Prezentowany protokół opisuje transport i przygotowanie wyciętej ludzkiej tkanki hipokampa, której ostatecznym celem jest wykorzystanie ważnych wycinków mózgu jako narzędzia do oceny przedklinicznej potencjalnych substancji przeciwpadaczkowych.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie ostrych wycinków ludzkiego hipokampa do zapisów elektrofizjologicznych
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Epilepsja dotyka około 1% światowej populacji i prowadzi do poważnego spadku jakości życia z powodu ciągłych napadów, jak również wysokiego ryzyka nagłej śmierci. Pomimo obfitości dostępnych opcji leczenia, około 30% pacjentów jest opornych na leki. Opracowano kilka nowych metod terapeutycznych przy użyciu modeli zwierzęcych, jednak odsetek pacjentów opornych na leki pozostaje niezmieniony. Jedną z prawdopodobnych przyczyn jest brak translacji między modelami gryzoni a ludźmi, np. słaba reprezentacja ludzkiej farmakooporności w modelach zwierzęcych. Wycięta ludzka tkanka mózgowa jako narzędzie oceny przedklinicznej ma tę zaletę, że wypełnia tę lukę translacyjną. Opisano tutaj metodę wysokiej jakości przygotowania wycinków mózgu ludzkiego hipokampa, a następnie stabilnej indukcji aktywności padaczkowej. Protokół opisuje indukcję aktywności impulsowej podczas stosowania 8 mM KCl i 4-aminopirydyny. Aktywność ta jest wrażliwa na uznany lakozamid AED lub nowych kandydatów na leki przeciwpadaczkowe, takie jak dimetyloetanoloamina (DMEA). Ponadto metoda opisuje indukcję zdarzeń podobnych do napadów w CA1 ludzkich wycinków mózgu hipokampa poprzez redukcję zewnątrzkomórkowego Mg2 + i zastosowanie bicukuliny, blokera receptora GABAA. Zestaw eksperymentalny może być wykorzystany do badań przesiewowych potencjalnych substancji przeciwpadaczkowych pod kątem ich wpływu na aktywność padaczkową. Co więcej, mechanizmy działania postulowane dla określonych związków mogą być walidowane przy użyciu tego podejścia w tkance ludzkiej (np. za pomocą zapisów patch-clamp). Podsumowując, badania żywotnej tkanki mózgowej człowieka ex vivo (w tym przypadku wycięty hipokamp od pacjentów cierpiących na padaczkę skroniową) poprawią obecną wiedzę na temat fizjologicznych i patologicznych mechanizmów zachodzących w ludzkim mózgu.
Wprowadzenie
Epilepsja jest jednym z najczęstszych zaburzeń neurologicznych, dotykającym 1% światowej populacji i wiąże się ze zwiększoną zachorowalnością i śmiertelnością1,2. Niestety, jedna trzecia pacjentów cierpiących na padaczkę jest oporna na leki, pomimo obfitości dostępnych opcji leczenia, w tym ponad 20 zatwierdzonych leków przeciwpadaczkowych (AED)3. Brak przełożenia wyników badań przedklinicznych na badania kliniczne na badania kliniczne jest jednym z powodów, dla których obiecujące strategie leczenia nie są skuteczne u wielu pacjentów4. Ostatnio wykazano, że neuropeptyd Y (NPY) i galanina mają działanie przeciwpadaczkowe w modelach zwierzęcych; jednakże, podczas testów na wyciętej ludzkiej tkance mózgowej, tylko NPY był skuteczny5.
Większość istniejącej wiedzy na temat podstawowych mechanizmów neurologicznych i metod terapii chorób wywodzi się z modeli zwierzęcych i eksperymentów z hodowlami komórkowymi. Chociaż modele te są pouczające, reprezentują tylko pojedyncze aspekty złożonych chorób człowieka i sieci mózgu dorosłego człowieka. Alternatywnie, ludzka tkanka mózgowa ma potencjał do wypełnienia luki translacyjnej, ale rzadko jest dostępna do badań funkcjonalnych. Na przykład pośmiertne badanie tkanki mózgowej było cennym narzędziem w badaniu ekspresji białek, morfologii mózgu lub połączeń anatomicznych, chociaż aktywność neuronalna jest często zagrożona w tym tissue6,7,8,9,10,11.
Natomiast żywa wycięta ludzka tkanka mózgowa została zbadana pod kątem przedklinicznej oceny leków, podstawowych funkcji neuronalnych i wzorców ekspresji genów12,13,14,15,16,17. Ogromną zaletą wycinków ludzkiego mózgu w porównaniu z wycinkami gryzoni jest długa żywotność tkanki neuronalnej po resekcji i preparacji. W porównaniu z wycinkami mózgu gryzoni, które zwykle można rejestrować do 8 godzin po przygotowaniu, wycinki ludzkiego mózgu wykazują stabilną aktywność neuronalną do 72 godzin, co umożliwia dokładne zbadanie tych rzadkich i cennych próbek12,18.
Kilka badań badało właściwości aktywności epileptiform w różnych obszarach wyciętej tkanki ludzkiej kory mózgowej i hipokampa oraz używało różnych metod do indukcji aktywności epileptowej. W plastrach gryzoni aktywność padaczkowatą można indukować kilkoma metodami: stymulacją elektryczną komórek wnękowych DG, wzrostem zewnątrzkomórkowego K+ (8–12 mM KCl), blokowaniem receptorów GABAA przez bicukulinę (BIC), blokowaniem kanałów potasowych przez 4-aminopirydynę (4-AP) oraz usuwaniem lub zmniejszaniem Mg2+ w roztworze zewnątrzkomórkowym19. Jednak indukcja aktywności padaczkowej w tkance ludzkiej wymaga połączenia co najmniej dwóch z wyżej wymienionych metod20,21,22.
Przedstawiona tutaj jest metoda przygotowania wycinków ludzkiego hipokampa mózgu, które są żywotne przez okres do 20 godzin i wykazują indukcję aktywności padaczkowej po zastosowaniu wysokiego K+ (8 mM) i 4-AP lub niskiego Mg2+ i BIC.
Protokół
Pacjenci muszą wyrazić świadomą pisemną zgodę przed operacją, a niezbędne umowy etyczne muszą być zawarte przed eksperymentem. Jeśli chodzi o reprezentatywne wyniki, wszystkie badania z udziałem ludzi zostały ocenione i zatwierdzone przez Charité-Universitätsmedizin w Berlinie (EA2/111/14).
