Artykuł metodologiczny

Test oparty na strumieniu do identyfikacji modulatorów autofagii w chorobie zwyrodnieniowej stawów

DOI:

10.3791/61078

⸱

8 lipca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Grupo de Biología del Cartílago, Servicio de Reumatología, Instituto de Investigación Biomédica de A Coruña (INIBIC), Complejo Hospitalario Universitario de A Coruña, 2Biofarma Research Group, Center for Research in Molecular Medicine and Chronic Diseases (CIMUS), Universidad de Santiago de Compostela

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł szczegółowo opisuje monitorowanie strumienia autofagii w celu identyfikacji nowych cząsteczek za pomocą badań przesiewowych opartych na obrazowaniu komórkowym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autofagia jest centralnym mechanizmem regulującym homeostazę. Zmiany w autofagii przyczyniają się do chorób związanych ze starzeniem się. Metody fenotypowe do identyfikacji regulatorów autofagii mogą być wykorzystane do identyfikacji nowych środków terapeutycznych. W artykule opisano proces badań przesiewowych obrazowania opartego na komórkach opracowany w celu monitorowania strumienia autofagicznego przy użyciu LC3 jako reportera strumienia autofagicznego (mCherry-EGFP-LC3B) w ludzkich chondrocytach. Akwizycja danych odbywa się za pomocą zautomatyzowanego mikroskopu High Content Imaging Screening System. Opracowano i zweryfikowano oparty na algorytmie protokół automatycznej analizy obrazu w celu identyfikacji cząsteczek aktywujących strumień autofagiczny. Przedstawiono krytyczne kroki, uwagi wyjaśniające i ulepszenia w stosunku do obecnych protokołów monitorowania autofagii. Fizjologicznie istotne fenotypowe metody badań przesiewowych mające na celu ukierunkowanie na cechy charakterystyczne starzenia się mogą ułatwić skuteczniejsze strategie odkrywania leków na choroby układu mięśniowo-szkieletowego związane z wiekiem.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele chorób przewlekłych jest związanych z cechami starzenia, w tym wadliwa autofagia1. Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) jest najbardziej rozpowszechnioną chorobą stawów i ma duży wpływ na ograniczanie codziennych czynności w starzejącej się populacji, ale ani środki zapobiegawcze, ani terapie modyfikujące przebieg choroby nie są jeszcze dostępne2.

Starzenie się stawów i choroba zwyrodnieniowa stawów są związane z cechami charakterystycznymi, które definiują postęp degeneracji chrząstki, w tym wadliwą autofagię i starzenie się3,4. Ukierunkowanie na autofagię w tkankach mięśniowo-szkieletowych może pomóc w znalezieniu innowacji terapeutycznych dla chorób reumatologicznych5,6. Farmakologiczna modulacja autofagii jest obiecującym, istotnym mechanizmem interwencji w przedklinicznych modelach chorób7. W chorobie zwyrodnieniowej stawów aktywacja autofagii została wykorzystana do zapobiegania dysfunkcji stawów8. Metody monitorowania autofagii oparte na solidnych, powtarzalnych protokołach, które umożliwiają analizę ilościową, mogą być wykorzystywane do identyfikacji nowych czynników i ułatwienia farmakologicznego celowania w istotne dla choroby cechy starzenia.

Strumień autofagii odzwierciedla aktywność degradacji i jest odpowiednim pomiarem do identyfikacji nowych cząsteczek aktywujących autofagię9. W badaniu tym opisano metodę opracowaną w celu określenia strumienia autofagicznego poprzez pomiar aktywności degradacji autofagii przy użyciu reporterowej linii komórkowej autofagii w ludzkich chondrocytach (TC28a2). mCherry-EGFP-LC3- ekspresja przejściowa umożliwia jednoczesne monitorowanie zdarzeń powstawania i degradacji autolizosomów poprzez ilościowe określenie różnic w czułości pH między sygnałami GFP i mCherry LC3 w lizosomach żywych komórek10.

