Artykuł metodologiczny

Przygotowanie małych bibliotek RNA do sekwencjonowania z wczesnych zarodków myszy

6.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61086

⸱

9 października 2020

 , 
1Development, Disease Models & Therapeutics Graduate Program, Department of Molecular and Cellular Biology, Department of Neuroscience, Center for Cell and Gene Therapy, Stem Cells and Regenerative Medicine Center, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy technikę profilowania mikroRNA we wczesnych zarodkach myszy. Protokół ten pozwala przezwyciężyć wyzwanie związane z niskim wkładem komórek i wzbogaceniem małego RNA. Test ten można wykorzystać do analizy zmian w ekspresji miRNA w czasie w różnych liniach komórkowych wczesnego zarodka myszy.

Streszczenie

MikroRNA (miRNA) są ważne dla złożonej regulacji decyzji dotyczących losu komórek i czasu rozwoju. Badania in vivo nad udziałem miRNA we wczesnym rozwoju są technicznie trudne ze względu na ograniczoną liczbę komórek. Co więcej, wiele podejść wymaga zdefiniowania interesującego miRNA w testach takich jak northern blotting, mikromacierz i qPCR. Dlatego ekspresja wielu miRNA i ich izoform nie była badana na wczesnym etapie rozwoju. W tym miejscu demonstrujemy protokół sekwencjonowania małych RNA posortowanych komórek z wczesnych zarodków myszy, aby umożliwić stosunkowo bezstronne profilowanie miRNA we wczesnych populacjach komórek grzebienia nerwowego. Pokonujemy wyzwania związane z niskim nakładem komórek i wyborem rozmiaru podczas przygotowywania biblioteki za pomocą amplifikacji i oczyszczania na bazie żelu. Identyfikujemy wiek embrionalny jako zmienną odpowiadającą za zmienność między powtórzeniami, a zarodki myszy dopasowane do etapu muszą być wykorzystane do dokładnego profilowania miRNA w replikacjach biologicznych. Nasze wyniki sugerują, że metoda ta może być szeroko stosowana do profilowania ekspresji miRNA z innych linii komórek. Podsumowując, protokół ten można wykorzystać do zbadania, w jaki sposób miRNA regulują programy rozwojowe w różnych liniach komórkowych wczesnego zarodka myszy.

Wprowadzenie

Centralnym pytaniem biologii rozwojowej jest to, jak pojedyncza niezróżnicowana komórka może dać początek całemu organizmowi z wieloma złożonymi typami komórek. Podczas embriogenezy potencjał rozwojowy komórek ulega stopniowemu ograniczeniu wraz z rozwojem organizmu. Jednym z przykładów jest linia grzebienia nerwowego, która stopniowo różnicuje się z populacji komórek multipotencjalnych na różne końcowe pochodne, takie jak neurony obwodowe, glej, kość czaszki i chrząstka. Komórki grzebienia nerwowego są wybierane z ektodermy podczas gastrulacji, a następnie przechodzą przejście nabłonkowe do mezenchymalnego i migrują przez zarodek do dyskretnych miejsc w całym ciele, gdzie będą się ostatecznie różnicować1. Dziesięciolecia prac doprowadziły do odkrycia sieci regulacji genów transkrypcyjnych, ale znacznie mniej wiadomo o mechanizmach regulacji potranskrypcyjnej, które kontrolują czas rozwoju grzebienia nerwowego.

Poprzednia praca sugeruje, że mikroRNA (miRNA) hamują ekspresję genów, aby zapewnić prawidłowy czas rozwoju i decyzje dotyczące losu komórki2,3,4,5,6. Badania nad miRNA w rozwoju grzebienia nerwowego w dużej mierze koncentrowały się na późniejszych etapach rozwoju twarzoczaszki. Na przykład miR-17~92 i miR-140 mają kluczowe znaczenie dla palatogenezy podczas rozwoju twarzoczaszki odpowiednio u myszy i danio pręgowanego7,8. Udział miRNA w najwcześniejszych decyzjach dotyczących losu grzebienia nerwowego zarodka nie został dokładnie zbadany. Badania nad miRNA we wczesnych decyzjach dotyczących losu były ograniczone przez wyzwania techniczne, takie jak niska liczba komórek obecnych we wczesnych zarodkach.

MiRNA zostały sprofilowane in vitro z linii komórkowych przy użyciu ciał embrionoidalnych na różnych etapach różnicowania, aby modelować wczesny rozwój myszy9. Badania nad małymi RNA in vivo we wczesnym okresie rozwoju ssaków były stosunkowo ograniczone. Poprzednie metody profilowania miRNA prowadziły do stronniczości, ponieważ znana sekwencja jest używana do analizy ekspresji określonego miRNA w metodach takich jak qPCR, mikromacierze i północne blots10. Sekwencjonowanie nowej generacji i coraz doskonalsze narzędzia molekularne pozwalają obecnie na stosunkowo bezstronną analizę ekspresji miRNA w celu zbadania ich wkładu we wczesny rozwój ssaków i decyzje dotyczące losu komórek.