1. Przygotowanie 10x roztworów
UWAGA: Ze względu na trudności w planowaniu dostępu do ludzkiej tkanki mózgowej, zaleca się przygotowanie 10x roztworów, jak opisano tutaj. Alternatywnie, końcowe roztwory 1x można przygotować na świeżo, dodając poszczególne substancje w końcowym stężeniu do podwójnie destylowanej wody (ddH2O).
- Dla pojedynczych 10x roztworów dodać substancje do ddH2O zgodnie z tabelą 1 i mieszać aż do rozpuszczenia.
- Stosować 10x roztwory do 1 miesiąca po przygotowaniu (do 1 roku w przypadku mrożonych 10x choliny aCSF).
- Dla 10x choliny aCSF przygotować 50 ml porcji 10x 1,1 choliny aCSF (Tabela 1) i zamrozić w temperaturze -20 °C lub -80 °C do dalszego użycia.
UWAGA: Nie dodawaj glukozy i CaCl2 do 10x 1,1 choliny aCSF, aby zapobiec zanieczyszczeniu bakteriami i wytrącaniu się węglanu wapnia. - 10x Rozwiązanie 2 może być używane dla wszystkich 1x końcowych rozwiązań, podczas gdy 10x roztwory 1.1-1.4 są dostosowywane i odpowiednio nazwane (Tabela 1).
2. Przygotowanie 1x roztworów końcowych
UWAGA: Końcowe roztwory 1x powinny być przygotowane świeże lub jak najwcześniej w dniu poprzedzającym użycie. Wszystkie roztwory końcowe należy karbonizować 5% CO2 i 95% O2 za pomocą szklanego dyspergatora gazu w celu wzbogacenia roztworów w tlen i dostosowania pH do 7,4 (max = 7,4 ± 0,2).
- Cholina aCSF do transportu i przygotowania
- Aby uzyskać końcowy roztwór o stężeniu 500 ml, rozmrozić 50 ml porcji 10 x roztworu 1,1 podwielokrotności choliny aCSF w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Dodać rozmrożoną 50 ml porcji 10x roztworu 1.1 i 50 ml 10x roztworu 2 do około 300 ml ddH2O.
- Dodać końcowe stężenia glukozy i CaCl2, a następnie mieszać aż do rozpuszczenia (Tabela 1, roztwór 1.1).
- Dodaj ddH2O do końcowej objętości 500 ml i zmierz osmolarność (300 mOsm ± 10 mOsm).
- Opcjonalnie należy użyć filtra do sterylizacji roztworu (patrz dyskusja na temat przedłużonej żywotności plastrów w sterylnych warunkach).
- Napełnij oddzielną butelkę około 100 ml 1x cholina aCSF do transportu z sali operacyjnej do laboratorium.
- Opcjonalnie: w zależności od czasu transportu z sali operacyjnej do laboratorium, należy rozważyć użycie gazoszczelnych nakrętek do butelek, aby zapewnić stabilne pH aCSF podczas dłuższych okresów transportu.
- Roztwór końcowy należy przechowywać w temperaturze 4–8°C do czasu dalszego użycia.
- W dniu pracy schłodzić 1x cholinę aCSF na lodzie i karbogenianu przez co najmniej 10–15 minut za pomocą szklanego dyspergatora gazu podłączonego do gazu karbonowego (5%CO2, 95%O2).
UWAGA: Rozważ pozostawienie butli z gazem pod ręką na sali operacyjnej w przypadku dłuższego czasu oczekiwania, który będzie wymagał ponownego skarbonowania roztworu transportowego. Jednak przetransportowaliśmy tkankę hipokampa bez rekarbonacji przed długimi i krótkimi czasami transportu (15 min vs. 60 min) i nie zaobserwowaliśmy różnic w indukcji aktywności padaczkowej.
- aCSF do przechowywania i nagrywania
- Aby uzyskać końcowy roztwór 2 l, dodaj 200 ml 10x roztworu 1,2 (aCSF) i 200 ml 10x roztworu 2 i glukozy (Tabela 1) do ~1500 ml ddH2O.
UWAGA: Objętości końcowych roztworów zależą od zastosowanych eksperymentów oraz rodzaju komory używanej do przechowywania i nagrywania. - Dodać ddH2O do końcowej objętości 2 l i zmierzyć osmolarność (300 mOsm ±10 mOsm).
- Przed użyciem podgrzej roztwór do temperatury 35 °C i skarbonuj go przez co najmniej 10–15 minut.
- Aby uzyskać końcowy roztwór 2 l, dodaj 200 ml 10x roztworu 1,2 (aCSF) i 200 ml 10x roztworu 2 i glukozy (Tabela 1) do ~1500 ml ddH2O.
- HighK++4-AP aCSF do indukcji aktywności impulsowej
- Aby uzyskać końcowy roztwór 1 l, dodaj 100 ml 10x roztworu 1,3 (highK++4-AP aCSF) i 100 ml 10x roztworu 2 do ~700 ml ddH2O.
- Dodać glukozę i 4-AP (stężenie końcowe = 100 μM) zgodnie z tabelą 1.
- Dodać ddH2O do końcowej objętości 1 l i zmierzyć osmolarność (300 mOsm ±10 mOsm).
- Przed użyciem podgrzej roztwór do temperatury 35 °C i skarbonuj go przez co najmniej 10–15 minut.
- Niski poziom Mg2 + + BIC aCSF do indukcji zdarzeń podobnych do napadów padaczkowych (SLE)
- Aby uzyskać końcowy roztwór 1 l, dodaj 100 ml 10x roztworu 1,4 (lowMg2 + + BIC aCSF) i 100 ml 10 x roztworu 2 do ~ 700 ml ddH2O.
- Dodać glukozę i BIC (stężenie końcowe = 10 μM) zgodnie z tabelą 1.
- Dodać ddH2O do końcowej objętości 1 l i zmierzyć osmolarność (300 mOsm ± 10 mOsm).
- Przed użyciem podgrzej roztwór do temperatury 35 °C i skarbonuj go przez co najmniej 10–15 minut.
