Artykuł metodologiczny

Nieinwazyjna elektrokardiografia u myszy okołoporodowej

6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61074

⸱

12 czerwca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine, Orono, ME, 2Department of Biomedical Sciences, College of Osteopathic Medicine, University of New England. Biddeford, ME, 3College of Arts and Sciences, University of New England, Biddeford, ME, 4Department of Pediatrics, Division of Pediatric Cardiology, Maine Medical Center, Portland, ME

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół nieinwazyjnej elektrokardiografii (EKG), zoptymalizowany dla myszy po urodzeniu, który nie wymaga stosowania środków znieczulających.

Streszczenie

Elektrokardiografia (EKG) od dawna jest uznawana za skuteczną i wiarygodną metodę oceny funkcji układu sercowo-naczyniowego (i krążeniowo-oddechowego) zarówno w ludzkich, jak i zwierzęcych modelach chorób. Indywidualne tętno, rytm i regularność, w połączeniu z parametrami ilościowymi pobranymi z EKG, służą do oceny integralności układu przewodzącego serca, a także zintegrowanej fizjologii cyklu pracy serca. Niniejszy artykuł zawiera wyczerpujący opis metod i technik stosowanych do wykonywania nieinwazyjnego EKG u okołoporodowych i noworodkowych szczeniąt myszy już w pierwszej dobie poporodowej, bez konieczności stosowania środków znieczulających. Protokół ten został opracowany, aby bezpośrednio odpowiedzieć na zapotrzebowanie na standaryzowaną i powtarzalną metodę uzyskiwania EKG u nowonarodzonych myszy. Z perspektywy translacyjnej protokół ten okazuje się całkowicie skuteczny w charakterystyce wrodzonych wad krążeniowo-oddechowych generowanych przy użyciu transgenicznych linii myszy, a w szczególności w analizie wad powodujących śmiertelność w pierwszych dniach po urodzeniu lub w ich trakcie. Protokół ten ma również na celu bezpośrednie wypełnienie luki w literaturze naukowej w celu scharakteryzowania i dostarczenia danych normatywnych związanych z dojrzewaniem układu przewodzącego serca we wczesnym okresie poporodowym. Metoda ta nie ogranicza się do określonego punktu czasowego po urodzeniu, ale raczej pozwala na gromadzenie danych EKG u nowonarodzonych młodych myszy od urodzenia do 10 dnia po urodzeniu (P10), co ma kluczowe znaczenie dla modelowania chorób człowieka in vivo, ze szczególnym uwzględnieniem wrodzonych wad serca (CHD).

Wprowadzenie

Funkcja serca może być mierzona na różne sposoby, z których najczęstszym jest użycie elektrokardiografii (EKG) do analizy przewodzenia prądu elektrycznego przez serce, jak również jego ogólnego cyklu i funkcji serca1. Elektrokardiografia nadal jest użytecznym narzędziem diagnostycznym do identyfikacji i charakteryzowania anomalii serca zarówno w ludzkich, jak i zwierzęcych modelach choroby1,2. Nieprawidłowości w odczycie elektrokardiogramu można znaleźć w nieprawidłowym rozwoju serca (tj. wrodzonej wadzie serca (CHD)) i mogą obejmować arytmie objawiające się zmianami częstości akcji serca (np. Bradykardia) i rytmu (np. "bloki serca"), sugerujące wady integralności i/lub funkcji leżącego poniżej mięśnia sercowego. Zmiany takie jak te mogą predysponować pacjentów do zagrażającej życiu dysfunkcji serca (np. zastoinowej niewydolności serca i/lub zatrzymania krążenia) i zwiększonej śmiertelności3,4. Biorąc pod uwagę wysokie wskaźniki śmiertelności z ciężką i nieleczoną chorobą niedokrwienną serca, opracowanie standaryzowanej i powtarzalnej metody zbierania EKG we wczesnym okresie poporodowym ma kluczowe znaczenie.