Tutaj opisujemy technikę zbierania i sekwencjonowania małych RNA wyrażanych w komórkach grzebienia nerwowego od wczesnych zarodków myszy od gastrulacji (E7.5) do początku organogenezy (E9.5). Technika ta jest prosta i łączy śledzenie linii, sortowanie komórek i wybór rozmiaru na podstawie żelu w celu przygotowania małych bibliotek sekwencjonowania RNA z minimalnej liczby komórek do sekwencjonowania nowej generacji. Podkreślamy znaczenie ścisłego dopasowania zarodków do stadiów somitowych w celu rozwiązania 6-godzinnych odstępów czasowych w celu uzyskania kompleksowego obrazu miRNA podczas szybkich zmian we wczesnym rozwoju. Metoda ta może być szeroko stosowana w badaniach genetycznych i rozwojowych i pozwala uniknąć łączenia zarodków. Opisujemy sposób przezwyciężenia wyzwań związanych z obecnymi metodami, takimi jak wzbogacanie miRNA za pomocą oczyszczania na bazie żelu, kwantyfikacja biblioteki i minimalizacja błędu systematycznego wprowadzonego z PCR. Metoda ta została wykorzystana do identyfikacji wzorców ekspresji miRNA w czasie, aby zbadać, w jaki sposób miRNA kontrolują czas rozwoju w linii grzebienia nerwowego zarodków myszy.

Protokół

Wszystkie procedury badawcze i opieki nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez Baylor College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee i znajdują się w zatwierdzonym przez Association for Assessment and Accreditation obiekcie dla zwierząt laboratoryjnych w Baylor College of Medicine. Wszystkie szczepy utrzymywano na tle C57BL6.

1. Sekcja zarodków (E7.5-E9.5)

  1. Usuń rogi macicy ciężarnej samicy myszy, sterylizując brzuch 70% etanolem w miejscu, w którym ma zostać wykonane nacięcie.
  2. Oczyść macicę, przepłukując ją solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Umieść macicę w sterylnym plastikowym naczyniu o średnicy 10 cm.
  3. Za pomocą nożyczek do mikrodysekcji oddziel od siebie każdy region zawierający deciduę. Oderwij mięsień macicy i odsłoń wszystkie deciduae. Jeden po drugim usuń decidua z każdego zarodka.
  4. Usuń woreczek żółtkowy z każdego zarodka i zachowaj do genotypowania.
  5. Przenieś wszystkie zarodki do nowego naczynia ze świeżym PBS w celu obrazowania.
  6. Zrób zdjęcie całego miotu. Wyobraź sobie każdy zarodek z osobna i policz liczbę somitów każdego zarodka. Utrzymuj takie samo powiększenie i ekspozycję (dla fluorescencji) między eksperymentami.
    UWAGA: Stwierdzamy, że ekspozycja 50-200 ms jest wystarczająca do fluorescencji, a 20 ms jest wystarczająca do ustawienia jasnego pola.

2. Dysocjacja zarodków i sortowanie komórek

  1. Dla każdego zarodka, który ma zostać posortowany, wykonaj następujące czynności.
    1. Ścięć głowę tuż nad plakodem otycznym dla zarodków starszych niż E8.0 (jeśli pożądane są tylko znakowane komórki obszaru czaszki). W przypadku zarodków E7.5 należy usunąć struktury pozazarodkowe (jeśli pożądany jest tylko właściwy zarodek).
    2. Przenieś głowę w minimalnej objętości PBS do czystego dołka na 48-dołkowej płytce. Dodać 250 μl papainy (27 j./ml). Delikatnie pipetuj w górę i w dół za pomocą p200.
    3. Sprawdź pod mikroskopem i poszukaj grudek i pojedynczych komórek.
    4. Powtarzać delikatne pipetowanie w górę i w dół, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki (zwykle trzy rundy pipetowania w górę i w dół, co powinno odpowiadać od 30 s do 1 minuty w przypadku E7,5-E9,5).
    5. Ugasić 250 μl płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    6. Powtórzyć kroki 2.1.1-2.1.5 dla każdego zarodka, który ma zostać posortowany.
  2. Przefiltruj 500 μl zawiesiny komórek przez rurkę z nasadką filtra z siatki nylonowej o grubości 35 μm, aby usunąć grudki.
  3. Pobrać filtrat i przenieść do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i wirować w ilości 200 x g przez 5 minut. Ostrożnie usunąć supernatant i przenieść do nowej probówki (pozostawić do momentu, gdy będzie wiadomo, że żywe komórki znajdują się w granulce).
  4. Zawiesić osad komórkowy w 300 μl PBS zawierającego 0,5-1% albuminy surowicy bydlęcej i trzymać na lodzie do czasu sortowania (zminimalizować czas od teraz do końca sortowania).
    1. W razie potrzeby weź 10 μl zawiesiny komórek i połącz z 10 μl błękitu trypanowego (0,4%) i policz za pomocą hemocytometru, aby określić przybliżoną kwantyfikację i żywotność komórek, ponieważ błękit trypanowy barwi tylko martwe komórki.
  5. Tuż przed sortowaniem ponownie przefiltruj każdą próbkę przez rurkę z nasadką filtra i dodaj barwnik DAPI do żywych komórek.
  6. Posortuj każdą próbkę do 500 μl roztworu do lizy do ekstrakcji RNA (patrz tabela materiałów) na sortowniku komórek z dyszą 70 μm.
  7. Wymieszać i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu pobrania wszystkich próbek. Kontynuuj od tego punktu tylko wtedy, gdy wszystkie próbki potrzebne do eksperymentu zostaną zebrane, aby zmniejszyć różnice techniczne między rundami przygotowania biblioteki.