3. Przygotowanie komory interfejsu
- W komorze interfejsu plastry spoczywają na trzech warstwach bibuły filtracyjnej, aby zapewnić wystarczającą ilość roztworu poniżej warstwy. Aby to zrobić, wytnij dwa kawałki bibuły filtracyjnej o wymiarach ~4 cm x ~2 cm na każdą komorę na plasterki (opisana komora interfejsu składa się z dwóch przegródek) i umieść je jeden na drugim.
- Umieść cienkie bawełniane sznurki wokół bibuł filtracyjnych o wymiarach 4 cm x 2 cm wewnątrz przegródek, aby złamać napięcie roztworu. Zadbaj o równomierny przepływ (tutaj używane są czarne nylonowe rajstopy przycięte na cienkie sznurki o długości ~10 cm; rozmieszczenie patrz Rysunek 1).
- Umieść małe kawałki bibuły filtracyjnej na większych bibułach filtracyjnych w przegródkach na plastry. Małe kawałki tkanki filtracyjnej powinny być mniej więcej wielkości jednego wycinka mózgu (~1,5 cm x ~1,0 cm) i umożliwią dalszą obróbkę pojedynczych plasterków. Umieść trzy do czterech małych kawałków bibuły filtracyjnej w każdej komorze.
- Zapewnić natężenie przepływu aCSF 1,8 ml/min za pomocą pompy perystaltycznej.
- Skarbonować i ogrzać komorę interfejsu do ~35 °C (końcowa temperatura plastra powinna wynosić ~32 °C).
4. Przygotowanie strefy przygotowań
UWAGA: Przygotowanie może być przeprowadzone w sterylnych warunkach, aby uniknąć zanieczyszczenia i wydłużyć przeżywalność plastrów. Jednak nie wszystkie wibratory mieszczą się pod sterylnym kapturem i wymagane są inne środki w celu zmniejszenia zanieczyszczenia podczas przygotowania. W tej sekcji opisano niektóre z tych środków.
- Przetrzyj obszar preparatu 70% EtOH i umieść folię aluminiową lub sterylne osłony na wierzchu obszaru.
- Przygotuj super klej, dwie ostre pęsety, szpatułkę, skalpel z ostrzami i ostrze do zgrubnego cięcia tkanki mózgowej. Narzędzia mogą być sterylizowane przed zabiegiem w celu zmniejszenia zanieczyszczenia.
- Przetrzyj tackę buforową i płytkę próbki wibratomu 70% EtOH. Gdy tacka buforowa całkowicie wyschnie, przykryj ją folią aluminiową i umieść tackę w łaźni lodowej. Napełnić łaźnię lodową kruszonym lodem i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu przygotowania.
- Przetrzyj wibratom i żyletkę 70% EtOH i skalibruj wibratom, aby zminimalizować wibracje pionowe i uszkodzenie tkanek podczas procedury krojenia.
5. Krojenie i przechowywanie tkanek
- Bezpośrednio po resekcji natychmiast umieść tkankę w zimnej, karbogenicznej cholinie aCSF i szybko przetransportuj do laboratorium.
UWAGA: Podczas przygotowywania należy nosić rękawiczki i maskę na twarz, ponieważ ludzka tkanka mózgowa może zawierać potencjalne patogeny. Ponadto noszenie maski na twarz, gdy nie pracujesz pod sterylnym kapturem, znacznie zmniejszy zanieczyszczenie roztworów i tkanki mózgowej. - Usuń tkankę z choliny aCSF i odetnij wszelkie spalone części tkanki.
- Wytnij równą powierzchnię, aby przykleić kawałek tkanki do płytki próbki, biorąc pod uwagę kąt cięcia i warstwy tkanki. Idealnie, wycinek hipokampa zawiera DG, CA1-4 i (jeśli to możliwe) subiculum.
- Pokrój tkankę mózgową na plastry o grubości 400 μm i dostosuj amplitudę i prędkość podczas cięcia. Ze względu na możliwe pozostałości pia mater, ludzka tkanka mózgowa wykazuje większą odporność i może wymagać wolniejszego cięcia.
UWAGA: Grubość warstwy ma duży wpływ na dostępną sieć (więcej neuronów w grubszych warstwach) lub żywotność warstwy (przenikanie roztworu do warstwy). Użyliśmy wycinków o wielkości 500 μm w celu zwiększenia potencjalnie dostępnej mikrosieci i nie mogliśmy zaobserwować różnic w indukcji aktywności padaczkowej. Plastry o średnicy 300 μm są powszechnie używane do eksperymentów z zaciskiem krosowym, chociaż indukcja aktywności padaczkowej w tych wycinkach nie została jeszcze tutaj przetestowana. Jako standardowej grubości plastra używamy 400 μm, chociaż plastry 300–500 μm mogą być wystarczające. - Przed pobraniem użyj skalpela, aby zmniejszyć rozmiary wycinków mózgu, aby zmieściły się w komorze nagrywającej. W celu korzystania z komory membranowej (patrz punkt 6) plastry powinny mieć wymiary maksymalnie 1,5 cm x 1 cm. Podczas redukcji należy wziąć pod uwagę konkretne warstwy i połączenia, które muszą być nienaruszone do nagrywania (np. do nagrywania w CA1 i DG odetnij subiculum i otaczającą białą tkankę).
- Za pomocą szpatułki i małych kleszczyków ostrożnie umieść plastry w komorze interfejsu na małych bibułach filtracyjnych i pozwól im odpocząć przez ~1 godzinę w CSF do momentu nagrania.
- Plastry mogą być rejestrowane do 20 godzin (nawet dłużej w sterylnych warunkach).
6. Rejestracja aktywności epilepticznej
- W komorze membranowej (zanurzonej komorze nagrywającej) umieść wycinek mózgu na przezroczystej półprzepuszczalnej membranie, która jest przyklejona do plastikowego pierścienia24. W tym celu użyj super kleju, aby przymocować plastikowy pierścień do membrany wkładki do hodowli komórkowej.
- Użyj skalpela, aby usunąć membranę na zewnątrz plastikowego pierścienia. Upewnij się, że membrana jest równa i całkowicie przymocowana do pierścienia przed umieszczeniem membrany w komorze.
