Artykuł metodologiczny

Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61068

⸱

24 maja 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pulmonary Diseases, Amsterdam UMC, VU University Medical Center, Amsterdam Cardiovascular Sciences (ACS), 2BIOS Lab-on-a-Chip group, University of Twente, 3Applied Stem Cell Technologies Group, University of Twente, 4Department of Cardio-thoracic Surgery, Amsterdam UMC, VU University Medical Center, 5Institute of Physiology, Charité-Universitätsmedizin, 6German Heart Center

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy model choroby naczyniowej in vitro do zbadania interakcji krwi pełnej ze śródbłonkiem pochodzącym od pacjenta. System ten pozwala na badanie właściwości trombogennych pierwotnych komórek śródbłonka w różnych okolicznościach. Metoda ta jest szczególnie przydatna do oceny trombogenności in situ i terapii przeciwzakrzepowej w różnych fazach krzepnięcia.

Streszczenie

Powstawanie skrzepów krwi wiąże się ze złożonymi interakcjami między komórkami śródbłonka, ich leżącą u podstaw matrycą, różnymi komórkami krwi i białkami. Śródbłonek jest głównym źródłem wielu głównych cząsteczek hemostatycznych, które kontrolują agregację płytek krwi, krzepnięcie i fibrynolizę. Chociaż mechanizm zakrzepicy jest badany od dziesięcioleci, badania in vitro koncentrują się głównie na sytuacjach uszkodzenia naczyń, w których dochodzi do odsłonięcia macierzy podśródbłonkowej, lub na interakcjach między komórkami z pojedynczymi składnikami krwi. Nasza metoda pozwala na badanie interakcji między krwią pełną a nienaruszoną, zlewającą się siecią komórek naczyniowych.

Wykorzystując pierwotne ludzkie komórki śródbłonka, ten protokół daje unikalną możliwość badania wpływu komórek śródbłonka na dynamikę skrzepliny i daje cenne informacje na temat patofizjologii choroby zakrzepowej. Zastosowanie specjalnie zaprojektowanych mikroprzepływowych kanałów przepływu pozwala na zastosowanie specyficznych dla choroby geometrii naczyń krwionośnych i modelowanie specyficznych morfologicznych zmian naczyniowych. Rozwój skrzepliny jest rejestrowany w czasie rzeczywistym i ilościowo charakteryzowany przez adhezję płytek krwi i odkładanie fibryny. Wpływ funkcji śródbłonka na zmienioną dynamikę skrzepliny określa się za pomocą postanalizy poprzez barwienie immunofluorescencyjne określonych cząsteczek.

Reprezentatywne wyniki opisują konfigurację eksperymentalną, zbieranie danych i ich analizę. W zależności od pytania badawczego, parametry dla każdej sekcji mogą być dostosowywane, w tym typ komórki, szybkość ścinania, geometria kanału, terapia lekowa i procedury postanalityczne. Protokół jest walidowany poprzez ilościowe określenie powstawania skrzepliny w śródbłonku tętnicy płucnej u pacjentów z przewlekłą chorobą zakrzepowo-zatorową.

Wprowadzenie

Śródbłonek tworzy wewnętrzną warstwę komórkową naczyń krwionośnych i oddziela krew od otaczającej tkanki. Został opisany jako dynamiczny narząd, który aktywnie reguluje swoje mikrośrodowisko i reaguje na bodźce zewnętrzne1. Ze względu na bezpośredni kontakt z przepływającą krwią, śródbłonek odgrywa kluczową rolę w kontroli hemostazy i zakrzepicy oraz jest głównym źródłem wielu głównych cząsteczek regulatorowych, które kontrolują agregację płytek krwi, krzepnięcie i fibrynolizę2. Zdrowe, nieaktywowane komórki śródbłonka (EC) wytwarzają kilka cząsteczek, które przeciwdziałają aktywacji płytek krwi i zapobiegają krzepnięciu i tworzeniu się skrzeplin w celu utrzymania przepływu krwi, takich jak prostacyklina, trombomodulina lub inhibitor szlaku czynnika tkankowego (TFPI)2,3. Zapobiega to adhezji płytek krwi, agregacji płytek krwi i tworzeniu się skrzeplin. Uszkodzenie lub aktywacja ściany naczynia powoduje powstanie fenotypu śródbłonka prokoagulacyjnego, który inicjuje miejscową adhezję płytek krwi i tworzenie skrzepów2,4. Po aktywacji śródbłonka płytki krwi przylegają do czynnika von Willebranda (VWF), białka multimerycznego uwalnianego z EC lub do odsłoniętych miejsc wiązania leżącej poniżej macierzy podśródbłonkowej. Następnie zmiany molekularne w płytkach krwi i ekspozycja na czynnik tkankowy (TF) inicjują aktywację układu krzepnięcia, który indukuje tworzenie skrzepliny przez polimeryzację fibryny5,6. Powstały skrzep stanowi podstawę do zamknięcia rany poprzez reendotelializację7. Zaburzenia układu krzepnięcia mogą powodować zaburzenia krzepnięcia, takie jak choroba von Willebranda, hemofilia lub zakrzepica, które często wynikają z rozregulowanej równowagi pro- i przeciwzakrzepowej śródbłonkowego szlaku hemostatycznego2,3.

Proces hemostazy występuje zarówno w krążeniu tętniczym, jak i żylnym. Jednak mechanizmy leżące u podstaw zakrzepicy tętniczej i żylnej są zasadniczo różne. Podczas gdy zakrzepica tętnicza, obserwowana w chorobie niedokrwiennej serca, jest głównie spowodowana pęknięciem blaszki miażdżycowej w warunkach dużego stresu ścinającego, zakrzepica żylna rozwija się głównie przy braku uszkodzenia śródbłonka w stanie zastoju8,9,10. Skrzeplina żyły głębokiej może ulec embolicji i przemieszczać się w kierunku tętnic płucnych, gdzie powoduje zatorowość płucną. Może to prowadzić do przewlekłych przeszkód naczyniowych prowadzących do znacznego upośledzenia zdolności funkcjonalnych, które mogą sprzyjać rozwojowi chorób płuc, w tym rozwojowi przewlekłego zakrzepowo-zatorowego nadciśnienia płucnego (CTEPH)11,12,13,14. CTEPH charakteryzuje się podwyższonym ciśnieniem płucnym spowodowanym niedrożnością tętnic płucnych przez materiał zakrzepowo-zatorowy po co najmniej trzymiesięcznej terapii przeciwzakrzepowej15. Oprócz zatorowości płucnej postuluje się, że śródbłonek płucny zapewnia środowisko prozakrzepowe w CTEPH, które ułatwia zakrzepicę in situ i przewlekłą niedrożność tętnic płucnych, powodując wzrost ciśnienia krwi, który ostatecznie może prowadzić do niewydolności serca, jeśli nie jest leczony16,17.

W ciągu ostatnich lat, różne badania doprowadziły do opracowania testów do badania powstawania skrzeplin poprzez pomiar funkcji płytek krwi i krzepnięcia18. Jednak większość z nich albo bada interakcję krwi pełnej z pojedynczymi składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej, takimi jak kolageny lub fibryny, albo funkcję śródbłonka w interakcji z pojedynczymi składnikami krwi, takimi jak interakcja śródbłonek-płytka krwi lub śródbłonek-leukocyty19,20,21,22. Testy te są najczęściej wykonywane na ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), ponieważ komórki te są łatwe do uzyskania. Jednak geny hemostatyczne są różnie wyrażane w całym drzewie naczyniowym, typach naczyń i układach narządów23,24, co sprawia, że użycie HUVEC do reprezentowania komórek śródbłonka zaangażowanych w zakrzepicę tętniczą lub zatorowość płucną jest problematyczne23.