3. Ekstrakcja RNA

UWAGA: Protokół jest zaadaptowany z zestawu do izolacji RNA; zobacz Tabelę materiałów.

  1. Dodać 500 μl roztworu do lizy do ekstrakcji RNA (patrz tabela materiałów) do każdej próbki, aby uzyskać całkowitą objętość 1000 μl.
  2. Rozmrozić każdą próbkę w temperaturze pokojowej.
  3. Wirować każdą próbkę przez 1,5 minuty, upewniając się, że nasadka jest dobrze osadzona na każdej probówce przed rozpoczęciem homogenizacji. Inkubować homogenat w temperaturze pokojowej (15–25 °C) przez 5 minut.
  4. Dodać 140 μl chloroformu, szczelnie zakryć probówkę i energicznie wstrząsać przez 15 s. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
  5. Wirować przez 15 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C. Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki zbiorczej na lodzie. Nie przenoś żadnej interfazy ani żadnej fazy organicznej. Zbliżając się do różowej fazy organicznej, przechyl probówkę na bok i usuń małe porcje, aż nie będzie można zebrać klarownej fazy wodnej.
  6. Zmierz objętość RNA zawierającego fazę wodną pobraną z każdej próbki, aby uzyskać prawidłowe obliczenia w następnym kroku.
  7. Dodać 1,5 objętości (zwykle 525 μl, ale może być nieco więcej lub mniej) 100% etanolu i dokładnie wymieszać pipetując.
  8. Pobrać pipetę do 700 μl próbki, w tym dowolny osad, do kolumny w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Zamknij pokrywę i odwiruj przy ≥8 000 x g przez 15 s w temperaturze pokojowej. Odrzuć przepływ.
  9. Powtórzyć krok 3.8, używając pozostałej części próbki.
  10. Umyj kolumnę zgodnie z instrukcjami producenta. Wysuszyć kolumnę, wirując z pełną prędkością przez 1 minutę. Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml.
  11. Odpipetować 11 μl wody wolnej od nukleaz na środek membrany. Odstawić w temperaturze pokojowej na 1 minutę. Wiruj z maksymalną prędkością przez 1 minutę, aby wymyć kolumnę.
  12. Zmierzyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru i równoległego przyrządu do elektroforezy kapilarnej (tabela materiałów).

4. Przygotowanie biblioteki

UWAGA: Protokół jest zaczerpnięty z podręcznika zestawu do przygotowywania małych bibliotek RNA; zobacz Tabelę materiałów.

  1. Zakończ denaturację i ligację adaptera 3', jak podano w podręczniku zestawu do przygotowywania małej biblioteki RNA, używając rozcieńczenia 1/4 adaptera 3'.
  2. Kontynuuj usuwanie adaptera z nadmiaru 3 stóp.
  3. Uzupełnij wyczerpywanie się adaptera zgodnie z podręcznikiem zestawu do przygotowywania małej biblioteki RNA. Upewnij się, że używasz świeżo przygotowanego 80% etanolu do czyszczenia kulek i że cały nadmiar etanolu jest całkowicie usuwany tuż przed ponownym zawieszeniem w wodzie wolnej od nukleaz bez nadmiernego wysuszania kulek (po nadmiernym wysuszeniu obserwuje się pękanie granulki kulki).
  4. Przejdź bezpośrednio do dezaktywacji nadmiaru adaptera.
  5. Zakończ inaktywację nadmiaru adaptera, jak podano w podręczniku zestawu do przygotowania małej biblioteki RNA, składając wszystkie odczynniki na lodzie.
  6. Kontynuuj do podwiązania adaptera 5' 4N.
  7. Zakończ ligację adaptera 5', jak podano w podręczniku zestawu do przygotowywania małej biblioteki RNA, upewniając się, że użyjesz 1/4 rozcieńczenia adaptera 5' i zbierając wszystkie odczynniki na lodzie.
  8. Przejdź do odwrotnej transkrypcji.
  9. Pełna synteza nici z odwrotną transkrypcją, jak podano w podręczniku zestawu do przygotowywania małej biblioteki RNA, z zachowaniem ostrożności, aby zebrać wszystkie odczynniki na lodzie i nie trzymać enzymu poza zamrażarką przez dłuższy czas.
    UWAGA: W tym momencie protokół może zostać zatrzymany, a próbki mogą być przechowywane przez noc w temperaturze 4 °C. Alternatywnie można kontynuować amplifikację PCR.
  10. Pełna amplifikacja PCR poprzez złożenie odczynników zgodnie z podręcznikiem zestawu do przygotowania małej biblioteki RNA i zminimalizowanie liczby cykli PCR. Liczba cykli PCR powinna być określona doświadczalnie dla każdego zastosowania i należy zastosować minimalną liczbę cykli. Tutaj użyliśmy 16 cykli, aby z powodzeniem amplifikować nasze małe biblioteki RNA.
  11. Przejdź bezpośrednio do wyboru rozmiaru.