UWAGA: Membrana może być przechowywana w ddH2O w temperaturze 4–8 °C i ponownie używana przez okres do 1 miesiąca. Utrzymuj membranę mokrą przez cały czas. - Zarówno dopływ, jak i odpływ komory membranowej są podłączone do rurek do dostarczania roztworu. Umieść rurki w pompie perystaltycznej tak, aby dopływ i odpływ poruszały się w przeciwnych kierunkach.
- Umieść rurkę doprowadzającą i odpływową w karbogenicznym, wstępnie podgrzanym aCSF, aż wszystkie rurki i komora zostaną wypełnione roztworem. Dostosuj prędkość pompy perystaltycznej, aby uzyskać równomierne natężenie przepływu 10–13 ml/min.
UWAGA: Zastosowana tutaj komora membranowa to komora rejestrująca o dużym natężeniu przepływu, zanurzona, umożliwiająca przepływ roztworu do 14 ml/min24. W przypadku korzystania z innej zanurzonej komory rejestracyjnej, należy dostosować natężenie przepływu. Jednak w celu indukcji aktywności padaczkowej zdecydowanie zaleca się stosowanie komory membranowej. - Użyj elementu grzejnego podłączonego do dopływu w bliskiej odległości od komory membranowej, aby zapewnić stabilną temperaturę 32 °C.
- Przygotuj szklane pipety o pojemności 1–2 MΩ za pomocą pionowego ściągacza. Napełnij pipety roztworem NaCl o stężeniu 154 mM i umieść je w uchwycie elektrody.
- Za pomocą pęsety i szpatułki wyjmij plasterek hipokampa z komory interfejsu, biorąc plasterek z małą bibułą filtracyjną i umieszczając oba na szalce Petriego wypełnionej karbogenicznym aCSF. Usuń małą bibułę filtracyjną z plastra hipokampa i (jeśli to konieczne) przyłóż pewną siłę za pomocą pipety, aby oddzielić plasterek od bibuły filtracyjnej. Uważaj, aby nie przewrócić plasterka.
- Umieść plasterek w komorze nagrywającej i przytrzymaj go na miejscu za pomocą slice mesh.
UWAGA: Ze względu na zasadę Bernoulliego, w stosowanej komorze membranowej typu zanurzeniowego, plastry są zwykle stabilne bez użycia dodatkowej siatki kropelkowej. - Umieść elektrody w obszarze i warstwie zainteresowania (tutaj CA1) i rozpocznij nagrywanie.
- Rejestruj aktywność potencjału pola w bieżącym trybie cęgowym z częstotliwością próbkowania 10–20 kHz i filtrem dolnoprzepustowym z częstotliwością 2 kHz.
- Rejestruj podstawową aktywność w płynie mózgowo-rdzeniowym przez maksymalnie 5 minut.
- Przełącz rurki dopływowe z aCSF na highK++4AP lub lowMg2++BIC aCSF, a rurkę odpływową na pojemnik na odpady, aby zapobiec mieszaniu się roztworów. Po 2 minutach umieść rurkę odpływową w tym samym roztworze co dopływ, aby zachować roztwór.
- Aktywność impulsowa wywołana przez highK++4-AP powinna być widoczna 2–5 minut po praniu. Jednak indukcja TRU przez lowMg2++BIC może trwać do 30 minut. W razie potrzeby należy ostrożnie zmienić położenie elektrod, aby uzyskać optymalne wyniki.
- Gdy znajdziesz się w końcowej pozycji, rejestruj podstawową aktywność przez co najmniej 20 minut. Jeśli rejestrujesz SLE, rozważ dłuższe zapisy wyjściowe ze względu na niską częstotliwość występowania SLE.
- W przypadku, gdy aktywność wyjściowa jest stabilna (plateau częstości zdarzeń), przemyć żądany lek. Należy pamiętać, że ze względu na duże natężenie przepływu mycie leków trwa tylko 2-5 minut, co pozwala na szybką wymianę roztworu.
- Rejestruj aktywność podczas aplikacji leku przez co najmniej 20 minut, po wypłukaniu. Aktywność powinna być stabilna przez co najmniej 60–90 minut, co pozwala na dłuższe nagrania.
7. Analiza
- Analizę częstotliwości i amplitudy można przeprowadzić za pomocą dowolnego dostępnego oprogramowania. Do tej pory nie byliśmy w stanie ustanowić wiarygodnej automatycznej analizy SLE lub aktywności wybuchowej, a zamiast tego zastosowaliśmy półautomatyczną analizę z wizualnym potwierdzeniem zidentyfikowanej aktywności.
- Aktywność impulsowa charakteryzuje się odchyleniem dwufazowym, dodatnim i ujemnym oraz czasem trwania ≥100 ms. Wszystkie zdarzenia wizualnie zidentyfikowane jako aktywność serii (np. półautomatycznie przez analizę progową) powinny być ręcznie wskazywane w celu dalszej analizy częstotliwości zdarzeń (interwał między zdarzeniami, IEI), amplitudy i całkowitej liczby zdarzeń w analizowanym przedziale czasowym.
UWAGA: Ze względu na wysoką częstotliwość aktywności burst, zazwyczaj analizowane jest ostatnie 5 minut każdej fazy aplikacji20. - SLE mogą być analizowane zgodnie z opisem w Heuzeroth i wsp. Zidentyfikowane SLE mogą być dalej analizowane pod kątem czasu trwania, amplitudy, częstotliwości skoków i czasu trwania fazy tonicznej (skoki o wysokiej częstotliwości) w porównaniu z klonicznymi (skoki niskiej częstotliwości). SLE, których czas trwania wynosi <10 s, należy wykluczyć z analizy.
UWAGA: W celu przedklinicznej oceny możliwych substancji przeciwpadaczkowych badany jest wpływ na aktywność wybuchową (indukowaną przez highK++4AP), ze względu na ustaloną indukcję w wyciętej tkance hipokampa. Podano wstępne wyniki dotyczące indukcji SLE przy użyciu niskiego Mg2++BIC (Rysunek 2), chociaż analiza tych danych nie została tutaj uwzględniona.
Wyniki
Aktywność padaczkową pomyślnie zarejestrowano w pobranych próbkach ludzkiego hipokampa pochodzących od maksymalnie 15 pacjentów. Ustalenie stabilnych procedur transportu i przygotowania tkanek jest kluczowe dla skutecznego wywołania aktywności padaczkowej w ludzkich próbkach mózgu. Ostatnio opublikowane wyniki wykazały 1) stabilne wywoływanie aktywności padaczkowej w pobranych próbkach tkanek różnych pacjentów oraz 2) wykorzystanie pobranych ludzkich próbek mózgu jako narzędzia przedklinicznego do oceny nowych mechanizmów przeciwpadaczkowych14,20.