Oprócz plastyczności EC, specyficzne dla choroby zmiany hemodynamiczne i zmiany w morfologii naczyń mogą sprzyjać tworzeniu się skrzepliny w normalnym śródbłonku25. Wyższe tempo ścinania, na przykład spowodowane miejscowym zwężeniem naczyń krwionośnych lub zmianami w geometrii naczyń, może skutkować ostrym tworzeniem się skrzepliny, powodując zwężenie, które przyspiesza zatrzymanie przepływu krwi26. Zastosowanie specjalnie zaprojektowanych mikroinżynieryjnych kanałów przepływowych pozwala na specyficzne projektowanie geometrii naczyń krwionośnych, które są reprezentatywne dla (pato)biologii. W ten sposób możliwe jest zbadanie wpływu lokalnych sił biomechanicznych na zdrowych lub chorych EC27.

Dostępne są terapie przeciwzakrzepowe do celowania w różne fazy i cząsteczki w kaskadzie krzepnięcia, które stwarzają szczególne ryzyko i korzyści, które mogą być specyficzne dla niektórych zaburzeń. Podejście do modelowania chorób opisane w tym artykule jest szczególnie przydatne do testowania wpływu różnych terapii przeciwzakrzepowych i przeciwpłytkowych na dynamikę skrzepliny.

Celem jest przedstawienie modelu zakrzepicy, który obejmuje pierwotne EC, dając wszechstronny model odpowiedni do analizy różnych form zakrzepicy w zależności od rodzaju użytych pierwotnych EC. Jako ilustrację wykorzystaliśmy komórki śródbłonka tętnicy płucnej od pacjentów z CTEPH w interakcji z pełną ludzką krwią zawierającą wszystkie składniki biorące udział w tworzeniu skrzepliny (płytki krwi, leukocyty, erytrocyty, białka krzepnięcia i kofaktory). Podejście to może być stosowane w komercyjnych kanałach przepływu równoległego lub w niestandardowych kanałach przepływu mikroprzepływowego o specyficznej konstrukcji naczyniowej. W związku z tym model może być ostatecznie wykorzystany w badaniach nad powstawaniem i ustępowaniem skrzepliny, do oceny reakcji zapalnych w modelowaniu choroby, do terapii przeciwpłytkowej lub przeciwzakrzepowej, a ostatecznie do medycyny spersonalizowanej.

To badanie opisuje izolację pierwotnych komórek śródbłonka ludzkiej tętnicy płucnej. W celu wyizolowania innych pierwotnych typów ludzkich komórek śródbłonka odnosimy się do wcześniej opublikowanych metod, w tym komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc25, ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej28 oraz krążących krwią komórek tworzących kolonię śródbłonka Rysunek 1A29.

Protokół

Badanie to zostało zatwierdzone przez instytucjonalną Komisję Etyki Medycznej Centrum Medycznego VU w Amsterdamie, Holandia (METC VUmc, NL69167.029.19). Izolacja pierwotnych komórek oraz pobieranie krwi od osób badanych zostało przeprowadzone po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody, zgodnie z Deklaracją Helsińską.

1. Izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka tętnicy płucnej (PAEC)

  1. Podgrzać w kąpieli wodnej w temperaturze 37 ˚C kompletną pożywkę dla komórek śródbłonka (cECM) uzupełnioną o 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny (P/S), 1% suplementów wzrostu dla komórek śródbłonka (ECGS) oraz 1% nieessentialnych aminokwasów (NEAA). Nożyczki chirurgiczne, pęsetę i skalpel wysterylizować za pomocą sterylizatora termicznego w temperaturze 120 ˚C lub 70% etanolu. Izolację PAEC przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza w warunkach sterylnych.
  2. Płytkę hodowlaną o średnicy 60 mm z wysokim powinowactwem do wiązania komórek (patrz Tabela materiałów) pokryć 2 mL fibronektyny w stężeniu 5 µg/mL i inkubować w temperaturze 37 ˚C przez co najmniej 15 min.
  3. Pozyskać tkankę tętnicy płucnej (PA) z zabiegu chirurgicznego (np. lobektomii lub endarterektomii płucnej), przechowywać w schłodzonym do 4 ˚C buforze do sznura pępowinowego (4 mM chlorku potasu, 140 mM chlorku sodu, 10 mM HEPES, 11 mM D-glukozy i 1% P/S, pH = 7,3) i trzymać na lodzie do momentu izolacji.
  4. Izolację komórek śródbłonka z PA przeprowadzić w ciągu 2 h po pobraniu tkanki. Ująć PA pęsetą i umieścić w 10 cm płytce Petriego w celu przemycia PBS. Jeśli PA ma wciąż kształt pierścienia, rozciąć tętnicę płucną nożyczkami. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie dotykać narzędziami najwewnętrznej warstwy naczynia, ponieważ śródbłonek jest łatwo uszkadzany i/lub usuwany.
  5. Usunąć fibronektynę z płytki hodowlanej i dodać 4 mL pożywki cECM.
  6. Ująć tkankę PA pęsetą i umieścić w pożywce. Następnie ostrożnie zeskrobać skalpelem wewnętrzną warstwę naczynia do pożywki. W ścianie naczynia często widoczne są zgromadzenia lipidów. Należy starać się ich unikać, ponieważ wpływają one na przyrost komórek.
  7. Hodować komórki aż do pojawienia się małych kolonii komórek śródbłonka.
  8. Wymieniać pożywkę co drugi dzień. W przypadku kontaminacji hodowli fibroblastami, oczyścić ją za pomocą magnetycznej separacji powinowactwa komórkowego dla CD144 przy użyciu zestawu, zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Do pierwszej puryfikacji zastosować metodę dwukolumnową, a do każdej kolejnej puryfikacji metodę jednokolumnową. Zazwyczaj hodowlę uznaje się za czystą, gdy cytometria przepływowa wykryje ≤10% komórek zanieczyszczających.
  9. Przesiewać komórki w stosunku od 1:3 do 1:4, aż do wyhodowania wystarczającej liczby PAEC do celów eksperymentalnych. Gdy PAEC będą gotowe do użycia, przejść do następnego kroku.
  10. Po puryfikacji pierwotne komórki śródbłonka muszą zostać scharakteryzowane pod kątem obecności markerów specyficznych dla EC (np. VE-kadheryny, CD31, TIE2) oraz braku markerów komórek mięśni gładkich (α-SMA), fibroblastów (wimentyny) i komórek nabłonkowych (cytocheratyny) (Rysunek 1B).

2. Przygotowanie komór przepływowych i monowarstw PAEC

UWAGA: W zależności od postawionej hipotezy należy użyć albo komercyjnie dostępnych komór przepływowych (patrz Tabela materiałów oraz Rysunek 1C Opcja A, krok 2.1 protokołu), albo wykonanej na zamówienie mikroprzepływowej komory przepływowej (Rysunek 1C Opcja B, krok 2.2 protokołu).