5. Wybór rozmiaru

  1. Do każdej próbki dodaj 5 μl 6x barwnika ładującego żel i odpipetuj do wymieszania.
  2. Załaduj 10 μl drabiny do pierwszego dołka żelu, pozostawiając studzienkę natychmiast po prawej pustą. Załaduj cały produkt z kroku 5.1 na 6% Tris/boran/etylenodiaminotetraoctowy żel – poliakryloamid (TBE-PAGE) i pozostaw 1 pas między każdą próbką.
    UWAGA: Zachowaj pojemnik, w którym przyszedł żel, aby wykonać kolejne czynności.
  3. Uruchom żel pod napięciem 150 V przez około 30-40 minut w buforze do pracy 0,5x TBE (do momentu, gdy dolny pasek barwnika znajdzie się w pobliżu dna żelu, 0,5-1 cm).
  4. Przygotować 1 l roztworu barwiącego podczas pracy żelu: SYBR Gold rozcieńczony w stosunku 1:10 000 w 0,5 TBE.
  5. Gdy żel zakończy działanie (tj. dolny pasek barwnika znajduje się w pobliżu dolnej części żelu), ostrożnie usuń żel ze szklanych płytek, zwracając uwagę na orientację żelu.
  6. Umieść żel w tacce w oryginalnym opakowaniu. Usuń 0,5x TBE i zastąp roztworem barwiącym z kroku 5.5. Plama w żelu przez 15 min. Może być konieczne wydłużenie czasu barwienia.
  7. Umieść żel na transiluminatorze UV, uważając, aby nie rozerwać żelu i zachowując orientację opisaną powyżej (ponownie zaplamić na dodatkowy czas, jeśli paski drabiny nie są wyraźnie widoczne).
  8. Zobrazuj żel po zakończeniu barwienia na transiluminatorze UV za pomocą kamery.
    1. Jeśli wymagany jest lepszy obraz, najpierw użyj aparatu do obrazowania innego niż transiluminator UV, aby uchwycić obraz żelu, zanim wytniesz pasma na transiluminatorze UV, ponieważ obrazowanie bezpośrednio na transiluminatorze UV powoduje zmienne zabarwienie tła, jak pokazano na Rysunek 3A-B. Nie przesuwaj żelu zbyt wiele razy, ponieważ jest delikatny i może się rozerwać .
  9. Zidentyfikuj i usuń pasmo ~150 pz za pomocą czystej żyletki i umieść w czystej probówce o pojemności 1,5 ml. Nie wycinaj pasma ~130 pz (produkt dimera adaptera).
    1. Ponownie zobrazuj żel po usunięciu plasterków zawierających produkt biblioteczny w celach dokumentacyjnych.
  10. Obracaj probówki do mikrowirówek zawierające plasterek żelu z maksymalną prędkością przez 30 sekund, aby zebrać plastry na dnie każdej probówki.
  11. Użyj końcówki p200 do każdej próbki, aby zmiażdżyć plasterek żelu na najmniejsze możliwe kawałki. Wysuń każdą końcówkę do każdej tuby.
  12. Do każdej probówki dodać 300 μl buforu elucyjnego, uważając, aby umyć kawałki żelu z boku probówki i ponownie założyć końcówkę p200 i zmyć końcówkę dla każdej próbki.
  13. Umieścić eluujące próbki w inkubatorze wytrząsającym ustawionym na 25 °C. Inkubować przez noc z wytrząsaniem z prędkością 1000 obr./min. Wyjmij probówki z inkubatora i wiruj z maksymalną prędkością przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  14. Przenieść supernatant zawierający produkt biblioteczny na 2 ml 96-dołkową płytkę wolną od RNazy. Uważaj, aby nie przenieść żadnego żelu.
  15. Do każdej próbki dodać 50 μl kulek czyszczących i wymieszać przez pipetowanie. Natychmiast dodać 350 μl izopropanolu i wymieszać pipetując. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut z kołysaniem.
  16. Pulsacyjnie wiruj płytkę do granulek, a następnie magnetyzuj przez 2 minuty. Ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant.
  17. Dodaj 950 μl 80% etanolu. Inkubować przez 30 s. Usunąć cały supernatant. Powtórz w sumie dwa płukania etanolem.
  18. Suszyć próbkę przez 3 minuty. Na tym etapie należy uważać, aby usunąć wszelkie pozostałości etanolu, które zbierają się na dnie każdej studzienki (nie więcej niż raz) i nie przesuszyć kulek (nadmierne wysuszenie spowoduje pękanie granulki kulki).
  19. Usuń wszystkie resztki płynu z dna studzienki. Zdejmij płytkę ze stojaka magnetycznego.
  20. Zawiesić osad w 13 μl buforu do sporządzania zawiesiny. Mieszać pipetą do uzyskania jednorodnej konsystencji. Inkubować przez 2 minuty, a następnie magnetyzować przez 3 minuty.
  21. Przenieść 12 μl supernatantu do czystej probówki lub studzienki z czystą płytką w celu późniejszego przechowywania. Wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc lub w temperaturze -20 °C przez długi czas.
  22. Sprawdź rozmiar i stężenie fragmentów obecnych w każdej bibliotece za pomocą testu DNA o wysokiej czułości elektroforezy kapilarnej. Potwierdź stężenie więcej niż jedną metodą.
    UWAGA: Od czasu do czasu używaliśmy standardowego zestawu czułości, aby uniknąć przeciążenia elektroforezy kapilarnej.