Chociaż nie jesteśmy pierwszymi, którzy zajmują się tym problemem, poprzednie metody zbierania EKG u szczeniąt myszy tradycyjnie obejmowały procedury inwazyjne (podskórne igły lub druty elektrodowe) i/lub stosowanie środków znieczulających5,6,7. Do zalet wykonywania nieinwazyjnej analizy EKG należy zminimalizowanie bólu i cofnięcie stresu u zwierzęcia. Podczas gdy eksperymentator musi nadal być ostrożny, aby nie powodować stresu u szczeniąt, urządzenie zostało zaprojektowane tak, aby unikać typowych stresorów w celu uzyskania dokładnych danych. W kontekście oceny czynności serca wprowadzenie znieczulenia u zwierząt, które mogą mieć nieprawidłowości krążeniowo-oddechowe, może potencjalnie zamaskować lub nawet zaostrzyć podstawowe schorzenia. Środki znieczulające mogą wpływać na przewodnictwo elektryczne poprzez zmianę depolaryzacji i/lub repolaryzacji komórek. Wreszcie, zastosowanie znieczulenia może narazić nowonarodzone szczenię na zwiększone ryzyko hipotermii, co może jeszcze bardziej zagmatwać każdą wrodzoną patologię. Poniższy protokół nie wprowadza żadnych środków znieczulających, inwazyjnych procedur ani wyraźnego dyskomfortu dla szczeniaka. Po sfinalizowaniu konfiguracji sprzętu, konfiguracja urządzenia i zbieranie danych dotyczących zwierzęcia mogą zostać skutecznie zakończone, po czym młode mogą zostać zwrócone matce. Dodatkowo system ten pozwala na wykonywanie powtórnych i/lub seryjnych analiz, co jest idealne do eksperymentów wymagających analizy w czasie, wprowadzania terapii farmakologicznych itp.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Poniższy protokół jest zgodny ze standardami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Nowej Anglii. Ścisła obserwacja protokołu powinna zapewnić zadowalające odczyty EKG u wszystkich badanych noworodków (n > 70).

1. Przygotowanie urządzenia

  1. Podłącz urządzenie do portu USB komputera z pobranym na niego oprogramowaniem EKG. Urządzenie pomiarowe automatycznie rozpocznie nagrzewanie do (37 °C/98.6 °F). Wewnętrzna jednostka grzewcza znajduje się w jednostce pomiarowej i ogrzewa tylko powierzchnię z tworzywa sztucznego. Druty elektrodowe ze srebrem nie są podgrzewane.
  2. Odczekaj około 15 minut, aż powierzchnia osiągnie odpowiednią temperaturę. Wykorzystaj ten czas na zebranie i ustawienie zwierząt.
    UWAGA: W tym momencie protokół może zostać wstrzymany, a platforma może pozostać podłączona i nagrzewać się przez dłuższy czas. W przypadku braku samonagrzewającej się platformy elektrody, bezpieczna dla zwierząt poduszka grzewcza może być również użyta, aby zapobiec hipotermii matki i młodych.

2. Preparaty zwierzęce

  1. Zebrać matkę i młode i trzymać je w klatce do momentu, gdy będą gotowe do odbioru.
  2. Gdy jednostka pomiarowa nagrzeje się do temperatury, wyjmij szczeniaka myszy z klatki i przetrzyj klatkę piersiową 70% etanolem rozpylonym na chusteczce. Umieść szczeniaka na rozgrzanej powierzchni plastiku.
  3. Pozwól myszy przyzwyczaić się do powierzchni w ciemności przez około 2-5 minut.