  1. Wysiew monowarstw komórek endotelialnych w komercyjnie dostępnych mikroslajdach
    UWAGA: Komercyjnie dostępne komory przepływowe są łatwe w użyciu i zapewniają laminarny profil przepływu w całym kanale, co umożliwia pracę przy wysokich prędkościach ścinania. Mikroslajdy te są zaprojektowane w sposób pozwalający na równoległe prowadzenie pomiarów w wielu kanałach i zapewniają dokładny oraz powtarzalny profil przepływu. Dzięki optymalizacji pod kątem mikroskopii odwróconej możliwe jest uzyskanie wysokiej jakości obrazów fluorescencyjnych. Ponadto dostępne są komory przepływowe o różnych wymiarach, rozmiarach kanałów lub geometriach. W tym teście preferowane są kanały przepływowe 6-dołkowe, ponieważ mikroslajdy te mają niewielkie wymiary i umożliwiają prowadzenie wielu pomiarów równolegle.
    1. Aby pokryć jeden kanał 6-dołkowego slajdu przepływowego (szerokość 3,5 mm x wysokość 0,4 mm x długość 17 mm), należy użyć 30 µL 0,1% żelatyny na kanał i inkubować w 37 ˚C przez co najmniej 15 min.
    2. Aby wysiać komórki do jednego kanału, należy trypsynizować 10 cm2 konfluentnych PAEC i wirować przy 300 x g przez 7 min w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Zawiesić PAEC w 600 µL cECM i nanieść pipetą 100 µL (1,5 cm2) zawiesiny komórkowej do jednego kanału. Zawiesina pokryje mikroslajd dzięki siłom kapilarnym. Jeśli proces przebiega zbyt wolno, mogą powstać pęcherzyki powietrza. Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza, stosując nieco większą siłę podczas pipetowania.
      UWAGA: Gęstość komórek wpływa na fenotyp endotelialny. Ilość 1,5 cm2 konfluentnych komórek na kanał oznacza nadmierną konfluencję, ponieważ powierzchnia kanału wynosi 0,6 cm2. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy hodować te komórki w kanałach przez kolejne 6 dni, aż osiągną maksymalną konfluencję.
    4. Dodać do kanału dodatkowe 50 µL cECM, aby zapewnić wystarczającą ilość medium do inkubacji nocnej w 37 ˚C, 5% CO2. Następnego dnia należy wymienić medium, aby wypłukać niezwiązane komórki.
    5. Hodować komórki przez 6 dni w 37 ˚C, 5% CO2 , aby PAEC mogły utworzyć trwałą, konfluentną monowarstwę. Wymieniać medium co drugi dzień, stosując 150 µL cECM.
    6. W 7. dniu poddać PAEC działaniu 100 µL 1 µM histaminy w ECM i 1% FBS bez żadnych innych dodatków przez 30 min przed analizą. Bodziec można dobrać ad libitum. Na przykład TNF-α jest powszechnie stosowany jako aktywator zapalny.
  2. Przygotowanie niestandardowych mikrofluidycznych komór przepływowych
    UWAGA: Niestandardowe komory przepływowe są dostosowane do potrzeb użytkownika, ponieważ ich wymiary i geometria mogą być łatwo zmieniane według preferencji. Na przykład, aby naśladować naczynie bardziej istotne fizjologicznie, można wprowadzić zwężenie (Rysunek 1D). Podejście to pozwala na wykorzystanie bardzo małych objętości krwi, co odzwierciedla sytuację w chorobach mikro naczyniowych.
    1. Litografia miękka polidimetylosiloksanu (PDMS) z użyciem wzorowanych wafli krzemowych
      1. Połączyć czynnik sieciujący PDMS i prepolimer na wadze mikroanalitycznej w stosunku 1:10 i dokładnie wymieszać za pomocą ogólnego mieszadła laboratoryjnego.
      2. Aby usunąć powstałe pęcherzyki powietrza, odgazować PDMS w desykatorze przez około 1 h.
      3. Wyłożyć szklaną szalkę Petriego folią aluminiową i dodać kilka kropel wody przed umieszczeniem wafla w wyłożonej szalce. Wafel służy jako forma dla niestandardowego kanału.
        UWAGA: Wafla lub formy dostarcza zaplecze clean room. Negatywny fotorezyst jest nanoszony na wafle w celu stworzenia wystających struktur przypominających kanały o następujących typowych wymiarach: szerokość 300 µm x wysokość 270 µm x długość 14 mm.
      4. Wlać odgazowany PDMS na wafel umieszczony w szklanej szalce Petriego.
      5. Odgazować PDMS wlany na wafel w desykatorze przez dodatkowe 15 min, aby usunąć pęcherzyki, które mogły powstać podczas odlewania.
      6. Wyjąć szalkę Petriego z formą i PDMS z desykatora i umieścić w piecu w 60 ˚C na minimum 4 h w celu sieciowania PDMS.
    2. Przygotowanie sieciowanego PDMS do łączenia ze szkiełkami
      1. Wyjąć formę i sieciowany PDMS z pieca i przenieść do dygestorium z przepływem krzyżowym, aby zapobiec zanieczyszczeniu PDMS kurzem.
      2. Usunąć nadmiar PDMS z dna formy za pomocą skalpela i oddzielić górną płytkę sieciowanego PDMS od formy.
      3. Zakleić odsłoniętą wzorowaną płytkę PDMS taśmą klejącą, aby zapobiec kontaktowi cząsteczek kurzu z kanałami PDMS.
      4. Przyciąć chipy PDMS do odpowiedniego rozmiaru i wykonać wloty i wyloty o średnicy 1 mm za pomocą wycinaka do biopsji.
    3. Sterylizacja i łączenie mikrofluidycznych kanałów PDMS ze szkiełkami szklanymi
      1. Oczyścić szklane szkiełka mikroskopowe poprzez dokładne płukanie etanolem, a następnie izopropanolu. Po każdym płukaniu dokładnie osuszyć szkiełka pistoletem azotowym.
        UWAGA: Alternatywnie można użyć szkiełek nakrywek, jeśli analiza jest przeprowadzana przy użyciu mikroskopu konfokalnego.
      2. Otworzyć komorę plazmową i włożyć oczyszczone szkiełka mikroskopowe oraz chipy mikrofluidyczne bez taśmy ochronnej.
      3. Zamknąć komorę, przepłukać azotem przez 1 min i napełnić komorę filtrowanym powietrzem, aż zostanie osiągnięte ciśnienie 500 mTorr.
      4. Poddać szkiełka szklane i chipy PDMS działaniu plazmy przez 40 s przy mocy 50 W i częstotliwości 5 kHz.
      5. Po ekspozycji na plazmę natychmiast połączyć szkiełka szklane z chipami mikrofluidycznymi. Przechowywać urządzenia w sterylnych szalkach Petriego.
  3. Wysiew monowarstw komórek endotelialnych w kanałach mikrofluidycznych
    1. Pokryć niestandardowy mikrokanał, nanieząc pipetą 10 µL kolagenu typu I w stężeniu 0,1 mg/mL lub 0,1% żelatyny na kanał i inkubować w 37 ˚C przez 30 min.
    2. Aby wysiać komórki do czterech mikrokanałów, należy trypsynizować 25 cm2 konfluentnych PAEC i wirować przy 300 x g przez 7 min w RT.
      UWAGA: Tylko niewielki procent komórek przylgnie do powierzchni. Dlatego konieczne jest użycie nadmiaru komórek, aby uzyskać konfluentną monowarstwę.
    3. Zawiesić PAEC w 20 µL cECM i użyć 5 µL zawiesiny komórkowej dla każdego kanału. Ze względu na niewielkie wymiary kanału, siły kapilarne wypełnią mikroslajd i zapobiegną powstawaniu pęcherzyków powietrza.
    4. Wymienić medium po 3–4 h, aby wypłukać niezwiązane komórki.
    5. Hodować komórki przez 6 dni, aby PAEC mogły utworzyć trwałą, konfluentną monowarstwę. Ze względu na małą objętość wymieniać medium codziennie, stosując 150 µL cECM. Pozostawić końcówkę pipety wypełnioną medium we wlocie, a pustą końcówkę w wylocie. Będzie to służyć jako rezerwuar dostarczający komórkom odpowiednią ilość składników odżywczych i czynników wzrostu oraz zapobiegnie wysychaniu slajdu.
    6. W 7. dniu zabarwić jądra w żywych komórkach barwnikiem Hoechst (1:5 000 w cECM) i inkubować maksymalnie przez 10 min w 37 ˚C i 5% CO2.
    7. Ostrożnie wypłukać 3x cECM i poddać działaniu 1 µM histaminy w ECM + 1% FBS przez 30 min przed analizą. Bodziec można dobrać ad libitum. Na przykład TNF-α jest powszechnie stosowany jako aktywator zapalny.
    8. Użyć stalowych łączników kątowych 90˚ o średnicy 1,27 mm, aby połączyć wylot chipów PDMS z cewkami.