Dostosowanie tej metody raportowania cytometrii przepływowej do systemu monitorowania stabilnej ekspresji w żywych chondrocytach może pozwolić na identyfikację cząsteczek aktywujących strumień autofagiczny w kontekście biologii chrząstki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generowanie reporterowej linii komórkowej autofagii unieśmiertelnionych ludzkich chondrocytów

UWAGA: Generowanie linii komórkowej reporterowej autofagii poprzez stabilną transfekcję pBABE-mCherry-GFP-LC3 poprzez ustalenie ilościowego odczytu cytometrii przepływowej zostało opisane wcześniej11. W transfekcji retrowirusowej wykorzystano dwie linie komórkowe: HEK 293-T17 w procesie kotransfekcji oraz T/C28a2 w procesie infekcji.

  1. Proces kotransfekcji
    1. Przygotuj pożywkę wzrostową dla komórek HEK 293-T17: 500 ml minimalnej pożywki egzogennej Eagle'a (EMEM), 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny (P/S). Przechowywać podłoże w temperaturze 4 °C i ogrzać do 37 °C przed każdym użyciem.
    2. Wysiewaj 1 x 106 komórek HEK 293-T17 na studzienkę na płytki do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm, inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i upewnij się, że są przy ~75% konfluencji przed rozpoczęciem procesu kotransfekcji.
    3. Usunąć pożywkę hodowlaną, przepłukać zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS) i dodać 8 ml EMEM z 2% FBS i 1% P/S.
    4. Do stożkowej probówki dodać 10 μg, 3 μg i 7 μg pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B, VSV. Plazmidy G i pCL-Eco. Następnie dodać 200 μl 1x zredukowanej pożywki surowicy (Tabela materiałów). Dodać odczynnik do transfekcji (tabela materiałów) jako nieliposomalną mieszaninę lipidów w stosunku 1:3 (1 μg DNA : 3 μg odczynnika do transfekcji; objętość końcowa = 60 μl).
      UWAGA: Na każdą 10 cm płytkę komórkową, która ma być transfekowana, przygotowuje się łącznie 20 μg mieszanki.
    5. Inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie przenieść mieszaninę transfekcji kroplami do komórek opakowaniowych HEK 293-T17. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 48 godzin przed sprawdzeniem ekspresji białek zielonych i czerwonych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej><. UWAGA: W tych warunkach ponad 75% komórek powinno mieć dodatni wynik fluorescencji. Upewnij się, że wydajność transfekcji jest wysoka (np. ponad 75% komórek jest dodatnich). Używaj wysokiej jakości plazmidowego DNA (np. w przeważającej mierze superskręconego i wolnego od genomowego DNA, RNA i białka; wysoce skoncentrowanego; wolnego od endotoksyn i soli), a także wysokiej jakości hodowli komórkowych (np. jednorodnych, niskopasażowych, jednowarstwowych, transfekowanych w fazie wzrostu wykładniczego, wolnych od mykoplazmy).
  2. W tym samym dniu kotransfekcji przygotuj chondrocyty T/C28a2.
    1. Przygotuj pożywkę do wzrostu komórek T/C28a2: 500 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 1% P/S. Przechowuj pożywkę wzrostową w temperaturze 4 °C i ogrzej do 37 °C przed każdym użyciem.
    2. Wysiewać 2 x 105 chondrocytów T/C28a2 w dwóch 6-dołkowych płytkach wielopłytkowych i inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Proces infekcji retrowirusowej
    1. Aspirować pożywkę hodowlaną z retrowirusowych komórek pakujących HEK 293-T17 otrzymanych z etapu 1.1.5. Przepłukać 1x 4 ml HBSS i odessać HBSS.
    2. Dodać 2 ml trypsyny i odczekać 2 minuty w temperaturze 37 °C. Zneutralizować trypsynę, dodając 6 ml pożywki hodowlanej HEK 293-T17 oraz komórek transferowych i pożywki do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
    3. Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut. Przenieść supernatant do sterylnego filtra przez membranę 0,45 μm.
