Artykuł metodologiczny

Platforma lab-on-a-chip do stymulacji mechanotransdukcji osteocytów i analizy funkcjonalnych wyników przebudowy kości

7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61076

⸱

21 maja 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, The University of Akron

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokoły analizy przebudowy kości w ramach platformy lab-on-a-chip. Wydrukowane w 3D mechaniczne urządzenie ładujące można sparować z platformą w celu wywołania mechanostransdukcji osteocytów poprzez deformację macierzy komórkowej. Platforma może być również wykorzystana do ilościowego określenia funkcjonalnych wyników przebudowy kości na podstawie osteoklastów i osteoblastów (resorpcja/tworzenie).

Streszczenie

Przebudowa kości to ściśle regulowany proces, który jest niezbędny do wzrostu i naprawy szkieletu, a także adaptacji do zmian w środowisku mechanicznym. Podczas tego procesu mechanowrażliwe osteocyty regulują przeciwstawne odpowiedzi między osteoklastami katabolicznymi a osteoblastami anabolicznymi. Aby lepiej zrozumieć bardzo skomplikowane szlaki sygnałowe, które regulują ten proces, nasze laboratorium opracowało podstawową platformę lab-on-a-chip (LOC) do analizy funkcjonalnych wyników (tworzenia i resorpcji) przebudowy kości w systemie na małą skalę. Ponieważ przebudowa kości jest długotrwałym procesem, który trwa od tygodni do miesięcy, opracowaliśmy długoterminowe protokoły hodowli komórek w systemie. Osteoblasty i osteoklasty hodowano na substratach aktywności funkcjonalnej w obrębie LOC i utrzymywano przez okres do siedmiu tygodni. Następnie wióry zostały zdemontowane, aby umożliwić ilościowe określenie tworzenia i resorpcji kości. Dodatkowo zaprojektowaliśmy wydrukowane w 3D mechaniczne urządzenie ładujące, które łączy się z platformą LOC i może być używane do indukcji mechanotransdukcji osteocytów poprzez deformację macierzy komórkowej. Zoptymalizowaliśmy protokoły hodowli komórek dla osteocytów, osteoblastów i osteoklastów w ramach platformy LOC i rozwiązaliśmy problemy związane ze sterylnością i cytotoksycznością. W tym miejscu przedstawiamy protokoły wytwarzania i sterylizacji LOC, wysiewania komórek na funkcjonalnych podłożach, indukowania obciążenia mechanicznego i demontażu LOC w celu ilościowego określenia wyników końcowych. Wierzymy, że techniki te stanowią podstawę do opracowania prawdziwego narządu na chipie do przebudowy kości.

Wprowadzenie

Kość to bardzo dynamiczna tkanka, która wymaga skomplikowanej koordynacji między trzema głównymi typami komórek: osteocytami, osteoblastami i osteoklastami. Interakcje wielokomórkowe między tymi komórkami są odpowiedzialne za utratę masy kostnej, która występuje podczas paraliżu i długotrwałego unieruchomienia oraz za tworzenie kości, które następuje w odpowiedzi na wzrost i ćwiczenia. Osteocyty, najliczniejszy typ komórek kostnych, są bardzo wrażliwe na bodźce mechaniczne wywierane na kość. Stymulacja mechaniczna zmienia aktywność metaboliczną osteocytów i prowadzi do wzrostu kluczowych cząsteczek sygnałowych1,2. Dzięki temu procesowi, znanemu jako mechanotransdukcja, osteocyty mogą bezpośrednio koordynować działania osteoblastów (komórek tworzących kość) i osteoklastów (komórek resorpcyjnych kości). Utrzymanie homeostazy kości wymaga ścisłej regulacji między tworzeniem kości a szybkością resorpcji kości; Jednak zakłócenia w tym procesie mogą skutkować stanami chorobowymi, takimi jak osteoporoza czy osteopetroza.