3. Przygotowanie pełnej krwi ludzkiej

  1. Pobrać krew żylną od badanych do probówek z antykoagulantem w postaci 0,109 M cytrynianu sodu. Krew może pochodzić od osób zdrowych lub chorych, które nie otrzymują leczenia przeciwzakrzepowego. Delikatnie odwrócić probówki, aby wymieszać zawartość. Całkowita ilość krwi wymagana do eksperymentu zależy głównie od wybranej szybkości przepływu. Przy szybkości przepływu 25 mL/h, w szkiełkach ibidi z 6 dołkami, wystarczająca jest całkowita objętość 2 mL z niewielką nadwyżką w celu wypełnienia zbiorników i kanału przepływowego.
  2. Przenieść krew do probówki 50 mL i dodać Calcein AM (1:10 000) w celu fluorescencyjnego znakowania komórek krwi oraz Alexa488-fibrinogen (15 µg/mL), aby skoniugować autologiczny fibrynogen. Inkubować krew w temperaturze 37 ˚C przez 15 min, aby umożliwić całkowłe wchłanianie.
  3. Bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentu rozcieńczyć krew w stosunku 1:1 buforem rekalcjyzującym (154 mM chlorku sodu, 10,8 mM cytrynianu trisodu, 2,5 mM chlorku wapnia i 2 mM chlorku magnezu).
    UWAGA: Hemodylucja do maksymalnie 50% nie wpłynęła na czas reakcji krzepnięcia30. Ponadto ludzka krew może zawierać wirusy i inne czynniki zakaźne. Praca z próbkami krwi wiąże się zatem z ryzykiem infekcji. Zdecydowanie zaleca się stosowanie odpowiednich środków bezpieczeństwa i ostrożne obchodzenie się z materiałem.

4. Montaż systemu przepływowego

  1. Przed podłączeniem przewodów przepłucz dreny za pomocą strzykawki 20 mL wypełnionej buforem płuczącym (36 mM kwasu cytrynowego, 103 mM chlorku sodu, 5 mM chlorku potasu, 5 mM EDTA i 0,35% mas/obj albuminy surowicy wołowej [BSA], pH = 6,5), aby zapobiec krzepnięciu krwi w drenach.
  2. Użyj nowej strzykawki, aby wypełnić dreny buforem HEPES (132 mM chlorku sodu, 20 mM HEPES, 6 mM chlorku potasu, 1 mM chlorku magnezu, 1% BSA i 5,5 mM D-glukozy, pH = 7,4) i ostrożnie podłącz go za pomocą kolankowego konektora Luer do mikropreparatu wypełnionego EC w medium. Podczas mocowania konektorów do mikrokanałów staraj się zapobiegać powstawaniu pęcherzyków powietrza w preparacie. Pęcherzyki uszkodzą śródbłonek i wpłyną na wyniki eksperymentu. Całkowicie usuń bufor płuczący i nie dopuść do kontaktu bufora z komórkami, ponieważ zahamuje to koagulację.
  3. Skonfiguruj system przepływowy zgodnie z Rysunkiem 1E. Pobierz 2 mL buforu płuczącego do strzykawki 20 mL i przepłucz system, aby zapobiec krzepnięciu krwi w momencie jej dostania się do strzykawki. Włóż pustą strzykawkę do pompy strzykawkowej i podłącz przewód wylotowy do tej strzykawki za pomocą żeńskiego konektora Luer. Umieść przewód wlotowy w pojemniku z przygotowaną ludzką krwią.
  4. Włącz pompę strzykawkową i oblicz szybkość przepływu. Profile przepływu mają charakter paraboliczny w pionie. Zakładając, że krew zachowuje się jak płyn newtonowski, użyj następującego wzoru do obliczenia szybkości przepływu.
    Równanie naprężenia ścinającego τ=η(6Q/h²w), koncepcja dynamiki płynów, obraz wzoru do celów edukacyjnych.           (Równanie 1)
    gdzie
    τ = naprężenie ścinające Wzór jednostki napięcia powierzchniowego \([ \text{dyn/cm}^2 ]\), istotny dla badań dynamiki płynów.
    η = lepkość dynamiczna Wzór lepkości dynamicznej w jednostkach cgs; symbol dla dyn×s/cm², kontekst fizyki edukacyjnej.
    Q = objętościowa szybkość przepływu Równowaga statyczna; wzór [mm²/s]; schemat jednostki pomiarowej; użytek edukacyjny.
    h = wysokość kanału Schemat równowagi statycznej ΣFx=0, MA=0, pokazujący analizę sił i obliczenia
    w = szerokość kanału Schemat równowagi statycznej ΣFx=0, MA=0, pokazujący analizę sił i obliczenia
    UWAGA: Dla przepływu w tętnicy płucnej z krwią w komercyjnych mikropreparatach 6-kanałowych o wymiarach prostokątnych (wysokość 0,4 mm i szerokość 3,5 mm) zastosowano objętościową szybkość przepływu 25 mL/h przez 5 min. Ze względu na różnice w wymiarach niestandardowych kanałów przepływowych, dynamika ta ulegnie zmianie. Dostosuj zmienne, aby zapewnić identyczne naprężenie ścinające.
  5. Zdefiniuj średnicę strzykawki 20 mL na 19,05 mm i ustaw program na Withdraw (Wysysanie). Przeciąganie krwi przez kanał pokryty komórkami poprzez zastosowanie podciśnienia zagwarantuje stałe szybkości ścinania i minimalne uszkodzenie warstwy komórkowej.

5. Konfiguracja mikroskopu do akwizycji obrazów

  1. Użyj obiektywu 20x i umieść preparat na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z kontrastem fazowym. Uruchom oprogramowanie mikroskopu, aby przemieścić stolik w kierunku osi Z i ustawić ostrość na monowarstwę komórek.
  2. Wybierz obszary zainteresowania (ROI) na początku, w środku i na końcu każdego kanału przepływowego. Początek i koniec powinny znajdować się w odległości co najmniej 3 mm od wlotu i wylotu kanału. Ustaw niebieski, zielony i czerwony filtry fluorescencyjne, dobierając moc lasera i intensywność światła tak, aby tło było minimalne.

6. Perfuzja krwi pełnej przez PAEC

  1. Po podłączeniu wszystkich elementów zgodnie z rysunką 1E i przygotowaniu mikroskopu do rejestracji, naciśnij Start, aby rozpocząć nagrywanie wideo. Naciśnij Start na pompie strzykawkowej, aby przeprowadzić perfuzję krwi przez śródbłonek.
  2. W momencie rozpoczęcia przepływu krwi nad śródbłonkiem, wykonuj zdjęcia przy użyciu wcześniej wybranych kanałów aktywnych i pozycji ROI co 15 s przez 5 min.
  3. Po 5 min perfuzji zakończ nagrywanie i zatrzymaj pompę strzykawkową. Zdemontuj komorę przepływową i bardzo ostrożnie usuń dreny. Często, jeśli czynność ta zostanie wykonana z nadmierną siłą, powstanie pęcherzyk powietrza. Należy starać się tego uniknąć, ponieważ może to doprowadzić do wypłukania śródbłonka.

7. Fixacja i analiza końcowa

UWAGA: Aby wykluczyć fałszywie dodatnią adhezję płytek krwi wynikającą z uszkodzenia śródbłonka podczas eksperymentu perfuzyjnego, konieczna jest charakterystyka komórek śródbłonka pod kątem tworzenia szczelin i ciągłości monowarstwy. Można to przeprowadzić za pomocą standardowego barwienia immunofluorescencyjnego na VE-cadherin.