Wyniki

Stosując zaprezentowaną tutaj procedurę, pobraliśmy zarodki w stadiach E7.5, E8.5 i E9.5. Ze wszystkich zarodków usunięto struktury pozazarodkowe, a następnie przeprowadzono określenie stadium rozwoju zarodków na podstawie liczby somytów, aby uzyskać 6-godzinne odstępy czasu (Rysunek 1A-1B). Wykorzystując analizę głównych składowych do grupowania próbek na podstawie podobieństwa, stwierdziliśmy, że próbki grupują się według wieku, co podkreśla zmienność wynikającą z wieku zarodkowego oraz konieczność dokładnego dopasowania liczby somytów dla powtórzeń biologicznych (Rysunek 1C). Wykonaliśmy profilowanie pluripotencjalnego epiblastu w stadium E7.5, a następnie śledzenie linii komórek grzebienia nerwowego przedmigracyjnych i migrujących przy użyciu Wnt1-Cre w stadium E8.5 oraz migrujących komórek grzebienia nerwowego przy użyciu Sox10-Cre w stadium E9.5 (Rysunek 1D). W niniejszym protokole pobieramy konkretnie grzebień nerwowy czaszki poprzez oddzielenie głowy zarodka tuż nad placodą słuchową. Porównanie dwóch linii Cre (Wnt1 i Sox10), często stosowanych do znakowania komórek grzebienia nerwowego, potwierdza, że znakują one różne populacje we wczesnych zarodkach myszy (Rysunek 1E). Zastosowano strategie bramkowania w celu uzyskania żywych, pojedynczych komórek RFP-dodatnich, które posortowano bezpośrednio do roztworu lizującego do ekstrakcji RNA (patrz Tabela materiałów) i przechowywano w -80 °C (Rysunek 1F). Ważne jest monitorowanie liczby komórek pobranych z każdej próbki.

Izolację RNA przeprowadzono przy użyciu zmodyfikowanej wersji protokołu zestawu do izolacji RNA. W szczególności zastosowano kolumny mini RNA, które należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Kolumny te są przydatne do elucji w małej objętości (11 µL), aby uzyskać jak najwyższe stężenie RNA z próbek o ograniczonej liczbie komórek. Z tego samego powodu ważne jest odzyskanie całej fazy wodnej po ekstrakcji fenolowo-chloroformowej. Powolne pipetowanie i przechylenie probówki na jedną stronę podczas zbierania fazy są kluczowe dla maksymalizacji wydajności. W tej procedurze RNA jest ilościowo oznaczane zarówno za pomocą spektrofotometru, aby uzyskać informacje o zanieczyszczeniu solami/białkami, jak i elektroforezy kapilarnej w celu pomiaru stężenia (Rycina 2). Wykres spektrofotometryczny wykazuje, że RNA zostało wyizolowane bez zanieczyszczeń białkowych, ale charakteryzuje się wysoką zawartością soli (Rycina 2A-2B). Idealnie stosunek 260/280 powinien wynosić ~1,8, a stosunek 260/230 powinien być >2,0. Całkowita wydajność RNA zmierzona spektrofotometrem nie wzrosła wraz z wiekiem w przedziale E8.5-E9.5. Wynika to z faktu, że rozdzielczość spektrofotometru nie jest wystarczająco wysoka, aby wykryć zmiany w stężeniu RNA wynikające z liczby zbieranych komórek, dlatego zalecamy korzystanie z informacji o stężeniu uzyskanych z elektroforezy kapilarnej (Rycina 2C). Wykres z elektroforezy kapilarnej może służyć do szacowania stężenia i wielkości fragmentów RNA. Piki <1000 nukleotydów świadczą o degradacji. Reprezentatywny wykres jest zgodny z niezydegradowanym RNA. Piki przy 2000 nukleotydach i 5100 nukleotydach odpowiadają odpowiednio 18s i 28s rRNA. Obszar małego RNA znajduje się przy ~150 nukleotydach (Rycina 2D).

Biblioteki do sekwencjonowania małych RNA przygotowano przy użyciu zestawu do przygotowania bibliotek małych RNA opisanego w Tabela materiałówW tym przypadku wykorzystujemy nieco mniej niż połowę RNA uzyskanego z każdej próbki (4 µL z/zs/ze* *(Note: As the source text provided is only a fragment "of the", it cannot be translated without context, as it could be "z", "ze", "należącego do", "dotyczącego" etc. depending on the following noun. However, following the instruction to provide only the translation, I have provided the most common prepositional equivalents. If this was a mistake and a full text was intended, please provide the complete source.)* 11 µL eluowanie, ~80-120 ng), co umożliwia syntezę bibliotek do sekwencjonowania RNA z pozostałego RNA z każdej próbki. W tym kroku rozcieńczamy adaptery małych RNA 3' oraz 5' ¼ aby zmniejszyć ilość obecnych dimerów adapterów i sugerujemy, aby etapy ligacji adapterów, oczyszczania oraz odwrotnej transkrypcji przeprowadzać w miarę możliwości w sposób ciągły. Do amplifikacji bibliotek zastosowaliśmy 16 cykli PCR i sugerujemy, aby minimalna liczba cykli PCR dla każdego eksperymentu została określona empirycznie. Wykonanie nadmiernej liczby cykli PCR mogłoby doprowadzić do sztucznego zawyżenia liczby odczytów dla słabo eksponowanego miRNA.