Złożoność interakcji między tymi trzema typami komórek dobrze nadaje się do badań z wykorzystaniem technologii mikroprzepływowych i lab-on-a-chip (LOC). W tym celu nasze laboratorium niedawno opracowało dowód słuszności koncepcji platformy LOC do analizy resorpcji i tworzenia kości (wyników funkcjonalnych) w procesie przebudowy kości. Platforma może być wykorzystywana do badania interakcji komórkowych, zmienionych środowisk ładowania i badań przesiewowych leków. W ostatnich latach opracowano różne urządzenia mikroprzepływowe do badania molekularnych szlaków sygnałowych, które regulują przebudowę kości; Jednak wiele z tych systemów określa ilościowo przemodelowanie za pomocą pośrednich markerów, które wskazują na aktywność funkcjonalną3,4,5,6,7. Zaletą naszego systemu jest to, że można go wykorzystać do bezpośredniej kwantyfikacji wyników funkcjonalnych. Przebudowa kości to proces długotrwały. W związku z tym bezpośrednia kwantyfikacja resorpcji i tworzenia kości wymaga systemu hodowli, który może być utrzymywany przez co najmniej kilka tygodni do miesięcy8,9,10,11. W związku z tym, opracowując platformę LOC, ustaliliśmy długoterminowe protokoły hodowli niezbędne do tworzenia i resorpcji oraz utrzymywaliśmy komórki w systemie przez okres do siedmiu tygodni11. Dodatkowo do platformy włączyliśmy odpowiednie substraty do hodowli dla obu typów komórek; Osteoklasty hodowano bezpośrednio na kościach, a osteoblasty, o których wiadomo, że przylegają do tworzyw sztucznych, hodowano na krążkach polistyrenowych. Ponadto poruszyliśmy kwestie związane ze sterylnością, długoterminową cytotoksycznością i demontażem chipów na potrzeby analizy przebudowy11,12.

Platforma LOC może być również używana do indukcji mechanotransdukcji osteocytów poprzez deformację matrycy. Wydrukowane w 3D mechaniczne urządzenie ładujące zostało opracowane w celu sparowania z LOC i zastosowania statycznego rozdęcia poza płaszczyzną w celu rozciągnięcia komórek13. Aby skompensować to obciążenie mechaniczne, głębokość studni w obrębie LOC została zwiększona. To proste, mechaniczne urządzenie ładujące na małą skalę może być łatwo wyprodukowane przez laboratoria z ograniczonym doświadczeniem inżynierskim, a wcześniej udostępniliśmy rysunki komponentów drukowanych w 3D13. W obecnej pracy demonstrujemy niektóre z nowatorskich technik niezbędnych do pomyślnego wykorzystania LOC. W szczególności demonstrujemy wytwarzanie chipów, wysiewanie komórek na podłożach funkcjonalnych, mechaniczne ładowanie i demontaż chipów w celu ilościowego modelowania. Uważamy, że wyjaśnienie tych technik korzysta z formatu wizualnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie maski chipowej

UWAGA: Kroki 1.1 - 1.3 muszą być wykonane tylko raz po pierwszym otrzymaniu maski chipowej. Dbają o to, aby maska nie wygięła się podczas użytkowania. Konstrukcja masek mikroprzepływowych została wcześniej opisana11,14. Maski zostały zaprojektowane wewnętrznie i wyprodukowane komercyjnie przy użyciu stereolitografii o wysokiej rozdzielczości (Rysunek 1A).

  1. Przykryj górną powierzchnię maski plastikową folią, aby chronić tę powierzchnię przed klejem. Przymocuj maskę wiórową do arkusza akrylowego o równej wielkości za pomocą kleju w sprayu. Zaciśnij kawałki razem przez noc, aby klej mógł się w pełni utwardzić. Po wyschnięciu kleju usuń plastikową folię z górnej części maski.
  2. Przymocuj dolną część arkusza akrylowego do wydrukowanego w 3D pudełka poziomującego (rysunek uzupełniający 1, pliki uzupełniające 1-4) za pomocą taśmy dwustronnej. Mocno dociśnij, aby zapewnić ścisłe połączenie.
  3. Uszczelnij wszelkie małe otwory w pobliżu zdejmowanej ścianki skrzynki wyrównującej wodoodpornym uszczelniaczem. Pozostaw szczeliwo do utwardzenia przez 24 godziny.
  4. Oczyść powierzchnię maski 70% etanolem (EtOH). Umieść pudełko wyrównujące z żądaną maską na wióry w piekarniku. Użyj kątomierza cyfrowego, aby upewnić się, że górna część maski jest wypoziomowana. W razie potrzeby wyreguluj poziomujące.

