 8 (3), 359-377 (2015).
  32. Wu, G., Poethig, R. S. Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis thaliana by miR156 and its target SPL3. Development. 133 (18), 3539-3547 (2006).
  33. Zhao, L., Kim, Y., Dinh, T. T., Chen, X. miR172 regulates stem cell fate and defines the inner boundary of APETALA3 and PISTILLATA expression domain in Arabidopsis floral meristems. The Plant Journal. 51 (5), 840-849 (2007).
  34. Li, J., Millar, A. A. Expression of a microRNA-Resistant Target Transgene Misrepresents the Functional Significance of the Endogenous microRNA: Target Gene Relationship. Molecular Plant. 6 (2), 577-580 (2013).
  35. Sha, A., et al. Virus-based microRNA silencing in plants. Plant Physiology. 164 (1), 36-47 (2014).
  36. Zhao, J., Liu, Y. Virus-based MicroRNA Silencing. Bio-protocol. 6 (2), 1714(2016).
  37. Yan, F., et al. A virus-based miRNA suppression (VbMS) system for miRNA loss-of-function analysis in plants. Biotechnology Journal. 9 (5), 702-708 (2014).
  38. Zhao, J., et al. An efficient Potato virus X-based microRNA silencing in Nicotiana benthamiana. Scientific Reports. 6, 20573(2016).
  39. Gu, Z., Huang, C., Li, F., Zhou, X. A versatile system for functional analysis of genes and microRNAs in cotton. Plant Biotechnology Journal. 12 (5), 638-649 (2014).
  40. Du, Z., et al. Using a viral vector to reveal the role of microRNA159 in disease symptom induction by a severe strain of cucumber mosaic virus. Plant Physiology. 164 (3), 1378-1388 (2014).
  41. Liao, Q., Tu, Y., Carr, J. P., Du, Z. An improved cucumber mosaic virus-based vector for efficient decoying of plant microRNAs. Scientific Reports. 5, 13178(2015).
  42. Liu, X., et al. Analyses of MiRNA Functions in Maize Using a Newly Developed ZMBJ-CMV-2bN81-STTM Vector. Frontiers in Plant Science. 10, 1277(2019).
  43. Yang, J., et al. Chinese Wheat Mosaic Virus-Induced Gene Silencing in Monocots and Dicots at Low Temperature. Frontiers in Plant Science. 9, 1627(2018).
  44. Jiao, J., Wang, Y., Selvaraj, J. N., Xing, F., Liu, Y. Barley Stripe Mosaic Virus (BSMV) Induced MicroRNA Silencing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). PLoS One. 10 (5), 0126621(2015).
  45. Jian, C., et al. Virus-Based MicroRNA Silencing and Overexpressing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). Frontiers in Plant Science. 8, 500(2017).
  46. Barrell, P. J., Meiyalaghan, S., Jacobs, J. M. E., Conner, A. J. Applications of biotechnology and genomics in potato improvement. Plant Biotechnology Journal. 11 (8), 907-920 (2013).
  47. Peng, T., et al. A Resource for Inactivation of MicroRNAs Using Short Tandem Target Mimic Technology in Model and Crop Plants. Molecular Plant. 11 (11), 1400-1417 (2018).
  48. Teotia, S., Zhang, D., Tang, G. Functional Genomics: Methods and Protocols. Kaufmann, M., Klinger, C., Savelsbergh, A. , Springer. New York. 337-349 (2017).
  49. Dommes, A. B., Herbert, D. B., Kivivirta, K. I., Gross, T., Becker, A. Virus-induced gene silencing: empowering genetics in non-model organisms. Journal of Experimental Botany. 70 (3), 757-770 (2018).
  50. Lacomme, C., Chapman, S. Use of Potato Virus X (PVX)-Based Vectors for Gene Expression and Virus-Induced Gene Silencing (VIGS). Current Protocols in Microbiology. 8 (1), 11-16 (2008).
  51. Lim, H. -S., et al. Efficiency of VIGS and gene expression in a novel bipartite potexvirus vector delivery system as a function of strength of TGB1 silencing suppression. Virology. 402 (1), 149-163 (2010).
  52. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), 134-141 (2007).
  53. Tang, G., et al. Construction of short tandem target mimic (STTM) to block the functions of plant and animal microRNAs. Methods. 58 (2), 118-125 (2012).
  54. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Research. 39, suppl 1 152-157 (2010).
  55. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (1), 68-73 (2013).
  56. Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, suppl 1 109-111 (2004).
  57. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, suppl 1 140-144 (2006).
  58. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, suppl 1 154-158 (2007).
  59. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47 (1), 155-162 (2018).
  60. Yin, K., Tang, Y., Zhao, J. Genome-wide characterization of miRNAs involved in N Gene-mediated Immunity in response to tobacco mosaic virus in Nicotiana benthamiana. Evolutionary Bioinformatics. , Supplementary Files 20744 1-11 (2015).
  61. Dunker, F., et al. Oomycete small RNAs invade the plant RNA-induced silencing complex for virulence. bioRxiv. , 689190(2019).
  62. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. A Laboratory Mannual 4th. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
  63. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd Edition. , Cold spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).
  64. Anderson, S., et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. 290 (5806), 457-465 (1981).
  65. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  66. Qian, L., et al. Hsp90 Interacts With Tm-22 and Is Essential for Tm-22-Mediated Resistance to Tobacco mosaic virus. Frontiers in Plant Science. 9 (411), (2018).