Selekcja wielkości jest niezbędna w celu wzbogacenia bibliotek o miRNA i usunięcia dimerów adapterów, które zazwyczaj są obecne. Wielkość produktu bibliotecznego (150 bp) oraz dimerów adapterów (130 bp) jest bardzo zbliżona. Ekstrakcja z żelu jest stosowana do wyizolowania bibliotek małych RNA od dimerów adapterów (Rycina 3). Obraz żelu PAGE przed wycięciem pokazuje, że w każdej próbce obecne są liczne wielkości produktów (Rycina 3A). Ważne jest, aby pozostawić jedną pustą ścieżkę między dowolnymi dwiema próbkami lub między próbką a markerem wielkości naniesionym na żel. Front migracji na dole żelu jest lekko zakrzywiony, co wskazuje, że w przypadku trudności z rozróżnieniem prążka 150 bp we wszystkich próbkach konieczne może być prowadzenie elektroforezy z mniejszą prędkością. Ten reprezentatywny obraz pokazuje również obfitość produktu 150 bp z wyższego stężenia RNA kontroli pozytywnej (całkowite RNA z mózgu szczura), które zostało użyte do przygotowania biblioteki, w porównaniu do ilości użytej dla każdej próbki embrionalnej. Kontrola negatywna wykazuje, że odczynniki były wolne od zanieczyszczeń kwasami nukleinowymi (Rycina 3A). Wycinanie prążka 150 bp należy przeprowadzić za pomocą czystej żyletki, a obszar poddany pobraniu przedstawiono na Rycynie 3B). Ślady elektroforezy kapilarnej przed i po selekcji wielkości pokazują gwałtowną poprawę czystości produktu bibliotecznego 150 bp po oczyszczaniu żelowym (Rycina 3C-3D). Należy zauważyć, że ślady na Rycynie 3C-3D mają piki próbek wyższe niż markery, co świadczy o przeładowaniu. W takich przypadkach wielkość fragmentów może być dokładna, jednak stężenie może być błędne. Ilościowe oznaczenie można uzyskać poprzez rozcieńczenie bibliotek do zakresu markerów lub zastosowanie alternatywnych metod. Odnotowaliśmy pewne różnice między alternatywnymi metodami kwantyfikacji bibliotek i zalecamy empiryczne przetestowanie wielu metod ilościowych. Dokładne oznaczenie stężenia jest niezbędne w celu maksymalizacji liczby próbek sekwencjonowanych jednocześnie. Biblioteki zostaną rozcieńczone do 1,3 pM do sekwencjonowania i zazwyczaj od 15 do 25 próbek może być sekwencjonowanych jednocześnie przy użyciu zestawu do sekwencjonowania 150 cykli, który dostarcza ~140 milionów odczytów. Przekłada się to na około 5 milionów odczytów na próbkę. Zazwyczaj wskaźniki mapowania wynoszą od 60-80%.

figure-results-1
Rysunek 1: Pozyskiwanie komórek z zarodków myszy do sekwencjonowania małego RNA. (A) Zarodek myszy w stadium E8.5 z zaznaczoną eliminacją worka żółtkowego i somytów wykorzystywanych do określenia stadium rozwoju zarodka (B) Określanie stadium rozwoju zarodków myszy na podstawie liczby somytów w celu uchwycenia etapów rozwoju grzebienia nerwowego (C) Analiza głównych składowych (PCA) bibliotek przygotowanych z posortowanych komórek grzebienia nerwowego typu dzikiego, wykazująca grupowanie próbek według wieku (D) Schemat przedstawiający sposób pozyskiwania próbek z wykorzystaniem Wnt1-Cre w stadium E8.5 do znakowania przedmigracyjnych i migrujących komórek grzebienia nerwowego oraz Sox10-Cre w stadium E9.5 do znakowania wyłącznie migrujących komórek grzebienia nerwowego (E) Analiza głównych składowych (PCA) bibliotek przygotowanych z posortowanych komórek grzebienia nerwowego typu dzikiego, wykazująca grupowanie próbek według linii Cre niezależnie od wieku (F) Strategia bramkowania zastosowana do izolacji komórek grzebienia nerwowego RFP+ z zarodków w stadiach E8.5 i E9.5 przy użyciu sortowania FACS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Izolacja RNA z embrionów myszy w stadiach E7.5-E9.5. (A) Reprezentatywny zapis spektrofotometryczny z izolacji RNA z najwcześniejszego stadium embrionalnego, dla którego zastosowano ten protokół. (B) Tabela przedstawiająca reprezentatywne wartości jakości RNA uzyskane za pomocą spektrofotometru. (C) Przykład RNA wyizolowanego z posortowanych komórek grzebienia neuronalnego z embrionów w każdym z wieków (D) Zapis elektroforezy kapilarnej wskazujący na dobrą jakość RNA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3: Biblioteki miRNA przed i po selekcji wielkości. (A) Żel TBE-PAGE przedstawiający reprezentatywne biblioteki małych RNA dla czterech próbek i kontroli przed i (B) po wycięciu prążka 150 bp. Strzałki wskazują prążek 150 bp przeznaczony do wycięcia (C) Wykres elektroforezy kapilarnej biblioteki małych RNA przed i (D) po selekcji wielkości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Procesy rozwojowe mogą przebiegać szybko, a komórki przechodzą wiele sekwencyjnych specyfikacji, tak że aby uchwycić kompleksowy obraz miRNA przyczyniających się do wczesnych decyzji o losie, potrzebna jest bardziej szczegółowa ocena stopnia zaawansowania niż powszechnie stosowany przyrost o pół dnia. W niedawnym badaniu przeprowadzono sekwencjonowanie RNA z zarodków Theiler w stadium 12, które mają od 3 do 6 somitów11. Odkryliśmy, że w tym okresie komórki grzebienia nerwowego są określone (3 somity wieku), rozwarstwiają się (4 somity wieku) i migrują (5-6 somitów wieku). Odkryliśmy również, że oprócz czynnika Cre używanego do oznaczania populacji komórek śladowych, wiek jest największym źródłem zmienności między próbkami biologicznymi i tylko zarodki dopasowane do somitów powinny być uważane za powtórzenia. Należy to również wziąć pod uwagę przy porównywaniu zarodków transgenicznych z zarodkami kontrolnymi typu dzikiego.