2. Produkcja PDMS

UWAGA: Układ chipowy płytkiej studni (1 mm) jest używany do testów aktywności funkcjonalnej (tworzenie i resorpcja), a układ chipowy z głęboką studnią (10 mm) jest używany do badań obciążenia mechanicznego. Dno studni głębinowej jest formowane przez przymocowanie oddzielnej cienkiej membrany PDMS (Rysunek 1B).

  1. Warstwa pokrywy (warstwa 1)
    1. Połącz 63 g prepolimeru PDMS i 6,3 g utwardzacza (w stosunku 10:1) w plastikowym kubku. Dokładnie wymieszać jednorazową szpatułką do komórek i odgazować w eksykatorze próżniowym przez 30 minut.
    2. Powoli wlej mieszaninę do przygotowanego pudełka wyrównującego. Pozostaw PDMS na 30 minut, a następnie piecz w temperaturze 45 °C przez 18 godzin.
    3. Poluzuj krawędzie PDMS za pomocą stożkowej szpatułki laboratoryjnej i wyjmij arkusz polimerowy z pudełka wyrównującego.
    4. Przytnij poszczególne pokrywki na wymiar (70 mm x 34 mm) za pomocą skalpela i szablonu wydrukowanego w 3D.
    5. Przebić otwory dostępowe przez każdą pokrywę za pomocą dziurkacza do biopsji (średnica 1 mm).
    6. Oczyść powierzchnię pokrywek taśmą pakową.
      UWAGA: Jeśli pokrywki nie są używane od razu, owiń je taśmą pakową i przechowuj w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Studnia i warstwa mikrokanalików (warstwa 2)
    1. Połącz prepolimer PDMS i utwardzacz (w stosunku 10:1) w plastikowym kubku. Konstrukcja z płytką studnią wymaga 43 g prepolimeru i 4,3 g utwardzacza, a konstrukcja z głęboką studnią wymaga 227 g prepolimeru i 22,7 g utwardzacza. Energicznie wymieszać polimer i odgazować przez 30 min.
      UWAGA: Przyjmuje się, że wymiar maski wynosi 152,4 mm x 152,4 mm.
    2. Powoli wylej mieszaninę na odpowiednią, wstępnie wyrównaną maskę. Pozostaw PDMS na 30 minut, a następnie piecz w temperaturze 45 °C przez 18 godzin.
    3. Poluzuj krawędzie PDMS za pomocą stożkowej szpatułki laboratoryjnej i ostrożnie oderwij polimer od maski. Użyj skalpela i szablonu wydrukowanego w 3D, aby wyciąć pojedyncze wióry.
      UWAGA: W przypadku badań załadunku ważne jest, aby wymiary wióra (70 x 34 mm) były precyzyjne i aby studzienka znajdowała się pośrodku chipa.
    4. Powierzchnię PDMS należy oczyścić taśmą pakową.
      UWAGA: Jeśli chipy nie są używane od razu, owiń każdy chip w taśmę pakową i przechowuj w RT.
  3. Cienka membrana PDMS (warstwa 3)
    UWAGA: Ta warstwa jest używana tylko do projektowania studni głębinowych.
    1. Do plastikowego kubka dodać 12,7 g prepolimeru PDMS i 1,3 g utwardzacza (w stosunku 10:1). Mieszać energicznie i odgazowywać przez 30 minut.
    2. Powoli wlej polimer do przygotowanego pudełka wyrównującego i dokładnie zeskrob plastikowy kubek, aby usunąć jak najwięcej PDMS.
    3. Użyj szpatułki do komórek, aby rozprowadzić PDMS na całej powierzchni.
      UWAGA: Jeśli polimer nie zostanie ręcznie rozłożony, napięcie powierzchniowe będzie wystarczające, aby zapobiec tworzeniu się jednolitego arkusza polimeru.
    4. Pozostaw PDMS na 30 minut, a następnie piecz w temperaturze 45 °C przez 18 godzin.
    5. Poluzuj krawędzie PDMS za pomocą stożkowej szpatułki i ostrożnie wyjmij arkusz PDMS z pudełka wyrównującego. Wytnij pojedyncze membrany, które pasują do wymiarów warstwy 2.
    6. Zmierz grubość membrany w środku membrany za pomocą suwmiarki. Wyrzuć wszystkie membrany, które znajdują się poza pożądaną grubością (0,5 mm ± 0,1 mm).
    7. Ostrożnie oczyść membrany taśmą pakową i ułóż na kawałku folii parafinowej.
      UWAGA: Jeśli membrany nie są używane od razu, przykryj górną część membrany taśmą pakową i przechowuj w temperaturze RT.