Zastosowanie wysokiego stężenia K++4-AP wywołało aktywność padaczkopodobną w postaci wyładowań burzowych w ciągu kilku minut (Rycina 2A,B,C,D). Ze względu na niską liczbę neuronów w ludzkim tkankowym hipokampie lub znaczną utratę komórek nerwowych spowodowaną padaczką skroniową (TLE), położenie elektrod można dostosować na początku rejestracji. W przypadkach, gdy aktywność wyładowaniowa w przekrojach nie jest widoczna w obszarze CA1 po 10 minutach (niezależnie od ustawienia elektrod), żywotność przekroju może być niewystarczająca i konieczna będzie jego wymiana.
SLE o trwaniu >10 s mogą być wywołane przez stosowanie niskiego stężenia Mg2++BIC (Rycina 2E,F). Rycina 2E przedstawia stabilne wywołanie SLE po kilku minutach oraz stabilną częstotliwość przez cały czas rejestracji. W tym przypadku aktywność SLE została pomyślnie wywołana w dwóch z czterech preparatów od badanego pacjenta. W jednym preparacie po 15 minutach aktywności SLE zaobserwowano jedynie aktywność typu wybuchowego, podczas gdy w drugim preparacie nie stwierdzono SLE nawet po 40 minutach.
W celu oceny wstępnej wpływu substancji zbadano potencjalny działanie przeciwdrgawkowe na aktywność wybuchową wywołaną przez highK++4-AP. Przetestowano znane i potencjalne substancje przeciwdrgawkowe (lakosamid, DMEA, dynorfina14) i przedstawiono tutaj przykłady dla konwencjonalnego leku przeciwdrgawkowego – lakosamidu (blokera kanałów sodowych) oraz DMEA (nowej potencjalnej substancji przeciwdrgawkowej)20. Liczba zdarzeń oraz odstępy między nimi (IEI) zmniejszyły się zarówno podczas aplikacji lakosamidu, jak i DMEA (Rycina 3C), natomiast amplitudy pozostawały w większości niezmienione (Rycina 3D). W podgrupie plasterków, mimo że wywołanie zdarzeń wybuchowych udało się w pierwszych kilku minutach, częstotliwość aktywności nie odzyskiwała się podczas płukania stosowanymi lekami przeciwdrgawkowymi (dane nie przedstawione, zob. Kraus et al.20). W tym przypadku stosowane leki uznano za wywołujące efekty; jednak spadek aktywności wybuchowej mógł być wpływowany przez stopniowy spadek aktywności podczas długotrwałych rejestracji. Dlatego wyniki należy interpretować ostrożnie.
Rycina 1: Komora interfejsowa. Do przechowywania ludzkich przekrojów hipokampa stosuje się komorę interfejsową z dwiema komorami na przekroje mózgu (A); w szczególności komorę interfejsową typu Haas23. Tutaj przekroje hipokampa spoczywają na (d) trzech warstwach bibuły filtracyjnej, (e) mniejszych kawałkach ułatwiających manipulację pojedynczymi przekrojami oraz (f) większych kawałkach bibuły zapewniających odpowiednią warstwę roztworu pod przekrojem. (c) Nitka bawełniana otaczająca przekroje, umieszczona na górze bibuły, zapewnia równomierne przepływanie roztworu z dopływów znajdujących się na (a) górze komory. (b) Pokrywa kieruje tlen z przestrzeni pod komorą na przekrój. (B) Widok z góry na jedną komorę do przechowywania przekrojów. (C) Przekrój boczny ilustrujący warstwy bibuły. (g) Dno komory. (h) Rurka do dopływu roztworu, połączona z pompą perystaltyczną (niebieskie strzałki wskazują kierunek przepływu roztworu). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Aktywność padaczkowa w ludzkich przekrojach hipokampa wywołana przez wysokie stężenie K++4-AP oraz niskie stężenie Mg2++BIC. Przykładowe zapisy z obszaru CA1 i fragmenty zastosowania roztworu o wysokim stężeniu K+ (8 mM)+4-AP (100 µM) (A,B,C,D) oraz roztworu o niskim stężeniu Mg2++BIC (10 µM) (E,F). (A) Podanie do łaźni roztworu o wysokim stężeniu K++4-AP wywołuje aktywność padaczkową w ciągu kilku minut, a aktywność ta pozostaje stabilna przez co najmniej 60 minut. Szczegóły z (A) przedstawiono w (B). W obszarze CA1 ludzkich przekrojów hipokampa wywołane są dwa różne typy aktywności: potencjały typu międzypadaczkowego (C, szczegóły z [B]) oraz aktywność typu wybuchowego (D, szczegóły z [B]). Wykazano, że aktywność wybuchowa jest wrażliwa na leki przeciwpadaczkowe, dlatego analizowano wpływ potencjalnych substancji przeciwpadaczkowych (Rycina 3). (E,F) Podanie roztworu o niskim stężeniu Mg2++BIC wywołuje długotrwałe wyładowania padaczkowe (SLE) o czasie trwania >10 s (F) w obszarze CA1 w ciągu kilku minut. Jednak indukcja SLE może trwać do 30 minut w innych przekrojach. Sztaby skali = 0,2 mV, 2 min (A,E), 5 s (B), 500 ms (C,D), 5 min (E), 2 s (F). Rycina została zmodyfikowana na podstawie Kraus et al.20. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Zmniejszenie aktywności napadowej w tkance ludzkiej podczas podawania lakosamidu lub DMEA. Aktywność napadowa zmniejszała się podczas podawania (A) lakosamidu oraz (B) DMEA, potencjalnej nowej cząsteczki przeciwpadaczkowej. (A) i (B) przedstawiają przykładowe zapisy z obszaru CA1 wraz z fragmentami wybranymi do analizy w (C) i (D). Aktywność napadowa zmniejszała się podczas podawania lakosamidu (100 µM) i DMEA (10 mM), co widać na środkowych fragmentach zapisu, a następnie ponownie wzrastała w trakcie przemywania. (C,D) Liczbę i amplitudę aktywności napadowej analizowano w ostatnich 5 minutach każdej fazy podawania (podstawa, lakosamid/DMEA, przemywanie) i przedstawiono jako uśrednione wyniki dla wszystkich pacjentów (liczba zdarzeń, C; amplituda, D) jako średnia ± SD. Każdy punkt oznacza jednego pacjenta. Gwiazdki oznaczają istotne różnice, ocenione za pomocą testu Friedmana z późniejszym testem a posteriori Dunnetta dla porównania wielokrotnego grup w analizie działania lakosamidu (*p < 0,05, n = 4) lub za pomocą analizy wariancji z powtarzanymi pomiarami i testu a posteriori Tukey’a w analizie działania DMEA (**p < 0,01, n = 10). Szcalki = 0,2 mV, 2 min (pełny zapis, A), 5 s (fragmenty, A), 3 min (pełny zapis, B), 1 s (fragmenty, B). Rycina została zmodyfikowana na podstawie Kraus et al.20. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Roztwór 1.1 choline aCSF | |||
| Substancja | stężenie 10x (mM) | stężenie 1x (mM) | Uwaga |
| choline Cl | 1100 | 110 | |
| (+)-Na L-ascorbate | 116 | 11,6 | |
| MgCl2x6H2O | 70 | 7 | |
| Na pyruvate | 31 | 3,1 | |
| KCl | 25 | 2,5 | |
| NaH2PO4 | 12,5 | 1,25 | |
| NaHCO3 | 260 | 26 | |
| CaCl2 | - | 0,5 | dodać do roztworu końcowego |
| Glukoza | - | 10 | dodać do roztworu końcowego |
| Roztwór 1.2 aCSF | |||
| Substancja | stężenie 10x (mM) | stężenie 1x (mM) | Uwaga |
| NaCl | 1290 | 129 | |
| NaH2PO4 | 12,5 | 1,25 | |
| CaCl2 | 16 | 1,6 | |
| KCl | 30 | 3 | |
| MgSO4 | 18 | 1,8 | |
| Glukoza | - | 10 | dodać do roztworu końcowego |
| Roztwór 1.3 highK++4-AP aCSF | |||
| Substancja | stężenie 10x (mM) | stężenie 1x (mM) | Uwaga |
| NaCl | 1240 | 124 | |
| NaH2PO4 | 12,5 | 1,25 | |
| CaCl2 | 16 | 1,6 | |
| KCl | 80 | 8 | |
| MgSO4 | 18 | 1,8 | |
| Glukoza | - | 10 | dodać do roztworu końcowego |
| 4-AP | - | 0,1 | dodać do roztworu końcowego |
| Roztwór 1.4 lowMg2++BIC aCSF | |||
| Substancja | stężenie 10x (mM) | stężenie 1x (mM) | Uwaga |
| NaCl | 1300 | 130 | |
| NaH2PO4 | 12,5 | 1,25 | |
| CaCl2 | 16 | 1,6 | |
| KCl | 30 | 3 | |
| Glukoza | - | 10 | dodać do roztworu końcowego |
| BIC | - | 0,01 | dodać do roztworu końcowego |
| Roztwór 2 | |||
| Substancja | stężenie 10x (mM) | stężenie 1x (mM) | Uwaga |
| NaHCO3 | 210 | 21 | |
Tabela 1: Przygotowanie roztworów 10x i końcowych roztworów 1x do transportu, przygotowania i rejestracji.
Dyskusja
Żywa, wycięta ludzka tkanka mózgowa jest bardzo cennym narzędziem w przedklinicznej ocenie defibrylatorów AED, ponieważ prawidłowo reprezentuje nienaruszoną mikrosieć ludzkiego mózgu. Przedstawiony protokół opisuje metodę transportu i preparacji tkanek, która zapewnia wysoką jakość wycinków hipokampa, a także stabilną metodę indukcji aktywności padaczkowej krytycznej dla oceny AED.
Badania nad aktywnością padaczkową, jak również metody indukcji chemicznej lub elektrycznej w wycinkach ludzkiego mózgu zostały wcześniej wykazane przez inne grupy 17,20,21,22. Protokół ten opisuje indukcję stabilnej aktywności impulsowej w warstwach od różnych pacjentów poprzez zastosowanie wysokiego K++4-AP, a także indukcję SLE w obszarze CA1 poprzez zastosowanie niskiej Mg2 + + BIC. Stwierdzono, że indukcja aktywności burst jest bardziej spójna (80% badanych plastrów u 15 pacjentów) niż indukcja SLE (50% badanych plastrów u jednego pacjenta). Jednak do tej pory indukcja TRU została przetestowana tylko u jednego pacjenta. Niemniej jednak zaleca się indukcję TRU przez niskie Mg2++BIC, ponieważ TRU nie udało się jeszcze indukować przy użyciu wysokiego K++4-AP.
W kilku badaniach wprowadzono metody transportu i przygotowania ludzkiej tkanki mózgowej i często podkreśla się trzy czynniki decydujące o przetrwaniu neuronów: czas transportu, stosowane rozwiązania transportowe i warunki przechowywania.
Aby zapewnić optymalną żywotność plastrów, niektóre grupy sugerują, że transport wyciętej tkanki mózgowej powinien być jak najkrótszy. Jednak sale operacyjne i laboratoria rzadko znajdują się w bliskiej odległości, co oznacza, że jakość plastrów może być zagrożona z powodu długiego transportu. Niektóre grupy pokonały tę przeszkodę, stosując stałą O2 do roztworu podczas transportu12. Tkankę mózgową transportowaliśmy przez krótkie (max = 15 min) i długie (do 1 h) okresy czasu bez stałego dodatkowego dostarczaniaO2 podczas transportu, podobnie jak w innych grupach18,25. W tych przypadkach nie zaobserwowano różnic w jakości tkanek podczas rejestracji padaczkowców. W komunikacji z innymi grupami w naszym instytucie, jakość plastrów również nie uległa zmianie w przypadku eksperymentów z zaciskiem krosowym. Natomiast różnice w jakości tkanek mogą wynikać z uszkodzeń podczas operacji, długotrwałej resekcji i procedury krojenia.