  1. Po perfuzji i rozmontowaniu rurek, przemyj kanał mikroprzepływowy roztworem HEPES. Pipetuj HEPES do kanału w taki sposób, aby wypłukać krew do wylotu. Nadmiar usuń inną pipetą.
    1. Opcjonalnie przemyj kanał PBS++ (z 0,5 mM chlorkiem magnezu i 0,9 mM chlorkiem wapnia), aby zapobiec wytrącaniu się nadnadłośnika białkowego. Zmniejsza to tło. Należy jednak pamiętać, że dodatkowy etap płukania może zmienić zachowanie i morfologię komórek, co może wpłynąć na obrazowanie w analizie końcowej.
  2. Usuń HEPES i utrwal śródbłonek z przytwierdzonymi płytkami krwi i zdeponowanym fibryną, pipetując do kanału podgrzany do 37 ˚C 4% paraformaldehyd (PFA), a następnie inkubuj przez 15 min w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność podczas utrwalania niestandardowych układów mikroprzepływowych, ponieważ kanały te są jeszcze mniejsze, co powoduje występowanie wyższych sił ścinania w kanale podczas każdego etapu manipulacji.
  3. Usuń PFA z kanału i przemyj 3x roztworem PBS. Mikroslajdy są teraz gotowe do zastosowania standardowego protokołu barwienia w celu charakterystyki markerów komórek śródbłonka, takich jak VE-kadheryna, CD31, P-selektyna lub integryny, CD42b dla płytek przylegających lub CD45 dla leukocytów.
  4. Po barwieniu wykonaj co najmniej pięć obrazów za pomocą standardowego mikroskopu konfokalnego w celu oceny kolokalizacji.

8. Analiza obrazu

  1. Otwórz w programie ImageJ obraz z analizy przepływu zawierający albo płytki krwi znakowane fluorescencyjnie, albo fluorescencyjną fibrynę. Przeciągnij wybrany obraz do programu ImageJ.
  2. Obraz został wykonany w kolorach RGB. Do analizy preferowany jest obraz 8-bitowy, dlatego przekształć obraz na 8 bitów: Image | Type | 8-bit.
  3. Aby zminimalizować tło, odejmij je za pomocą przesuwnej paraboloidy, gdzie tocząca się kula lokalnie oblicza i odejmuje piksele tła z oryginalnego obrazu: Process | Subtract Background | Rolling Ball Radius = 50 pixels | Sliding Paraboloid.
    UWAGA: Rozmiar obrazu jest zdefiniowany w pikselach. Aby jednak zmierzyć powierzchnię, konieczne jest ustawienie skali. Gdy obrazy są wykonywane za pomocą obiektywu 20x z aperturą numeryczną 0,45, mikroskop ma skalę 2 pikseli na µm. Przeważnie informacje niezbędne do ustawienia skali są zapisane w metadanych obrazu i mogą zostać automatycznie wykorzystane przez ImageJ: Analyze | Set Scale.
  4. Ustaw próg, aby zdefiniować przytwierdzone płytki krwi lub osadzoną fibrynę. Użyj metody Triangle, a próg zostanie dostosowany automatycznie: Image | Adjust | Threshold.
  5. Przeanalizuj powierzchnię zajętą przez płytki krwi lub fibrynę za pomocą polecenia Analyze Particles. Ustaw rozmiar na 2-Infinity, ponieważ minimalny rozmiar płytki krwi wynosi 2 µm: Analyze | Analyze Particles.
  6. Wyniki podadzą całkowitą powierzchnię w µm2, średni rozmiar agregatów w µm2 oraz procent zajętej powierzchni.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki można podzielić na trzy części, z których każda odpowiada kolejnym etapom: przygotowania eksperymentalnego, gromadzenia danych oraz analizy danych. W zależności od pytania badawczego parametry każdego etapu mogą ulec zmianie. Przedstawione dane zostały zastosowane do badania wpływu śródbłonka na tworzenie się skrzepów.

Układ eksperymentalny
Powszechnie wiadomo, że komórki śródbłonka są wysoce heterogeniczne pod względem struktury i funkcji, w zależności od lokalizacji i czasu, zarówno w stanie zdrowia, jak i choroby23. Do badania oddziaływań między śródbłonkiem a krwią można wykorzystać różne źródła komórek śródbłonka, którymi w tym przypadku były dostępne komercyjnie HUVEC oraz PAEC (Rycina 1A). Komórki HUVEC są najczęściej stosowane w modelach laboratoryjnych, natomiast PAEC są komórkami izolowanymi od pacjentów z tętnic płucnych. Ponadto istnieją uznane protokoły izolacji komórek śródbłonka mikro naczyniowego (MVEC) z krążenia płucnego lub krążących we krwi komórek tworzących kolonie śródbłonka (ECFC)25,28,29.

Po izolacji komórki śródbłonka scharakteryzowano za pomocą barwienia na VE-cadherin, CD31 i TIE2, aby potwierdzić fenotyp śródbłonkowy. Charakterystyka pod kątem obecności αSMA i cytokeratyny wykazała brak fenotypu fibroblastycznego lub nabłonkowego (Rycina 1B). Po uzyskaniu wysokiej czystości populacji EC, komórki z pasaży 3–5 wykorzystano do zasiewu na komercyjnych mikropłytkach lub wykonanych na zamówienie mikrofluidycznych kanałach przepływowych (Rycina 1C). Podczas gdy dostępne komercyjnie mikropłytki są głównie równoległymi komorami przepływowymi lub kanałami w kształcie litery Y o ściśle określonych parametrach wysokości lub kąta rozgałęzienia, zastosowanie płytek mikrofluidycznych umożliwia dostosowanie parametrów eksperymentalnych do geometrii naczyń in vivo oraz dynamiki przepływu krwi31. Jednakże wykonane na zamówienie rozmiary mikrofluidyczne są mniejsze i mają tendencję do ograniczania rozprzestrzeniania się komórek oraz indukowania większej liczby zgonów komórkowych32,33. Użycie nadmiaru komórek rekompensuje fakt, że przylgnie tylko niewielki procent z nich. Zaobserwowano to w przypadku wprowadzenia stenozy, gdzie komórki śródbłonka wykazały bardziej wydłużony fenotyp w porównaniu do równoległego kanału mikrofluidycznego (Rycina 1D). Komercyjne komory przepływowe mają większą powierzchnię, do której mogą przyłączyć się komórki, co wymaga mniejszej liczby komórek do zasiewu.

W celu zbadania interakcji między komórkami śródbłonka a krwią, krew pełną perfundowano nad monowarstwą śródbłonka. Krew cytratową pobrano w dniu eksperymentu i poddano rekalkcyfikacji bezpośrednio przed perfuzją. Komórki stymulowano histaminą w celu wywołania uwalniania VWF i adhezji płytek krwi na 30 min przed perfuzją (Rysunek 1E)34,35. Dzięki niewielkim wymiarom, wykonane na zamówienie kanały mikrofluidyczne pozwoliły na zastosowanie mniejszych objętości krwi.

Gromadzenie danych
Aby zbadać tworzenie się zakrzepów na PAEC, przeprowadzono perfuzję komórek krwi znakowanych fluorescencyjnie Calcein AM-Red oraz fibryny koniugowanej z Alexa488 przez 5 min przy naprężeniu ścinającym 2,5 dyne/cm2 (Rysunek 2A–C). Ilościowo określono liczbę przylegających komórek krwi oraz osadzoną fibrynę. Obrazyzowano próbki co 30 s, a następnie wykonano kwantyfikację w programie ImageJ. Istotne było odjęcie tła w celu wyeliminowania autofluorescencji nieprzylegających płytek krwi. Do wyznaczenia minimalnego tła zastosowano algorytm trójkąta do ustalania progu (thresholding). Pozwoliło to na pomiar niewielkich agregatów płytek krwi (Rysunek 2D).