    4. Odessać pożywkę do hodowli chondrocytów T/C28a2 z 6-dołkowych płytek wielopłytkowych. Zainfekuj komórki T / C28a2, dodając 2 ml zawiesiny wirusa (krok 1.3.3) na dołek do 6 wielodołkowych płytek. Użyj jednego dołka do kontroli (tj. Komórek nietransfekowanych), dodając 2 ml pożywki do wzrostu komórek T / C28a2 zamiast zawiesiny wirusa.
    5. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. Aby przeprowadzić proces selekcji, należy użyć selekcji antybiotyków na transfekowanych komórkach w celu wyeliminowania nietransfekowanych komórek i uzyskania jednorodnej populacji komórek.
    UWAGA: Wektor retrowirusowy pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B zapewnia ssakom antybiotykową oporność na puromycynę, co umożliwia wybór stabilnej hodowli komórkowej po transfekcji wirusa. Krzywe zabijania dla optymalnego stężenia puromycyny w chondrocytach T / C28a2 powinny być ustalone z wyprzedzeniem, aby stworzyć odpowiednie warunki do wyboru klonów komórek przenoszących transgen o wysokich poziomach ekspresji.
    1. Przygotuj T/C28a2-pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B stabilną pożywkę do wzrostu linii komórkowych: 500 ml DMEM, 10% FCS, 1% P / S i 2,5 μl / ml puromycyny. Przechowywać podłoże w temperaturze 4 °C i ogrzać do 37 °C przed każdym użyciem.
    2. Zmień medium. Dla każdej 6-dołkowej wielopłytki odessać pożywkę hodowlaną, przepłukać 1x 2 ml HBSS i odessać. Dodać 2 ml pożywki i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . To jest początek procesu selekcji.
    3. Wymieniaj pożywkę co 2 dni i obserwuj martwe komórki oraz populacje komórek opornych na puromycynę. Porównaj wyniki z nietransfekowanymi komórkami kontrolnymi, które nie są odporne na puromycynę i umierają.
  5. Aby rozpocząć selekcję klonalną, upewnij się, że populacje monoklonalne wzrosły. Dla każdej 6-dołkowej wielopłytki:
    1. Dodać 200 μl pożywki na dołek do 96-dołkowej płytki wielopłytkowej.
      UWAGA: Każda pojedyncza komórka wybrana z 6-dołkowej wielopłytki zostanie wsażona w indywidualne dołki 96-dołkowej multipłytki
      2. .
    2. Użyj mikroskopu, aby zidentyfikować każdą populację monoklonalną w 6 dołkach wielopłytkowych. Można zaobserwować kolonie powstałe z pojedynczych komórek.
    3. Odessać pożywkę hodowlaną z 6 dołków wielopłytkowych, przepłukać 1x 2 ml HBSS i odessać HBSS.
    4. Dodaj 10 μl trypsyny do każdej populacji monoklonalnej, aby przenieść pojedyncze komórki do każdej z 96 dołków wielopłytkowych. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  6. Po 48 godzinach zastąpić pożywkę 100 μl świeżej pożywki na studzienkę. Powtarzaj tę procedurę, aż utworzą się kolonie w wyniku ekspansji pojedynczych komórek.
  7. Gdy pojedyncza komórka dobrze się rozwinie, umieść każdą populację monoklonalną w indywidualnych dołkach składających się z 24 dołków, 6 dołków i 100 mm płytek do hodowli komórkowych.
  8. Wygeneruj stabilną linię komórkową monoklonalną przy użyciu metody sortowania pojedynczych komórek.
    1. Odessać pożywkę hodowlaną z płytek do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm. Przepłukać 1x 8 ml HBSS i odessać.
    2. Dodać 2 ml trypsyny na każdą płytkę i inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C. Zneutralizować trypsynę, dodając 8 ml pożywki hodowlanej.
    3. Odwirować komórki o masie 252 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Dodać 4 ml HBSS do każdej osadki komórkowej, ostrożnie zawiesić ją ponownie i przenieść do probówek cytometrycznych.
    4. Wstrzyknąć każdą próbkę komórki do cytometru przepływowego (tabela materiałów) z technologią sortowania komórek i oddzielić komórki o wysokiej fluorescencji zielonej i czerwonej.
    5. Przenieść wybrane komórki do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i odwirować komórki w temperaturze 252 x g przez 5 minut. Dodać osad komórkowy do kolby T-25 z 9 ml stabilnej pożywki do wzrostu linii komórkowej. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
      UWAGA: Po sortowaniu komórek należy otrzymać trzy populacje monoklonalne (Tabela 1).