3. Konfiguracja myszy i platformy elektrod (zastosowanie elektrod)

  1. Użyj metalowej szpatułki, sondy lub drewnianego kołka, aby zebrać małą kroplę kleju, żelu przewodzącego prąd elektryczny (szybkoschnący żel elektrodowy o wysokiej przewodności, powszechnie stosowany do umieszczania elektrod gryzoni).
    UWAGA: Do nałożenia żelu przewodzącego można użyć dowolnego niewłóknistego, stałego przedmiotu, o ile przedmiot ten nie pozostawi na elektrodach włókien syntetycznych lub podobnego materiału, który mógłby zakłócać jakość sygnału elektrycznego.
  2. Za pomocą szpatułki/kołka delikatnie dotknij górnej części każdej z czterech, spłaszczonych powierzchni elektrody, delikatnie dociskając i ciągnąc żel przewodzący pod kątem od środka konstrukcji elektrody. Upewnij się, że każda elektroda jest całkowicie pokryta żelem.
    UWAGA: Ten krok jest niezwykle ważny, aby upewnić się, że przewodzący żel elektrodowy nie przylega do więcej niż jednej elektrody. Pasma kleju, które tworzą się między elektrodami, mogą przewodzić ładunek i potencjalnie zakłócać lub zwierać pożądany sygnał elektryczny. W tym czasie nie należy przerywać stosowania protokołu, ponieważ żel zacznie krzepnąć i przylegać. Upewnij się, że ustawiłeś mysz na platformie w ciągu 5-10 minut od nałożenia żelu przewodzącego (lub równoważnej substytucji żelu do elektrod przewodzących).
  3. Umieść metalową szpatułkę lub drewniany kołek z pozostałą częścią żelu na bok.
  4. Umieść mostek nowonarodzonego szczeniaka myszy w dół i na brzuchu, tak aby głowa szczeniaka była skierowana w stronę wychodzącej krawędzi USB platformy. Upewnij się, że część klatki piersiowej szczeniaka zakrywa każdą z czterech elektrod. Delikatnie przytrzymuj przedramiona szczeniaka przy boku, jednocześnie przytrzymując przez około 1 minutę, aby żel przewodzący zastygł.
  5. Umieść gumowe silikonowe zderzaki po prawej i lewej stronie szczeniaka. Zderzaki powinny zabezpieczać szczenię z każdej strony i zapewniać stabilność, aby zapobiec nadmiernym ruchom myszy, ale NIE powinny uniemożliwiać wszelkich ruchów myszy. Po zainstalowaniu obserwuj przez chwilę mysz i dostosuj położenie zderzaka w razie potrzeby.
    UWAGA: Nie ściskaj myszy zbyt mocno, ponieważ może to zakłócać mechanikę oddychania i częstość oddechów.
  6. Użyj odłożonego na bok kołka, aby nałożyć pozostały żel przewodzący na uziemiającą elektrodę ogonową i umieścić na zadzie szczeniaka. Delikatnie dociśnij, aby żel stwardniał przed wypuszczeniem szczeniaka.
  7. Umieść ostatni silikonowy zderzak na zadzie myszy, aby utrzymać elektrodę uziemiającą na miejscu.
    UWAGA: Nie przykładaj nadmiernej siły podczas umieszczania ostatniego zderzaka, ponieważ może to spowodować dyskomfort dla szczeniąt i/lub przemieszczenie elektrody uziemiającej.
  8. Chwyć całą platformę i delikatnie umieść ją w klatce Faradaya.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność i upewnij się, że górny silikonowy zderzak nie zostanie przemieszczony po umieszczeniu klatki Faradaya na miejscu.
  9. Przed nagrywaniem upewnij się, że szczenię myszy nie porusza się nadmiernie i upewnij się, że korpus i głowa myszy wydają się bezpieczne.
    UWAGA: Upewnij się, że głowa szczeniaka myszy może poruszać się dość swobodnie w zderzakach i nie jest całkowicie wysunięta pyskiem w dół. Podniesiona platforma została zaprojektowana tak, aby nieznacznie unieść klatkę piersiową myszy i zapobiec uduszeniu, ale należy to ściśle monitorować.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Idealny zapis EKG powinien charakteryzować się wyraźnym, wyraźnym sygnałem, który pozwala na analizę wszystkich zafalowań w kilku różnych ramach czasowych (Rysunek 1). Laboratorium początkowo wykorzystywało zmodyfikowane urządzenie do elektromiografii do rejestracji zapisów EKG o niezadowalającej jakości, co pozwalało jedynie na analizę podstawowych parametrów, takich jak częstotliwość akcji serca (Rysunek S1). Stało się to impulsem do współpracy z firmą nad opracowaniem now...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Punkty danych zebrane w okresie okołoporodowym u młodych myszy w 1. dobie są nieco poniżej średnich oczekiwanych wartości dla dorosłych myszy (500-700 uderzeń na minutę). 8 Wraz z wiekiem myszy obserwuje się wzrost częstości akcji serca, który jest bardziej zgodny z oczekiwanymi wartościami (Tabela 1). Należy jednak podkreślić, że wartości noworodkowe znajdowały się na dolnym końcu tego zakresu, co potwierdza ideę, że wartości normatywne powinny być dokumentowane w sposób specyfic...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują za hojne wsparcie ze strony Saving tiny Hearts Society (KLT), UNE COBRE Program (grant NIGMS numer P20GM103643; LAF) oraz program stypendialny SURE na Uniwersytecie Nowej Anglii (VLB), a także wsparcie techniczne dla pacjentów ze strony Ashish More (iWorx, Dover, NH). Rysunek 3, Rysunek 4 i Rysunek S1 zostały utworzone za pomocą oprogramowania Biorender.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
LabScribe4iWorxLabScribe4Oprogramowanie służące do zapisu EKG
Noworodków Mysz EKG & System oddechowyiWorxRS-NMECG : Urządzenie EKG EKG u noworodków
Zaciskowy przewodzący żel adhezyjnyParker Laboratories, Inc22-60Tac-gel stosowany jako żel przewodzący do EKG