  67. Voinnet, O., Baulcombe, D. C. Systemic signalling in gene silencing. Nature. 389 (6651), 553(1997).
  68. Li, C., et al. A cis Element within Flowering Locus T mRNA Determines Its Mobility and Facilitates Trafficking of Heterologous Viral RNA. Journal of Virology. 83 (8), 3540-3548 (2009).
  69. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. 33 (20), 179(2005).
  70. Varkonyi-Gasic, E., Hellens, R. P. RNAi and Plant Gene Function Analysis: Methods and Protocols. Kodama, H., Komamine, A. , Humana Press. 145-157 (2011).
  71. Varkonyi-Gasic, E., Wu, R., Wood, M., Walton, E. F., Hellens, R. P. Protocol: a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs. Plant Methods. 3 (1), 12(2007).
  72. Varkonyi-Gasic, E. Plant Epigenetics: Methods and Protocols. Kovalchuk, I. , Springer US. 163-175 (2017).
  73. Czimmerer, Z., et al. A Versatile Method to Design Stem-Loop Primer-Based Quantitative PCR Assays for Detecting Small Regulatory RNA Molecules. PLoS One. 8 (1), 55168(2013).
  74. Dai, X., Zhuang, Z., Zhao, P. X. psRNATarget: a plant small RNA target analysis server (2017 release). Nucleic Acids Research. 46 (1), 49-54 (2018).
  75. Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115(2012).
  76. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  77. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  78. Todesco, M., Rubio-Somoza, I., Paz-Ares, J., Weigel, D. A Collection of Target Mimics for Comprehensive Analysis of MicroRNA Function in Arabidopsis thaliana. PLoS Genetics. 6 (7), 1001031(2010).
  79. Franco-Zorrilla, J. M., et al. Target mimicry provides a new mechanism for regulation of microRNA activity. Nature Genetics. 39 (8), 1033-1037 (2007).
  80. Jiang, N., et al. Tomato lncRNA23468 functions as a competing endogenous RNA to modulate NBS-LRR genes by decoying miR482b in the tomato-Phytophthora infestans interaction. Horticulture Research. 6 (1), 28(2019).
  81. Ivashuta, S., et al. Regulation of gene expression in plants through miRNA inactivation. PLoS One. 6 (6), 21330(2011).
  82. Reichel, M., Li, Y., Li, J., Millar, A. A. Inhibiting plant microRNA activity: molecular SPONGEs, target MIMICs and STTMs all display variable efficacies against target microRNAs. Plant Biotechnology Journal. 13 (7), 915-926 (2015).
  83. Wong, G., Alonso-Peral, M., Li, B., Li, J., Millar, A. A. MicroRNA MIMIC binding sites: Minor flanking nucleotide alterations can strongly impact MIMIC silencing efficacy in Arabidopsis. Plant Direct. 2 (10), 00088(2018).
  84. Paschoal, A. R., Lozada-Chávez, I., Domingues, D. S., Stadler, P. F. ceRNAs in plants: computational approaches and associated challenges for target mimic research. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1273-1289 (2018).
  85. Faivre-Rampant, O., et al. Potato Virus X-Induced Gene Silencing in Leaves and Tubers of Potato. Plant Physiology. 134 (4), 1308-1316 (2004).
  86. Zhao, J., et al. Virus-Induced Gene Silencing in Diploid and Tetraploid Potata Species. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  87. Leisner, C. P., et al. Genome sequence of M6, a diploid inbred clone of the high-glycoalkaloid-producing tuber-bearing potato species Solanum chacoense, reveals residual heterozygosity. The Plant Journal. 94 (3), 562-570 (2018).
  88. Aversano, R., et al. The Solanum commersonii Genome Sequence Provides Insights into Adaptation to Stress Conditions and Genome Evolution of Wild Potato Relatives. The Plant Cell. 27 (4), 954-968 (2015).
  89. The Potato Genome Sequencing, C. et al. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato. Nature. 475, 189(2011).
  90. Navarro, C., et al. Control of flowering and storage organ formation in potato by FLOWERING LOCUS T. Nature. 478 (7367), 119-122 (2011).
  91. Lehretz, G. G., Sonnewald, S., Hornyik, C., Corral, J. M., Sonnewald, U. Post-transcriptional Regulation of FLOWERING LOCUS T Modulates Heat-Dependent Source-Sink Development in Potato. Current Biology. 29 (10), 1614-1624 (2019).
  92. Natarajan, B., et al. MiRNA160 is associated with local defense and systemic acquired resistance against Phytophthora infestans infection in potato. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 2023-2036 (2018).
  93. Li, F., et al. MicroRNA regulation of plant innate immune receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1790-1795 (2012).
  94. Weiberg, A., et al. Fungal Small RNAs Suppress Plant Immunity by Hijacking Host RNA Interference Pathways. Science. 342 (6154), 118-123 (2013).
  95. Huang, C. -Y., Wang, H., Hu, P., Hamby, R., Jin, H. Small RNAs - Big Players in Plant-Microbe Interactions. Cell Host, Microbe. 26 (2), 173-182 (2019).
  96. Shahid, S., et al. MicroRNAs from the parasitic plant Cuscuta campestris target host messenger RNAs. Nature. 553 (7686), 82-85 (2018).
  97. Weiberg, A., Jin, H. Small RNAs-the secret agents in the plant-pathogen interactions. Current Opinion in Plant Biology. 26, 87-94 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wyciszanie mikroRNA oparte na wirusachprojektowanie mimik w celuinfiltracja Agrobacteriumpolimeraza DNA T4klonowanie niezale ne od ligacjiizolacja RNART PCRanaliza fenotypowapodej cia transgeniczne
Wyciszanie mikroRNA na bazie wirusa ziemniaka (VbMS) w ziemniakach.
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.