Jeśli chodzi o roztwór do transportu i cięcia, wszystkie opublikowane metody pomijają NaCl w roztworach w celu zmniejszenia pęcznienia komórek z powodu ciśnienia osmotycznego, podobnie jak w przypadku standardowej procedury eksperymentów z klamrą łatkową gryzoni. Jednak do tej pory wprowadzono kilka substytutów (tj. aCSF13,22 na bazie sacharozy, aCSF12,26 na bazie NMDG i aCSF27 na bazie choliny). W 2014 roku Ting i współpracownicy wprowadzili oparty na NMDG aCSF do przygotowania plastrów26, a później dodali protokół odzyskiwania, który powoli przywraca NaCl do plasterków28. Jednak, jak opisali Ting i wsp., neurony tkanki mózgowej przygotowane w aCSF na bazie NMDG wykazują wyższą odporność błony, wpływając w ten sposób na uszczelnienie całej komórki podczas eksperymentów z klamrą26. W związku z tym przeszliśmy z aCSF opartego na NMDG na użycie aCSF20 na bazie choliny, co daje wysokiej jakości warstwy zarówno dla nagrań potencjału terenowego, jak i patch-clamp.
Jeśli chodzi o przechowywanie plastrów, ogólnie przyjmuje się, że warunki granicy faz zapewniają optymalne natlenienie, które ma kluczowe znaczenie dla przetrwania długich plastrów18. Jednak inne grupy wykazują przeżywalność do 72 godzin w warunkach zanurzenia12. W przeciwieństwie do wcześniejszej hipotezy, wycinki ludzkiego mózgu wydają się być bardziej odporne na niskie natlenienie lub stres oksydacyjny w porównaniu z plastrami gryzoni. Przede wszystkim komory interfejsu były wcześniej używane do przechowywania ludzkich wycinków hipokampa, chociaż warunki zanurzenia są zalecane do konserwacji wycinków ludzkiego mózgu w eksperymentach z klamrą.
Jak omówiono w innych grupach, dodatkowym krytycznym krokiem dla przetrwania długich warstw (interfejs dla <48 h18, zanurzony przez <72 h12) jest zapobieganie skażeniu bakteryjnemu. Wycinki mózgu gryzoni są zwykle używane w zapisach elektrofizjologicznych przez okres do 8 godzin, a zanieczyszczenie bakteryjne nie jest uważane za wpływające na żywotność plastrów w tym okresie. Duża liczba wycinków przygotowanych z jednej resekcji i niezwykła dostępność ludzkiej tkanki mózgowej podkreśla potrzebę przedłużenia żywotności wycinków ludzkiego mózgu. Metoda ta z powodzeniem opisuje przygotowanie żywych wycinków ludzkiego mózgu w hipokampie, które można łatwo przystosować do warunków sterylnych. Jednak w przypadku wykonywanych tu nagrań przeżycie slice wydłużające się o 20 h nie było priorytetem.
Wykazano również, że rejestracja w komorach międzyfazowych jest niezbędna do indukcji aktywności padaczkowców, takich jak SLE22. Warunki zanurzenia, ze względu na niskie natlenienie, są rzadko wykorzystywane do rejestrowania SLE; Są one jednak niezbędne do uzyskania wysokiej rozdzielczości optycznej potrzebnej do eksperymentów z zaciskiem krosowym. Zastosowanie zoptymalizowanej komory rejestracyjnej typu zanurzonego umożliwia rejestrację aktywności padaczkowej (pole zewnątrzkomórkowe lub pojedynczy neuron) w wycinkach ludzkiego mózgu, dzięki wysokiemu natlenieniu i szybkiemu stosowaniu leków29. W tym miejscu opisano metody i wyniki dla zapisów potencjału pola, ale należy podkreślić, że zapisy patch-clamp zostały z powodzeniem przeprowadzone w mysich i ludzkich wycinkach mózgu przy użyciu tej zmodyfikowanej komory zapisu (dane nie pokazane).
Wycięta ludzka tkanka mózgowa ma wyższą wartość translacyjną w porównaniu z modelami gryzoni. Reprezentuje dorosłą, chorą sieć neuronalną, która nie może być odtworzona przez iPSC. Jednak, jak w każdym systemie in vitro , wycinki ludzkiego mózgu nie reprezentują nienaruszonego ludzkiego mózgu. Dodatkowo, zarejestrowane sieci neuronalne wyciętej tkanki mózgowej mogą ulegać znacznym zmianom molekularnym i funkcjonalnym z powodu uszkodzenia podczas operacji lub przygotowania. Wykazano, że procedury krojenia wpływają na czynność GABA-ergiczną i mogą wpływać na indukcję aktywności padaczkowej30. Ograniczenia te należy wziąć pod uwagę przy formułowaniu hipotezy. Podczas testowania potencjalnych leków przeciwpadaczkowych należy wziąć pod uwagę wykorzystanie różnych obszarów mózgu, ponieważ docelowe leki mogą nie być wyrażone we wszystkich obszarach mózgu człowieka lub u wszystkich pacjentów. W szczególności hipokampy pacjentów z TLE często wykazują objawy stwardnienia hipokampa, któremu towarzyszy poważna utrata komórek neuronalnych. Zaleca się uzyskanie od pacjenta informacji na temat zmian patologicznych i historii choroby, takich jak potencjalna oporność na leki, i uwzględnienie tego podczas interpretacji danych.