3. Substraty aktywności funkcjonalnej

UWAGA: Krążki polistyrenowe i płytki kostne muszą być przymocowane do dna studzienek, które będą używane odpowiednio do hodowli osteoblastów i osteoklastów.

  1. Krążki z polistyrenu (Rysunek 1C)
    1. Umieść taśmę maskującą na tylnej stronie polistyrenowego szkiełka nakrywkowego poddanego działaniu kultur tkankowych. Wyciąć okrągłe krążki ze szkiełka nakrywkowego za pomocą zaostrzonego świdra korkowego (średnica 5,4 mm). Zanurz krążki w 70% EtOH i pozostaw na noc.
    2. Delikatnie wyszoruj górną powierzchnię krążka aplikatorem z bawełnianą końcówką nasączonym 70% EtOH. Upewnij się, że zewnętrzna krawędź dysku jest dokładnie oczyszczona.
    3. Za pomocą dwóch par kleszczy przytrzymaj dysk i usuń podkład z taśmy maskującej. Umieść krążek stroną potraktowaną do dołu i wyczyść tylną stronę za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką.
    4. Zanurz drewnianą końcówkę aplikatora z bawełnianą końcówką w odgazowanej mieszaninie nieutwardzonego PDMS i umieść niewielką ilość polimeru na dnie żądanego dołka.
      UWAGA: Pozostały nieutwardzony PDMS można przechowywać w temperaturze -20 °C.
    5. Umieść krążek polistyrenowy stroną podniesioną do góry w studzience i delikatnie dociśnij krążek bawełnianym wacikiem. Upewnij się, że żaden nieutwardzony PDMS nie styka się z obrabianą stroną dysku.
      UWAGA: Jeśli PDMS wejdzie w kontakt z obrabianą powierzchnią dysku, wyjmij dysk z dołka i powtórz kroki 3.1.4 i 3.1.5 z nowym dyskiem.
    6. Pozostaw frytki na równej powierzchni na 30 minut, a następnie piecz w temperaturze 65 °C przez 4 godziny.
  2. Wafle kostne
    1. Za pomocą kleszczy umieść wafel kostny (o średnicy 6 mm, grubości 0,4 mm) na dnie naczynia o średnicy 100 mm. Przytrzymaj wafel stabilnie kleszczami i delikatnie wytraw literę "X" z tyłu wafla za pomocą skalpela.
      UWAGA: Podczas procesu obrazowania "X" służy do rozróżnienia tylnej części płytki od powierzchni, na której zostały wysiane komórki.
    2. Użyj drewnianego końca aplikatora z bawełnianą końcówką, aby dodać niewielką ilość nieutwardzonego PDMS na dno żądanego dołka. Umieść wafel kostny, oznaczoną stroną do dołu, w studzience i użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby docisnąć wafel.
    3. Pozostaw frytki na równej powierzchni na 30 minut, a następnie piecz w temperaturze 65 °C przez 4 godziny.