Poprzednie metody profilowania miRNA we wczesnym okresie rozwoju wykorzystywały od 10 do 100 ng wejściowego RNA do przygotowania małej biblioteki sekwencjonowania RNA i łączyły wiele zarodków w jednej próbce13,14. Demonstrujemy izolację RNA i przygotowanie biblioteki z pojedynczego zarodka E7,5 lub z posortowanych komórek grzebienia nerwowego w E8,5 i E9,5 przy użyciu około 100 ng całkowitego RNA jako danych wejściowych. Podczas dysocjacji zarodków do sortowania należy zwrócić uwagę na obserwację dysocjacji pod mikroskopem i wygasić reakcję, aby zaobserwować, kiedy uzyskuje się pojedyncze komórki. Odkryliśmy, że dysocjacja obszaru czaszki zarodków E8,5-E9,5 jest prawie natychmiastowa przy delikatnym ręcznym pipetowaniu, jak opisano w protokole. W przypadku większych tkanek i coraz starszych zarodków czas dysocjacji może być dłuższy w zależności od części zarodka, która jest dysocjowana. W przypadku zarodków E7.5-E9.5 grudki komórek są łatwo widoczne pod mikroskopem, a dysocjacja powinna trwać do momentu, gdy nie będzie już widocznych grudek. Pojedyncze komórki są widoczne w roztworze, jeśli dostosujesz ostrość przez roztwór w studzience w dowolnym miejscu od 5 do 10 razy. Poprzednie metody sortowały komórki bezpośrednio do bufora do lizy w celu sekwencjonowania RNA w celu przygotowania masowego RNA z małej liczby komórek14. Tutaj sortujemy bezpośrednio do roztworu do lizy ekstrakcji RNA, aby RNA można było wyizolować przed rozpoczęciem przygotowania biblioteki. Zastosowanie mini kolumn o objętości elucji 11 μl pozwoliło na uzyskanie wystarczająco wysokiego stężenia RNA, tak aby pojedynczy preparat RNA mógł zostać podzielony na sekwencjonowanie małych RNA i masowych RNA.

Jednym z obecnych ograniczeń większości metod sekwencjonowania małych RNA jest amplifikacja PCR przekształconego cDNA. Nasza metoda nie pokonuje tego ograniczenia, ale udało nam się zminimalizować liczbę cykli PCR z zalecanych 25 maksimum do 16 cykli. To zmniejszenie amplifikacji zmniejsza sztuczne odchylenie amplifikacji wprowadzone przez PCR. Innym źródłem stronniczości jest ligacja adapterów, gdzie wiadomo, że określone sekwencje znajdujące się na końcach adapterów i miRNA mogą zwijalić się ze sobą z większą wydajnością niż inne sekwencje. Aby tego uniknąć, adaptery używane w tym protokole mają 4 losowe zasady wbudowane na końcu każdego adaptera, aby zapobiec odchyleniu w reakcjach ligacji. Ponadto innym częstym problemem jest ilość dimerów adapterowych, które tworzą, gdy wejście RNA jest niskie. Zestaw do przygotowania biblioteki zawiera kroki mające na celu zmniejszenie tworzenia się dimerów adaptera, takie jak inaktywacja adaptera i czyszczenie koralików w celu usunięcia nadmiaru adapterów po każdym podwiązaniu. Rozcieńczyliśmy również adaptery 3' i 5' 4N o 1/4, aby zmniejszyć ilość dimeru adaptera, który może się utworzyć. Odkryliśmy, że gdy nie jest rozcieńczony, intensywność pasma 130 pz wzrasta, co utrudnia odróżnienie od pasma 150 pz zawierającego pożądane małe biblioteki RNA na żelu.