  9. Po 24 godzinach usuń pożywkę i dodaj 8 ml świeżej pożywki. Powtarzaj tę procedurę co 2 dni, aż komórki osiągną zbieg.
    UWAGA: Do badania strumienia autofagicznego można użyć dwóch kontroli: rapamycyny jako odniesienia sygnału o wysokim strumieniu autofagicznym i chlorochiny jako odniesienia sygnału o niskim strumieniu autofagicznym.Przygotować 10 mM roztwór podstawowy rapamycyny w sulfotlenku dimetylu (DMSO) i 30 mM roztwór podstawowy chlorochiny wH2Oi przechowywać w temperaturze -20 °C. Aby wybrać najlepszą populację monoklonalną poprzez badanie ekspresji mCherry i GFP, można zastosować dwie metody: cytometrię przepływową (krok 1.10) lub analizę obrazu fluorescencyjnego o wysokiej zawartości (krok 1.11).
  10. Cytometria przepływowa
    1. Wysiewać 2,5 x 105 komórek na basenik z każdej populacji monoklonalnej na płytkach 12-dołkowych co najmniej 24 godziny przed poddaniem działaniu substancji w 1 ml stabilnej pożywki do wzrostu linii komórkowej i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    2. W dniu zabiegu należy usunąć pożywkę, dodać 1 ml stabilnej pożywki do wzrostu linii komórkowej uzupełnionej 2% FCS na dołek. Dodać 10 μM rapamycyny i 30 μM chlorochiny do stabilnej pożywki wzrostu linii komórkowej z 2% FCS i inkubować przez 16 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    3. Usuń pożywkę, spłucz 1 ml HBSS na studzienkę i odessać.
    4. Dodać 500 μl trypsyny do każdego dołka, inkubować przez 1 minutę w temperaturze 37 °C i zneutralizować reakcję przez dodanie 500 μl pożywki hodowlanej. Zeskrob komórki i przenieś je do stożkowych rurek.
    5. Odwirować komórki przy 252 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Przepłukać granulki komórkowe 500 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wirować przy 252 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
    6. Dodać 500 μl PBS, przenieść komórki do probówek cytometrycznych i wstrzyknąć każdą próbkę do sprzętu cytometrycznego. Dla każdego warunku zbierz 10 000 wydarzeń.
    7. Aby wybrać populację monoklonalną za pomocą cytometrii przepływowej, użyj lasera o długości fali 488 nm do wzbudzenia EGFP i lasera o długości fali 633 nm do zastosowania mCherry. Następnie ustal stosunek fluorescencji mCherry i EGFP, aby wybrać populację komórek o wysokim i niskim strumieniu autofagicznym.
  11. Analiza obrazu fluorescencyjnego o wysokiej zawartości
    1. Wysiew 4 x 103 komórek każdej populacji monoklonalnej na studzienkę w 384 płytkach dołkowych (ściana / przezroczyste dno) w pożywce wzrostowej uzupełnionej 10% FCS, 1% P / S i 2,5 μl / ml puromycyny. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny przed zabiegiem.
    2. Usunąć pożywkę i dodać 10 μM rapamycyny i 30 μM chlorochiny do 50 μl stabilnej pożywki do wzrostu linii komórkowej uzupełnionej 2% FCS na studzienkę. Inkubować przez 16 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    3. Usuń pożywkę, spłucz 50 μl HBSS na studzienkę i odessać. Utrwalić komórki 4% paraformaldehydem (PFA) przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Usunąć PFA i spłukać 50 μl HBSS na studzienkę.
    4. Aby zidentyfikować jądra komórkowe, wybarwić Hoechst 33342 (2,5 μg/ml) przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Odessać barwnik Hoechst 33342, spłukać 50 μl HBSS na studzienkę i dodać 50 μl PBS na studzienkę.
    5. Przeprowadzić akwizycję i analizę strumienia autofagicznego uzyskanego przez platformę HTS zgodnie z opisem w sekcji 3.
      UWAGA: Kryteria wyboru populacji monoklonalnej opierają się na tym, czy strumień autofagiczny zwiększał się czy zmniejszał odpowiednio po rapamycynie lub chlorochinie (Tabela 1). Klony o wysokim poziomie ekspresji mCherry i GFP są bardziej odpowiednie do dokładnej analizy obrazu fluorescencyjnego o wysokiej zawartości, ilościowego oznaczania strumienia autofagii.