Podsumowując, metoda ta z powodzeniem opisuje przygotowanie żywych ludzkich wycinków mózgu hipokampa i techniki indukcji do rejestrowania dwóch różnych typów aktywności padaczkowej. Ponieważ dostępność żywej ludzkiej tkanki mózgowej jest rzadka, należy zastosować zoptymalizowane warunki transportu i rejestracji, aby zapewnić maksymalną wydajność eksperymentów z wykorzystaniem wycinków ludzkiego mózgu. Sugeruje się, że wycięta ludzka tkanka mózgowa może być wykorzystana jako narzędzie walidacji przedklinicznej jako uzupełnienie modeli gryzoni i eksperymentów z hodowlami komórkowymi.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Mandy Marbler-Pötter (Charite-Unversitätsmedizin, Berlin) za doskonałą pomoc techniczną. P.F. została sfinansowana przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG, Deutsche Forschungsgemeinschaft) w ramach Niemieckiej Strategii Doskonałości-EXC-2049-390688087. Prace te były wspierane przez QUEST Center for Transforming Biomedical Research przy Berlińskim Instytucie Zdrowia.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| (+)-Na L-askorbinian | Sigma Aldrich | A4034 | |
| 4-AP | Sigma Aldrich | 275875-5G | |
| Ostrza | eliteSERVE GmbH | HW3 | używany do wibratomu |
| CaCl2 | Merck | 102382 | |
| Cholina Cl | Sigma Aldrich | C1879 | |
| Bibuła filtracyjna | Tiffen | ||
| Gazoszczelne nakrętki do butelek | Carl Roth GmbH+Co.KG | E694.1 | |
| Filamenty szklane | Produkty naukowe | GB150F-8P | do elektrod rejestrujących |
| Szklany dyspergator gazu | DWK Life Sciences GmbH | 258573309 | |
| Glukoza | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Interfejs Komora | własnej | produkcji-zobacz | Haas i wsp., 1979 |
| KCl | AppliChem | 131494.1210 | |
| Membrana (wkładki do hodowli komórkowych) | Merck | PICM030050 | |
| Komora membranowa | własnej produkcji | patrz Hill and Greenfield, 2011 | |
| MgCl2?6H2O | Carl Roth | HNO3.2 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Na pirogronian | Sigma Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | |
| NaHCO3 | Carl Roth | HNO1.2 | |
| Pompa perystaltyczna | Gilson | Minipuls 3 | |
| Uchwyt na plastry | Warner instruments | SHD-41/15 | |
| Ściągacz pionowy | Narishige | PC-10 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
Bibliografia
- Hirtz, D., et al. How common are the "common" neurologic disorders. Neurology. 68 (5), 326-337 (2007).
- Ngugi, A. K., Bottomley, C., Kleinschmidt, I., Sander, J. W., Newton, C. R. Estimation of the burden of active and life-time epilepsy: a meta-analytic approach. Epilepsia. 51 (5), 883-890 (2010).
- Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
- Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Ledri, M., et al. Differential Effect of Neuropeptides on Excitatory Synaptic Transmission in Human Epileptic Hippocampus. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 35 (26), 9622-9631 (2015).
- Qi, X. R., et al. Alterations in the steroid biosynthetic pathways in the human prefrontal cortex in mood disorders: A post-mortem study. Brain Pathology. 28 (4), 536-547 (2018).
- Verwer, R. W. H., et al. Post-mortem brain tissue cultures from elderly control subjects and patients with a neurodegenerative disease. Experimental Gerontology. 38 (1-2), 167-172 (2003).
- Verwer, R. W. H., et al. Cells in human postmortem brain tissue slices remain alive for several weeks in culture. FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (1), 54-60 (2002).
- Le Maître, T. W., Dhanabalan, G., Bogdanovic, N., Alkass, K., Druid, H. Effects of Alcohol Abuse on Proliferating Cells, Stem/Progenitor Cells, and Immature Neurons in the Adult Human Hippocampus. Neuropsychopharmacology. 43 (4), 690-699 (2018).
- Dennis, C. V., Suh, L. S., Rodriguez, M. L., Kril, J. J., Sutherland, G. T. Human adult neurogenesis across the ages: An immunohistochemical study. Neuropathology and Applied Neurobiology. 42 (7), 621-638 (2016).
- Verwer, R. W. H., et al. Mature astrocytes in the adult human neocortex express the early neuronal marker doublecortin. Brain. 130 (12), 3321-3335 (2007).
- Ting, J. T., et al. A robust ex vivo experimental platform for molecular-genetic dissection of adult human neocortical cell types and circuits. Scientific Reports. 8 (1), 8407(2018).
- Le Duigou, C., et al. Imaging pathological activities of human brain tissue in organotypic culture. Journal of Neuroscience Methods. 298, 33-44 (2018).
- Agostinho, A. S., et al. Dynorphin-based "release on demand" gene therapy for drug-resistant temporal lobe epilepsy. EMBO molecular medicine. 11 (10), 9963(2019).
- Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Beaulieu-Laroche, L., et al. Enhanced Dendritic Compartmentalization in Human Cortical Neurons. Cell. 175 (3), 643-651 (2018).
- Sandow, N., et al. Drug resistance in cortical and hippocampal slices from resected tissue of epilepsy patients: no significant impact of p-glycoprotein and multidrug resistance-associated proteins. Frontiers in Neurology. 6, 30(2015).
- Wickham, J., et al. Prolonged life of human acute hippocampal slices from temporal lobe epilepsy surgery. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
- Avoli, M., Jefferys, J. G. R. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. , (2015).
- Kraus, L., et al. Dimethylethanolamine Decreases Epileptiform Activity in Acute Human Hippocampal Slices in vitro. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 209(2019).
- Antonio, L. L., et al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration. Journal of Neuroscience Methods. , (2016).
- Gabriel, S., et al. Stimulus and Potassium-Induced Epileptiform Activity in the Human Dentate Gyrus from Patients with and without Hippocampal Sclerosis. Journal of Neuroscience. 24 (46), 10416-10430 (2004).
- Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).
- Hill, M. R. H., Greenfield, S. A. The membrane chamber: a new type of in vitro recording chamber. Journal of neuroscience methods. 195 (1), 15-23 (2011).
- Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, 24818(2016).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in molecular biology. 1183, Clifton, N.J. 221-242 (2014).
- Testa-Silva, G., et al. Human synapses show a wide temporal window for spike-timing-dependent plasticity. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 2, 12(2010).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Morris, G., Jiruska, P., Jefferys, J. G. R., Powell, A. D. A New Approach of Modified Submerged Patch Clamp Recording Reveals Interneuronal Dynamics during Epileptiform Oscillations. Frontiers in Neuroscience. 10, 519(2016).
- Valeeva, G., Valiullina, F., Khazipov, R. Excitatory actions of GABA in the intact neonatal rodent hippocampus in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2013).
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings
Posted by JoVE Editors on 7/13/2020. Citeable Link.
An erratum was issued for: Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings. Step 2.1.3 in the Protocol was corrected.
Step 2.1.3 in the Protocol was updated from:
Add final concentrations of glucose and MgCl, then stir until dissolved (Table 1, solution 1.1).
to:
Add final concentrations of glucose and CaCl2, then stir until dissolved (Table 1, solution 1.1).