Kolejnym aktualnym wyzwaniem związanym z przygotowaniem bibliotek sekwencjonowania jest dokładna kwantyfikacja produktu przed sekwencjonowaniem. Odkryliśmy, że różne metody dają różne wyniki w tej samej bibliotece. Sugerujemy, aby naukowcy użyli wielu metod kwantyfikacji, aby uzyskać dokładne oszacowanie stężenia.

Protokół ten może być szeroko stosowany w badaniach genetycznych, rozwojowych lub innych zastosowaniach, w których RNA jest pobierane z niewielkiej liczby komórek. Takie podejście upraszcza badania czasowe, unikając łączenia zarodków i może być łatwo stosowane zarówno do komórek niesortowanych, jak i sortowanych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ten projekt był wspierany przez Andrew McDonough B+ Foundation i NIH (R01-HD099252, R01-HD098131. R.J.P. is a CPRIT Scholar in Cancer Research (RR150106) i V Scholar in Cancer Research (V Foundation). Autorzy pragną również podziękować Ośrodkowi Cytometrii i Sortowania Komórek w BCM za dostarczenie sprzętu niezbędnego do realizacji tego projektu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#5 Kleszcze Narzędzia do naukiFisher ScientificNC9277114
0,4% Trypan niebieskiThermoFisher15250061
10 cm szalki PetriegoFisher Scientific07-202-011
2-PropanolMiilapore SigmaI9516-500ML
5 % Criterion TBE Żel poliakrylamidowy, 12+2 dołk, 45 &mikro; LAnalizator fragmentów Bio-Rad3450047
5200AgilentM5310AA
96-dołkowe płytki PCR wysokoprofilowe półlistwowe przezroczyste/przezroczysteBio-RadHSS9601
BD FACSAria IIbdbiosciences Albumina
surowicy bydlęcej, frakcja VFisher ScientificBP1600100
Dulbecco's Buforowany fosforanem Sól fizjologiczna (DPBS)GendepotCA008-300
Probówki EppendorfFisher Scientific05-408-129
Etanol Czysty, 200 proof bezwodnySigma AldrichE7023-500ml
FC-404-2001IlluminaFC-404-2001
HS NGS Zestaw fragmentówAgilentDNF-474-0500
HS RNA KitAgilentDNF-472-0500
miRNeasy Mini Kit (50)Qiagen217004
NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 kodów kreskowych)Fisher ScientificNC1289113
NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cykli)IlluminaFC-404-2001
Zestaw fragmentów NGSAgilentDNF-473-1000
PapainWorthingtonLK003176ponownie zawiesić w 5 ml PBS wolnego Ca/Mg dla końcowego stężenia 27 U/ml
SYBR Gold barwnik żelowy z kwasem nukleinowymThermoFisherS11494
Trizol LSStacjonarne
Pojedyncze UVNożyczki UV Fisher ScientificUVP95044701
Proste narzędzia do nauki precyzyjnej #91500-09Fisher ScientificNC9609583
transiluminatory UVP UVP ThermoFisher 10296028:

Bibliografia

  1. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 557-568 (2008).
  2. Abrahante, J. E., et al. The Caenorhabditis elegans hunchback-like gene lin-57/hbl-1 controls developmental time and is regulated by microRNAs. Developmental Cell. 4 (5), 625-637 (2003).
  3. Lin, S. Y., et al. The C elegans hunchback homolog, hbl-1, controls temporal patterning and is a probable microRNA target. Developmental Cell. 4 (5), 639-650 (2003).
  4. Reinhart, B. J., et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature. 403 (6772), 901(2000).
  5. Slack, F. J., et al. The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor. Molecular Cell. 5 (4), 659-669 (2000).
  6. Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR. Genes & Development. 18 (2), 132-137 (2004).
  7. Ventura, A., et al. Targeted deletion reveals essential and overlapping functions of the miR-17 92 family of miRNA clusters. Cell. 132 (5), 875-886 (2008).
  8. Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nature Genetics. 40 (3), 290(2008).
  9. Li, Y., et al. Dynamic regulation of small RNAome during the early stage of cardiac differentiation from pluripotent embryonic stem cells. Genomics Data. 12, 136-145 (2017).
  10. Chugh, P., Dittmer, D. P. Potential pitfalls in microRNA profiling. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 3 (5), 601-616 (2012).
  11. Werber, M., Wittler, L., Timmermann, B., Grote, P., Herrmann, B. G. The tissue-specific transcriptomic landscape of the mid-gestational mouse embryo. Development. 141 (11), 2325-2330 (2014).
  12. Yang, Q., et al. Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos. Science Advances. 2, (2016).
  13. Ohnishi, Y., et al. Small RNA class transition from siRNA/piRNA to miRNA during pre-implantation mouse development. Nucleic Acids Research. 38 (15), 5141-5151 (2010).
  14. Loontiens, S., et al. Purification of high-quality RNA from a small number of fluorescence activated cell sorted zebrafish cells for RNA sequencing purposes. BMC Genomics. 20 (1), 228(2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sekwencjonowanie ma ych RNAkom rki grzebienia nerwowegoprzygotowanie bibliotekioczyszczanie w elusortowanie kom rekelektroforeza kapilarnasekcja embrion wekstrakcja RNAprofilowanie mikroRNA

Powiązane artykuły