2. Test strumienia autofagicznego oparty na obrazie w żywych chondrocytach

UWAGA: Po wybraniu klonu, rozpocznij test, aby określić ilościowo strumień autofagiczny.

  1. Za pomocą ręcznej elektronicznej pipety 384-kanałowej wysiewaj 4 x 103 komórki wybranego klonu (krok 1.11) na studzienkę do 384 dołków (ścianka/przezroczyste dno) w 50 μl stabilnej pożywki do wzrostu linii komórkowej uzupełnionej 10% FCS, 1% P / S i 2,5 μl / ml puromycyny na studzienkę. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny przed zabiegiem.
  2. W dniu eksperymentu przygotuj płytkę interwałową do dodania związku.
    1. Dodaj objętość każdego związku/kontroli i stabilnej pożywki do wzrostu linii komórkowej na płytkę interwałową, używając odpowiednio technologii akustycznej obsługi cieczy i elektronicznej pipety 384-kanałowej, aby uzyskać stężenie interwałowe.
      UWAGA: Kontrole w tym teście obejmowały stabilną pożywkę wzrostu linii komórkowej uzupełnioną 2% FCS, 30 μM chlorochiny i 10 μM rapamycyny. Stężenia interwałowe będą zależeć od pożądanego stężenia końcowego. Na przykład w tym teście chlorochinę i rapamycynę dodano do 50 μl stabilnej pożywki wzrostu linii komórkowej na studzienkę, aby uzyskać stężenie w odstępie odpowiednio 300 μM i 100 μM.
    2. Za pomocą robota do mycia mikropłytek odessać pożywkę z płytki komórkowej w sposób zautomatyzowany i dodać 45 μl stabilnej pożywki do wzrostu linii komórkowej uzupełnionej 2% FCS na studzienkę.
    3. Następnie przenieść 5 μl na studzienkę z płytki interwałowej na płytkę testową, aby uzyskać końcowe stężenie za pomocą innej zautomatyzowanej stacji roboczej do obsługi cieczy.
  3. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 16 godzin. Za pomocą robota do mycia mikropłytek odessać pożywkę.
  4. Utrwalić komórki 50 μl 4% PFA na studzienkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Przemyć 50 μl HBSS na studzienkę.
  5. Wybarwić jądra preparatem Hoechst 33342 (2,5 μg/ml) przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Odessać Hoechst 33342 i spłukać 50 μl HBSS na studzienkę.
  6. Dodać 50 μl PBS do dołka. Płytka jest teraz gotowa do odczytu, zbierania danych i późniejszej analizy.
    UWAGA: Ten protokół jest opisany dla badań przesiewowych o wysokiej przepustowości (HTS). Jeśli jednak używa się kilku związków, można je dodawać ręcznie, bez automatycznych instrumentów. Minimalna manipulacja komórkami i supernatantem przy użyciu skalibrowanych przyrządów do obsługi cieczy i/lub pipet elektronicznych ułatwia pomyślne przygotowanie monowarstw kultur komórkowych do ilościowego oznaczania strumienia autofagii za pomocą analizy obrazu fluorescencyjnego o wysokiej zawartości.