Zgodnie z oczekiwaniami, w warunkach bez stymulacji nie stwierdzono wiązania płytek krwi i fibryny z endotelium. Aby pobudzić uwalnianie VWF i wiązanie płytek, komórki PAECs stymulowano histaminą, co doprowadziło do natychmiastowego wzrostu adhezji płytek, która osiągnęła plateau po 2,5 min. W tym czasie płytki krwi zaczęły wydzielać czynniki autokrynne, które indukowali agregację płytek oraz rozszczepianie fibrynogenu do fibryny. Fibryna została odłożona po 3 min i po 4 min utworzyła stabilny agregat z płytkami krwi (Rycyna 2E).

Aby zbadać, czy efekt ten można zahamować za pomocą bezpośredniego doustnego antykoagulanta (DOAC), krew poddano działaniu 10 nM dabigatrany. Dabigatran dodano do rozcieńczenia krwi, gdzie hamuje on czynnik IIa w kaskadzie krzepnięcia, co zapobiegło rozszczepianiu fibrynogenu i tworzeniu włókien fibryny. Podczas perfuzji krwi traktowanej dabigatranem przez stymulowane PAEC, tworzenie skrzepu zostało bezpośrednio zahamowane, głównie poprzez opóźnienie odkładania fibryny (Rysunek 2F).

Analiza danych
Aby zbadać wpływ różnych źródeł śródbłonka na tworzenie zakrzepów, przeanalizowano zmiany komórkowe po 5 min perfuzji krwi. Śródbłonek utrwalono, a przylegające płytki krwi znakowano przeciwciałem CD42b przed obrazowaniem pod mikroskopem konfokalnym. Pozwoliło to na szczegółową analizę kolokalizacji płytek krwi i fibryny, co może wskazywać na dysfunkcję czynników krzepnięcia we krwi. Wpływ EC na tworzenie skrzepów określono za pomocą standardowego barwienia immunofluorescencyjnego. Kontakty międzykomórkowe śródbłonka zostały zachowane, co potwierdzono barwieniem VE-kadheryny, co wskazuje, że skrzepy krwi tworzyły się na powierzchni jednowarstwy śródbłonka, a nie na leżącej poniżej macierzy w przerwach między komórkami śródbłonka (Rycina 3). Co więcej, zastosowanie różnych źródeł komórek doprowadziło do powstania różnych wzorów zakrzepów na śródbłonce. HUVEC są komórkami śródbłonka żylnego i wykazywały ograniczoną adhezję płytek krwi oraz depozycję fibryny, podczas gdy chorobowe pierwotne PAEC od pacjentów z CTEPH wykazywały obfitą adhezję płytek krwi i większą depozycję fibryny po stymulacji histaminą w porównaniu do zdrowych PAEC. Sugeruje to, że śródbłonek pacjentów z CTEPH wykazuje większą reaktywność na wazoaktywację, co skutkuje zwiększonym tworzeniem zakrzepów.

Schemat hodowli komórek endotelialnych; diagram mikroskopowy; projekt kanału przepływowego; układ do rekalkulacji krwi.
Rysunek 1: Schematyczny przegląd protokołu. (A) Różne źródła i typy komórek endotelialnych zostały wyizolowane i hodowane do wykorzystania w mikroprzepływowym kanale przepływowym w eksperymentach perfuzyjnych. Reprezentatywne obrazy w jasnym polu dla różnych typów komórek endotelialnych. Pasek skali = 50 µm. (B) Izolowane komórki scharakteryzowano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego w celu potwierdzenia fenotypu endotelialnego. Pasek skali = 50 µm. (C) Komórki mogą być wysiewane do komercyjnych płytek przepływowych lub niestandardowych kanałów mikroprzepływowych. (D) Reprezentatywne obrazy w jasnym polu komórek HUVEC hodowanych w różnych geometriach kanałów. Pasek skali = 50 µm. (E) Układ eksperymentalny doświadczeń z perfuzją krwi. Krew z cytrynianem została pobrana, rozcieńczona buforem solnym i przeprowadzona przez komórki endotelialne za pomocą pompy strzykawkowej. Płuca i żyła pępkowa na tym rysunku zostały zmodyfikowane z Servier Medical Art, na podstawie licencji Creative Common Attribution 3.0 Generic Licence. http://smart.servier.com/ Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Test tworzenia zakrzepu; adhezja płytek; depozycja fibryny; histamina; dabigatran; wykresy.
Rycina 2: Akwizycja obrazu i kwantyfikacja tworzenia zakrzepu. (A) Reprezentatywne obrazy time-lapse przywierających płytek znakowanych Calcein AM-Red oraz zdeponowanej fibryny sprzężonej z Alexa488 w 1., 3. i 5. minucie po perfuzji krwi pełnej nad niestymulowanymi PAECs (B) oraz nad PAECs stymulowanymi histaminą. (C) Reprezentatywne obrazy time-lapse adhezji płytek i depozycji fibryny w 1., 3. i 5. minucie perfuzji krwi pełnej inkubowanej z dabigatranem nad PAECs stymulowanymi histaminą. Pasek skali = 50 µm. (D) Schematyczny przegląd kwantyfikacji obrazów w programie ImageJ. (E) Kwantyfikacja adhezji płytek i depozycji fibryny co 30 s na śródbłonku niestymulowanym i stymulowanym histaminą. (F) Kwantyfikacja wpływu dabigatranu na tworzenie zakrzepu, określona poprzez adhezję płytek i depozycję fibryny. Dane przedstawiono jako średnia ± SD, n = 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Reakcja komórek śródbłonka na histaminę w mikroskopii immunofluorescencyjnej; porównanie PAEC i HUVEC.
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy konfokalne z eksperymentów przepływowych służących do charakterystyki tworzenia zakrzepów w adhezji płytek krwi i depozycji fibryny na komórkach śródbłonka. Kontakty międzykomórkowe komórek śródbłonka zostały scharakteryzowane za pomocą VE-cadherin i zmierzone w kontrolnych PAEC, PAEC pochodzących od pacjentów z CTEPH oraz HUVEC. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Krzepnięcie jest wynikiem złożonej i kontrolowanej czasowo interakcji między śródbłonkiem a składnikami krwi. Ten test in vitro przedstawia metodę badania właściwości trombogennych komórek śródbłonka w czasie rzeczywistym. Można stosować różne typy pierwotnych komórek śródbłonka ludzkiego, ułatwiając zakrzepicę in situ w sposób specyficzny dla narządu i pacjenta. W tym badaniu zilustrowaliśmy zastosowanie tego protokołu, porównując właściwości trombogenne PAEC wyizolowanych od zdrowych dawców w porównaniu z pacjentami z CTEPH. Żywe tworzenie skrzepliny badano przez perfuzję krwi pełnej od zdrowych osób przez śródbłonek aktywowany histaminą, podczas gdy działanie DOAC testowano jako środek przeciwzakrzepowy.

Oprócz wykorzystania dostępnych na rynku mikrokanałów, jak wykazano w reprezentatywnych wynikach, wprowadzenie niestandardowych kanałów mikroprzepływowych umożliwia badanie wpływu zmian geometrii naczyń krwionośnych na powstawanie skrzeplin. Na przykład spadek przepływu w punkcie rozgałęzienia lub zwężenie powoduje wzrost naprężeń ścinających i większą aktywację płytek krwi36. Jednak istotnym ograniczeniem tych niestandardowych kanałów mikroprzepływowych jest wymóg dużej liczby komórek w celu utworzenia stabilnej monowarstwy EC, jak opisano w kroku 2.3.2. Może to stanowić czynnik ograniczający, gdy komórki pochodzące od pacjenta są rzadkie. Zaletą dostępnych na rynku mikroszkiełek jest to, że powierzchnie są modyfikowane na potrzeby hodowli komórkowych, a obszary wzrostu są większe, co pozwala EC na tworzenie zlewającej się i stabilnej monowarstwy. Z drugiej strony, większa powierzchnia spowoduje większy prześwit. Zgodnie z równaniem 1 wymaga to większej objętości krwi, aby osiągnąć podobne prędkości przepływu, jak w mikrofluidyce wykonanej na zamówienie.

Ulepszeniem tego protokołu może być zbadanie utraty EC w czasie rzeczywistym lub zmian w integralności bariery. Uszkodzenia EC w tym protokole są mierzone dopiero na końcu eksperymentu. W celu śledzenia na żywo, EC można oznaczyć mCherry VE-cadherin, na przykład37. Ponieważ jednak wymagałoby to wysoce zoptymalizowanego protokołu z wydajną transfekcją wirusa, wykrywanie impedancji elektrycznej komórki komórkowej (ECIS) może być wykorzystane jako alternatywa do badania integralności śródbłonka i funkcji bariery38. Perfuzja przez specjalne kanały przepływu ECIS umożliwia wzdłużne monitorowanie integralności bariery śródbłonka pod przepływem. Te szczególne cechy ECIS pozwalają na równoległe pomiary właściwości bariery śródbłonkowej i tworzenia skrzeplin. Alternatywne sposoby równoległych pomiarów bariery EC, zwłaszcza w matrycach wykonanych na zamówienie, obejmują zastosowanie fluorescencyjnego dekstransu w perfuzacie, który dyfunduje ze światła, w zależności od właściwości bariery EC.

Ograniczeniem opisanego protokołu jest to, że EC są usuwane z organizmu ludzkiego i hodowane na plastiku do hodowli tkankowej, który jest sztywnym, sztucznym podłożem. Komórki przystosowują się do swojego środowiska biofizycznego. Może to wpływać na odpowiedź śródbłonka na aktywację płytek krwi, ponieważ istnieje związek między aktywacją płytek krwi a sztywnością ścian39. Pomimo tych adaptacji do tworzyw sztucznych do hodowli, komórki zachowują cechy specyficzne dla choroby, które można zidentyfikować w bezpośrednim porównaniu z EC pochodzącymi od zdrowych dawców, jak pokazano w przypadku kontroli, CTEPH-PAEC i HUVEC, które wywierały różne wzorce adhezji płytek krwi i odkładania fibryny po 5 minutach perfuzji krwi.

W przeciwieństwie do innych protokołów, system ten wykorzystuje krew pełną, podczas gdy inne badają interakcję EC z pojedynczym składnikiem krwi, takim jak płytki krwi i leukocyty 19,20,21. Opracowano bardziej zaawansowane modele mikroprzepływowe, które umożliwiają badanie funkcji śródbłonka w modelu naczyniowym z okrągłą geometrią naczynia i miękką macierzą zewnątrzkomórkową. Są one jednak zoptymalizowane za pomocą HUVEC 40,41,42. Nowatorstwem opisanego protokołu jest zastosowanie pierwotnych EC w połączeniu z krwią pełną, co przybliża modelowanie zakrzepicy in situ o krok do warunków in vivo. Zoptymalizowanie protokołu pod kątem stosowania EC pochodzących od pacjenta i krwi pochodzącej od pacjenta jeszcze bardziej optymalizuje modelowanie choroby in vitro, umożliwiając ocenę spersonalizowanego tworzenia się skrzeplin i leczenia farmakologicznego.

Opisany protokół można zastosować do badania wpływu terapii przeciwzakrzepowych na komórki pochodzące od pacjenta. Podczas gdy stosowaliśmy dabigatran w celu zahamowania tworzenia skrzepliny, możliwe jest stosowanie innych leków przeciwzakrzepowych, takich jak rywaroksaban, który bezpośrednio hamuje czynnik Xa w kaskadzie krzepnięcia. Można również badać bezpośrednie inhibitory płytek krwi, takie jak klopidogrel lub aspiryna, ponieważ działają one na pierwotną fazę hemostazy, w której płytki krwi wiążą się z EC. Ostatecznie zdolności trombogenne specyficznych dla pacjenta EC w interakcji z własną krwią pacjenta można wykorzystać do przewidywania osobistego wpływu terapii przeciwzakrzepowej na indywidualnego pacjenta. Co więcej, knockdown określonych białek może dostarczyć dodatkowych informacji funkcjonalnych.

W opisanym protokole jest kilka kroków, które mają kluczowe znaczenie dla udanego eksperymentu perfuzyjnego. Po pierwsze, podczas izolacji komórek pierwotnych konieczne jest uzyskanie wysoce czystej kultury EC. Po drugie, ważne jest, aby EC tworzyły stabilną, zlewającą się monowarstwę. Jeśli tak nie jest, niewielka zmiana naprężenia ścinającego może spowodować uszkodzenie śródbłonka i aktywację kaskady krzepnięcia lub płytki krwi mogą zacząć wiązać się z błoną podstawną, co zapewni fałszywie dodatnie wyniki. Po trzecie, ważne jest, aby zapobiegać powstawaniu pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one uszkodzić śródbłonek, a tym samym wpłynąć na wyniki.

Po ponownym zwapnieniu krwi cytrynianej chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu ważne jest, aby natychmiast rozpocząć eksperyment perfuzyjny. Ponowne zwapnienie wywołuje szybką reakcję w aktywacji płytek krwi i tworzeniu skrzepliny, co powoduje szybkie krzepnięcie w próbce.

Podsumowując, opisujemy bardzo wszechstronny protokół badania interakcji między krwią pełną a komórkami śródbłonka podczas zakrzepicy.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Janowi Voorbergowi z Wydziału Białek Osocza, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, Amsterdam UMC, Academic Medical Center, Amsterdam, Holandia, za jego wkład w ten manuskrypt. Prace te były wspierane przez Dutch CardioVascular Alliance (DCVA) [2012-08, 2014-11] przyznany konsorcjum Phaedra i Reconnect, a także grant Impulse 2018 przyznany konsorcjum Phaedra IMPACT. Granty te są finansowane wspólnie przez Holenderską Fundację Kardiologiczną, Holenderską Federację Uniwersyteckich Centrów Medycznych, Holenderską Organizację Badań i Rozwoju Zdrowia oraz Królewską Holenderską Akademię Nauk. Ponadto praca ta została sfinansowana przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych w ramach programu Advanced Grant "VESCEL" (numer grantu: 669768). XDM jest finansowany z grantu badawczego Instytutu Badań Sercowo-Naczyniowych (ICaR-VU) w Uniwersyteckim Centrum Medycznym VU w Amsterdamie, Holandia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NaClMerck106404
20 mlObiektyw BD300613
20XOlympusN1492900LUCPLFLN20XPH/0,45
2-Propanol (IPA)Boom760514555000
Pompa strzykawkowa AladdinWord Precision InstrumentsAL-4000
Alexa488-FibrinogenInvitrogenF1319115 ug / ml
Alexa647-Goat anti RabbitInvitrogenA212451:100
Dziurkacz do biopsji o średnicy 1 mmTed Pella15110-10
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA9647
CaCl2Sigma-Aldrich21115
Calcein AM-RedInvitrogenC30991:1000
CD42b-APCMiltenyi Biotec130-100-2081:100
Kwas cytrynowyMerck100244
Kolagen typu I, ogon szczuraCorning3542490,1 mg/ml
Corning CellBIND Powierzchnia 60 mm Naczynie hodowlaneCorning3295
Kaptur z przepływem krzyżowymBasan
EksykatorDuran2478269
D-GlucoseMerck14431-43-7
EDTAInvitrogen15575020
Pożywka z komórek śródbłonka (ECM)ScienCell1001
Fibronektyna Osocze ludzkieSigma-AldrichF0895
Rurki przepływoweibidi10831, 10841
ŻelatynaMerck1040700,1%
HEPESSigma-AldrichH4034
Hoechst 33342InvitrogenH13991:1000
mikron-Slide VI 0,4 komory przepływoweibidi80606
ImageJNIHv1.49
KClMerck7447-40-7
Piec laboratoryjnyQuincy10GC
LS720 Mikroskop fluorescencyjnyEtalumaLS720
Złącze Lueribidi10802, 10825Męskie złącza kolankowe, Żeńskie łączniki rurowe
Koraliki magnetyczne MACS (anty-CD144)Miltenyi Biotec130-097-8571:5
MgCl2Sigma-AldrichM1028
Szkiełka mikroskopowe, 76 x 26 mmThermo ScientificAAAA000001##12E
Negatywny fotorezystant, SU-8Microchem
Aminokwasy endogenne (NEAA)Lonza13-114E
Paraformaldehyd (PFA)Merck8187154% PFA w PBS
Penicylina/streptomycyna (P/S)Gibco15140-1221%
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco14190-094bez wapnia lub magnezu
Osocze komora, CUTEFemto Science
Polidimetylosiloksan (PDMS), Sylgard 184Dow101697
probówki do pobierania krwi z cytrynianu sodu Cytrynian sodu363048Merck
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaGibco25300-045
VE-Kadheryna (D87F2)-XPSygnalizacja komórkowa25001:300
Strzykawka 106448