4. Montaż i sterylizacja chipów

  1. Aktywuj powierzchnie warstwy 1 i warstwy 2 za pomocą myjki plazmowej przez 30 sekund, używając ustawienia mocy średniej częstotliwości radiowej (RF) (co odpowiada około 10.2 W).
  2. Dopasuj otwory dostępowe w warstwie 1 do mikrokanalików w warstwie 2 i mocno dociśnij obie warstwy do siebie.
  3. W przypadku projektu ze studnią głębinową powtórz krok 4.1 z warstwą 2 i warstwą 3. Podczas obróbki plazmowej za pomocą taśmy dwustronnej przymocuj folię parafinową warstwy 3 do płaskiej powierzchni.
  4. Użyj skalpela, aby odciąć nadmiar materiału z membrany PDMS. Ostrożnie oderwij arkusz folii parafinowej od spodu chipa
  5. Piecz frytki w temperaturze 65 °C przez 10 minut, aby zwiększyć siłę wiązania między warstwami PDMS.
  6. Włóż kątowe końcówki dozujące (rozmiar 18, 0.5 cala, 90°) do otworów dostępowych w pokrywie. Przymocuj końcówki dozujące do pokrywki za pomocą dwuskładnikowej żywicy epoksydowej. Użyj końcówki do mikropipet, aby nałożyć żywicę epoksydową wokół każdej końcówki dozującej.
  7. Po całkowitym utwardzeniu żywicy epoksydowej wyczyść powierzchnię chipa 70% EtOH i umieść w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Wykonaj wszystkie kolejne kroki w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  8. Podłącz strzykawkę o pojemności 5 ml do końcówek dozujących ze sterylną silikonową rurką (1/32'' ID, ~10 cm długości) i napełnij cały chip 70% EtOH przez co najmniej 30 s. W przypadku konstrukcji z płytką studnią wszystkie płyny należy podawać za pomocą pompy strzykawkowej ustawionej na natężenie przepływu 4 ml/h. W przypadku konstrukcji z głęboką studnią należy podawać wszystkie płyny, powoli dozując strzykawkę ręcznie.
  9. Usuń EtOH z chipa i wysterylizuj chip światłem UV przez noc.
  10. Umyj frytki 3 razy za pomocą dH2O. Napełnij wiór dH2O, wyjmij rurkę z końcówek dozujących i inkubuj przez co najmniej 48 godzin w temperaturze 37 °C.

5. Zespół mechanicznego urządzenia ładującego

UWAGA: Procesy projektowania i produkcji dla drukowanego w 3D mechanicznego urządzenia ładującego (Rysunek 2A-C) zostały wcześniej opisane i wszystkie pliki projektowe dla drukowanych komponentów zostały wcześniej dostarczone13.

  1. Autoklawować wszystkie elementy urządzenia ładującego przez 30 minut w temperaturze 121 °C.
    UWAGA: Aby uniknąć wypaczania drukowanych elementów, owiń każdy element osobno folią i umieść na twardej, płaskiej powierzchni podczas procesu autoklawowania. Metalowy sprzęt można owinąć razem. Wykonaj wszystkie kolejne kroki w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Umieść sprężynę naciskową wokół wału płyty dociskowej i włóż płytę do środkowego otworu w dolnej części podstawy (Rysunek 2D).
  3. Przymocuj blok wybierania do dolnej części podstawy za pomocą czterech wkrętów samogwintujących.
  4. Umieść drugą sprężynę naciskową wokół centralnej. Włóż do sześciokątnego otworu w dolnej części tarczy i wkręć zespół w gwintowany otwór pośrodku bloku wybierania.
  5. Przykręć cztery wsporniki męsko-żeńskie w dolnej części podstawy.
  6. Usuń luz z urządzenia, obracając pokrętło w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż górna część płyty znajdzie się poniżej górnej części podstawy. Następnie powoli obracaj tarczę zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż górna część płyty zrówna się z górną częścią podstawy.

6. Eksperymentowanie

UWAGA: Protokoły eksperymentów z aktywnością funkcjonalną były wcześniej dostarczane11,12.