3. Akwizycja danych i analiza strumienia autofagicznego

  1. Do pozyskiwania danych należy użyć systemu badań przesiewowych o wysokiej zawartości (HCS) i zautomatyzowanego mikroskopu, który umożliwia automatyczne pozyskiwanie i analizę obrazu za pomocą algorytmu przetwarzania obrazu.
  2. Aby opracować protokół akwizycji, wybierz kilka kanałów i czasów ekspozycji (Tabela 2) w celu identyfikacji jąder i tworzenia autofagosomów i autolizosomów podczas zdarzeń strumienia autofagicznego.
  3. Dla każdej studzienki zbierz obrazy z czterech pól pokrywających powierzchnię studni i w czterech stosach, zaczynając od 8 μm oddzielonych odległością roboczą 0,2 μm. Uchwyć obrazy za pomocą obiektywu 60x, aby uzyskać szczegółowe obrazowanie komórek.
  4. Analizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy obrazu dostarczonego przez mikroskop HCS. Aby opracować solidny algorytm protokołu analizy do monitorowania strumienia autofagii, należy wybrać najbardziej odpowiednią metodę automatycznej segmentacji obrazu komórki i specyficznego wykrywania plamek odpowiadających aktywacji LC3. Wykonaj końcową sekwencję analizy, dodając metody, etapy segmentacji komórek i instrukcje dotyczące kwantyfikacji, jak opisano poniżej:
    1. Kliknij blok konstrukcyjny Znajdź jądra i wybierz kanał barwnika jądrowego Hoechst 33342. Wybierz Metoda i wybierz jądra populacji wyjściowej.
    2. Kliknij blok konstrukcyjny Znajdź cytoplazmę i wybierz cytoplazmatyczny kanał barwnikowy Fluoresceina. Wybierz metodę | Próg indywidualny.
    3. Kliknij blok konstrukcyjny Znajdź cytoplazmę (2) i wybierz RFP kanału barwnika cytoplazmatycznego. Wybierz metodę | Próg indywidualny.
    4. Kliknij blok konstrukcyjny Populacja i wybierz jądra badanej populacji. Wybierz metodę Wspólne filtry (Usuń obiekty obramowania) i wybierz populację wyjściową Nuclei Inside Borders.
    5. Kliknij blok konstrukcyjny Znajdź miejsca i wybierz konkretny kanał znacznika Fluoresceina. Wybierz badaną populację Jądra wewnątrz granic i wybierz badany region Cytoplazma. Wybierz opcję Method (Metoda) i wybierz pozycję Spots Inside Borders (Miejsca wewnątrz obramowań) w populacji wynikowej.
    6. Kliknij blok konstrukcyjny Znajdź miejsca (2) i wybierz zapytanie ofertowe określonego kanału znacznika. Należy wybrać badaną populację Jądra wewnątrz granic i wybrać badany region Cytoplazma (2). Wybierz Metoda i wybierz populację wyjściową Miejsca (2) Wewnątrz obramowań.
    7. Kliknij blok konstrukcyjny Oblicz właściwości intensywności i wybierz konkretny kanał znacznika Fluoresceina. Wybierz badaną populację Nuclei Inside Borders i wybierz region badany Spot. Wybierz Metoda i wybierz właściwości wyjściowe Intensywność Spot Fluoresceina Inside Borders.
    8. Kliknij blok konstrukcyjny Oblicz właściwości intensywności i wybierz zapytanie ofertowe określonego kanału znacznika. Wybrać badaną populację Nuclei Inside Borders i wybrać badany region Spot (2). Wybierz Metoda i wybierz właściwości wyjściowe Intensywność Punkt (2) RFP Inside Borders.
    9. Kliknij blok konstrukcyjny Definiuj wyniki, wybierz populację Jądra wewnątrz granic, wybierz Liczba obiektów jąder (średnia), wybierz Względna intensywność plam Fluoresceina – średnia na odwiert i wybierz Względna intensywność plam (2) – RFP – średnia na odwiert.
  5. Aby określić ilościowo strumień autofagiczny, użyj tej samej metody, którą opisano wcześniej dla analizy cytometrii przepływowej11. Ustal stosunek mCherry/EGFP plamek o względnej intensywności.
    UWAGA: Komórki o wyższym strumieniu są mniej zielone, co zwiększa stosunek mCherry/EGFP w komórce. Identyfikacja i dokładne określenie ilościowe znaczącej liczby istotnych sygnałów pochodzących ze zdarzeń strumienia autofagii w komórkach jest bardzo ważne dla ustalenia statystycznie istotnych różnic.