Bibliografia

  1. Yau, J. W., Teoh, H., Verma, S. Endothelial cell control of thrombosis. BMC Cardiovascular Disorders. 15, 130(2015).
  2. Pearson, J. D. Endothelial cell function and thrombosis. Best Practice & Research: Clinical Haematology. 12 (3), 329-341 (1999).
  3. Bochenek, M. L., Schafer, K. Role of Endothelial Cells in Acute and Chronic Thrombosis. Hamostaseologie. 39 (2), 128-139 (2019).
  4. Swieringa, F., et al. Platelet Control of Fibrin Distribution and Microelasticity in Thrombus Formation Under Flow. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (4), 692-699 (2016).
  5. Macfarlane, R. G. An Enzyme Cascade in the Blood Clotting Mechanism, and Its Function as a Biochemical Amplifier. Nature. 202, 498-499 (1964).
  6. Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiological Reviews. 93 (1), 327-358 (2013).
  7. Opneja, A., Kapoor, S., Stavrou, E. X. Contribution of platelets, the coagulation and fibrinolytic systems to cutaneous wound healing. Thrombosis Research. 179, 56-63 (2019).
  8. Tabas, I., Garcia-Cardena, G., Owens, G. K. Recent insights into the cellular biology of atherosclerosis. Journal of Cell Biology. 209 (1), 13-22 (2015).
  9. Karino, T., Motomiya, M. Flow through a venous valve and its implication for thrombus formation. Thrombosis Research. 36 (3), 245-257 (1984).
  10. ISTH Steering Committee for World Thrombosis Day. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Thrombosis Research. 134 (5), 931-938 (2014).
  11. Witkin, A. S. Acute and chronic pulmonary embolism: the role of the pulmonary embolism response team. Current Opinion in Cardiology. 32 (6), 672-678 (2017).
  12. Kim, N. H., et al. Chronic thromboembolic pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 53 (1), 1801915(2019).
  13. Zhang, M., Zhang, Y., Pang, W., Zhai, Z., Wang, C. Circulating biomarkers in chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Pulmonary Circulation. 9 (2), 2045894019844480(2019).
  14. Giri, J., et al. Interventional Therapies for Acute Pulmonary Embolism: Current Status and Principles for the Development of Novel Evidence: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation. 140 (20), 774-801 (2019).
  15. Sharma, S., Lang, I. M. Current understanding of the pathophysiology of chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Thrombosis Research. 164, 136-144 (2018).
  16. Eisenberg, P. R., et al. Fibrinopeptide A levels indicative of pulmonary vascular thrombosis in patients with primary pulmonary hypertension. Circulation. 82 (3), 841-847 (1990).
  17. Bochenek, M. L., et al. From thrombosis to fibrosis in chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Thrombosis and Haemostasis. 117 (4), 769-783 (2017).
  18. Nagy, M., Heemskerk, J. W. M., Swieringa, F. Use of microfluidics to assess the platelet-based control of coagulation. Platelets. 28 (5), 441-448 (2017).
  19. Barendrecht, A. D., et al. Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow. Journal of Visualized Experiments. (125), e55658(2017).
  20. Vajen, T., et al. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. Journal of Visualized Experiments. (134), e57009(2018).
  21. Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albanez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. (126), e55917(2017).
  22. Smeets, M. W. J., Mourik, M. J., Niessen, H. W. M., Hordijk, P. L. Stasis Promotes Erythrocyte Adhesion to von Willebrand Factor. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), 1618-1627 (2017).
  23. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), 006429(2012).
  24. Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity. Circulation Research. 103 (9), 929-939 (2008).
  25. Szulcek, R., et al. Delayed Microvascular Shear Adaptation in Pulmonary Arterial Hypertension. Role of Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Cleavage. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (12), 1410-1420 (2016).
  26. Casa, L. D., Deaton, D. H., Ku, D. N. Role of high shear rate in thrombosis. Journal of Vascular Surgery. 61 (4), 1068-1080 (2015).
  27. Jain, A., et al. Assessment of whole blood thrombosis in a microfluidic device lined by fixed human endothelium. Biomedical Microdevices. 18 (4), 73(2016).
  28. van Nieuw Amerongen, G. P., Draijer, R., Vermeer, M. A., van Hinsbergh, V. W. Transient and prolonged increase in endothelial permeability induced by histamine and thrombin: role of protein kinases, calcium, and RhoA. Circulation Research. 83 (11), 1115-1123 (1998).
  29. Smits, J., et al. Blood Outgrowth and Proliferation of Endothelial Colony Forming Cells are Related to Markers of Disease Severity in Patients with Pulmonary Arterial Hypertension. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 3763(2018).
  30. Tobias, M. D., Wambold, D., Pilla, M. A., Greer, F. Differential effects of serial hemodilution with hydroxyethyl starch, albumin, and 0.9% saline on whole blood coagulation. Journal of Clinical Anesthesia. 10 (5), 366-371 (1998).
  31. Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
  32. Veiseh, M., Veiseh, O., Martin, M. C., Asphahani, F., Zhang, M. Short peptides enhance single cell adhesion and viability on microarrays. Langmuir-ACS. 23 (8), 4472-4479 (2007).
  33. Kuo, C. W., Chueh, D. Y., Chen, P. Investigation of size-dependent cell adhesion on nanostructured interfaces. Journal of Nanobiotechnology. 12, 54(2014).
  34. McCormack, J. J., Lopes da Silva, M., Ferraro, F., Patella, F., Cutler, D. F. Weibel-Palade bodies at a glance. Journal of Cell Science. 130 (21), 3611-3617 (2017).
  35. Guilarte, M., Sala-Cunill, A., Luengo, O., Labrador-Horrillo, M., Cardona, V. The Mast Cell, Contact, and Coagulation System Connection in Anaphylaxis. Frontiers in Immunology. 8, 846(2017).
  36. Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (4), 1357-1362 (2013).
  37. Huveneers, S., et al. Vinculin associates with endothelial VE-cadherin junctions to control force-dependent remodeling. Journal of Cell Biology. 196 (5), 641-652 (2012).
  38. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).
  39. Yamasaki, F., et al. Association between arterial stiffness and platelet activation. Journal of Human Hypertension. 19 (7), 527-533 (2005).
  40. Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. Journal of Clinical Investigation. 122 (1), 408-418 (2012).
  41. Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9342-9347 (2012).
  42. Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. Journal of Visualized Experiments. (64), e3958(2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kultura kom rek r db onkaprzygotowanie komory przep ywowejanaliza adhezji p ytek krwipomiar odk adania fibrynyanaliza barwienia immunofluorescencyjnegoprzewlek a choroba zakrzepowo zatorowapodej cie medycyny personalizowanej
Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.