  1. Badania obciążenia (Rysunek 3)
    1. Wykonując krok 4.9, użyj strzykawki o pojemności 5 ml, aby usunąć dH2O z chipa studni głębinowej. Pokryj dno studzienki 200 μl 0,15 mg/ml kolagenu typu I (CTI) w 0,02 M kwasie octowym przez 1 godzinę.
    2. Trzykrotnie przepłukać frytki solą fizjologiczną z wapniem i magnezem buforowanym fosforanami firmy Dulbecco (DPBS++).
    3. Umieść chip w uchwycie na chipsy i wysiew z osteocytami MLO-Y4 o gęstości 2 x 104 komórek/ml w minimalnej niezbędnej pożywce alfa (MEMα) uzupełnionej 5% surowicą cielęcą, 5% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną/streptomycyną.
    4. Wyjmij rurkę z końcówek dozujących i umieść chip w głębokim naczyniu hodowlanym (150 mm x 25 mm). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 72 godziny.
    5. Podłącz sterylne rurki do końcówek dozujących i użyj strzykawki o pojemności 5 ml, aby usunąć zużytą pożywkę hodowlaną z chipa. Powoli dozuj świeżą pożywkę hodowlaną, aby ponownie napełnić chip.
    6. Umieść uchwyt na wióry w prostokątnej wstawce na górze podstawy urządzenia ładującego. Przeprowadź rurkę przez szczeliny znajdujące się na pokrywie urządzenia ładującego i przymocuj pokrywę do podstawy za pomocą czterech z stożkowym płaskim i nakrętek sześciokątnych.
      UWAGA: Aby upewnić się, że pokrywa pozostaje wypoziomowana, najpierw dokręć dwie, które znajdują się po przekątnej od siebie, zanim dokręcisz pozostałe dwie.
    7. Przyłóż obciążenie do ogniw, obracając pokrętło zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż do osiągnięcia żądanego przemieszczenia płyty.
      UWAGA: Urządzenie zostało zaprojektowane w taki sposób, że jeden obrót tarczy jest równy przemieszczeniu płyty o 1 mm. Pole odkształcenia generowane na górze membrany PDMS było wcześniej modelowane jako funkcja przemieszczenia płyty za pomocą analizy elementów skończonych (MES)13.
    8. Umieść urządzenie ładujące w pustym pudełku na końcówki do mikropipet P1000. Inkubować komórki z przyłożonym ładunkiem przez 15 min.
      UWAGA: Użyty tutaj okres czasu ładowania służy jako przykład. Można zastosować alternatywne czasy ładowania.
    9. Po inkubacji usuń ładunek z komórek, obracając pokrętło w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż płyta powróci do pierwotnej pozycji wyjściowej. Zdejmij pokrywę z urządzenia i umieść uchwyt na wióry w płytce do hodowli głębinowej. Inkubuj komórki przez 90-minutowy okres regeneracji po obciążeniu.
      UWAGA: Ponownie, okres odzyskiwania użyty tutaj służy jako przykład. Można zastosować alternatywne czasy odzyskiwania. W przypadku badań długoterminowych należy karmić komórki co 72 godziny.
    10. Użyj strzykawki o pojemności 5 ml, aby usunąć kondycjonowane podłoże z chipa.
      UWAGA: To medium można zapisać i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    11. Wyjmij chip z uchwytu na wióry i użyj stożkowej szpatułki, aby zerwać połączenie między pokrywą PDMS a warstwą studzienki.
      UWAGA: Testy komórkowe można teraz wykonywać zgodnie z dowolnym protokołem ustalonym dla płytki do hodowli komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Konfiguracja z płytkimi studzienkami może być wykorzystana do analizy aktywności funkcjonalnej osteoblastów i osteoklastów. Tworzenie kości przez osteoblasty oraz resorpcja przez osteoklasty wymagają czasu hodowli rzędu od kilku tygodni do kilku miesięcy. Tworzenie kości przez pre-osteoblasty MC3T3-E1 ilościowo określono za pomocą barwień alizaryną czerwoną oraz metodą von Kossa11,15. W 49. dniu średnia powierzchnia zabarwiona ali...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym artykule opisano podstawy wytwarzania platformy LOC do przebudowy kości do hodowli osteocytów, osteoklastów i osteoblastów. Zmieniając głębokość i rozmiar studzienki w chipie, opracowano wiele konfiguracji do stymulacji osteocytów obciążeniem mechanicznym i ilościowego określenia funkcjonalnych wyników przebudowy kości (ryc. 1B).