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strumień autofagiczny może być monitorowany w komórkach za pomocą modulacji farmakologicznej lub reakcji komórki na stres. Nieśmiertelne ludzkie chondrocyty (T / C28a2) wykorzystano do opracowania linii komórkowej reporterowej autofagii przy użyciu LC3 jako fluorescencyjnego reportera (mCherry-EGFP-LC3B) do autofagii. Rysunek 1 pokazuje schematyczny przebieg testu przesiewowego, począwszy od rozwoju linii komórek reporterowych autofagii w ludzkich chondrocytach (mCherry-EGFP-LC3-T/C28a2), aż do indukc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wadliwa autofagia jest ważną cechą charakterystyczną zwyrodnienia stawów związanego ze starzeniem się, ale ani profilaktyczne, ani modyfikujące przebieg choroby terapie ukierunkowane na autofagię nie są jeszcze dostępne w przypadku zwyrodnienia chrząstki2. Biorąc pod uwagę jej znaczenie i implikacje kliniczne, autofagia stała się celem zainteresowania przy odkrywaniu i opracowywaniu leków, chociaż metody bezpośredniego monitorowania zmian w tym kluczowym mechanizmie homeostazy okazały się trudne.<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Instituto de Salud Carlos III- Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spain, Plan Estatal 2013-2016 i Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), "Una manera de hacer Europa", PI14/01324 i PI17/02059, przez platformę Innopharma Pharmacogenomics zastosowaną do walidacji celów i odkrywania leków kandydujących do faz przedklinicznych, Ministerio de Economía y Competitividad. Dziękujemy również Fundacji Badań Reumatologicznych (FOREUM) za wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka do hodowli komórkowej 100 mmCorning430167Płytka do hodowli komórkowych
12-dołkowa wielopłytkaCorning353043Płytka do hodowli komórkowych
15 ml Probówka stożkowa wirówkiFalcon-Corning 352095 Wirówkastożkowa
24-dołkowa wielopłytkaCorning351147Płytka do hodowli komórkowych
25 cm2 Kolbado hodowli komórkowychFalcon-Corning353014Kolba do hodowli komórkowych
384-dołkowa wielopłytkowa Nośnik komórekPerkin Elmer6007550Płytka do hodowli komórkowych
6-dołkowa wielopłytkaCorning351146Płytka do hodowli komórkowych
96-dołkowa wielopłytkaCorning 353077 Płytkado hodowli komórkowych
Technologia akustycznego obchodzenia się z cieczamiLabcyte−https://www.labcyte.com
ChlorochinaSigma-AldrichC6628autofagiczny inhibitor strumienia
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOD2650Disolvent
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Lonza, Bazylea, SzwajcariaBE-604FT/C28a2 podłoże wzrostowe
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)ATCC30– 2003HEK 293-T17 pożywka wzrostowa
cytometr FACScaliburBecton Dickinson, CAi minus;https://www.bdbiosciences.com/en-eu
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOF9665HEK 293-T17 surowica
Płodowa surowica cielęca (FCS)Gibco firmy Life Technologies, CA26010– 074Serum
FuGenePromegaE2691Nieliposomalna mieszanina lipidów jako metoda dostarczania plazmidu w celu wytworzenia autofagii zgłoszona linia komórkowa
Ręczna elektroniczna pipeta 384-kanałowaIntegra−https://www.integra-biosciences.com/united-states/en/electronic-pipettes/viaflo-96384#downloads
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)Sigma-AldrichH6648Bufor
HEK 293-T17ATCCCRL-11268Linia komórek nerkowych. Komórki wykorzystano w celu ułatwienia pakowania retrowirusowego
System badań przesiewowych o wysokiej zawartościPerkin Elmer−https://www.perkinelmer.com/es/product/operetta-cls-system-hh16000000
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific62249Oprogramowanie do analizy obrazu barwienia DNA
Perkin Elmer−https://www.perkinelmer.com/es/product/harmony-4-9-office-license-hh17000010
Stacja robocza Liquid HandlerPerkin Elmer−https://www.perkinelmer.com/es/category/janus-liquid-handler-workstations
Robot do mycia mikropłytekBiotek−https://go.biotek.com/405tradein
Opti-MEM® (1x)Thermo Fisher Scientific11058Pożywka transfekcyjna
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich158127Fixer
pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3BAddgene, Cambridge, MA22418Plazmid
pCL-EcoAddgene, Cambridge, MA12371Plazmidowa
penicylina-streptomycyna (P/S)Sigma-AldrichP0781Antybiotyk
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)MP Biomedicals2810305Bufor
PuromycinSigma-Aldrich, St. Louis, MOP8833Antybiotyk
RapamycynaCalbiochem, Niemcy5053210autofagiczny aktywator strumienia
Oprogramowanie CellQuestProBecton Dickinson−https://www.bdbiosciences.com/en-eu
Filtry strzykawkowe 0,45 μ mCorningCLS431220Sterylny filtr
T/C28a2−−ludzka linia komórkowa chondrocytów
TrypsynaGibco firmy Life Technologies, CA15400054Trypsyna stosowana z komórkami T / C28a2
TrypsynaSigma-Aldrich, St. Louis, MOSM-2002-CTrypsyna stosowana z komórkami HEK 293-T17
VSV. GAddgene, Cambridge, MA14888Plazmid