Bibliografia

  1. Pappano, A. J., Wier, W. G. Cardiovascular Physiology. 11, Elsevier. 40-41 (2019).
  2. Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: A matter of size. Frontiers in Physiology. 3, Semptember 1-19 (2012).
  3. Sisakian, H. Cardiomyopathies: Evolution of pathogenesis concepts and potential for new therapies. World Journal of Cardiology. 6 (6), 478-494 (2014).
  4. London, B. Cardiac Arrhythmias: From (Transgenic) Mice to Men. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 12 (9), 1089-1091 (2001).
  5. Zehendner, C. M., Luhmann, H. J., Yang, J. -W. A Simple and Novel Method to Monitor Breathing and Heart Rate in Awake and Urethane Anesthetized Newborn Rodents. PLoS ONE. 5, 62628(2013).
  6. Zhao, Y., et al. Dry-contact microelectrode membranes for wireless detection of electrical phenotypes in neonatal mouse hearts. Biomedical Microdevices. 17 (2), 40(2015).
  7. Cao, H., et al. Wearable multi-channel microelectrode membranes for elucidating electrophysiological phenotypes of injured myocardium. Integrative Biology. 6 (8), 789(2014).
  8. Ho, D., et al. Heart rate and electrocardiography monitoring in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 1 (1), 123-139 (2011).
  9. Heier, C. R., Hampton, T. G., Wang, D., DiDonato, C. J. Development of electrocardiogram intervals during growth of FVB/N neonate mice. BMC Physiology. 10, 16(2010).
  10. Heier, C. R., DiDonato, C. J. ECG in neonate mice with spinal muscular atrophy allows assessment of drug efficacy. Frontiers Biosciences (Elite Ed). 7, 107-116 (2015).
  11. Chu, V., et al. Method for noninvasively recording electrocardiograms in conscious mice. BMC Physiology. 1, 6(2001).
  12. Patel, S. I., Souter, M. J. Equipment-related electrocardiographic artifacts: causes, characteristics, consequences, and correction. Anesthesiology. 108 (1), 138-148 (2008).
  13. Castellan, R. F. P., Thomson, A., Moran, C. M., Gray, G. A. Electrocardiogram-gated kilohertz visualisation (EKV) ultrasound allows assessment of neonatal cardiac structural and functional maturation and longitudinal evaluation of regeneration after injury. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (1), 167-179 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

EKG noworodka myszyperinatalna cz sto akcji serca myszyanaliza sygna u EKGfunkcja uk adu sercowo naczyniowego m odych myszywrodzone wady sercael przewodz cykonfiguracja klatki Faradayapomiar cz sto ci akcji sercaanaliza odst pu RR

Powiązane artykuły