Podczas montażu chipów optymalizacja protokołu utleniania plazmowego miała kluczowe znaczenie dla wyeliminowania ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation w ramach grantów nr (CBET 1060990 i EBMS 1700299). Ponadto materiał ten opiera się na pracach wspieranych przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program w ramach grantu nr. (2018250692). Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy National Science Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Arkusz akrylowyOptix-grubość 3,175 mm
Kątowe końcówki dozująceJensen GlobalJG18-0,5X-90Usuń plastikowe złącze przed użyciem
Dziurkacz do biopsjiRobbins InstrumentsRBP-10o średnicy 1 mm
Wafle kostneogrubości Boneslices.com 0,4 mmKość korowa bydlęca
Surowica cielęca Bydlęca surowica
CalipersGlobal Industrial T9F534164
Cell SzpatułkaTPP99010
Maska chipowaProtoLabsSpecjalnie zaprojektowanaMateriał do druku: Accura SL 5530
Świdr korkowyFisher Scientific07-865-10B
Aplikator z bawełnianą końcówkąPuritan806-WCL
Kultura naczynie (100 mm)Corning430591Sterylne, Niepoddawane hodowli tkankowej
Naczynie hodowlane (150 mm)Corning430597Sterylne, Hodowla nietkankowa
Taśma dwustronna3M CompanyScotch 237
Płodowa surowica bydlęcaKleszczeSH30910
Fisher Scientific22-327379
Pudełko niwelacyjneWykonane na zamówienie-drukowana w 3D
taśma maskująca3M Company Scoth2600
MC3T3-E1 preosteoblastyATCCCRL-2593Subclone 4
Mechaniczne urządzenie ładująceWykonane na zamówienie-wydrukowane w 3D
Minimalne niezbędne podłoże alfaGibco12571-063
Osteocyty MLO-Y4----Prezent od dr Lyndy Bonewald
Taśma pakowaMarkakaczki -standardowa taśma pakowa
Folia parafinowaBemis ParafilmPM999
Penicylina / streptomycynaInvitrogenp4333
Środek do czyszczenia plazmyHarrick PlasmaPDC-001Ekspandowany środek do czyszczenia plazmy
Zestaw polidimetylosiloksanuDow CorningSylgard 184
Polistyrenowe szkiełka nakrywkoweNunc Thermanox174942Sterylne, poddane hodowli tkankowej
Piekarnik QuincyLab12-180
RAW264.7 preosteoklastyATCCTIB-71
SkalpelBD Medical372611
Rurki silikonoweSaint-Gobain TygonABW00001 ID: 1/32" (0,79 mm), OD: 3/32" (2,38 mm)
Oprogramowanie SolidWorksDassault Systè mes-Służy do generowania modeli drukowanych w 3D i wykonywania MES
Klej w sprayuLoctite2323879Uniwersalny klej
Strzykawka (5 ml)BD Medical309646Sterylna
pompa strzykawkowaAparat Harvarda70-2213Pompa 11 Pico Plus
Stożkowa szpatułka laboratoryjnaFisher Scientific21-401-10
Dwuczęściowa expoxyLoctite13953915-minutowy szybki zestaw
kolagenu typu ICorning354236Kolagen z ogona szczura
Eksykator próżniowyBel-ArtF42010-0000
Wodoodporny uszczelniaczGorilla8090001100% uszczelniacz silikonowy
SH30072Hyklon

Bibliografia

  1. Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction. Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).
  2. Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
  3. Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation. Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).
  4. Kou, S., et al. A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).
  5. Ma, H. P., et al. A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation. Royal Society Open Science. 5 (9), 180528(2018).
  6. Jang, K., et al. Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).
  7. Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PLOS ONE. 9 (2), e89966(2014).
  8. Hwang, P. W., Horton, J. A. Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology. Scientific Reports. 9 (1), 8299(2019).
  9. Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice. Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).
  10. Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation. Bone. 34 (3), 402-411 (2004).
  11. George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling. Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).
  12. Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform. Biotechniques. , In review (2019).
  13. Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. 3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation. Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).
  14. George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment. Bone. 127, 460-473 (2019).
  15. George, E. L. Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , University of Akron. (2019).
  16. York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform. Medical Engineering & Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).
  17. Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices. Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).
  18. Millare, B., et al. Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma. Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).
  19. Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
  20. Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
  21. Wang, Y., Burghardt, T. P. Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell. Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).
  22. Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).
  23. Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
  24. Van Scoy, G. K., et al. A cellular automata model of bone formation. Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).
  25. Truesdell, S. L., Saunders, M. M. Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models. Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza przebudowy ko ciwarstwa membrany PDMSurz dzenie do obci ania mechanicznegod ugoterminowe hodowanie kom rekkwantyfikacja tworzenia ko ciocena resorpcji ko cikokultura osteoblast w i osteoklast wstatyczne rozci ganie poza p aszczyzn

Powiązane artykuły