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lopez-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  2. Lotz, M. K., Carames, B. Autophagy and cartilage homeostasis mechanisms in joint health, aging and OA. Nature Reviews Rheumatology. 7 (10), 579-587 (2011).
  3. Carames, B., Taniguchi, N., Otsuki, S., Blanco, F. J., Lotz, M. Autophagy is a protective mechanism in normal cartilage, and its aging-related loss is linked with cell death and osteoarthritis. Arthritis & Rheumatology. 62 (3), 791-801 (2010).
  4. Carames, B., Olmer, M., Kiosses, W. B., Lotz, M. K. The relationship of autophagy defects to cartilage damage during joint aging in a mouse model. Arthritis & Rheumatology. 67 (6), 1568-1576 (2015).
  5. Kroemer, G. Autophagy: a druggable process that is deregulated in aging and human disease. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 1-4 (2015).
  6. Leidal, A. M., Levine, B., Debnath, J. Autophagy and the cell biology of age-related disease. Nature Cell Biology. 20 (12), 1338-1348 (2018).
  7. Maiuri, M. C., Kroemer, G. Therapeutic modulation of autophagy: which disease comes first. Cell Death & Differentiation. 26 (4), 680-689 (2019).
  8. Vinatier, C., Dominguez, E., Guicheux, J., Carames, B. Role of the inflammation- autophagy-senescence integrative network in osteoarthritis. Frontiers in Physiology. 9, 706(2018).
  9. du Toit, A., Hofmeyr, J. S., Gniadek, T. J., Loos, B. Measuring autophagosome flux. Autophagy. 14 (6), 1060-1071 (2018).
  10. N'Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO Reports. 10 (2), 173-179 (2009).
  11. Gump, J. M., Thorburn, A. Sorting cells for basal and induced autophagic flux by quantitative ratiometric flow cytometry. Autophagy. 10 (7), 1327-1334 (2014).
  12. Yoshii, S. R., Mizushima, N. Monitoring and Measuring Autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865(2017).
  13. Nogueira-Recalde, U., et al. Fibrates as drugs with senolytic and autophagic activity for osteoarthritis therapy. EBioMedicine. 45, 588-605 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przesiewowe badanie choroby zwyrodnieniowej staw wreporter LC3obrazowanie wysokotre ciowezautomatyzowana analiza obrazuludzkie chondrocytymCherry EGFP LC3Bprzesiew fenotypowychoroby zwi zane z wiekiem
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły